CN111051497A - 细胞保存材料 - Google Patents

Abstract

本发明的课题为提供将细胞或组织在非冷冻状态下、维持良好的存活性而进行保存的技术。在液体组合物中，在非冷冻状态下保存细胞或组织，所述液体组合物含有脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类或其盐。该酸性多糖类可以是海藻酸。该液体组合物可以还含有钙离子等金属阳离子。

Description

细胞保存材料

技术领域

本发明涉及用于将细胞或组织在非冷冻状态下进行保存的液体组合物、及使用了该液体组合物的细胞或组织的保存方法。

背景技术

目前，在利用iPS细胞或间充质干细胞等干细胞的移植医疗研究中，细胞银行在大量制备干细胞的基础上，将其冷冻保存，各研究机构、医疗机构从该细胞银行的储备中以冷冻保存的状态获取所期望的干细胞，将其解冻·复苏，并根据需要而使其分化成所期望的细胞后，供于各种用途。然而，对于被寄予未来期望的细胞银行系统(其运作自体移植体制，管理并保管许多异体细胞的库存)而言，利用以细胞冷冻为前提的现有运输技术时，难以大量且稳定地供给处于适合移植状态的细胞。即，在移植时，需要将经冷冻保存的细胞解冻、培养并根据需要使其分化为目标细胞，并在此基础上，提供大量良好状态的细胞，但是，在必须以冷冻状态运输细胞的情况下，移植实施设施不得不从保存·管理细胞的细胞银行订购冷冻细胞，于该设施内自行大量培养。因此，实施移植的设施需要配备细胞的大量培养设备(例如，细胞处理中心(CPC))，而在不具有该设备的设施中，则难以实施移植医疗。另一方面，细胞银行通常具有大量培养细胞的技术、设备，因此，如果细胞银行侧能够在大量制备适于移植的良好状态的细胞的基础上、将得到的细胞维持在良好的状态，直到迅速供给至移植实施设施，则即使是不具有细胞的大量培养设备的设施，也能够实施移植医疗。为了解决该课题，不进行冷冻而将大量的细胞在维持为良好状态的情况下保存、运输的技术是不可或缺的。

脱酰基结冷胶(DAG)等多糖类介由金属阳离子(例如钙离子等二价金属阳离子)聚集而在水中形成三维网络(无定形的结构体)。在含有该三维网络的液体培养基中培养细胞时，培养基中的细胞被该三维网络捕获而不下沉，因此无需振荡、旋转操作等就能够以均匀分散的悬浮状态培养(悬浮静置培养)细胞。另外，能够在不实质性地提高液体培养基的粘度的情况下形成上述的三维网络，因此，含有该三维网络的培养基组合物在传代培养等的操作性方面也优异(专利文献1)。该可进行悬浮静置培养的培养基组合物具有增强各种细胞的增殖活性等各种优异的特性，因此能够期待在再生医疗、蛋白质等的大量生产等广泛的技术领域中应用。

专利文献2中，公开了将含有纳米纤维的培养基组合物用于细胞、组织的保存、运输。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2014/017513号

专利文献2：国际公开第2015/111686号

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于，提供将在非冷冻状态下、维持住细胞或组织的良好存活性而进行保存的技术。

用于解决课题的手段

本申请发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，通过在含有脱酰基结冷胶及海藻酸的培养基组合物中悬浮，能够在室温、维持良好的存活性而长期保存细胞、组织。在该培养基组合物中保存球体(sphere)时，避免了球体彼此的凝集、抑制了球体内部的坏死的发生。该培养基组合物中，即使在所设想的运输时的环境的振动条件下，仍然能够在室温维持细胞良好的存活性而长期保存。基于这些见解，本申请的发明人进一步进行研究，从而完成了本发明。

即，本发明如下：

[1]液体组合物，其用于在非冷冻状态下保存细胞或组织，所述液体组合物含有脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类或其盐。

[2]如[1]所述的液体组合物，其中，所述液体组合物中的脱酰基结冷胶或其盐的浓度以游离体的脱酰基结冷胶换算计为0.002～0.01(w/v)％，所述酸性多糖类或其盐的浓度以游离体换算计为0.004～0.1(w/v)％，所述酸性多糖类或其盐相对于脱酰基结冷胶或其盐的质量比以游离体换算计为1以上。

[3]如[1]或[2]所述的液体组合物，其中，所述酸性多糖类为选自由海藻酸、果胶和果胶酸组成的组中的任一种。

[4]如[3]所述的液体组合物，其中，所述酸性多糖类为海藻酸。

[5]如[1]～[4]中任一项所述的液体组合物，其还含有金属阳离子。

[6]如[5]所述的液体组合物，其中，所述金属阳离子为钙离子。

[7]如[1]～[6]中任一项所述的液体组合物，其中，所述酸性多糖类或其盐进行了高压蒸气灭菌处理。

[8]细胞或组织的保存方法，其包括在[1]～[7]中任一项所述的液体组合物中、在非冷冻状态下保存细胞或组织。

[9]如[8]所述的方法，其中，在所述液体组合物中、在悬浮的状态下保存细胞或组织

[10]如[8]或[9]所述的方法，其中，于1℃～30℃保存细胞或组织。

[11]如[8]～[10]中任一项所述的方法，其中，在密封的容器内保存细胞或组织。

[12]如[8]～[11]中任一项所述的方法，其中，在伴随振动的环境下保存细胞或组织。

[13]如[8]～[12]中任一项所述的方法，其中，将球体的状态的细胞进行保存。

发明效果

通过使用本发明的液体组合物，能够在例如室温等、在非冷冻状态下维持细胞、组织良好的存活性而对其长期保存。在本发明的液体组合物中保存球体时，可以避免球体彼此的凝集、抑制球体内部的坏死的发生。

本发明的液体组合物也可以用于细胞、组织在非冷冻状态下的运输。例如，在平板上贴壁培养细胞、并直接以该状态进行运输的情况下，存在由于运输中的振动而使得细胞从平板脱离等、细胞所具有的原本的功能降低的情况，但使用本发明的液体组合物时，由于能够将细胞、组织保持在悬浮的状态，因此能够避免由于运输中的振动而从平板脱离等所导致的细胞的损伤，在维持细胞的原本的功能的状态下，保存及运输细胞、组织。

附图说明

[图1]表示保存前后的球体的形态。左图表示保存开始时的球体的形态。中央图表示保存7天后的球体的形态。右图表示在保存7天后维持了悬浮状态的球体。

具体实施方式

以下，更详细地说明本发明。

液体组合物

本发明提供用于在非冷冻状态下保存细胞或组织的液体组合物。该液体组合物能够在维持存活的情况下，在非冷冻状态下保存细胞、组织。

本发明中的细胞是构成动物或植物的最基本的单位，在细胞膜的内部具有细胞质和各种细胞器作为其要素。这时，在细胞内部含有或不含有内包有DNA的核都可以。例如，本发明中的来自动物的细胞包括精子、卵子等生殖细胞、构成生物体的体细胞、干细胞、祖细胞、从生物体中分离的癌细胞、从生物体分离且获得了永生能力而可在体外稳定维持的细胞(细胞株)、从生物体分离且人工进行了基因改造的细胞、从生物体分离且人工更换了核的细胞等。作为构成生物体的体细胞的例子，不限于以下，但包括成纤维细胞、骨髓细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞、单核细胞、骨细胞、骨髓细胞、周细胞、树突细胞、角质形成细胞、脂肪细胞、间充质细胞、上皮细胞、表皮细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、肝实质细胞、软骨细胞、卵丘细胞、神经系细胞、胶质细胞、神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、心肌细胞、食道细胞、肌肉细胞(例如，平滑肌细胞、骨骼肌细胞)、胰腺β细胞、黑素细胞、造血祖细胞和单核细胞等。该体细胞是包括从例如皮肤、肾脏、脾脏、肾上腺、肝脏、肺、卵巢、胰腺、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、膀胱、前列腺、睾丸、胸腺、肌肉、结缔组织、骨、软骨、血管组织、血液、心脏、眼睛、大脑或神经组织等任意的组织中采集的细胞。干细胞是指兼具自我复制的能力和分化为其他多个系统的细胞的能力的细胞，作为其例，不限定于以下，但包括胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎肿瘤细胞、胚胎生殖干细胞、人工诱导多能干细胞(iPS细胞)、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、肌肉干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌症干细胞、毛囊干细胞等。祖细胞是指处于从上述干细胞向特定的体细胞、生殖细胞分化的中途的阶段的细胞。癌细胞是指从体细胞派生而获得了无限的增殖能力的细胞。细胞株是指通过在生物体外的人工操作而获得了无限增殖能力的细胞，作为其例，不限定于以下，但包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞株)、HCT116、Huh7、HEK293(人胚胎肾细胞)、HeLa(人子宫癌细胞株)、HepG2(人肝癌细胞株)、UT7/TPO(人白血病细胞株)、MDCK、MDBK、BHK、C-33A、HT-29、AE-1、3D9、Ns0/1、Jurkat、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five(注册商标)、Vero等。

本发明中的来自植物的细胞包括从植物体的各组织分离的细胞，也包括从该细胞中人工除去细胞壁而得的原生质体。

本发明中的组织是指若干种具有不同的性质、功能的细胞以一定的样式聚集而成的结构单位，作为动物的组织的例子，包括上皮组织、结缔组织、肌肉组织、神经组织等。作为植物的组织的例子，包括分生组织、表皮组织、同化组织、叶肉组织、输导组织、机械组织、软组织、去分化的细胞团(愈伤组织)等。

在本发明的液体组合物中保存的细胞或组织可以从上述记载的细胞或组织中任意选择。细胞或组织可以直接从动物或植物体采集。细胞或组织可以通过实施特定的处理而从动物或植物体诱导或生长或者转化后进行采集。这时，该处理可以在生物体内也可以在生物体外。作为动物，例如可举出鱼类、两栖类、爬虫类、鸟类、泛甲壳类、昆虫类、哺乳类等。作为哺乳动物的例子，没有限定，但可举出大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、松鼠、仓鼠、田鼠、鸭嘴兽、海豚、鲸鱼、狗、猫、山羊、牛、马、绵羊、猪、大象、普通狨、松鼠猴、恒河猴、黑猩猩以及人。作为植物，采集的细胞或组织只要能够液体培养，就没有特别限定。例如，可举出生产生药类(例如，皂甙、生物碱、小檗碱、莨菪碱、植物甾醇等)的植物(例如，药用人参、长春花、天仙子、黄连、颠茄等)；生产成为化妆品、食品原料的色素、多糖体(例如，花青素、红花色素、茜草色素、藏红花色素、黄酮类等)的植物(例如，蓝莓、红花、染色茜草、藏红花等)；或生产医药品原体的植物等，但不限定于此。

优选的方式中，本发明的液体组合物能够在维持悬浮状态的情况下，将存活的细胞、组织在非冷冻状态下进行保存。

本发明中的细胞或组织的悬浮是指细胞或组织相对于保存容器或培养容器不粘附的状态(非粘附)。并且，本发明中，将以下状态称为“悬浮静置”，所述状态是在液体组合物中保存细胞或组织时，不伴有外部针对液体组合物的压力或振动、或不伴有该液体组合物的振荡、旋转操作等，细胞或组织在该液体组合物中均匀地分散且处于悬浮状态的状态，以该状态保存细胞或组织被称为“悬浮静置保存”。另外，作为“悬浮静置”中能够悬浮的时间，包括5分钟以上(例如，至少5～60分钟)、1小时以上(例如，1小时～24小时)、24小时以上(例如，1天～21天)、48小时以上、7天以上等，但只要保持悬浮状态，就不限定于这些时间。

优选的方式中，本发明的液体组合物能够在可实现细胞、组织的非冷冻状态下的保存的温度范围(例如，0～37℃)内的至少1点进行细胞或组织的悬浮静置。本发明的液体组合物能够在优选为1～30℃的温度范围内的至少1点、更优选为15～30℃的温度范围内的至少1点、进一步优选为22～28℃的温度范围内的至少1点、更进一步优选为24～26℃的温度范围内的至少1点、最优选为至少25℃进行细胞或组织的悬浮静置。

关于是否能够悬浮静置，例如可以通过下述方式进行评价：使作为保存对象的细胞以2×10⁴个细胞/ml的浓度均匀分散在作为评价对象的液体组合物中，向15ml锥形管中注入10ml，在所期望的温度(例如，25℃、37℃)静置至少5分钟以上(例如，1小时以上、24小时以上、48小时以上、7天以上)，观察该细胞的悬浮状态是否得以维持。全部细胞中的70％以上为悬浮状态时，可以得出悬浮状态得以维持的结论。可以代替细胞而换成聚苯乙烯微珠(尺寸为500-600μm，Polysciences Inc.制)进行评价。

本发明的液体组合物含有脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类或其盐。本发明的液体组合物通过含有脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类或其盐，从而能够在维持良好的存活性的同时，将细胞或组织在非冷冻状态下进行保存。优选的方式中，本发明的液体组合物通过含有脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类或其盐，从而具备能在细胞或组织的悬浮状态下保存(优选为悬浮静置保存)的特性(维持细胞、组织的悬浮状态的效果)。

脱酰基结冷胶是以1-3键合的葡萄糖、1-4键合的葡萄糖醛酸、1-4键合的葡萄糖和1-4键合的鼠李糖这4分子糖作为结构单元的直链状的高分子多糖类，是由以下的通式(I)(这里，R₁、R₂均为氢原子，n为2以上的整数)表示的多糖类。但是，R₁可以含有甘油基，R₂可以含有乙酰基，但乙酰基和甘油基的含量优选为10％以下，更优选为1％以下。

[化学式1]

脱酰基结冷胶可通过下述方式来制造：在发酵培养基中培养结冷胶生产微生物，对在菌体外生产的粘膜物进行碱处理，将与1-3键合的葡萄糖残基键合的甘油基和乙酰基进行脱酰基后，进行回收、干燥、粉碎等工序后，制成粉末状。作为纯化方法，例如通过将液-液萃取，分级沉淀，结晶化，基于各种离子交换色谱法、使用Sephadex LH-20等的凝胶过滤色谱法、利用活性炭、硅胶等的吸附色谱法或薄层色谱法的活性物质的吸附解吸处理，或使用反相柱的高效液相色谱法等单独或按任意顺序组合，并反复使用，能够除去杂质而进行纯化。作为结冷胶的生产微生物的例子，对此没有限定，但可举出多沼鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas elodea)和改变了该微生物的基因的微生物。

脱酰基结冷胶也可以使用经磷酸化的脱酰基结冷胶。该磷酸化可以用已知的方法进行。

通式(I)表示的化合物的R₁和/或R₂的羟基置换为C_1-3烷氧基、C_1-3烷基磺酰基、葡萄糖或果糖等单糖残基、蔗糖、乳糖等低聚糖残基、甘氨酸、精氨酸等氨基酸残基等的脱酰基结冷胶的衍生物也可以在本发明中使用。另外，也可以使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)等交联剂将脱酰基结冷胶交联。

作为盐，可举出锂、钠、钾之类的碱金属的盐；钙、钡、镁之类的碱土金属的盐；铝、锌、铜、铁等的盐；铵盐；四乙基铵、四丁基铵、甲基三丁基铵、十六烷基三甲基铵、苄基甲基己基癸基铵、胆碱等季铵盐；与吡啶、三乙胺、二异丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、氨丁三醇、葡甲胺、普鲁卡因、氯普鲁卡因等有机胺形成的盐；与甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸等氨基酸形成的盐等。

脱酰基结冷胶或其盐的重均分子量优选为10000～50000000，更优选为100000～20000000，进一步优选为1000000～10000000。例如，该分子量可以利用基于凝胶渗透色谱法(GPC)的普鲁兰多糖换算进行测定。

作为脱酰基结冷胶或其盐，可以使用市售的制品，例如三晶株式会社制“KELCOGEL(CP Kelco公司的注册商标)CG-LA”、三荣源FII株式会社制“KELCOGEL(CP Kelco公司的注册商标)”等。

作为在二价金属阳离子(例如，钙离子、镁离子、钡离子、铜离子、铁离子、锌离子、锡离子、铅离子等，优选为钙离子)介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类或其盐，可以举出海藻酸、果胶、果胶酸、它们的盐等，优选为海藻酸或其盐。

海藻酸是具有α1-4键合的L-葡萄糖醛酸和β1-4键合的D-甘露糖醛酸这两种糖醛酸进行直链聚合而成的结构的多糖类。

海藻酸或其盐可以由海带和裙带菜所代表的褐藻类对海藻酸所具有的羧基进行离子交换反应而萃取、纯化。由于藻体中的海藻酸与钙离子等多价阳离子形成不溶性的盐，所以通过使其与Na进行离子交换而制成水溶性的海藻酸钠从而向藻体外萃取。进而，向海藻酸钠的水溶液加入酸而使不溶性的海藻酸凝固析出，分离凝固析出的海藻酸，从而能够得到纯化的海藻酸。

作为盐，可举出锂、钠、钾之类的碱金属的盐；钙、钡、镁之类的碱土金属的盐；铝、锌、铜、铁等的盐；铵盐；四乙基铵、四丁基铵、甲基三丁基铵、十六烷基三甲基铵、苄基甲基己基癸基铵、胆碱等季铵盐；与吡啶、三乙胺、二异丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、氨丁三醇、葡甲胺、普鲁卡因、氯普鲁卡因等有机胺形成的盐；与甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸等氨基酸形成的盐等。本发明中，从水中的溶解性的观点考虑，优选使用海藻酸钠。

海藻酸或其盐的重均分子量优选为300～50000000，更优选500～10000000，进一步优选为1000～5000000。例如，该分子量可以利用基于凝胶渗透色谱法(GPC)的普鲁兰多糖换算进行测定。

作为海藻酸或其盐，也可以使用市售的制品，例如以下的制品。

株式会社KIMIKA：

KIMIKAALGIN系列IL-2、IL-6、I-1、I-3、I-5、I-8、ULV-L3、ULV-L5、ULV-1、ULV-3、ULV-5、ULV-20、ULV-L3G、IL-6G、I-1G、I-3G、IL-6M、BL-2、BL-6、B-1、B-3、B-5、B-8、SKAT-ONE、SKAT-ULV

Algitex系列LL、L、M、H

Kikkoman Biochemifa Company：

Duck Algin NSPH2R、NSPHR、NSPMR、NSPLR、NSPLLR

三晶株式会社：

Sukohgin(スコ一ギン)、San Algin(サンアルギン)

北海道三井化学株式会社：

海藻酸低聚糖ALGIN

脱酰基结冷胶、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类可以以由环内或环外异构化生成的互变异构体、几何异构体、互变异构体或几何异构体的混合物、或它们的混合物的形式存在。脱酰基结冷胶及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类不论是否由异构化产生，在具有不对称中心时，都可以以经拆分的光学异构体或以任意的比率含有所述光学异构体的混合物的形式存在。

脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类或其盐介由液体组合物中的金属阳离子(例如，钙离子等二价金属阳离子)聚集，形成三维网络(无定形的结构体)。多糖类介由金属阳离子形成微凝胶是已知的(例如，日本特开2004-129596号公报)，上述无定形的结构体中也包含该微凝胶作为一种形式。关于脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类或其盐介由金属阳离子聚集而得的结构体，可举出薄膜状的结构体作为其一种形式。本发明的液体组合物包含该脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类或其盐介由金属阳离子(例如，钙离子等二价金属阳离子)聚集而形成的三维网络(无定形的结构体)。如果在本发明的液体组合物中使细胞或组织悬浮而进行保存，则液体组合物中悬浮的细胞或组织被该三维网络捕获，不会沉降，因此无需振荡、旋转操作等，就能够在悬浮状态下均匀地分散着地保存(悬浮静置保存)细胞或组织。本发明的液体组合物优选以均匀分散的形式包含上述三维网络(无定形的结构体)。

优选的方式中，上述三维网络(无定形的结构体)的形成实质上不提高本发明的液体组合物的粘度。“实质上不提高液体组合物的粘度”是指液体组合物的粘度不超过8mPa·s。这时的该液体组合物的粘度在25℃时为8mPa·s以下，优选为4mPa·s以下，更优选为2mPa·s以下。

液体组合物的粘度例如可以用后述的实施例中记载的方法进行测定。具体而言，在25℃条件下使用E型粘度计(东机工业株式会社制，TV-22型粘度计，机型：TVE-22L，锥形转子：标准转子1°34’×R24，转速100rpm)进行测定。

本发明的液体组合物可以含有“脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类或其盐”以外的多糖类或其盐。该多糖类优选为具有阴离子性的官能团的酸性多糖类。酸性多糖类只要其结构中具有阴离子性的官能团，就没有特别限制，例如具有糖醛酸(例如，葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸)的多糖类、结构中的一部分具有硫酸基或磷酸基的多糖类、或具有这两者的结构的多糖类，不仅包含天然得到的多糖类，还包含由微生物产生的多糖类、以基因工程学方式产生的多糖类、或使用酶而人工合成的多糖类。更具体而言，可例示透明质酸、天然结冷胶、鼠李糖胶(rhamsan gum)、定优胶(DiutanGum)、黄原胶、角叉菜胶、汉生胶、己糖醛酸、褐藻糖胶、果胶、果胶酸、果胶酯酸、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸类肝素、硫酸角质、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸鼠李聚糖、或它们的盐。

本发明的液体组合物中的脱酰基结冷胶或其盐的浓度(按游离体的脱酰基结冷胶换算)例如为0.002～0.01(w/v)％，优选为0.002～0.009(w/v)％，更优选为0.003～0.009(w/v)％，更进一步优选为0.0033～0.0066(w/v)％。

本发明的液体组合物中的在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐的浓度(游离体换算)例如为0.004～0.1(w/v)％，优选为0.004～0.02(w/v)％，更优选为0.004～0.015(w/v)％，进一步优选为0.005～0.015(w/v)％，更进一步优选为0.0066～0.0133(w/v)％。

从确保使细胞或组织悬浮的充分的作用的观点考虑，脱酰基结冷胶或其盐的浓度优选设为0.002(w/v)％以上、优选0.003(w/v)％以上。另一方面，如果该浓度过高，则悬浮作用增强而细胞回收率降低，或培养基本身的操作性可能降低，因此优选设为0.01(w/v)％以下、优选0.009(w/v)％以下。从确保通过剪切力使维持细胞、组织的悬浮状态的效果迅速消失的特性(维持细胞、组织的悬浮状态的效果相对于剪切力的脆弱性)的观点考虑，在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐的浓度优选设为0.004(w/v)％以上、优选0.005(w/v)％以上。另一方面，如果该浓度过高，则可能会凝胶化，因此，优选设为0.1(w/v)％以下、优选0.02(w/v)％以下、更优选0.015(w/v)％以下。

本发明的液体组合物中所含的脱酰基结冷胶或其盐、与在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐的质量比(游离体换算)，从实现通过剪切力使维持细胞、组织的悬浮状态的效果迅速消失的特性的观点考虑，相对于脱酰基结冷胶或其盐1质量份，在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐设为1质量份以上、优选2质量份以上。一个方式中，相对于脱酰基结冷胶或其盐1质量份，在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐例如设为1～4质量份，优选为1～3质量份，更优选为1～2质量份。

需要说明的是，液体组合物中的化合物浓度可以按下式计算。

浓度[(w/v)％]＝化合物的质量(g)/液体组合物的容量(ml)×100本发明的液体组合物通过以上述的含量含有脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐，从而实现维持保存在非冷冻状态下的细胞或组织的良好的存活性的效果。本发明的液体组合物通过以上述的含量含有脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐，从而实现维持细胞、组织的悬浮状态的效果。

本发明的液体组合物通过以上述的含量含有脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐，还具备因吹吸或过滤器过滤等的剪切力而迅速丧失维持细胞、组织的悬浮状态的效果的特性(维持细胞、组织的悬浮状态的效果相对于剪切力的脆弱性)。

本发明的液体组合物含有脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐介由金属阳离子(例如，钙离子等二价金属阳离子)聚集而形成的三维网络(无定形的结构体)，这产生维持细胞、组织的悬浮状态的效果，但通过含有在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐，三维网络相对于螯合剂或剪切力变得脆弱，介由吹吸、过滤器过滤等的剪切力，可容易的破坏该三维网络，迅速丧失维持细胞、组织的悬浮状态的效果。脱酰基结冷胶具有比较直线性的结构的结构单元，在液体组合物中多个脱酰基结冷胶链发生链束化，从而形成紧凑且稳定的三维网络，因此通过螯合剂、吹吸、过滤器过滤等很难将该三维网络破坏，与此相对，认为如果将由于包含α1-4键合的L-葡萄糖醛酸和β1-4键合的D-甘露糖醛酸这两种糖醛酸而具有较大体积的结构的、在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐添加在液体组合物中，则脱酰基结冷胶的链束化被抑制，从而三维网络相对于吹吸、过滤器过滤等的剪切力变得脆弱，但不受该理论特别约束。

如上述那样，本发明的液体组合物中，脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐介由液体组合物中的金属阳离子(例如，钙离子等二价金属阳离子)聚集而形成三维网络(无定形的结构体)，因此本发明的液体组合物含有金属阳离子、例如二价的金属阳离子(钙离子、镁离子、锌离子、铁离子以及铜离子等)，优选含有钙离子。该金属阳离子例如可以像钙离子和镁离子、钙离子和锌离子、钙离子和铁离子、钙离子和铜离子这样将2种以上组合使用。本领域技术人员可以适当地决定其组合。本发明的液体组合物中的金属阳离子浓度为0.1mM～300mM，优选为0.5mM～100mM，但不限定于这些。

由吹吸、过滤器过滤等的剪切力导致的三维网络的破坏(维持细胞、组织的悬浮状态的特性的丧失)是可逆反应。这是因为被剪切力破坏的三维网络(无定形的结构体)的片段介由金属阳离子(例如，钙离子等二价金属阳离子)再次聚集，由此重新形成三维网络(无定形的结构体)。

本发明的液体组合物优选含有所保存的细胞或组织的培养中使用的培养基(优选液体培养基)。这种情况下，本发明的液体组合物可以通过将所保存的细胞或组织的培养中使用的培养基(优选液体培养基)、脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐混合而制备。

作为培养来自动物(例如，哺乳动物)的细胞或组织时使用的培养基，例如可举出Leibovitz’s L-15培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagles’sMedium；DMEM)、Ham F12培养基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培养基、McCoy5A培养基(McCoy’s 5A medium)、Eagle MEM培养基(Eagle’s Minimum Essential Medium；EMEM)、αMEM培养基(alpha Modified Eagle’s Minimum Essential Medium；αMEM)、MEM培养基(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培养基、Iscove改良的Dulbecco培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM)、MCDB131培养基、威廉培养基E、IPL41培养基、Fischer培养基、NutriStem MSC XF(Biological Industries公司制)、NutriStemhPSC XF(Biological Industries公司制)、StemPro34(Invitrogen公司制)、X-VIVO 10(Cambrex公司制)、X-VIVO 15(Cambrex公司制)、HPGM(Cambrex公司制)、StemSpan H3000(Stemcell Technology公司制)、StemSpanSFEM(Stemcell Technology公司制)、StemlineII(Sigma Aldrich公司制)、QBSF-60(Quality Biological公司制)、StemProhESCSFM(Invitrogen公司制)、mTeSR1或2培养基(Stemcell Technology公司制)、Sf-900II(Invitrogen公司制)、Opti-Pro(Invitrogen公司制)、HFDM-1(NIPRO公司制)、NIPRO EIDF(NIPRO公司制)、BMPro(NIPRO公司制)等。

细胞或组织来自植物时，作为培养基，可举出植物组织培养通常使用的Murashige&Skoog(MS)培养基、Linsmaier&Skoog(LS)培养基、White培养基、Gamborg B5培养基、Niche培养基、Heller培养基、Morel培养基等基础培养基；或在将这些培养基成分校正为最佳浓度的校正培养基(例如，将氨氮浓度减半等)中以适当的浓度添加植物生长素(Auxin)类和根据需要的细胞分裂素(Cytokinin)类等植物生长调节物质(植物激素)而得的培养基。这些培养基中根据需要可以进一步补充酪蛋白降解酶、玉米浆、维生素类等。作为植物生长素类，例如，可举出3-吲哚乙酸(IAA)、3-吲哚酪酸(IBA)、1-萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)等，但不限定于此。植物生长素类例如可以按约0.1～约10ppm的浓度添加到培养基中。作为细胞分裂素类，例如，可举出激动素、苯甲腺嘌呤(BA)、玉米素等，但不限定于此。细胞分裂素类例如可以按约0.1～约10ppm的浓度添加到培养基中。

本领域技术人员根据需要可以自由向上述的培养基中添加钠、钾、钙、镁、磷、氯、各种氨基酸、各种维生素、抗生素、血清、脂肪酸、糖等。培养来自动物的细胞或组织时，本领域技术人员也可以根据目的组合添加一种以上的其他化学成分或生物体成分。作为来自动物的细胞和/或组织的培养基中添加的成分，可举出胎牛血清、人血清、马血清、胰岛素、转铁蛋白、乳铁蛋白、胆固醇、乙醇胺、亚硒酸钠、单硫代甘油、2-巯基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、聚乙二醇、各种维生素、各种氨基酸、琼脂、琼脂糖、胶原蛋白、甲基纤维素、各种细胞因子、各种激素、各种生长因子、各种细胞外基质或各种细胞粘附分子等。作为培养基中添加的细胞因子，例如可举出白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-9(IL-9)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-11(IL-11)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-14(IL-14)、白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-21(IL-21)、干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、单核细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)、flk2/flt3配体(FL)、白血病细胞抑制因子(LIF)、制瘤素M(OM)、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)等，但不限于这些。

作为培养基中添加的激素，可举出褪黑激素、血清素、甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、抗苗勒管激素、脂联素、促肾上腺皮质激素、血管紧张素原以及血管紧张素、抗利尿激素、心房利钠肽、降钙素、胆囊收缩素、促肾上腺皮质激素释放激素、促红细胞生成素、卵泡刺激素、胃泌素、胃促生长素(Ghrelin)、胰高血糖素、促性腺激素释放激素、生长激素释放激素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳素、生长激素、抑制素、胰岛素、胰岛素样生长因子、瘦素、黄体生成素、黑素细胞刺激素、催产素、甲状旁腺激素、催乳素、促胰液素、生长抑素、血小板生成素、促甲状腺激素、促甲状腺激素释放激素、皮质醇、醛固酮、睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、二氢睾酮、雌二醇、雌酮、雌三醇、黄体酮、骨化三醇、骨化二醇、前列腺素、白三烯、前列环素、血栓素、催乳素释放激素、促脂解素、脑利钠肽、神经肽Y、组胺、内皮素、胰多肽、肾素和脑啡肽，但不限于这些。

作为培养基中添加的生长因子，可举出转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)、表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子-1、2、3、4、5、6、7、8或9(FGF-1、2、3、4、5、6、7、8、9)、神经细胞生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、白血病抑制因子(LIF)、蛋白酶连结素I、蛋白酶连结素II、血小板衍生生长因子(PDGF)、胆碱能分化因子(CDF)、趋化因子、Notch配体(Deltal等)、Wnt蛋白、血管生成素样蛋白2、3、5或7(Angpt2、3、5、7)、胰岛素样生长因子(IGF)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)、多效生长因子(Pleiotrophin)等，但不限于这些。

另外，也可以添加通过基因重组技术而人工改变这些细胞因子、生长因子的氨基酸序列而得到的物质。作为其例，可举出IL-6/可溶性IL-6受体复合体或Hyper IL-6(IL-6与可溶性IL-6受体的融合蛋白)等。

作为各种细胞外基质、各种细胞粘附分子的例子，可举出胶原蛋白I～XIX、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白-1～12、巢蛋白、生腱蛋白、血小板反应蛋白、血管性血友病(vonWillebrand)因子、骨桥蛋白、纤维蛋白原、各种弹性蛋白、各种蛋白多糖、各种钙粘蛋白、桥粒糖蛋白(desmocollin)、桥粒芯糖蛋白、各种整合素、E-选择蛋白、P-选择蛋白、L-选择蛋白、免疫球蛋白超家族、基质胶、聚-D-赖氨酸、聚L-赖氨酸、几丁质、壳聚糖、琼脂糖、透明质酸、海藻酸凝胶、各种水凝胶、以及它们的切割片段等。

作为培养基中添加的抗生素的例子，可举出磺胺制剂、青霉素、非奈西林(pheneticillin)、甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、萘夫西林、氨苄青霉素、青霉素、阿莫西林、环青霉素、羧苄青霉素、替卡西林、哌拉西林、阿洛西林、美洛西林、美西林、阿姆地诺西林(Amdinocillin)、头孢菌素及其衍生物、奥索利酸、氨氟哌酸、替马沙星、萘啶酸、吡咯米酸、环丙沙星(Ciprofloxacin)、西诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、罗索沙星、氧氟沙星、依诺沙星、吡哌酸、舒巴坦、克拉维酸、β-溴代青霉烷酸、β-氯代青霉烷酸、6-乙酰基亚甲基-青霉烷酸、头孢恶唑、Sultampicillin、Adinocillin以及舒巴坦的甲醛水合物酯(sulbactam formaldehyde hudrate ester)、他佐巴坦、氨曲南(Aztreonam)、磺酰胺菌素(Sulfazethin)、异磺酰胺菌素(isosulfazethin)、诺卡杀菌素(Nocardicin)、间羧基苯基、苯乙酰氨基膦酸甲酯、氯四环素、土霉素、四环素、地美环素、多西环素、美他环素和米诺环素。

优选的方式中，培养基(优选为液体培养基)含有金属阳离子(例如二价的金属阳离子(钙离子、镁离子、锌离子、铁离子以及铜离子等)，优选为钙离子)。这是因为与液体培养基混合时，脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐介由液体培养基中的金属阳离子(例如，钙离子等二价金属阳离子)聚集而形成三维网络(无定形的结构体)。培养基中的金属阳离子(优选为钙离子)浓度只要是足以使脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐介由该金属阳离子聚集而形成三维网络(无定形的结构体)的浓度，就没有特别限定，例如为0.1mM～300mM，优选为0.5mM～100mM。可以将含有该金属阳离子的液体培养基、与脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐混合，也可以将不含有该金属阳离子的培养基、与脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐混合，之后，将另行制备好的含有该金属阳离子的水溶液添加到混合液中。

就本发明的液体组合物而言，除了上述的组成以外，可含有在细胞、组织的非冷冻状态下的保存时具有延长细胞生命的效果的各种成分。作为该成分，可举出糖类(但不包括多糖类)(例如单糖类(葡萄糖)、二糖类)、抗氧化剂(例如SOD、维生素E、谷胱甘肽、多酚)、亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)、螯合剂(例如EDTA)、糖醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)、甘油等，但不限于这些。一个方式中，本发明的液体组合物含有选自由糖类(但不包括多糖类)(例如单糖类(葡萄糖)、二糖类)、抗氧化剂(例如SOD、维生素E、谷胱甘肽、多酚)、亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)、螯合剂(例如EDTA)、糖醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)、及甘油组成的组中的至少1种化合物。

需要说明的是，本发明的液体组合物通过含有脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐，从而实现维持保存在非冷冻状态下的细胞或组织的良好的存活性的效果，因此可以不含有在细胞、组织的非冷冻状态下的保存时具有延长细胞生命的效果的其他成分。一个方式中，本发明的液体组合物不含有选自由糖类(但不包括多糖类)(例如单糖类(葡萄糖)、二糖类)、抗氧化剂(例如SOD、维生素E、谷胱甘肽、多酚)、亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)、螯合剂(例如EDTA)、糖醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)、及甘油组成的组中的至少1种化合物。

本发明的液体组合物用于在非冷冻状态下保存细胞或组织，因此可以不含有冷冻保护剂。作为冷冻保护剂，可以举出DMSO、甘油、乙二醇、丙二醇、甲醇、二甲基乙酰胺、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、葡聚糖、白蛋白等。一个方式中，本发明的液体组合物不含有选自由DMSO、甘油、乙二醇、丙二醇、甲醇、二甲基乙酰胺、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、葡聚糖、及白蛋白组成的组中的至少1种化合物。

将脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐添加到上述的液体培养基时，首先用适当的溶剂使脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐溶解或分散(将其作为培养基添加剂)。其后，以液体组合物中的最终的脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐的浓度成为如上详述的浓度的方式将该培养基添加剂添加到液体培养基中即可。可以分别制备含有脱酰基结冷胶或其盐的培养基添加剂、和含有在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐的培养基添加剂，分别添加到液体培养基中，或者可以制备含有脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐这两者的培养基添加剂(即，脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐的混合物)，将其添加到液体培养基中。优选制备含有脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐这两者的培养基添加剂(即，脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐的混合物)，将其添加到液体培养基中。

这里，作为培养基添加剂的制备中使用的适当的溶剂的例子，可举出水、生理盐水、PBS等水性溶剂、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、乙醇、丁醇、丙醇、甘油、丙二醇、丁二醇等各种醇等亲水性溶剂，但不限于这些。这时，优选使培养基添加剂中的脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐的浓度为如上详述的本发明的液体组合物中的最终浓度的例如10～500倍(更优选为25～100倍)左右的浓度。

脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐可以根据需要实施灭菌处理。灭菌方法没有特别限制，例如，可举出放射线灭菌、环氧乙烷气体灭菌、高压蒸气灭菌(高压釜灭菌)、过滤器灭菌等。进行过滤器灭菌(以下，也有时称为过滤灭菌)时的过滤器部分的材质没有特别限制，例如可举出玻璃纤维、尼龙、PES(聚芳醚砜)、亲水性PVDF(聚偏氟乙烯)、纤维素混合酯、乙酸纤维素、聚四氟乙烯等。过滤器的细孔的大小没有特别限制，但优选为0.1μm～10μm，更优选为0.1μm～1μm，最优选为0.1μm～0.5μm。这些灭菌处理可以在脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐为固体的状态下进行，也可以在溶液的状态下进行。

高压蒸气灭菌处理的温度通常为105～135℃，优选为115℃～130℃，更优选为118～123℃(例如为121±1℃)。灭菌处理时的压力通常为0.12～0.32MPa，优选为0.17～0.27MPa，更优选为0.19～0.23MPa(例如，0.21±0.1MPa)。灭菌处理时间通常为1～60分钟，优选为5～45分钟，更优选为15～25分钟(例如，20±1分钟)。

关于高压蒸气灭菌处理条件的组合，

例如为105～135℃、0.12～0.32MPa、1～60分钟；

优选为115℃～130℃、0.17～0.27MPa、5～45分钟；

更优选为118～123℃(例如为121±1℃)、0.19～0.23MPa(例如为0.21±0.1MPa)、15～25分钟(例如为20±1分钟)。

通过将脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐的溶液或分散液添加到液体培养基中，从而在液体培养基中，脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐介由金属阳离子(例如，钙离子等二价金属阳离子)聚集而形成三维网络(无定形的结构体)，能够得到本发明的液体组合物。培养基中通常包含浓度足以使脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐聚集而形成三维网络(无定形的结构体)的金属阳离子(例如，钙离子)，因而仅通过将脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐的溶液或分散液添加到液体培养基中，就能够得到本发明的液体组合物。或者，可以在本发明的培养基添加剂(脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐的溶液或分散液)中添加培养基。并且，本发明的液体组合物也可以将脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐与培养基成分(粉末培养基或浓缩培养基)在水性溶剂(例如包含离子交换水、超纯水等的水)中混合进行制备。作为混合的方式，可举出(1)将液体培养基和培养基添加剂(溶液)混合；(2)在液体培养基中添加脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐的固体(粉末等)；(3)在培养基添加剂(溶液)中混合粉末培养基；(4)将粉末培养基及脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐的固体(粉末等)与水性溶剂混合，等等，但不限于这些。为了防止液体组合物中的脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐的分布变得不均匀，优选(1)的方式。

将脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐溶解在溶剂(例如水、液体培养基等水性溶剂)中，或者，将脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐、以及粉末培养基溶解在溶剂中时，为了促进溶解，可以加热该混合液。作为加热的温度，例如可举出80℃～130℃，优选加热灭菌这样的100℃～125℃(例如，121℃)。加热后，将得到的脱酰基结冷胶或其盐及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐的溶液冷却至室温。通过向该溶液中添加上述的金属阳离子(例如，钙离子等二价金属阳离子)(例如，通过将该溶液添加到液体培养基中)，脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐介由金属阳离子(例如，钙离子等二价金属阳离子)聚集而形成三维网络(无定形的结构体)，能够得到本发明的液体组合物。或者，将脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐溶解在含有上述的金属阳离子(例如，钙离子等2价金属阳离子)的溶剂(例如，水、液体培养基等水性溶剂)中时，通过加热(例如80℃～130℃，优选100℃～125℃(例如，121℃))并将得到的溶液冷却至室温，脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐也会介由金属阳离子(例如，钙离子等二价金属阳离子)聚集而形成三维网络(无定形的结构体)。

需要说明的是，脱酰基结冷胶或其盐具有比较直线性的结构的结构单元，因此添加到溶剂(例如，水)中时，多个糖链发生链束化，因而不易溶解，但如果向其中加入在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐，则由于含有α1-4键合的L-葡萄糖醛酸和β1-4键合的D-甘露糖醛酸这两种糖醛酸而具有较大体积的结构，所以脱酰基结冷胶或其盐的链束化受到抑制，变得比较容易溶解。因此，脱酰基结冷胶或其盐及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐不必加热即能够在较低的温度(例如0～37℃，优选为10～30℃)溶解在溶剂(例如，水、液体培养基等水性溶剂)中。

例示本发明的液体组合物的制造方法，但不受此限定。

将脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐添加到离子交换水或超纯水中。然后，在能够溶解脱酰基结冷胶或其盐及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐的温度(例如，5～60℃，优选为5～40℃，更优选为10～30℃)搅拌使其溶解至呈透明的状态。

溶解后，根据需要在搅拌下放置冷却，进行灭菌(例如，121℃、20分钟的高压釜灭菌、过滤器过滤)。在对任意培养基进行搅拌(例如，均质混合器等)的同时，向该培养基中添加上述灭菌后的水溶液，与该培养基混合均匀。该水溶液与培养基的混合方法没有特别限制，例如可举出吹吸等手动进行的混合；使用磁力搅拌器或机械搅拌器、均质混合器、均化机等设备进行的混合。

为了使脱酰基结冷胶或其盐及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐均匀地分散在液体培养基中，可以例如，向锥形管内加入液体培养基，利用涡旋混合器(Vortex)等维持搅拌状态，从安装有注射针的注射器，将脱酰基结冷胶或其盐及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐的水溶液用力射入到液体培养基中。通过使用培养基制备试剂盒(日产化学工业FCeM^TM-seriesPreparation Kit)，能够容易地制备脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐介由金属阳离子(例如，钙离子等二价金属阳离子)聚集而形成的三维网络(无定形的结构体)均匀分散而成的、本发明的液体组合物。

混合后，可以用过滤器对本发明的液体组合物进行过滤。过滤处理时使用的过滤器的细孔的大小为5μm～100μm，优选为5μm～70μm，更优选为10μm～70μm。

[细胞或组织的保存方法]

本发明还提供细胞或组织的保存方法，其包括在上述本发明的液体组合物中、在非冷冻状态下保存细胞或组织。优选的方式中，本发明的保存方法中，能够在本发明的液体组合物中以悬浮的状态(优选为悬浮静置状态)保存或运输细胞或组织。

作为在本发明的液体组合物中保存的细胞及组织，可以举出上述的[液体组合物]这项中详述的细胞及组织。

对于使用本发明的方法保存的细胞及组织的形态、状态，本领域技术人员可以任意选择。作为所保存的细胞的状态的具体例，可以举出分散至单细胞的状态、细胞粘附在载体表面上的状态、细胞包埋于载体内部的状态、多个细胞聚集而形成细胞团(例如，球体)的状态；或2种以上的细胞聚集而形成细胞团(例如，球体)的状态等，但不限于这些。这些状态中，在形成细胞团(例如，球体)的状态下，接近生物体内环境的细胞-细胞间相互作用和细胞结构体得以再次构建，能够在长期维持细胞功能的状态下进行保存，而且细胞的回收比较容易，因此可以作为用本发明中的方法保存的最优选方式而列举。细胞团优选为包含哺乳动物干细胞(例如，胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎肿瘤细胞、胚胎生殖干细胞、人工诱导多能干细胞(iPS细胞)、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、肌肉干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌症干细胞、毛囊干细胞、癌症干细胞)或祖细胞的球体。作为本发明中的球体，可以举出例如形成由数十个～数百个细胞形成的凝集块。球体可以通过已知的方法制造。

在本发明的液体组合物中保存细胞的情况下，细胞浓度只要能够在维持良好的存活性的同时，在非冷冻状态下进行保存即可，没有特别限定，通常为0.1×10⁴～200×10⁴个/ml，优选为1×10⁴～100×10⁴个/ml。

本发明的保存方法中，将所期望的细胞或组织在分散在本发明的液体组合物中的基础上，装入能够密封的容器。作为该容器，可以举出烧瓶、塑料袋、Teflon(注册商标)袋、管、培养袋等，但不限于这些。在保存中，为了避免内容物的泄漏、来自外界的细菌等的污染，优选密封装有细胞、组织在本发明的液体组合物中的分散物的容器。

如上所述，本发明的液体组合物中，脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐介由金属阳离子(例如，钙离子等二价金属阳离子)聚集而形成了三维网络(无定形的结构体)，如果在本发明的液体组合物中保存细胞或组织，则在液体组合物中悬浮的细胞或组织被该三维网络捕获而不沉降，因此能在使细胞或组织在悬浮状态下均匀地分散地保存(悬浮静置保存)。另一方面，由于含有在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐，该三维网络相对于剪切力是脆弱的，在含有本发明的液体组合物、及细胞或组织的保存制备物中，根据需要加入螯合剂、通过吹吸等施加足以破坏该三维网络的剪切力时，基于该三维网络的使细胞或组织悬浮的特性迅速丧失。因此，在保存开始时，利用吹吸、搅拌等的剪切力而使脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐介由金属阳离子(例如，钙离子等二价金属阳离子)聚集而形成的三维网络(无定形的结构体)破坏，能够迅速地使细胞、组织在本发明的液体组合物中均匀地分散并且悬浮。重要的是，剪切力导致的、三维网络(无定形的结构体)的破坏(维持细胞、组织的悬浮状态的效果的丧失)是可逆反应，如果将得到的细胞、组织的悬浮物静置，随着时间的经过，被破坏的三维网络(无定形的结构体)的片段介由金属阳离子(例如，钙离子等二价金属阳离子)再次聚集，由此重新形成三维网络(无定形的结构体)，再次显示维持细胞、组织的悬浮状态的特性，能够在维持细胞、组织的悬浮状态的情况下进行保存。

就保存时的温度而言，只要可维持细胞或组织的存活则没有特别限定，通常为37℃以下。温度低时能够避免保存中的细胞或组织的存活性的降低，但通常于高于本发明的液体组合物的熔点的温度进行保存，以使得细胞或组织不会冷冻。因此，保存时的温度通常维持为0～37℃，优选为1～30℃，更优选为15～30℃(例如，在15～25℃的常温保存)、进一步优选为22～28℃，更进一步优选为24～26℃(例如，25℃)。

为了实现悬浮静置状态下的、细胞或组织的保存，保存时的温度优选为本发明的液体组合物能实现所保存的细胞或组织的悬浮静置的温度。

对于保存的时间而言，只要是能够在本发明的液体组合物中维持所保存的细胞或组织的存活状态的范围内即可，没有特别限定，通常为1小时以上(例如，12小时以上、24小时(1天)以上、2天以上)。就保存时间的上限而言，只要能够在本发明的液体组合物中维持所保存的细胞或组织的存活状态即可，没有特别限定，通常为28天以内(例如，21天以内、14天以内、7天以内、3天以内)。保存时间可根据保存的目的适当设定。优选在保存或运输期间，细胞或组织在本发明的液体组合物中的悬浮静置状态得以维持。

一个方式中，在伴随振动的环境下将细胞或组织保存于本发明的液体组合物中。作为“伴随振动的环境”，可以举出细胞或组织的运输时段。即，本发明的保存方法也可以理解为：一边在本发明的液体组合物中在非冷冻状态下保存细胞或组织，一边运输所述细胞或组织的方法。

使用本发明的保存方法时，由于能够将细胞、组织保持为悬浮的状态，因此能够避免由于运输中的振动而从平板脱离、沉降而接触的细胞、组织彼此凝集而导致的细胞、组织的损伤，在维持原本的功能的状态下，对细胞、组织进行保存。利用本发明的方法保存球体时，能够将球体保持为悬浮的状态，因此，运输中的振动、振动所导致的球体彼此的凝集得以避免，能够在维持球体的形态的情况下保存球体。

保存的细胞或组织的回收

本发明也提供从通过在本发明的液体组合物中保存细胞或组织而得到的保存制备物中高效地回收该细胞或组织的方法。本发明的回收方法的特征在于对该保存制备物施加剪切力。

如上所述，本发明的液体组合物中，脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐介由金属阳离子(例如，钙离子等二价金属阳离子)聚集而形成三维网络(无定形的结构体)，如果在本发明的液体组合物中保存细胞或组织，则在液体组合物中悬浮的细胞或组织被该三维网络捕获而不沉降，因而能在使细胞或组织以悬浮状态均匀分散的状态下进行保存(悬浮静置保存)。另一方面，该三维网络由于含有在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐而相对于剪切力是脆弱的，在含有本发明的液体组合物、及细胞或组织的、保存制备物中根据需要加入螯合剂，施加足以破坏该三维网络的剪切力时，基于该三维网络的、使细胞或组织悬浮的特性迅速丧失，细胞或组织因重力而容易沉降。在这样的状态下对该保存制备物进行离心分离时，其中含有的细胞或组织容易沉降，通过除去上清液的液体组合物，能够回收该细胞或组织。

对保存制备物施加剪切力的操作只要能够破坏脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐介由金属阳离子(例如，钙离子等二价金属阳离子)聚集而形成的三维网络(无定形的结构体)即可，没有特别限定，例如，可以举出吹吸、过滤器过滤、搅拌、超声波等。

为了对保存制备物施加足够的剪切力，优选使用前端比较细的移液器(前端的内径例如为5mm以下，优选为0.1～3.0mm，更优选为0.5～2.0mm)进行吹吸。

另外，为了能够迅速搅拌保存制备物整体，优选1次吸入和排出保存制备物的体积的例如1％以上、优选10％以上、更优选20％以上、进一步优选30％以上、更进一步优选50％以上。

为了对保存制备物施加足够的剪切力，优选以例如1ml/秒以上、优选2～20ml/秒、更优选5～10ml/秒的流速进行吸入和/或排出的操作。

吹吸的次数只要足以破坏上述三维网络，就没有特别限定，通常连续进行1次以上，优选3次以上，更优选5次以上。吹吸次数越多，上述三维网络越会更可靠地被破坏，因而优选，理论上不存在其上限，但吹吸次数过多时，细胞或组织的存活率降低，因此优选的是，通常为50次以下，优选为20次以下，更优选15次以下。吹吸的次数通常为1～50次，优选为3～20次，更优选为5～15次。

过滤器的细孔的大小(孔径)只要为能够破坏上述三维网络的范围，就没有特别限定，通常为500μm以下，优选为200μm以下，更优选为100μm以下。孔径越小，对保存制备物的剪切力作用越强，越能够更可靠地破坏上述三维网络，但如果过小，则液体组合物很难通过过滤器。因此，过滤器的细孔的大小(孔径)通常为5μm以上，优选为10μm以上，更优选为20μm以上，进一步优选为40μm以上。

过滤器的孔径优选为保存制备物中的细胞或组织能够通过的大小。这里，“细胞或组织能够通过的大小”是在维持存活的状态下能够使细胞或组织通过的大小。例如，不仅是过滤器的孔径比保存的细胞或组织的直径大的情况，保存制备物中的细胞团(例如，球体)、组织从比其直径小的孔径的过滤器中通过、从而在维持存活的状态下被拆分为多个细胞、细胞团(例如，球体)或组织的方式也包含在“细胞或组织能够通过的大小”中。细胞的大小取决于细胞的种类，因此不能一概规定，但只要是直径7.5～20μm左右的一般的细胞，在单细胞的状态下，能够维持良好的存活性而容易地通过20μm以上、优选40μm的孔径的过滤器。因此，从维持细胞或组织的良好的存活性并有效地破坏上述三维网络的观点出发，过滤器的孔径例如为20～200μm，优选为40～100μm的范围内。

作为过滤器的材料，可举出聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺(尼龙)、聚砜、聚丙烯、丙烯酸、聚乳酸、纤维素混合酯、聚碳酸酯、聚酯、玻璃等，没有特别限定。虽然根据材料的不同，极性、带电性、亲水性等性能不同，但这些性能与回收率的相关性弱，使用任意材料的情况下，都可期待良好的回收率。从得到容易性等观点考虑，优选聚酰胺(尼龙)、聚乙烯、聚酯、玻璃等。

这些过滤器可以使用市售品，作为其具体例，可举出Partec公司制CellTrics过滤器(商标)：孔径5μm(型号06-04-004-2323)、10μm(型号06-04-004-2324)、20μm(型号06-04-004-2325)、30μm(型号06-04-004-2326)、50μm(型号06-04-004-2327)、100μm(型号06-04-004-2328)以及150μm(型号06-04-004-2329)、Beckton Dickinson公司制Cell Strainer(商标)：孔径40μm(型号352340)、70μm(型号352350)以及100μm(型号352360)、As One公司制Filcon S(商标)：孔径20μm(型号2-7211-01)、30μm(型号2-7211-02)、50μm(型号2-7211-03)、70μm(型号2-7211-04)、100μm(型号2-7211-05)以及200μm(型号2-7211-06)等。

从过滤器通过的次数可以是1次，但根据需要，可以从过滤器通过多次，由此提高细胞或组织的回收率。从过滤器通过的次数通常为1～10次。

从过滤器通过多次时，可以将使细胞或组织的保存制备物通过1张过滤器并回收所通过的悬浮液的操作进行多次，也可以使细胞或组织的保存制备物通过包含重叠了多张(例如，3～5张)的过滤膜的多重过滤器。从操作效率的观点考虑，使用多重过滤器是有利的。多次通过过滤器时，可以使用相同孔径的多个过滤器，也可以将不同孔径的多个过滤器组合使用。优选将多张(例如，3～5张)相同孔径(例如40～100μm)的过滤器重叠而使用。

作为搅拌操作，可以举出涡旋混合器、反转混合、磁力搅拌器、桨式搅拌器等。涡旋混合器的速度例如为200～3000rpm。

对保存制备物施加剪切力时，可以根据需要向该培养制备物中添加螯合剂。通过添加螯合剂，从液体组合物中含有的上述三维网络除去金属阳离子(优选钙离子、镁离子等二价金属阳离子)，介由该三维网络中的金属阳离子的多糖类(脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐)彼此的结合松开，该三维网络被部分破坏，可期待细胞或组织的回收率提高。

作为螯合剂，只要为能够与钙离子、镁离子等2价金属阳离子(优选钙离子)形成络合物的化合物，就没有特别限定，例如，可以举出柠檬酸或其盐(例如，柠檬酸三钠)；EDTA或其盐(例如，EDTA2Na、EDTA3Na、EDTA4Na等乙二胺四乙酸钠盐)；HEDTA3Na等羟基乙基乙二胺三乙酸盐；EGTA或其盐；戊酸盐(二亚乙基三胺五乙酸酯盐)；植酸；依替膦酸(etidronicacid)等膦酸以及其钠盐等盐类；草酸钠；聚天冬氨酸、聚谷氨酸等聚氨基酸类；多磷酸钠；偏磷酸钠；磷酸；丙氨酸；二羟乙基甘氨酸；葡糖酸；抗坏血酸；琥珀酸；酒石酸等。从提高细胞或组织的回收率的观点考虑，优选柠檬酸或其盐(例如，柠檬酸三钠)或EDTA或其盐(例如，EDTA2Na、EDTA3Na、EDTA4Na等乙二胺四乙酸钠盐)。螯合剂也可以2种以上混合使用。作为螯合剂的组合，没有特别限定，例如，可以举出柠檬酸或其盐(例如，柠檬酸三钠)与EDTA或其盐(例如，EDTA2Na、EDTA3Na、EDTA4Na等乙二胺四乙酸钠盐)的组合。

螯合剂的添加量是能够使介由本发明的液体组合物中含有的上述三维网络中的金属阳离子的多糖类(脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类(例如，海藻酸)或其盐)彼此的结合松开的量。

例如，在柠檬酸或其盐(例如，柠檬酸三钠)的情况下，通常，以刚添加后的终浓度计为0.001w/v％以上，优选为0.005w/v％以上。理论上而言，上限值为柠檬酸或其盐的饱和浓度，但如果浓度过高，则可能会对细胞或组织的存活性有影响，因此通常为0.2w/v％以下，更优选为0.1w/v％以下。

另外，在EDTA或其盐(例如，EDTA2Na、EDTA3Na、EDTA4Na等乙二胺四乙酸钠盐)的情况下，通常，以刚添加后的终浓度计为0.001w/v％以上，优选为0.005w/v％以上。理论上而言，上限值是EDTA或其盐的饱和浓度，但如果浓度过高，则可能会对细胞或组织的存活性有影响，因此通常为0.2w/v％以下，更优选为0.1w/v％以下。

对上述保存制备物添加螯合剂后，为了使螯合剂变得均匀，优选实施对上述的保存制备物施加剪切力的操作从而进行充分搅拌。

上述的前处理工序后，对含有得到的细胞或组织的混合物加以离心分离，使细胞或组织沉淀，除去细胞或组织以外的部分(例如，上清液的本发明的液体组合物)，由此能够最终从细胞或组织的保存制备物中回收细胞或组织。通过离心分离使细胞、组织沉淀的技术是本领域技术人员所已知的，根据细胞、组织的种类，只要是本领域技术人员就能够设定适当的条件。一般以10～400G左右的离心力进行离心分离，由此能够使细胞、组织沉淀，与上清液分离。

如上所述，由吹吸、过滤器过滤等的剪切力导致的维持细胞、组织的悬浮状态的效果的丧失是可逆的反应，因此，优选的是，在上述的前处理工序之后，在重新形成三维网络(无定形的结构体)之前，加以离心分离。例如，上述前处理工序结束后，在60分钟以内、优选30分钟以内、更优选10分钟以内开始离心分离。

以下通过具体阐述本发明的液体组合物的实施例，进一步对本发明进行详细说明，但本发明不限定于这些。

实施例

[试验例1]多糖混合液的制作

向玻璃制培养基瓶中加入1质量份的海藻酸钠(ALG)(KIMIKAALGIN IL-2，株式会社KIMIKA制)及99质量份的纯水，进行高压釜灭菌处理(121℃，20分钟)，由此制作1质量％浓度的ALG水溶液。

同样地制作1质量％浓度的脱酰基结冷胶(DAG)(KELCOGEL CG-LA，三晶株式会社制)水溶液。

将ALG水溶液及DAG水溶液以2∶1(v/v)的比例分取到锥形管中，使用安装有注射针的一次性注射器细心地进行吹吸混合而使其均匀化，制作多糖混合液。

[试验例2]液体组合物的制作

使用了培养基制备试剂盒(日产化学工业FCeM^TM-series Preparation Kit)制作本发明的液体组合物。向锥形管(Sumitomo Bakelite 50mL离心管)中注入规定量的各种培养基，安装属于试剂盒的构成品的接头帽(Adapter cap)。将填充有规定量的试验例1中得到的多糖混合液的一次性注射器的前端部嵌入接头帽的圆筒部而连接，用人力挤压注射器的柱塞，用力地将注射器内的多糖混合液射出至容器内，使其与培养基瞬时地混合，制作本发明的液体组合物。制作的液体组合物示于表1。

[表1]

[分析]液体组合物的粘度测定

测定了试验例2中制备的液体组合物的粘度。作为代表例，使用E型粘度计(东机工业株式会社制，粘度计TVE-22L，标准转子1°34’×R24)，在25℃条件下以转速100rpm对DHb087进行5分钟测定，结果，进行3次测定而得到的值的平均值为2.07mPa·s(第1次为1.95mPa·s，第2次为2.21mPa·s，第3次为2.05mPa·s)。

[试验例3]细胞保存(细胞种类：NHDF)

准备含有正常人新生儿包皮皮肤成纤维细胞(NHDF，仓敷纺织公司制)的152×10⁴个细胞的细胞悬浮液，向4根锥形管中分别注入各38×10⁴个细胞。进行离心分离(300×g，3分钟)除去上清液后，加入表1所示的含有DAG及ALG(合计浓度0.016(w/v)％)的液体组合物(DHb086～DHb090)或作为比较的不含有DAG及ALG的液体组合物(比较例1或比较例2)1.9mL而再次悬浮，制作含有各液体组合物的细胞悬浮液(20×10⁴个细胞/mL)。向各18根1.5mL圆底微管中分别注入上述悬浮液100μL，闭合盖子在25(±1)℃静置保管。在保管开始日、保管后第1天、第4天、第7天、第14天、第21天的每一天分别各取出3根，对细胞中含有的ATP量使用CellTiter-Glo试剂(Promega公司)利用平板读取器T(infiniteM200PRO，Tecan公司制)进行定量。将在保管开始日进行测定而得到的RLU值作为基准(细胞存活率100％)，比较在保管各天数后进行测定而得到的RLU值，算出时间经过后的细胞存活率，由此对细胞保存性进行评价。通过以上的试验进行测定而得到的3次的平均值记于表2。

[表2]

根据表2，未配制多糖组成物的比较例1中存活率减少至3成，而配制有DAG及ALG的液体组合物即DHb086中，在3星期后仍然确认到约7成的存活，DHb090中，在4天后确认到5成的存活。由此确认了配制有DAG及ALG的液体组合物显示细胞保存效果。

[试验例4]细胞保存(细胞种类：NHDF)

准备含有正常人新生儿包皮皮肤成纤维细胞(NHDF，仓敷纺织公司制)的310×10⁴个细胞的细胞悬浮液，向5根锥形管中分别注入各62×10⁴个细胞。进行离心分离(300×g，3分钟)除去上清液后，加入表1所示的含有DAG及ALG(合计浓度0.010、0.013、0.016、0.020(w/v)％)的液体组合物(表1DHb084、DHb085、DHb086、或DHb087)或作为比较的不含有DAG及ALG的液体组合物(比较例1)3.1mL而再次悬浮，制作含有各液体组合物的细胞悬浮液(20×10⁴个细胞/mL)。向96孔U底细胞培养板(Sumitomo Bakelite公司制，MS-309UR)分别注入上述悬浮液各5孔，每孔100μL，各注入6张板，盖上盖子于25(±1)℃静置保管。在保管开始日、保管后第1天、第3天、第7天、第14天、第21天的每一天分别对各5孔的细胞中含有的ATP量使用CellTiter-Glo试剂(Promega公司)利用平板读取器T(infiniteM200PRO，Tecan公司制)进行定量。将在保管开始日进行测定而得到的RLU值作为基准(细胞存活率100％)，比较在保管各天数后进行测定而得到的RLU值，算出时间经过后的细胞存活率，由此对细胞保存性进行评价。通过以上的试验进行测定而得到的5次的平均值记于表3。

[表3]

根据表3，在任一多糖浓度下，经3星期仍显示约7成以上的存活率，确认到配制DAG及ALG的液体组合物的较高的细胞保存效果。

[试验例5]细胞保存(细胞种类：h-MSC)

准备含有来自人骨髓的间充质干细胞(h-MSC，LONZA公司制)的104×10⁴个细胞的细胞悬浮液，向4根锥形管中分别注入26×10⁴个细胞。进行离心分离(300×g，3分钟)除去上清液后，加入表1所示的含有DAG及ALG(合计浓度0.016(w/v)％)的液体组合物(实施例DHb086～DHb090)、或作为比较的不含有DAG及ALG的液体组合物(比较例1至比较例2)1.3mL而再次悬浮，制作含有各液体组合物的细胞悬浮液(20×10⁴个细胞/mL)。向各12根1.5mL圆底微管中分别注入上述悬浮液100μL，闭合盖子在25(±1)℃静置保管。在保管开始日、保管后第3天、第7天的每一天分别各取出3根，对细胞中含有的ATP量使用CellTiter-Glo试剂(Promega公司)利用平板读取器T(infiniteM200PRO，Tecan公司制)进行定量。将在保管开始日进行测定而得到的RLU值作为基准(细胞存活率100％)，比较在保管各天数后进行测定而得到的RLU值，算出时间经过后的细胞存活率，由此对细胞保存性进行评价。通过以上的试验进行测定而得到的3次的平均值记于表4。

[表4]

根据表4，在DHb086中1星期后仍然显示约7成的存活，在DHb090中显示约6成的存活，含有DAG及ALG的液体组合物显示了约2倍的存活率提高，因此，确认了配制DAG及ALG的液体组合物的优异的细胞保存效果。

[试验例6]变更了细胞接种密度及保存温度的细胞保存试验(细胞种类：h-MSC)

准备含有来自人骨髓的间充质干细胞(h-MSC，LONZA公司制)的510×10⁴个细胞的细胞悬浮液17mL，向4根锥形管中分别注入3×10⁴个细胞(0.1mL)、30×10⁴个细胞(1mL)、150×10⁴个细胞(5mL)、300×10⁴个细胞(10mL)。进行离心分离(300×g，3分钟)除去上清液后，加入表1所示的含有DAG及ALG(合计浓度0.016(w/v)％)的液体组合物(DHb086)而再次悬浮，制作各细胞密度的细胞悬浮液(1×10⁴个细胞/mL、10×10⁴个细胞/mL、50×10⁴个细胞/mL、100×10⁴个细胞/mL)。向各24根1.5mL圆底微管中分别注入上述悬浮液100μL，闭合盖子在25(±1)℃或37℃静置保管。在保管开始日、保管后第1天、第3天、第7天的各天分别各取3根，对细胞中含有的ATP量使用CellTiter-Glo试剂(Promega公司)利用平板读取器T(infiniteM200PRO，Tecan公司制)进行定量。将在保管开始日进行测定而得到的RLU值作为基准(细胞存活率100％)，比较在保管各天数后进行测定而得到的RLU值，算出时间经过后的细胞存活率，由此对细胞保存性进行评价。通过以上的试验进行测定而得到的3次的平均值记于表5。

[表5]

根据表5，含有DAG及ALG的液体组合物在25℃的保存试验中，在任一细胞接种密度下均显示了优异的细胞保存性。另一方面，在37℃的保存试验中，存活率显著降低，由此确认了针对常温保存而言的有效性。

[试验例7]球体的保存(细胞种类：h-MSC)

准备含有来自人骨髓的间充质干细胞(h-MSC，LONZA公司制)的32.4×10⁴个细胞的细胞悬浮液，向球体制备用6孔板(Elplasia Spheroid Generators MPc500，KURARAY公司制)的1孔中加入32.4×10⁴个细胞份的细胞悬浮液4ml，在37℃、5％二氧化碳条件下，在含血清的DMEM低葡萄糖培养基中培养3天，由此制备h-MSC的球体。在孔底面开有650个直径500μm的针孔，因此，以每个悬滴状的针孔底面500个细胞的密度进行接种，在各针孔中得到约650个形成的球体。将得到的球体回收至15mL锥形管中，进行离心分离(100×g，1分钟)除去上清液后，加入表1所示的含有DAG及ALG(合计浓度0.020(w/v)％)的液体组合物(DHb087)1.3mL而再次悬浮，制作球体悬浮液(50个/100μL)。向12根1.5mL圆底微管中分别注入上述悬浮液100μL，闭合盖子在25(±1)℃静置保管。在保管开始日、保管后第3天、第5天、第7天的各天分别各取3根，对细胞中含有的ATP量使用CellTiter-Glo试剂(Promega公司)利用平板读取器T(infiniteM200PRO，Tecan公司制)进行定量。将在保管开始日进行测定而得到的RLU值作为基准(细胞存活率100％)，比较在保管各天数后进行测定而得到的RLU值，算出时间经过后的细胞存活率，由此对细胞保存性进行评价。通过以上的试验进行测定而得到的3次的平均值记于表6。另外，静置7天后的球体保存悬浮液的外观及保存前后的球体观察照片示于图1。

[表6]

根据表6，确认到球体在经过5天保存后仍然不死亡而是存活，经过7天后仍然存活80％以上。在比较例1的培养基中保存时，球体彼此凝集，在凝集块的内部发生坏死，因此从试验中排除(未显示数据)。

根据图1，确认了在保存前后，球体的形态得以维持，在保存7天后，仍然在含有DAG及ALG的液体组合物中保持了悬浮状态。

[试验例8]振动环境中的球体保存(细胞种类：h-MSC)

准备含有来自人骨髓的间充质干细胞(h-MSC，LONZA公司制)的64.8×10⁴个细胞的细胞悬浮液，向球体制备用6孔板(Elplasia Spheroid Generators MPc500，KURARAY公司制)的2孔中加入32.4×10⁴个细胞份的细胞悬浮液各4ml，在37℃、5％二氧化碳条件下，在含血清的DMEM低葡萄糖培养基中培养3天，由此制备h-MSC的球体。在孔底面开有650个直径500μm的针孔，因此，以每个悬滴状的针孔底面500个细胞的密度进行接种，在各针孔中得到约650个/孔的形成的球体。将得到的球体按孔分别回收至15mL锥形管中，进行离心分离(100×g，1分钟)除去上清液后，加入表1所示的含有DAG及ALG(合计浓度0.020(w/v)％)的液体组合物(DHb087)或作为比较的不含有DAG及ALG的液体组合物(比较例1)1.3mL而再次悬浮，制作各球体悬浮液(50个/100μL)。向1.5mL圆底微管各12根中分别注入上述悬浮液100μL，闭合盖子在25(±1)℃保管于振动环境(高速振荡机ASCM-1(安装1.5mL用管架，300rpm)，AS ONE CORPORATION制)。在保管开始日、保管后第3天、第7天的各天分别各取3根，对细胞中含有的ATP量使用CellTiter-Glo试剂(Promega公司)利用平板读取器T(infiniteM200PRO，Tecan公司制)进行定量。将在保管开始日进行测定而得到的RLU值作为基准(细胞存活率100％)，比较在保管各天数后进行测定而得到的RLU值，算出时间经过后的细胞存活率，由此对细胞保存性进行评价。通过以上的试验进行测定而得到的3次的平均值记于表7。

[表7]

在所设想的运输时的环境的振动条件下，实施h-MSC球体的保存试验，根据表7，含有DAG及ALG的液体组合物在振动条件下也显示了良好的细胞保存性。比较例1中，由于振动因而略微抑制了球体彼此的凝集，但观察到存活率的降低。

[参考例1]多糖混合液的制作

向玻璃制培养基瓶中加入1质量份或2质量份的海藻酸钠(ALG)(KIMIKAALGIN，株式会社KIMIKA制)及99质量份或98质量份的纯水，进行高压釜灭菌处理(121℃，20分钟)，由此制作1质量％浓度或2质量％浓度的ALG水溶液。

同样地制作1质量％浓度和2质量％浓度的脱酰基结冷胶(DAG)(KELCOGEL CG-LA，三晶株式会社制)水溶液。

将规定量的ALG水溶液和DAG水溶液分取到微管中，使用安装有注射针的一次性注射器细心地进行吹吸混合而使其均匀化，制作多糖混合液。

[参考例2]液体组合物的制作

(1)使用涡旋混合器的液体组合物的制作

向锥形管(Sumitomo Bakelite 15mL、50mL、或225mL离心管)中注入规定量的培养基，在敞开的状态下利用涡旋混合器形成搅拌状态。从向其中填充了规定量的参考例1中得到的多糖混合液安装有注射针(Fuchigami仪器FN5200)的一次性注射器(Terumo制Terumosyringe)，用力将多糖混合液加入到培养基中，由此制作液体组合物。

(2)使用培养基制备试剂盒(日产化学工业FCeM^TM-series Preparation Kit)制备液体组合物

向锥形管(Sumitomo Bakelite 50mL离心管)中注入规定量的培养基，安装属于试剂盒的构成品的接头帽(Adapter cap)。将填充有规定量的参考例1中得到的多糖混合液的一次性注射器的前端部嵌入接头帽的圆筒部而连接，用人力挤压注射器的柱塞，用力地将注射器内的多糖混合液射出至容器内，使其与培养基接触，制作液体组合物。

[参考例3]悬浮作用的确认

在参考例2中制作的液体组合物中添加用于模拟再现悬浮的细胞的聚苯乙烯微珠(直径500～600μm，Polysciences Inc.制)并搅拌，搅拌停止10分钟后，目视观察液中的微珠的分散状态进行确认。DAG和ALG介由二价金属阳离子(Ca²⁺等)交联而形成的结构体的充分量在液中适当微细地分散时，微珠也分散在液中而保持悬浮状态。另一方面，该结构体的分散不充分时，微珠也随之沉降。对于微珠的分散状态，将理想分散悬浮的状态表示为○，将分散但一部分沉降的状态表示为△，将全部的微珠均沉降的状态表示为×。

(1)使用DAG和ALG(1∶1)时的悬浮作用

[表8]

(2)使用DAG和ALG(0.5∶1)时的悬浮作用

[表9]

[参考例4]利用吹吸来回收细胞

准备处于对数增殖期的正常人新生儿包皮皮肤成纤维细胞(NHDF，仓敷纺织公司制)共计1800×10⁴个细胞，各注入300×10⁴个细胞。进行离心分离(300×g，3分钟)除去上清液后，加入以各种比例含有DAG和ALG(合计浓度0.015(w/v)％)的液体组合物(表10的实施例C369～C373)30mL，缓慢搅拌，制作细胞悬浮液(10×10⁴个细胞/mL)。向24孔细胞培养板(Sumitomo Bakelite公司制)的每1个孔加入10×10⁴个细胞份的细胞悬浮液各1mL，在37℃、5％二氧化碳条件下培养1周。使用细胞计数器(TC-20，BIO-RAD)测定培养后的细胞悬浮液的细胞浓度后，将该悬浮液移入1.5mL微管中，利用将抽吸·排出容量设定为0.2mL的微量移液器(Thermo Scientific公司制，Clip chip1000μL)进行20次吹吸而使其均匀化。其后进行离心分离(300×g，3分钟)，除去上清液1.1mL，添加0.9mL的含10％胎牛血清的DMEM-LG而再次悬浮后，对细胞中含有的ATP量使用CellTiter-Glo(Promega公司)利用平板读取器(Plate reader)(Tecan公司制)进行定量。将对细胞回收操作前的培养后细胞悬浮液进行测定而得到的RLU值作为基准(细胞回收率100％)，与添加悬浮阻碍剂并进行细胞回收操作时得到的RLU值比较，计算细胞回收率。以上的试验全部实施3次，将其平均值记在表中。

[表10]

[参考例5]吹吸次数的研究

准备处于对数增殖期的正常人新生儿包皮皮肤成纤维细胞(NHDF，仓敷纺织公司制)共计1440×10⁴个细胞，在表10的实施例C371的液体组合物48mL中悬浮，向24孔细胞培养板(Sumitomo Bakelite公司制)每孔注入30×10⁴个细胞(1mL)，在37℃、5％二氧化碳条件下培养3天。使用细胞计数器(TC-20，BIO-RAD)测定培养后的细胞悬浮液的细胞浓度后，将该悬浮液移入1.5mL微管，利用将抽吸·排出容量设定为0.2mL的微量移液器(ThermoScientific公司制，Clip chip 1000μL)进行规定次数的吹吸。其后进行离心分离(300×g，3分钟)，除去上清液1.1mL，添加0.9mL的含10％胎牛血清的DMEM-LG而再次悬浮后，对细胞中含有的ATP量使用CellTiter-Glo(Promega公司)利用平板读取器(Tecan公司制)进行定量，计算细胞回收率。以上的试验全部实施5次，将其平均值记于表中。

[表11]

吹吸次数	3	5	10	15	20
						细胞回收率％	44.2	69.9	70.6	68.3	75.9

[参考例6]螯合剂的添加

准备处于对数增殖期的正常人新生儿包皮皮肤成纤维细胞(NHDF，仓敷纺织公司制)共计450×10⁴个细胞，在表10的实施例C371的液体组合物15mL中悬浮，向24孔细胞培养板(Sumitomo Bakelite公司制)每孔注入30×10⁴个细胞(1mL)，在37℃、5％二氧化碳条件下培养3天。使用细胞计数器(TC-20，BIO-RAD)测定培养后的细胞悬浮液的细胞浓度后，将该悬浮液移入1.5mL微管，加入规定量的螯合剂(EDTA-2Na 0.033(w/v)％与柠檬酸钠0.007(w/v)％的混合水溶液)0～0.1mL，利用将抽吸·排出容量设定为0.2mL的微量移液器(Thermo Scientific公司制，Clip chip1000μL)进行0或10次吹吸。其后进行离心分离(300×g，3分钟)，除去上清液1.1mL，添加0.9mL的含10％胎牛血清的DMEM-LG而再次悬浮后，对细胞中含有的ATP量使用CellTiter-Glo(Promega公司)利用平板读取器(Tecan公司制)进行定量，计算细胞回收率。以上的试验全部实施3次，将其平均值记载于表中。

[表12]

吹吸次数	0	10	10	10
					螯合剂添加量mL	0	0	0.05	0.1
细胞回收率％	6.1	91.3	89.1	89.6

[试验例7]Jurkat细胞增殖

准备处于对数增殖期的来自人T细胞白血病的细胞(Jurkat E6.1，DS PharmaBiomedical株式会社)共计240×10⁴个细胞，每40×10⁴个细胞进行离心分离(300×g，3分钟)，除去上清液后，加入以各种浓度含有DAG和ALG(质量比1∶0.5)的液体组合物(表13的实施例DHb020～DHb023)、和含有DAG而不含ALG的液体组合物(表13的比较例DHb024)8mL，缓慢搅拌，制作细胞悬浮液(5×10⁴个细胞/mL)。向96孔U底细胞培养板(Sumitomo Bakelite公司制，MS-309UR)的每1个孔加入0.5×10⁴个细胞份的细胞悬浮液0.1mL，在37℃、5％二氧化碳条件下培养1或4天。对于培养前后的细胞数，以细胞中含有的ATP量的形式使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega公司，G7571)、利用平板读取器(Tecan公司制，infiniteM200PRO)来进行比较。以上的试验全部实施4次，将其平均值记载于表中。

[表13]

评价的结果显示，使用本发明的液体组合物也实现了与比较例同等的细胞增殖性。

[参考例8]A549细胞增殖

准备处于对数增殖期的人肺泡基底上皮腺癌细胞(A549，DSPharma Biomedical株式会社)共计86.4×10⁴个细胞，进行离心分离(300×g，3分钟)，除去上清液后，加入以各种浓度含有DAG和ALG(质量比1∶0.5)的液体组合物(表14的实施例E041和实施例E045、E047、E048)、以及含有DAG而不含ALG的液体组合物(表14的比较例E049)8mL，缓慢搅拌，制作细胞悬浮液(5×10⁴个细胞/mL)。向96孔U底细胞培养板(Sumitomo Bakelite公司制，MS-309UR)的每1个孔加入0.5×10⁴个细胞份的细胞悬浮液0.1mL，在37℃、5％二氧化碳条件下培养1或4天。对于培养前后的细胞数，以细胞中含有的ATP量的形式使用CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay(Promega公司，G7571)、利用平板读取器(Tecan公司制，infiniteM200PRO)来进行比较。以上的试验全部实施6次，将其平均值记载于表中。

[表14]

评价的结果显示，使用本发明的液体组合物也实现了与比较例同等的细胞增殖性。

[参考例9]10mL规模的细胞回收

向表14的实施例E041的液体组合物200mL中接种A549细胞以使其成为10×10⁴个细胞/mL，在37℃、5％二氧化碳条件下培养2天。培养后，各分取10mL细胞悬浮液，添加1mL螯合剂(EDTA-2Na0.033(w/v)％和柠檬酸钠0.007(w/v)％的混合水溶液)，立即通过细胞滤网(40μm、70μm、100μm、Falcon(R)细胞滤网)并在各种条件下进行离心分离(3分钟)(50×g、100×g、300×g、g：gravity重力加速度)。对于前述的细胞回收操作前后的细胞数，以细胞中含有的ATP量的形式使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega公司，G7571)、利用平板读取器(Tecan公司制，infiniteM200PRO)来进行比较。

[表15]

评价的结果显示，对于本发明的液体组合物而言，即使代替吹吸操作而使其通过筛网(细胞滤网)，也能够实现高的细胞回收率。

产业上的可利用性

通过使用本发明的液体组合物，能够于例如室温等、在非冷冻状态下维持细胞、组织的良好的存活性而使其长期保存。在本发明的液体组合物中保存球体时，可以避免球体彼此的凝集、抑制球体内部的坏死的发生。

这里所说的包括专利、专利申请说明书、科学文献在内的全部出版物中记载的内容在这里通过引用而与明确记载其全部内容同程度地并入本说明书中。

本申请以在日本提出申请的日本特愿2017-173479为基础，其内容全部包含于本说明书中。

Claims (13)

1.液体组合物，其用于在非冷冻状态下保存细胞或组织，所述液体组合物含有脱酰基结冷胶或其盐、及在二价金属阳离子介质中维持无规卷曲状态、且能介由二价金属离子进行交联的酸性多糖类或其盐。

2.如权利要求1所述的液体组合物，其中，所述液体组合物中的脱酰基结冷胶或其盐的浓度以游离体的脱酰基结冷胶换算计为0.002～0.01(w/v)％，所述酸性多糖类或其盐的浓度以游离体换算计为0.004～0.1(w/v)％，所述酸性多糖类或其盐相对于脱酰基结冷胶或其盐的质量比以游离体换算计为1以上。

3.如权利要求1或2所述的液体组合物，其中，所述酸性多糖类为选自由海藻酸、果胶和果胶酸组成的组中的任一种。

4.如权利要求3所述的液体组合物，其中，所述酸性多糖类为海藻酸。

5.如权利要求1～4中任一项所述的液体组合物，其还含有金属阳离子。

6.如权利要求5所述的液体组合物，其中，所述金属阳离子为钙离子。

7.如权利要求1～6中任一项所述的液体组合物，其中，所述酸性多糖类或其盐进行了高压蒸气灭菌处理。

8.细胞或组织的保存方法，其包括在权利要求1～7中任一项所述的液体组合物中、在非冷冻状态下保存细胞或组织。

9.如权利要求8所述的方法，其中，在所述液体组合物中、在悬浮的状态下保存细胞或组织。

10.如权利要求8或9所述的方法，其中，于1℃～30℃保存细胞或组织。

11.如权利要求8～10中任一项所述的方法，其中，在密封的容器内保存细胞或组织。

12.如权利要求8～11中任一项所述的方法，其中，在伴随振动的环境下保存细胞或组织。

13.如权利要求8～12中任一项所述的方法，其中保存球体状态的细胞。

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