CN109097391A - 一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，包括分离提取健康人蜕膜间充质干细胞；经基因工程改造后进行悬浮驯化，通过生物反应器悬浮扩大培养，收集大量上清液；通过特有低温真空冻干技术制成蜕膜间充质干细胞活性因子。本发明的有益效果是：基于基因工程手段改造蜕膜间充质干细胞并进行悬浮驯化获得悬浮细胞株，此细胞株能够分泌更高水平的活性因子，并且能够通过生物反应器大规模生产，大大降低生产成本。并且此方法通过特殊的低温真空冻干技术，获得活性因子纯度、稳定性更高。通过此方法生产的蜕膜间充质干细胞活性因子在具有生物学活性功能的产品，如化妆品或保健品中应用，具有更高的社会及经济效益。

Description

一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种活性因子技术领域，特别涉及一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法及其应用。

背景技术

蜕膜间充质干细胞是一种分离自健康个体胎盘蜕膜的成体干细胞。蜕膜间充质干细胞能够分泌许多细胞因子如EGF、bFGF、TGF-β、HGF、IGF等及许多干细胞外泌体。蜕膜间充质干细胞及其分泌活性因子在再生医学领域已经得到广泛的研究和应用。

蜕膜间充质干细胞是一种贴壁依赖性细胞，传统的贴壁培养的制备工艺复杂，需要许多经验丰富的技术人员，加上过程中的大量设备、耗材的投入，导致蜕膜间充质干细胞活性因子的制备成本高昂，而且所获得的活性因子含量也不高，大大影响了蜕膜间充质干细胞活性因子的产品开发。传统的制备工艺均是在含血清、含抗生素的条件下进行，会引入许多风险因素，影响活性因子的纯度，给产品开发带来一系列的困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，此方法在于通过基因工程手段改造蜕膜间充质干细胞并进行悬浮驯化获得悬浮细胞株，此细胞株能够分泌更高水平的活性因子，并且能够通过生物反应器大规模生产，大大降低生产成本。

本发明的另一个目的在于提供一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，此方法为无血清、无抗生素培养，风险因素大大减小。

本发明的另一个目的在于一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，此方法通过特殊的低温真空冻干技术，获得活性因子纯度、稳定性更高。

本发明的另一个目的在于一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子在具有生物学活性功能的产品，如化妆品或保健品中应用，具有极高的社会及经济效益。

本发明意外地发现，如果利用h-siat7e真核表达载体转染蜕膜间充质干细胞，可以将贴壁培养的蜕膜间充质干细胞驯化为悬浮培养，且悬浮培养的细胞能够分泌更多的活性因子。

本发明采用如下技术方案：

一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)分离提取健康人蜕膜间充质干细胞；

b)经基因工程改造后进行悬浮驯化，通过生物反应器悬浮扩大培养，收集大量上清液；

c)通过特有低温真空冻干技术制成蜕膜间充质干细胞活性因子。

所述的步骤b)中，悬浮驯化方法如下：通过h-siat7e真核表达载体转染蜕膜间充质干细胞，通过无血清悬浮培养培养基不断进行贴壁-悬浮间隔培养筛选出悬浮蜕膜间充质干细胞细胞株，命名为Siat7e-DPMSC，进而通过生物反应器扩大培养，收集培养上清。

所述步骤b)中，无血清悬浮培养培养基由以下成分组成：DMEM/F12、PDGF-BB、bFGF、(TGF)-β1、EGF、转铁蛋白Transferrin、胰岛素、硫酸葡聚糖和BMP-2；其中，PDGF-BB含量为50～100ng/mL；bFGF含量为0～50ng/mL；(TGF)-β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30ng/mL；转铁蛋白Transferrin含量为2.0～4.5mg/mL、胰岛素含量为100～200U/mL、硫酸葡聚糖含量为10～50μg/mL、BMP-2含量为10～50ng/mL。优选地，所述步骤b)的无血清悬浮培养培养基中，PDGF-BB含量为80ng/mL；bFGF含量为20ng/mL；(TGF)-β1含量为10ng/mL；EGF含量为10ng/mL；转铁蛋白Transferrin含量为3mg/mL、胰岛素含量为100U/mL、硫酸葡聚糖含量为25μg/mL、BMP-2含量为10ng/mL。

所述步骤b)中，贴壁-悬浮间隔培养筛选方法步骤为：将h-siat7e真核表达载体转染后的蜕膜间充质干细胞用无血清悬浮培养培养液先进行贴壁培养，然后用0.25％的胰酶消化收集贴壁和悬浮细胞，再用生物反应器悬浮培养，然后再进行贴壁培养，反复20～30个循环后，收集悬浮细胞进行鉴定，即筛选出Siat7e-DPMSC悬浮细胞株。

所述步骤b)中，所述生物反应器为搅拌式生物反应器；反应条件为：搅拌速率40～100rpm，PH值为6-8，溶氧(DO)值为50～80％。优选地，所述步骤b)中，所述生物反应器为搅拌式生物反应器；反应条件为：搅拌速率50rpm，PH值为7，溶氧(DO)值为60％。

所述步骤c)中，低温真空冻干技术步骤包括：将收集的培养上清通过3kD的滤膜进行超浓缩，然后通过0.22μm滤网过滤后加入冻干赋型剂，通过程序降温系统降温至-80℃凝固备用；将凝固样本进行抽真空，升华干燥，除去冰晶，最后制得冻干活性因子，-20℃保存。

所述的程序降温体系为1℃/min下降至-80℃。

所述的培养上清经过超浓缩后体积为原上清体积的1/20。

所述冻干赋型剂为甘露醇、葡萄糖、海藻糖、蔗糖或乳糖中的至少一种，加入量为浓缩液的15～20％v/v。优选地，所述冻干赋型剂为甘露醇，加入量为浓缩液的15％v/v。

采用所述方法生产制得的蜕膜间充质干细胞活性因子，生产过程中不添加任何的抗生素。

采用所述方法生产制得的蜕膜间充质干细胞的悬浮细胞株。

所述的蜕膜间充质干细胞活性因子在制备具有生物学活性功能产品中的应用。所述的生物学活性功能产品为化妆品或保健品。

本发明中：

“活性因子”的定义为：活性因子定义为具有生物学活性的因子，如EGF、bFGF、IGF、VEGF、HGF、TGF-β、PGE2等细胞因子及干细胞分泌的外泌体等。

“具有生物学活性功能产品”的定义为：含有EGF、bFGF、IGF、VEGF、HGF、TGF-β、PGE2等细胞因子及干细胞分泌的外泌体等生物活性因子且具备抗衰、护肤等功能的产品，如精华液、面膜等化妆品和保健品。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明基于h-siat7e真核表达载体转染蜕膜间充质干细胞这一基因工程手段改造蜕膜间充质干细胞并进行悬浮驯化获得悬浮细胞株，此细胞株能够分泌更高水平的活性因子，并且能够通过生物反应器大规模生产，大大降低生产成本。

2)本发明的方法通过特殊的低温真空冻干技术，获得活性因子纯度、稳定性更高。

3)通过本发明的方法生产的蜕膜间充质干细胞活性因子安全性高，对口、皮肤和眼显示均无毒性，无刺激性。

4)通过本发明的方法生产的蜕膜间充质干细胞活性因子具有生物学活性，包括改善脂溢性皮炎，可以用于制备具有生物学活性功能的产品，如化妆品或保健品，具有更高的社会及经济效益。

附图说明

图1为蜕膜间充质干细胞贴壁培养图片；

图2为蜕膜间充质干细胞流式检测结果；

图3为蜕膜间充质干细胞核型分析结果；

图4为蜕膜间充质干细胞悬浮驯化过程图片；

图5为Siat7e-DPMSC中Siat7e表达情况；

图6为Siat7e-DPMSC的MSC marker流式检测结果；

图7为Siat7e-DPMSC的核型分析结果；

图8为贴壁与悬浮培养方法细胞因子分泌情况比较；

图9为HDF细胞生长曲线；

图10为实验前、实验后症状评分统计分析图；

图11为皮肤肌理效果图；

图12为皮肤肌理检测结果。

具体实施方式

本发明中，h-siat7e真核表达载体使用Genecopoeia公司生产的真核表达载体，货号为EX-V1581-M03。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

实施例1

(一)蜕膜间充质干细胞分离培养及鉴定

“蜕膜间充质干细胞”分离培养的方法和培养基均参考中国专利，专利号为CN201410795200.0，公告号为CN104560870B，专利名称为“一种制备蜕膜间充质干细胞的方法”。

制得的蜕膜间充质干细胞如图1所示，贴壁成梭状生长，状态良好。

流式分析项目有：CD73、CD90、CD105、CD29、CD14、CD34、CD45、CD79-α、HLA-DR。检测结果如图2所示，可以看出多次传代后细胞表面标记表达维持稳定，符合MSC检测标准。

通过G显带分析核型，如图3所示，样本取自男性胎儿胎盘蜕膜，蜕膜间充质干细胞核型为女性，可以确认细胞为母体蜕膜细胞。

(二)蜕膜间充质干细胞悬浮细胞株的建立及鉴定：

将上述步骤制备得到的P3代的蜕膜间充质干细胞按2*10⁴/cm²的密度接种至T75培养瓶中，第二天将培养液换成OptiMEM I培养基(Invitrogen)并加入20μg的h-siat7e真核表达载体(Genecopoeia)和10μL Lipofectamine 2000，37℃培养4个小时。然后去掉转染培养基，换成无血清悬浮培养培养基。次日用0.25％胰酶(gibco)消化收集贴壁和悬浮细胞，放入生物反应器，按搅拌速度50rpm、PH值7、DO值60％的条件进行搅拌培养。两天后收集细胞，再重新接种至T75培养瓶中，重复操作20个循环。收集悬浮细胞，将细胞接种至生物反应器中进行扩大培养，条件不变。取细胞样本用通过细胞计数仪检测细胞数量及活率、通过流式检测siat7e表达、MSC标记，并取样进行核型分析。

过程中无血清悬浮培养培养基成分如下：DMEM/F12(invitrogen)、80ng/mLPDGF-BB(gibco)、20ng/mLbFGF(invitrogen)、10ng/mL(TGF)-β1(Peprotech)、10ng/mL EGF(gibco)、3.0mg/mL转铁蛋白(sigma)、100U/mL胰岛素、25μg/mL硫酸葡聚糖、10ng/mL BMP-2。

如图4所示，0Day、5Day、20Day筛选的Siat7e-DPMSC的形态变化，蜕膜间充质干细胞逐步由贴壁转化为悬浮。

通过苔盼兰染色镜检细胞活率，所获得的Siat7e-DPMSC收集时活率均在90％以上；通过流式检测Siat7e表达情况，如图5结果所示，没有改造过的蜕膜间充质干细胞不表达Siat7e，改造过的Siat7e-DPMSC表达率超过90％；通过流式检测CD73、CD90、CD105、CD29、CD14、CD34、CD45、CD79-α、HLA-DR，如图6结果所示，各项MSC指标均合格。如图7的结果显示，筛选的Siat7e-DPMSC悬浮细胞株核型并没有改变，改造不会造成染色体紊乱。可见，Siat7e-DPMSC悬浮细胞株建立成功。

(三)活性因子浓缩冻干：

取上清液，用0.22μm的滤网过滤，然后用3kD的滤器进行超浓缩，将上清液浓缩至原体积的1/20，加入15％的甘露醇。将此时的浓缩液通过程序降温设备进行程序降温，体系为1℃/min下降至-80℃。将凝固的浓缩液进行抽真空，升华干燥，除去冰晶，最后制得冻干活性因子，-20℃保存。

(四)蜕膜间充质干细胞细胞因子分泌检测：

对照组：取P3代的膜间充质干细胞用无血清培养基培养，待达到90％的融合度，培养基发黄时收集上清备检。

实验组：取Siat7e-DPMSC用无血清悬浮培养培养基在生物反应器中进行培养，直至培养基发黄时收集上清备检。

检测项目：通过Elisa法检测对照组和实验组上清EGF、bFGF、IGF、VEGF、HGF、TGF-β、PGE2含量。

如图8结果所示，Siat7e-DPMSC在相关细胞因子分泌的水平上远远高于传统的贴壁培养方法。

(五)蜕膜间充质干细胞活性因子的生物学特性及安全性检测：

a)HDF增殖活力实验：

HDF为人皮肤成纤维细胞，本实验意在验证本发明所述的蜕膜间充质干细胞活性因子对HDF体外培养的刺激，间接反映其对皮肤的可能的毒性及激活效果。

贴壁培养的蜕膜间充质干细胞上清和Siat7e-DPMSC培养上清均按步骤(三)进行冻干操作获得活性因子。

取HDF细胞分成三组：实验组A、实验组B、阴性对照组C，每组分0H、6H、12H、24H四个96孔板，同时接种相同细胞量的HDF细胞每孔200μL，用DMEM/F12加上10％的FBS进行培养。实验组A加入50μg/mL的Siat7e-DPMSC细胞活性因子，实验组B加入等量的贴壁蜕膜间充质干细胞活性因子，阴性对照组C则加入等体积的生理盐水。分别分0H、6H、12H、24H四个时间点取样检测，每到时间点，则取相应的培养板出来，加入20μL WST1，37℃孵育4H，然后在450nm波长下测定吸光值，最后将数据收集分析。

如图9结果所示，通过蜕膜间充质干细胞活性因子对HDF无毒性，甚至能够刺激其增殖，悬浮蜕膜间充质干细胞活性因子的刺激增殖能力更强。

b)悬浮蜕膜间充质干细胞活性因子急性经口毒性实验：

由于前期体外实验结果表明，受试样本基本无毒，因此采用一次限量法进一步证实其对生物体的安全性，即一次最大灌胃剂量采用其10倍实效标识药量的受试物对50只昆明鼠进行灌胃，观察其毒性，如果在14天的观察周期内没有引起动物死亡，则不必继续进行多剂量测试。此次试验所用剂量为1mg/只，昆明鼠体重20±0.5g。

观察结果：14天内没有观察到动物异常反应或死亡，说明悬浮蜕膜间充质干细胞活性因子无经口毒性。

c)悬浮蜕膜间充质干细胞活性因子急性经皮毒性实验：

由于前期体外实验结果表明，受试样本基本无毒，因此采用一次限量法进一步证实其对生物体的安全性。用50只SD大鼠，体重为150±13g，涂抹5mg/kg体重剂量的蜕膜间充质干细胞活性因子水溶液，在14天的观察期内，如果没有发现引起动物死亡，则不再进行多计量实验。

观察结果：无发现动物有异常反应或死亡，说明悬浮蜕膜间充质干细胞活性因子无经皮毒性。

d)悬浮蜕膜间充质干细胞活性因子急性眼刺激实验

取30只健康成年白色家兔，实验前在动物房适应三天，常规饲养。在实验前24H内对实验兔子眼睛进行检查，有眼睛刺激症状、角膜缺陷和结膜损伤的眼部问题的兔子不能用于实验。

轻轻拉开家兔右眼下眼脸，分别将1μg、100μg、200μg悬浮蜕膜间充质干细胞活性因子水溶液0.1mL滴入不同的家兔右眼的结膜囊中，使上下眼脸被动闭合1s，防止受试物丢失。左眼不做处理作自身对照。滴入受试物后不冲洗眼睛。按照表1的评分标准对症状进行评分，收集统计分析最终结果，并根据眼刺激性评价标准进行评价。

表1：眼损伤评分标准

眼损伤	积分
		角膜：无溃疡形成或混浊	0
散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见	1
		半透明区易分辨，虹膜模糊不清	2
出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强可见	3
		角膜混浊，虹膜无法辨认	4
虹膜：正常	0
		皱褶明显加深，充血、肿胀、角膜周围有中度充血，瞳孔对光仍有反应	1
出血、肉血可见破坏，对光无反应	2
		结膜：血管正常	0
血管充血呈鲜红色	1
		血管充血呈鲜红色，血管不易分辨	2
弥漫性充血呈紫红色	3
		水肿：无	0
轻微水肿	1
		明显水肿，伴有部分眼脸外翻	2
水肿至眼脸近半闭合	3
		水肿至眼脸大半闭合	4
分泌物：无分泌物	0
		少量分泌物	1
分泌物使眼脸或睫毛潮湿或黏着	2
		分泌物使整个眼区潮湿或黏着	3

眼刺激性评价标准：分值为0～3属于无刺激性；分值为4～8属于轻度刺激性；分值为9～12属于中度刺激性；分值为13～16属于强度刺激性。

实验结果：给予不同浓度的受试物后，家兔均没有观察到眼睛刺激反应。

(六)悬浮蜕膜间充质干细胞活性因子对面部脂溢性皮炎症的作用

招募10名患有面部脂溢性皮炎症的志愿者，先按照评分表(见表2)给症状评分。然后给每人分发7份实验套装，每份套装包括7支50μg蜕膜间充质干细胞活性因子，7瓶20mL去离子水，7片干面膜(无添加)。套装使用方法为：用20mL去离子水在干净容器里溶解50μg蜕膜间充质干细胞活性因子，将干面膜浸泡在其中，放置5分钟后在脸上敷30分钟，脸部不做清水洗涤之外的任何处理。让10名志愿者连续7个晚上按照实验方案敷面膜，7天后重新给志愿者脸部症状评分。通过评分分析来研究悬浮蜕膜间充质干细胞活性因子对面部脂溢性皮炎症的作用。

表2：脸部症状评分表

症状	评分
		毛孔：细致	0
毛孔放大	1
		毛孔堵塞	2
粉刺	3
		油脂：少量	0
用吸油纸测试有油印	1
		油脂分泌多，用吸油纸测试有深油印	2
痤疮：无	0
		偶尔会出现少量，恢复快	1
有持续出现的烦恼	2
		大面积出现，恢复慢	3
红疹：无	0
		少量，自行消退	1
成片，难以自行消退	2
		痂屑：无	0
少量痂屑	1
		大量痂屑	2

如图10结果所示，经过7天的使用，总体评分都下降，说明悬浮蜕膜间充质干细胞活性因子对面部脂溢性皮炎症具有明显的改善作用。

实施例2蜕膜间充质干细胞活性因子皮肤修复实验

取实施例1制成的蜕膜间充质干细胞活性因子按100μg溶解于10mL去离子水中的比例进行配置，制成实验试剂。

招募20名志愿者，在受试者的左右手手臂划定一块3cm*3cm大小的区域。将受试者右手区域作为实验组，左右区域为对照组。实验组：每天早晚对实验区域进行简单清洗后，均匀涂抹实验试剂；对照组：每天早晚对实验区域进行简单清洗后，均匀涂抹去离子水。两组均进行30天操作，在第0天(未处理)、第2天、第5天、第10天、第12天、第15天、第18天、第20天、第25天、第30天进行检测。在以上时间点用硅橡胶对实验区域取样进行肌理分析，用激光对复制表面的凹凸进行精密的三维测量。再用图像分析法对试验区域的皮沟的异向性(VC1)。

图11为皮肤肌理效果图，如图所示，使用30天后，肉眼观察，实验组实验区域的皮肤，明显比对照组的皮肤更细腻，横纹减少。

图12为皮肤肌理检测结果，如图所示，使用30天后皮肤的异向性明显下降，皮肤纹理更平滑，说明此发明的方法制成的蜕膜间充质干细胞活性因子对皮肤有明显的修复作用。

实施例3蜕膜间充质干细胞活性因子精华乳液

蜕膜间充质干细胞活性因子精华乳液配方如下：

制备方法如下：

1)将蜕膜间充质干细胞活性因子100μg溶解于10mL溶液中，所述的溶液中的成分及成分含量如下：海藻糖2％w/v，酯化左旋维生素C 7.5％w/v，酯化维生素E 7.5％w/v，三乙醇胺5％w/v，去离子水70％w/v，水杨酸1％w/v，透明质酸钠5％w/v，玫瑰精油1％w/v，薄荷乳酸酯1％w/v。

2)在8～10℃环境下乳化36h，静置12h后制得终产品，转移至洁净的10mL按压瓶中。

综上所述，用所述方法制备的蜕膜间充质干细胞活性因子在生物活性上具有比传统工艺更好的结果，而且通过各种毒性测试，可以看出蜕膜间充质干细胞活性因子对口服、皮肤、眼均无毒性。对面部脂溢性皮炎症有明显的改善作用。使用此发明的方法制成的蜕膜间充质干细胞活性因子制成一种精华液，具有显著的补水、保水和修复皮肤的作用。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限于上述实施方式，凡是属于本发明原理的技术方案，均属于本发明的保护范围。对于本领域的技术人员而言，再不脱离本发明的原理的前提下进行的若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (15)

1.一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)分离提取健康人蜕膜间充质干细胞；

b)经基因工程改造后进行悬浮驯化，通过生物反应器悬浮扩大培养，收集大量上清液；

c)通过低温真空冻干技术制成蜕膜间充质干细胞活性因子；

所述的步骤b)中，悬浮驯化方法如下：通过h-siat7e真核表达载体转染蜕膜间充质干细胞，通过无血清悬浮培养培养基不断进行贴壁-悬浮间隔培养筛选出悬浮蜕膜间充质干细胞细胞株，命名为Siat7e-DPMSC，进而通过生物反应器扩大培养，收集培养上清。

2.根据权利要求1所述的一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述步骤b)中，无血清悬浮培养培养基由以下成分组成：DMEM/F12、PDGF-BB、bFGF、(TGF)-β1、EGF、转铁蛋白Transferrin、胰岛素、硫酸葡聚糖和BMP-2；其中，PDGF-BB含量为50～100ng/mL；bFGF含量为0～50ng/mL；(TGF)-β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30ng/mL；转铁蛋白Transferrin含量为2.0～4.5mg/mL、胰岛素含量为100～200U/mL、硫酸葡聚糖含量为10～50μg/mL、BMP-2含量为10～50ng/mL。

3.根据权利要求2所述的一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述步骤b)的无血清悬浮培养培养基中，PDGF-BB含量为80ng/mL；bFGF含量为20ng/mL；(TGF)-β1含量为10ng/mL；EGF含量为10ng/mL；转铁蛋白Transferrin含量为3mg/mL、胰岛素含量为100U/mL、硫酸葡聚糖含量为25μg/mL、BMP-2含量为10ng/mL。

4.根据权利要求1所述的一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述步骤b)中，贴壁-悬浮间隔培养筛选方法步骤为：将h-siat7e真核表达载体转染后的蜕膜间充质干细胞用无血清悬浮培养培养液先进行贴壁培养，然后用0.25％的胰酶消化收集贴壁和悬浮细胞，再用生物反应器悬浮培养，然后再进行贴壁培养，反复20～30个循环后，收集悬浮细胞进行鉴定，即筛选出Siat7e-DPMSC悬浮细胞株。

5.根据权利要求1所述的一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述步骤b)中，所述生物反应器为搅拌式生物反应器；反应条件为：搅拌速率40～100rpm，PH值为6-8，溶氧(DO)值为50～80％。

6.根据权利要求7所述的一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述步骤b)中，所述生物反应器为搅拌式生物反应器；反应条件为：搅拌速率50rpm，PH值为7，溶氧(DO)值为60％。

7.根据权利要求1所述的一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述步骤c)中，低温真空冻干技术步骤包括：将收集的培养上清通过3kD的滤膜进行超浓缩，然后通过0.22μm滤网过滤后加入冻干赋型剂，通过程序降温系统降温至-80℃凝固备用；将凝固样本进行抽真空，升华干燥，除去冰晶，最后制得冻干活性因子，-20℃保存。

8.根据权利要求7中所述一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述的程序降温体系为1℃/min下降至-80℃。

9.根据权利要求7中所述一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述的培养上清经过超浓缩后体积为原上清体积的1/20。

10.根据权利要求7中所述一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述冻干赋型剂为甘露醇、葡萄糖、海藻糖、蔗糖或乳糖中的至少一种，加入量为浓缩液的15～20％v/v。

11.根据权利要求10中所述一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述冻干赋型剂为甘露醇，加入量为浓缩液的15％v/v。

12.采用如权利要求1-11中任一种所述方法生产制得的蜕膜间充质干细胞活性因子，其特征在于：生产过程中不添加任何的抗生素。

13.采用如权利要求1-4中任一种所述方法生产制得的蜕膜间充质干细胞的悬浮细胞株。

14.如权利要求12所述的蜕膜间充质干细胞活性因子在制备具有生物学活性功能产品中的应用。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述的生物学活性功能产品为化妆品或保健品。