CN112920996A - 一种外泌体分泌培养基及脐带间充质干细胞外泌体的培养分离方法 - Google Patents

一种外泌体分泌培养基及脐带间充质干细胞外泌体的培养分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种外泌体分泌培养基及脐带间充质干细胞外泌体的培养分离方法，涉及外泌体富集和分离技术领域以无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：100‑300ng/ml的EGF、50‑150ng/ml的TGF、10‑30μg/ml的辅酶Q10、300‑600μg/ml的钾盐、0.3‑0.9μg/ml的果糖二磷酸钠和100‑300μg/ml的组胺二盐酸盐。采用本发明提供的外泌体分泌培养基可以在相同数量的培养细胞条件下获得更多数量的外泌体。上述外泌体分泌培养基有利于大规模生产具有良好生物活性的脐带间充质干细胞外泌体，进而推动外泌体在医疗、抗衰老、美容等广泛应用，具有良好的经济效益。

Description

一种外泌体分泌培养基及脐带间充质干细胞外泌体的培养分 离方法
技术领域
本发明涉及外泌体富集和分离技术领域，具体而言，涉及一种外泌体分泌培养基及脐带间充质干细胞外泌体的培养分离方法。
背景技术
外泌体(exosome)是一类可由多种细胞分泌并包裹了蛋白质、mRNA、微小RNA(microRNA)、非编码RNA(lncRNA)、DNA、脂质等物质的膜性囊泡,研究发现外泌体在细胞间通讯、肿瘤免疫、肿瘤治疗、组织损伤修复、疾病诊断中具有重要的意义。美国科学家JamesE.Rothman和Randy W.Schekman，德国科学家Thomas C.Südhof基于细胞内部囊泡(外泌体等)运输调控机制的发现共享了2013年诺贝尔生理或医学奖。
而间充质干细胞(MSCs)是一种来自于中胚层的多能干细胞,具有高度的自我更新及多向分化潜能,并在适宜的条件下具有诱导分化为肌细胞、软骨细胞、成骨细胞、成脂细胞等多种细胞的能力。MSCs不仅具有多向分化潜能,而且还具有免疫调节功能,可抑制多种免疫细胞的性能,调节免疫应答。
近年来,研究发现,来源于MSCs的外泌体(MSCs-Exo)具有与MSCs相似的组织损伤修复和再生功能。外泌体(exosome)是多种细胞分泌的膜外小囊泡,直径30～200nm,可以转运核酸、脂质和蛋白质,参与细胞间的信息交流。与MSCs相比,外泌体用于临床疾病的治疗更加稳定,体内同种异体给药后免疫排斥反应的可能性较低,并可为各种疾病提供替代疗法。MSCs-Exo逐渐成为新的研究热点，特别是在MSCs-Exo发挥组织损伤修复和再生功能的研究领域，MSCs-Exo起到抗衰老和保健作用，同时也具有良好的美容作用。
目前，市售的脐带间充质干细胞培养基正常培养的脐带间充质干细胞其分泌的外泌体数量非常的少，培养的细胞数和分泌的外泌体数的比大约为1：5。也就是说，目前培养的脐带间充质干细胞只分泌很少量的外泌体，若要提炼出外泌体用于临床，必须培养大量干细胞，这样会产生巨大成本而失去实际应用意义。况且外泌体数量太少也给下游分离纯化带来较大的操作难度。此外，目前正常培养的脐带间充质干细胞的外泌体中含有的活性成分只是细胞间维持相互关系的成分例如主要含有G蛋白(调节细胞生化功能)，而激活修复组织细胞的成分含量较少，例如成纤维细胞生长因子(FGF)。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种外泌体分泌培养基及脐带间充质干细胞外泌体的培养分离方法以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种外泌体分泌培养基，其以无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：100-300ng/ml的EGF、50-150ng/ml的TGF、10-30μg/ml的辅酶Q10、300-600μg/ml的钾盐、0.3-0.9μg/ml的果糖二磷酸钠和100-300μg/ml的组胺二盐酸盐。
在本发明应用较佳的实施方式中，以无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：200-300ng/ml的EGF、100-150ng/ml的TGF、20-30μg/ml的辅酶Q10、300-600μg/ml的钾盐、0.6-0.9μg/ml的果糖二磷酸钠和200-300μg/ml的组胺二盐酸盐。
钾盐为：氯化钾溶于磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的混合盐溶液，磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的总浓度为0.008-0.015mol/L，pH为7.4，氯化钾在混合盐溶液中的浓度为0.8-1.2g/L。
在本发明应用较佳的实施方式中，以无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：200ng/ml的EGF、150ng/ml的TGF、30μg/ml的辅酶Q10、600μg/ml的钾盐、0.6μg/ml的果糖二磷酸钠和300μg/ml的组胺二盐酸盐；
优选地，钾盐为：氯化钾溶于磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的混合盐溶液，磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的总浓度为0.01mol/L，pH为7.4，氯化钾在混合盐溶液中的浓度为1g/L。组胺二盐酸盐是一种化学物质，分子式：C5H9N3·2HCl。
在本发明应用较佳的实施方式中，无血清干细胞培养基以D-MEM培养基和人血白蛋白为基础培养基。D-MEM培养基是美国GIBCO公司产品，人血白蛋白是临床使用药品，配制好的干细胞培养基含质量浓度为5％-10％人血白蛋白。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞外泌体的培养方法，其包括如下步骤：将脐带间充质干细胞传代培养至第三代后，去除培养基，清洗细胞后加入上述的外泌体分泌培养基进行培养。
在本发明应用较佳的实施方式中，加入外泌体分泌培养基后每间隔1-3天更换一次外泌体分泌培养基，并收集每次更换后的培养液。
在本发明应用较佳的实施方式中，更换培养基前，对脐带间充质干细胞总细胞数进行计数，按照每100万个加入10-20ml分泌外泌体培养基。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞外泌体的分离方法，其包括如下步骤：
收集由脐带间充质干细胞外泌体的培养方法培养后的培养液，并进行脱细胞处理获得脐带间充质干细胞外泌体。
在本发明应用较佳的实施方式中，脱细胞处理为离心处理。
在本发明应用较佳的实施方式中，离心的速度为1000-1500rpm，时间为10-15分钟。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种新的外泌体分泌培养基，借助该分泌培养基可以使得脐带间充质干细胞大量分泌外泌体，细胞数和分泌的外泌体数的比大约为1：50至1:80。也即，采用本发明提供的外泌体分泌培养基可以在相同数量的培养细胞条件下获得更多数量的外泌体。上述外泌体分泌培养基有利于大规模生产具有良好生物活性的脐带间充质干细胞外泌体，进而推动外泌体在医疗、抗衰老、美容等广泛应用，具有良好的经济效益。
本发明提供的外泌体分泌培养基的成分侧重于激活干细胞的修复功能，其分泌外泌体含有的EGF、TGF、辅酶Q10可以刺激脐带间充质干细胞向上皮细胞方向分化，并初步使得分化后的脐带间充质干细胞具有上皮细胞功能趋向，同时也有利于分化后的脐带间充质干细胞具有修复皮肤及内脏上皮组织的功能趋向。由此培养出的脐带间充质干细胞产生的外泌体必然有更好的修复上皮组织作用。
加入高浓度的钾盐、果糖二磷酸钠和组胺二盐酸盐，可以促使干细胞如处于一个损伤组织环境中，并且高浓度钾盐使得干细胞误以为外围已经很多细胞死亡，引起或激活干细胞的修复机制，促使干细胞自身增殖加快，并大量分泌外泌体，从而有利于获得高浓度的具有修复作用的间充质干细胞外泌体的培养上清。
本发明还提供了脐带间充质干细胞外泌体的培养方法及分离方法，该方法简单易行，易于规模化生产。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
脐带间充质干细胞的外泌体在实际应用中具有诸多特点：1、具有来源容易，来源于新生儿脐带；2、脐带间充质干细胞分离培养技术已经很成熟，并有专用于脐带间充质干细胞的培养基(商品)市场销售；3、在抗衰老、美容作用上具有良好作用。
基于此，本发明提供了一种外泌体分泌培养基用于提升细胞分泌外泌体的水平(细胞数和分泌的外泌体数的比大约为1：50至1:80)，并提供下游的培养分离工序从而有利于后续制备脐带间充质干细胞分泌外泌体制剂。
外泌体分泌培养基以无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：100-300ng/ml的EGF、50-150ng/ml的TGF、10-30μg/ml的辅酶Q10、300-600μg/ml的钾盐、0.3-0.9μg/ml的果糖二磷酸钠和100-300μg/ml的组胺二盐酸盐。
上述的EGF(人表皮生长因子)、TGF(人转化生长因子)、辅酶Q10可以刺激脐带间充质干细胞向上皮细胞方向分化，并初步使得分化后的脐带间充质干细胞具有上皮细胞功能趋向，同时也有利于分化后的脐带间充质干细胞具有修复皮肤及内脏上皮组织的功能趋向。由此培养出的脐带间充质干细胞产生的外泌体必然有更好的修复上皮组织作用。
加入高浓度的钾盐(K+)、果糖二磷酸钠(FDP)和组胺二盐酸盐(ZA)，可以促使干细胞如处于一个损伤组织环境中，并且高浓度钾盐使得干细胞误以为外围已经很多细胞死亡，引起或激活干细胞的修复机制，促使干细胞自身增殖加快，并大量分泌外泌体，从而有利于获得高浓度的具有修复作用的间充质干细胞外泌体的培养上清。
需要说明的是，上述模拟干细胞处于损伤环境是基于研发人员从事细胞培养超过20年的技术经验所得，经过长久沉淀积聚的技术结晶，并不是培养基各组分的随机简单组合。
EGF(人表皮生长因子)、TGF(人转化生长因子)、辅酶Q10选自市售的商品试剂。
在本发明应用较佳的实施方式中，以间充质无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：200-300ng/ml的EGF、100-150ng/ml的TGF、20-30μg/ml的辅酶Q10、300-600μg/ml的钾盐、0.6-0.9μg/ml的果糖二磷酸钠和200-300μg/ml的组胺二盐酸盐。
钾盐为：氯化钾溶于磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的混合盐溶液，磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的总浓度为0.008-0.015mol/L，pH为7.4，氯化钾在混合盐溶液中的浓度为0.8-1.2g/L。
例如培养基中EGF的添加浓度选自210ng/ml、220ng/ml、230ng/ml、240ng/ml或250ng/ml；
培养基中TGF的添加浓度选自130ng/ml、140ng/ml、145ng/ml、148ng/ml或149ng/ml。
培养基中辅酶Q10的添加浓度选自25μg/ml、22μg/ml、25μg/ml、27μg/ml、28μg/ml、29μg/ml或30μg/ml。
培养基中钾盐的添加浓度选自400μg/ml、450μg/ml、480μg/ml、490μg/ml、500μg/ml、550μg/ml、580μg/ml或600μg/ml。
培养基中果糖二磷酸钠的添加浓度选自0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml或0.9μg/ml。
培养基中组胺二盐酸盐的添加浓度选自200μg/ml、230μg/ml、240μg/ml、250μg/ml、270μg/ml或300μg/ml。
上述列举的培养基中各组分的添加浓度仅为发明人可选的几组数值，在其他实施方式中，培养基的各组分的添加浓度也可根据需要进行自适应调节。
发明人发现在上述配方浓度范围内，检测培养上清中外泌体的数量处于较高水平，若钾盐的浓度超出上述浓度范围则会导致干细胞死亡速度过快，不利于外泌体的分泌。
在本发明应用较佳的实施方式中，以间充质无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：200ng/ml的EGF、150ng/ml的TGF、30μg/ml的辅酶Q10、600μg/ml的钾盐、0.6μg/ml的果糖二磷酸钠和300μg/ml的组胺二盐酸盐；
优选地，钾盐为：氯化钾溶于磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的混合盐溶液，磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的总浓度为0.01mol/L，pH为7.4，氯化钾在混合盐溶液中的浓度为1g/L。组胺二盐酸盐是一种化学物质，分子式：C5H9N3·2HCl。
在本发明应用较佳的实施方式中，无血清干细胞培养基以D-MEM培养基和人血白蛋白为基础培养基。D-MEM培养基是美国GIBCO公司产品，人血白蛋白是临床使用药品，配制好的干细胞培养基含质量浓度为5％-10％人血白蛋白。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞外泌体的培养方法，其包括如下步骤：将脐带间充质干细胞传代培养至第三代后，去除培养基，清洗细胞后加入上述的外泌体分泌培养基进行培养(即为第四代培养)。
上述传代培养可选择市售的商品培养基进行培养。清洗细胞可选择PBS进行清洗，也可选择重复清洗。
本发明还提供了脐带间充质干细胞外泌体的培养方法及分离方法，上述方法简单易行，易于规模化生产。借助上述外泌体分泌培养基以及培养方法有利于大规模产业化生产具有良好生物活性的脐带间充质干细胞外泌体，从而为医疗、抗衰老、美容等广泛应用提供了良好的基础。
在本发明应用较佳的实施方式中，加入外泌体分泌培养基后每间隔1-3天更换一次外泌体分泌培养基，并收集每次更换后的培养液。
例如可选择间隔2天更换一次外泌体分泌培养基，可以选择每次更换添加的外泌体分泌培养基的量相同。需要说明的是，更换培养基的次数可以根据需要选择，例如更换3-4次。
在本发明应用较佳的实施方式中，更换培养基前，对脐带间充质干细胞总细胞数进行计数，按照每100万个加入10-20ml分泌外泌体培养基。需要说明的是，在第一次添加外泌体分泌培养基和后续更换培养基时添加的外泌体分泌培养基的量一致。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞外泌体的分离方法，其包括如下步骤：
收集由脐带间充质干细胞外泌体的培养方法培养后的培养液，并进行脱细胞处理获得脐带间充质干细胞外泌体。
在本发明应用较佳的实施方式中，脱细胞处理为离心处理。
在本发明应用较佳的实施方式中，离心的速度为1000-1500rpm，时间为10-15分钟。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种外泌体分泌培养基。
以间充质无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：200ng/ml的EGF、150ng/ml的TGF、30μg/ml的辅酶Q10、600μg/ml的钾盐、0.6μg/ml的果糖二磷酸钠和300μg/ml的组胺二盐酸盐。
上述各组分的含量为间充质无血清干细胞培养基中的浓度。
钾盐为：氯化钾溶于磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的混合盐溶液，磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的总浓度为0.01mol/L，pH为7.4，氯化钾在混合盐溶液中的浓度为1g/L。
实施例2
本实施例提供了一种外泌体分泌培养基。
以间充质无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：EGF:200ng/ml；TGF:150ng/m；Q10：30μg/ml；钾盐：300μg/ml；FDP:0.6μg/ml；组胺二盐酸盐:300μg/ml。钾盐为：氯化钾溶于磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的混合盐溶液，磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的总浓度为0.01mol/L，pH为7.4，氯化钾在混合盐溶液中的浓度为1g/L。
实施例3
本实施例提供了一种外泌体分泌培养基。
以间充质无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：200ng/ml的EGF、150ng/ml的TGF、30μg/ml的辅酶Q10、600μg/ml的钾盐、0.3μg/ml的果糖二磷酸钠和300μg/ml的组胺二盐酸盐。钾盐为：氯化钾溶于磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的混合盐溶液，磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的总浓度为0.01mol/L，pH为7.4，氯化钾在混合盐溶液中的浓度为1g/L。
实施例4
本实施例提供了一种外泌体分泌培养基。
以间充质无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：200ng/ml的EGF、150ng/ml的TGF、30μg/ml的辅酶Q10、600μg/ml的钾盐、0.9μg/ml的果糖二磷酸钠和300μg/ml的组胺二盐酸盐。
实施例5
本实施例提供了一种外泌体分泌培养基。
以间充质无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：200ng/ml的EGF、150ng/ml的TGF、30μg/ml的辅酶Q10、500μg/ml的钾盐、0.9μg/ml的果糖二磷酸钠和300μg/ml的组胺二盐酸盐。
实施例6
本实施例提供了一种外泌体分泌培养基。
以间充质无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：200ng/ml的EGF、150ng/ml的TGF、30μg/ml的辅酶Q10、400μg/ml的钾盐、0.9μg/ml的果糖二磷酸钠和300μg/ml的组胺二盐酸盐。钾盐为：氯化钾溶于磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的混合盐溶液，磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的总浓度为0.01mol/L，pH为7.4，氯化钾在混合盐溶液中的浓度为1g/L。
实施例7
本实施例提供了一种外泌体分泌培养基。
以间充质无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：250ng/ml的EGF、100ng/ml的TGF、25μg/ml的辅酶Q10、500μg/ml的钾盐、0.6μg/ml的果糖二磷酸钠和250μg/ml的组胺二盐酸盐。钾盐为：氯化钾溶于磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的混合盐溶液，磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的总浓度为0.01mol/L，pH为7.4，氯化钾在混合盐溶液中的浓度为1g/L。
实施例8
本实施例提供了一种外泌体分泌培养基。
以间充质无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：100ng/ml的EGF、80ng/ml的TGF、10μg/ml的辅酶Q10、500μg/ml的钾盐、0.6μg/ml的果糖二磷酸钠和100μg/ml的组胺二盐酸盐。钾盐为：氯化钾溶于磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的混合盐溶液，磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的总浓度为0.01mol/L，pH为7.4，氯化钾在混合盐溶液中的浓度为1g/L。
实施例9
本实施例提供了一种脐带间充质干细胞外泌体的培养方法，其包括如下步骤：从正规医院产科获得健康人的脐带，实验室进行分离培养出脐带间充质干细胞，将培养皿中刚从脐带分离长出的第二代的脐带间充质干细胞(以100万个细胞为一管装入冻存管中，一根脐带因脐带的差异大约获得50-200支冻存管)作为种子冻存液氮中，需要生产外泌体时，取出液氮保持种子冻存管，复苏脐带间充质干细胞后用购得的商品培养基进行培养，也经过第三代培养，经过几天培养数量已经增殖十倍以上，去尽培养基，洗涤细胞，完全更换成自制的分泌外泌体培养基(例如实施例1-8中任一实施例)进行培养也即第四代培养(更换培养基前，对脐带间充质干细胞总细胞数进行计数，按照每100万个加入10ml分泌外泌体培养基)。当干细胞数量快速增殖，大约2天完全更换一次培养基，收集换出来的培养基(也即培养上清)(里面含有高浓度的外泌体)，一共收集四次培养上清也即获得含大量外泌体的培养上清溶液，然后离心脱细胞处理，离心的速度为1000rpm，时间为10分钟，完成一次脐带间充质干细胞外泌体生产。
需要说明的是：除了自制的分泌外泌体培养基外，其他的用具和培养基都是购自市场商品。
对比例
对比例中外泌体分泌培养基的组成参照表1所示。
表1对比例中外泌体分泌培养基的配方
Figure BDA0003035463030000121
Figure BDA0003035463030000131
实验例
使用3块96孔培养板，将120种组合中的每一种组合进行双孔培养(上述表1以及实施例仅为120种组合中的列举的几种)，取每一组的培养上清，使用荧光染料PKH67通过与膜结构的脂质分子结合而标记外泌体，置于荧光倒置显微镜下观察绿色荧光(绿色荧光为PKH67标记的外泌体)分布情况，统计绿色荧光点，并使用Image软件计算绿色荧光光密度百分比。
最终确定检测培养上清外泌体最高数量为最合适浓度为：EGF:200ng/ml；TGF:150ng/ml；Q10：30μg/ml；K+：600μg/ml；FDP:0.6μg/ml；ZA:300μg/ml。
而钾盐浓度提高三倍后，与二倍钾盐浓度的上清外泌体最高数量差异不大，但干细胞死亡较快，因此最终确定分泌外泌体培养基配方浓度为：EGF:200ng/ml；TGF:150ng/ml；Q10：30μg/ml；K+：600μg/ml；FDP:0.6μg/ml；ZA:300μg/ml。
实验例2
从市场采购的干细胞培养基(赛业(苏州)生物科技有限公司)培养脐带间充质干细胞，并对产生外泌体情况进行研究。
实验目的：研究证明市售的干细胞培养基能产生外泌体的量及其主要生物活性细胞因子(FGF)的水平。
实验方法：从已经建立的脐带间充质干细胞种子细胞库取出10支冻存管(100万个干细胞/管)，每管独立接种培养，按购买的干细胞培养基说明书操作将复苏的种子脐带间充质干细胞加入培养基装进培养方瓶进行常规培养，每两天更换一半培养基，将换出的培养基检测其外泌体和FGF(成纤维细胞生长因子)。培养至第十天结束。
每管种子独立培养，实验情况如下所示：
培养天数 2天 4天 6天 8天 10天 单位
干细胞数量 425 1205 3509 7208 14200 万个
上清总量 75 240 1200 5000 15000 ml
外泌体数量 62 406 3820 11300 32030 万个
上清的FGF浓度 69 110 236 210 190 pg/ml
结果显示：干细胞生长过程从复苏开始培养至第六天呈现加速增长，第六天后开始减慢增长速度，由于更换培养基原因上清总量很大，但培养后面4天外泌体增加数量还维持，但活性物质FGF含量下降，说明外泌体功效降低。也即，培养至第六天就终止培养。
实验例3
在市售商品干细胞培养基中加入实施例1提供的外泌体分泌培养基，进行培养。
实验目的：证实自制外泌体培养基的促进外泌体和活性物质作用情况。
实验方法：从已经建立的脐带间充质干细胞种子细胞库取出10支冻存管(100万个干细胞/管)，每管独立接种培养，按购买的干细胞培养基说明书操作将复苏的种子脐带间充质干细胞加入培养基，并装进培养方瓶进行常规培养，培养2天后换成自制分泌外泌体培养基继续培养，继续培养至第8天结束。检测其外泌体和FGF(成纤维细胞生长因子)。
每管种子独立培养，检测外泌体数量以及上清的FGF浓度，参照下表所示：
Figure BDA0003035463030000151
加入实施例1提供的分泌外泌体培养基后干细胞数量加速增长，外泌体数量爆发式增长，生物活性分子(FGF)维持高值，即最终收集上清具有高活性和高浓度外泌体。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种外泌体分泌培养基，其特征在于，其以无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：100-300ng/ml的EGF、50-150ng/ml的TGF、10-30μg/ml的辅酶Q10、300-600μg/ml的钾盐、0.3-0.9μg/ml的果糖二磷酸钠和100-300μg/ml的组胺二盐酸盐。
2.根据权利要求1所述的外泌体分泌培养基，其特征在于，以无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：200-300ng/ml的EGF、100-150ng/ml的TGF、20-30μg/ml的辅酶Q10、300-600μg/ml的钾盐、0.6-0.9μg/ml的果糖二磷酸钠和200-300μg/ml的组胺二盐酸盐；
所述钾盐为：氯化钾溶于磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的混合盐溶液，所述磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的总浓度为0.008-0.015mol/L，pH为7.4，所述氯化钾在混合盐溶液中的浓度为0.8-1.2g/L。
3.根据权利要求1或2所述的外泌体分泌培养基，其特征在于，以无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：200ng/ml的EGF、150ng/ml的TGF、30μg/ml的辅酶Q10、600μg/ml的钾盐、0.6μg/ml的果糖二磷酸钠和300μg/ml的组胺二盐酸盐；
优选地，所述钾盐为：氯化钾溶于磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的混合盐溶液，所述磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的总浓度为0.01mol/L，pH为7.4，所述氯化钾在混合盐溶液中的浓度为1g/L。
4.根据权利要求1-3任一项所述的外泌体分泌培养基，其特征在于，所述无血清干细胞培养基以D-MEM培养基和人血白蛋白为基础培养基，所述间充质干细胞培养基含质量浓度为5％-10％的人血白蛋白。
5.脐带间充质干细胞外泌体的培养方法，其特征在于，其包括如下步骤：将脐带间充质干细胞传代培养至第三代后，去除培养基，清洗细胞后加入权利要求1-4任一项所述的外泌体分泌培养基进行培养。
6.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞外泌体的培养方法，其特征在于，加入外泌体分泌培养基后每间隔1-3天更换一次所述外泌体分泌培养基，并收集每次更换后的培养液。
7.根据权利要求5或6所述的脐带间充质干细胞外泌体的培养方法，其特征在于，更换培养基前，对脐带间充质干细胞总细胞数进行计数，按照每100万个加入10-20ml分泌外泌体培养基。
8.脐带间充质干细胞外泌体的分离方法，其特征在于，其包括如下步骤：
收集权利要求5-7任一项所述的脐带间充质干细胞外泌体的培养方法培养后的培养液，并进行脱细胞处理获得脐带间充质干细胞外泌体。
9.根据权利要求8所述的脐带间充质干细胞外泌体的分离方法，其特征在于，所述脱细胞处理为离心处理。
10.根据权利要求9所述的脐带间充质干细胞外泌体的分离方法，其特征在于，所述离心的速度为1000-1500rpm，离心时间为10-15分钟。
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