CN106591372A

CN106591372A - 延缓人源骨髓间充质干细胞体外培养导致衰老的方法

Info

Publication number: CN106591372A
Application number: CN201611085228.0A
Authority: CN
Inventors: 郭熙志; 李汉骏
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Guo Xizhi
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2036-11-30
Also published as: CN106591372B

Abstract

本发明公开了一种延缓人源骨髓间充质干细胞体外培养导致衰老的方法；通过在人源MSC细胞中提高FOXP1表达水平，来提高MSC的增殖能力，保护MSC的分化能力，延缓MSC的衰老。具体是以慢病毒为载体，转染人源MSC，抗生素筛选阳性MSC克隆并传代扩大培养。与现有技术相比，本发明能有效提升年轻人源MSC的体外扩增能力；能逆转老龄70‑80岁以上人源MSC的衰老症状；能促进MSC的成骨分化潜能；能抑制MSC的成脂分化潜能。

Description

延缓人源骨髓间充质干细胞体外培养导致衰老的方法

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种延缓人源骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养导致衰老的方法。

背景技术

间充质干细胞(MSC)是一种重要的成体干细胞(Caplan，1991)。MSC在身体器官的多个部位，如脐带血都能检测到(Goodwin et al.，2001)，其中骨髓是MSC重要的储藏部位(Fehrer and Lepperdinger，2005；Mendez-Ferret et al.，2010)。骨髓间充质干细胞具有高度的自我更新能力，同时具有向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的能力(Bianco etal.，2008a；Bianco et al.，2008b；Nombela-Arrietaet al.，2011；Pittenger et al.，1999)，参与了骨骼系统的形成和稳态保持。大部分研究将成骨、成脂肪和成软骨的三系分化能力作为定义间充质干细胞的“金标准”(Bianco et al.，2008b)。MSC细胞表面标记包括CD73，CD90和CD105，但不表达CD11b，CD14，CD34，CD45，和HLA-DR。

MSC可以用来移植治疗各种疾病(Ankrum and Karp，2010；Newman et al.，2009；Uccelli et al.，2008)，包括关节损伤(Barry，2003)；心肌缺血(Amado et al.，2005)，成骨发育不全症(Horwitz et al.，2002)，移植免疫排斥(Newman et al.，2009)等。但由于骨髓MSC数量比较少，因此临床应用需要分离MSC进行体外大量扩增和培养。MSC能体外培养传代30代以上(Friedenstein et al.，1987)。MSC体外传代培养过程中，前6-8代细胞相对正常(Khoo et al.，2008)，但长时间传代培养容易导致形态和分化能力发生改变，如MSC传代10-15代后，它仍能保留成骨分化的潜能，但成脂分化能力却丧失了(Digirolamo et al.，1999)。人源MSC的传代培养还会导致增殖潜力的不断下降，端粒长度缩短等衰老症状(Baxter et al.，2004；Digirolamo et al.，1999；Metsand Verdonk，1981)。这些体外培养导致的MSC衰老和增殖潜力下降，限制了MSC的移植和临床治疗应用。另外，老龄人群的MSC，相对于年轻人的骨髓MSC，增殖潜能和分化能力都大幅下降(Stenderup et al.，2003)，这也限制了老龄人群MSC的移植和治疗运用。

通过细胞生物学或遗传学方法，改变MSC细胞当中衰老相关基因的表达水平，可以通过病毒载体，哺乳动物细胞表达质粒等方法转染细胞，在细胞中上调基因表达(Gronthoset al.，2003；Shi et al.，2002；Simonsen et al.，2002)。通过同源重组的遗传方法，在人类基因组AAVS1，Rosa26，CCR5位点插入目标基因cDNA(Sadelain，et al.，2012)。近年，也有通过Cas9/sgRNA介导的方式上调或下调基因的表达水平(Gilbert，et al.，2013)。

现有提高和改善MSC体外培养导致的衰老的方法有如下几种方法：

1.卡路里限制：高糖培养基容易导致MSC培养过程提早分化和衰老，如0.5g/L或者0.25g/L Glucose浓度的培养基，相对于4.5g/L Glucose的高糖培养基，可以提高MSC的存活率，CFU-F克隆形成数量可以提高10-15％(Blazer et al.，2002；Stolzing et al.，2006)。

2.运用血小板裂解物替代小牛血清：传统人源MSC的培养可以用基本培养基DMEM或α MEM，添加小牛血清FBS。但是这些培养基和添加物，容易成为疯牛病传染的介质，而且不同批次FBS的质量不同，给MSC的传代和繁殖造成不稳定的影响。因此，用于临床治疗的MSC，多采用血小板裂解物替代小牛血清(Capelli et al.，2007；Capelli et al.，2015；Riordan et al.，2015)，这样也能提高MSC增殖速度，节省培养的时间和成本。

3.低氧培养：研究表明，1％O₂或5％O₂的低氧环境，相比21％O₂的正常环境，可以有效延缓MSC培养传代过程中的衰老(Jin et al.，2010；Tsai et al.，2011)，减少DNA损伤(Bigot et al.，2015)。在培养基当中添加维生素C和氧化抑制剂NAC，可以提高MSC的增殖潜能(Fehrer et al.，2007；Kashino et al.，2003)。Isothiocyanates，另一种氧化抑制剂，也可以降低MSC的DNA损伤，保护MSC的干细胞属性，延缓MSC的细胞衰老(Zanichellietal.，2012)。在培养箱中补充3％氢气也可以延缓MSC衰老，保护MSC干细胞属性(Kawasakiet al.，2010)。

4.Serum-free media/xeno-free FDA-approved culture medium(SFM/XF)，一种无血清无动物添加物的培养基，据称可以有效促进MSC的体外扩增，保持MSC干细胞属性(Oikonomopoulos et al.，2015)。

5.在MSC当中过表达端粒酶hTERT：在人源MSC当中，通过逆转录病毒过表达端粒酶催化亚基hTERT，可以有效延长MSC的寿命和成骨分化潜能(Gronthos et al.，2003；Shi etal.，2002；Simonsen et al.，2002)。

6.敲低Rb2基因：在MSC当中敲低Rb2基因，会减少传代培养过程中的DNA损伤，提升MSC的增殖潜能(Alessio et al.，2013)。

7.HDAC抑制剂处理：敲除HDAC基因，或运用HDAC抑制剂处理可以适当延缓MSC体外培养过程中的衰老(Jung et al.，2010)。

8.抑制溶血磷脂酸受体：溶血磷脂酸lysophosphatidic acid是合成细胞膜磷脂的重要成分，敲除溶血磷脂酸信号通路，或者药物抑制溶血磷脂酸受体，都可以促进MSC的增殖，延缓MSC的衰老(Kanehira et al.，2012)。

9.雷帕霉素处理：雷帕霉素是PI3/AKT/mTOR信号通路的重要配体，雷帕霉素处理MSC细胞，可以保持MSC的增殖潜力和成骨分化潜能，降低DNA损伤积累，改善免疫调节机制，延缓MSC的衰老(Gharibi et al.，2014；Gu et al.，2016)。

10.添加Fgf2，PDGF-BB，EGF，维生素C：在MSC培养基中添加Fgf2，PDGF-BB，EGF，维生素C等，可以大大刺激MSC的增殖速度和扩大传代数量(Coutu et al.，2011；GharibiandHughes，2012)。在培养基当中添加Fgf4蛋白，可以适当刺激MSC的体外扩增和增殖，但不会影响MSC的成骨或成脂分化能力(Farre et al.，2007)。

然而，上述方法存在如下问题：

1、运用血小板裂解物替代小牛血清，会影响MSC的免疫抑制能力，会导致MSC传代和增殖过程中的自发分化(Oikonomopoulos et al.，2015)。

2、低氧培养，1％O₂的培养条件，普通实验室为21％O₂浓度，不容易控制和实现目标条件。

3、卡路里限制，Fgf4蛋白添加，无血清培养基等方法，对MSC的体外扩增有所帮助，但对延缓MSC的衰老和分化潜力，没有明显的益处。

4、在MSC当中过表达端粒酶hTERT，容易导致MSC在长期培养过程中癌变和自发成骨分化(Gronthos et al.，2003；Simonsen et al.，2002)。

5、在MSC当中敲低Rb2基因，会影响MSC的分化潜能，其成骨，成软骨分化能力下降(Alessio et al.，2013)。

6、培养基添加Fgf2，PDGF-BB，EGF，维生素C等成分，费用比较贵，而且长期传代培养，会导致MSC丧失成骨或成脂的分化潜能(Coutu et al.，2011；Gharibi and Hughes，2012)。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种延缓人源骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养导致衰老的方法。具体来说，通过在衰老MSC细胞中上调Foxp1蛋白的表达，抑制细胞周期抑制因子p16的表达，促进MSC的增殖和成骨分化潜力，延缓MSC的衰老进程。上调Foxp1蛋白的表达包括：病毒载体介导的FOXP1 cDNA过表达；哺乳动物细胞表达质粒介导的FOXP1 cDNA过表达；通过同源重组的方法，在人类基因组AAVS1，Rosa26，CCR5位点插入FOXP1 cDNA；通过Cas9/sgRNA介导的基因表达激活方式，提高FOXP1表达水平。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种延缓人源骨髓间充质干细胞体外培养导致衰老的方法，在人源MSC细胞中提高FOXP1表达水平。

优选的，以病毒为载体，转染人源MSC，抗生素筛选阳性MSC克隆并传代扩大培养。

优选的，所述病毒为LV、AAV或pMSCV病毒载体。

优选的，具体包括如下步骤：

S1、分离和培养人源骨髓MSC，按1∶3～1∶6比例稀释传代培养；

S2、在人源骨髓MSC传代培养液中加入含FOXP1基因的慢病毒原液，感染；

S3、吸去含病毒的培养基，换成含青霉素、链霉素的MSC培养基，培养，使病毒携带的抗性基因表达；

S4、加入含Puromycin的MSC培养基进行筛选培养；

S5、将感染并在筛选过程中存活的细胞继续消化传代，待扩增至获得稳转细胞株即可。

优选的，步骤S2中，在人源骨髓MSC传代培养液中按MOI为5～20∶1的比例加入含FOXP1的慢病毒原液。

优选的，步骤S2中，人源骨髓MSC传代培养液选用每1毫升含8μg/mL Polybrene、不含任何抗生素的MSC培养基。

优选的，步骤S5中，感染并在筛选过程中存活的细胞按1∶3～1∶6比例继续消化传代。

优选的，在人源MSC细胞中提高FOXP1表达水平包括：用哺乳动物细胞表达质粒载体介导，在人源骨髓MSC中提高FOXP1表达水平，筛选到稳定MSC克隆并传代。

优选的，在人源MSC细胞中提高FOXP1表达水平包括：通过同源重组方法，在人源骨髓MSC的基因组AAVS1，Rosa26，CCR5中的一个或几个位点插入FOXP1 cDNA片段，在人源骨髓MSC中提高FOXP1表达水平，筛选到稳定MSC克隆并传代。

优选的，在人源MSC细胞中提高FOXP1表达水平包括：用Cas9/SgRNA介导的基因表达激活方式，在人源骨髓MSC中提高FOXP1表达水平，筛选到稳定MSC克隆并传代。

本发明主要着重于解决MSC体外传代培养过程中，伴随的衰老和分化潜能下降问题。正常情况下，不同供体来源的MSC在传代5-8代以后会伴随增殖潜能和细胞分裂速度下降，DNA损伤积累，分泌SA-βgal增多，成骨能力下降，成脂能力上升等变化。这些问题不利于MSC的体外大规模扩增和临床注射应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)能有效提升年轻人源MSC的体外扩增能力

2)能逆转老龄70-80岁以上人源MSC的衰老症状

3)能促进MSC的成骨分化潜能

4)能抑制MSC的成脂分化潜能。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为LV-FOXP1转染不同年龄供体来源的MSC细胞，并体外扩增传代示意图；其中，A.27岁男性供体MSC，B.75岁女性供体MSC，C.82岁女性供体MSC，D.74岁男性供体MSC；

图2为MSC当中过表达FOXP1示意图；

图3为LV-FOXP1转染的MSC成骨分化能力、成脂能力示意图；其中，A为MSC细胞成骨细胞诱导后ALP染色，以及成脂细胞诱导后Oil Red染色示意图；B为定量PCR显示成骨标记基因ALP，COL1表达水平和Notch信号基因HEY1，HEYL表达水平的示意图；C为Western blot显示脂肪标记PPARγ和FABP4蛋白的表达水平的示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

Foxp1转录因子在胚胎发育、细胞周期调节、肿瘤生成等过程中起着重要作用。其中，Foxp1参与了胚胎干细胞多能性维持、心肌发育、B细胞和T细胞形成以及脊髓神经元的迁移等过程。Foxp1对人的恶性肿瘤和细胞分化也起着重要作用，同时还是肿瘤抑制因子。

在骨髓MSC细胞当中敲除Foxp1基因，小鼠表现出明显的骨质疏松，成骨分化能力下降，同时骨髓中脂肪细胞的比例显著上升；骨髓MSC自我更新能力下降，p16^INK4a表达水平上升；同时还表现出其他一系列的衰老症状。因此，Foxp1调控间充质干细胞(MSC)的分化和衰老的进程。

因此，本发明主要通过慢病毒(如Lentivirus、腺病毒AAV，逆转录病毒pMSCV等)为载体，转染人源MSC，抗生素筛选阳性MSC克隆并传代扩大培养。具体过程见实施例。

实施例

本实施例涉及一种延缓人源骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养导致衰老的方法；所述方法包括以下步骤：

1)分离和培养人源骨髓MSC

用十毫升无菌真空EDTA抗凝管抽吸骨髓3到5毫升，轻柔混匀，置于冰上保存，样品在离体后6小时内可用于分离MSC。本实施例采用上海生工的人类骨髓淋巴细胞分离试剂盒经过密度梯度离心的方法分离骨髓中的单个核细胞后，采用贴壁培养法分离骨髓MSC。

(1)将骨髓从抗凝管中吸出，用10毫升DMEM+10％FBS培养基重悬，100微米滤网过滤，收集于一新离心管中。

(2)500g离心20分钟收集细胞，弃上清，用5毫升DMEM+10％FBS培养基重悬细胞。

(3)向一个新的无菌15毫升离心管中加入5毫升骨髓淋巴细胞分离液，在分离液之上缓慢加入5毫升重悬的骨髓细胞悬液，注意此步骤中分离液与细胞悬液的体积比为1∶1，细胞悬液必须缓慢加入，避免与淋巴细胞分离液混合。

(4)在20℃的室温环境中，450g离心20分钟。

(5)经过离心后离心管中的液体将会分为四层，从上往下分别是红色的培养基层、白色环状单个核细胞层、淋巴细胞分离液层和暗红色的红细胞层。

(6)小心吸取白色环状细胞层，用10毫升DMEM+10％FBS重悬细胞，500g离心20分钟收集细胞，再用10毫升DMEM+10％FBS重复洗涤细胞一次。

(7)离心收集细胞后，用STEMCELL Technologies的MesenCult^TM ProliferationKit(Human)对人类骨髓MSC进行富集培养，一般一次取样分离的细胞重悬于5毫升培养基里种植在一个T25培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中静置培养。

(8)四到五天后换液，去除未贴壁的悬浮细胞，而后每三到四天换液一次。

(9)待细胞汇合度达到80％时，用0.25％胰酶/EDTA消化细胞，按1：3的比例传代。

2)慢病毒包装与侵染细胞

本实施例涉及的慢病毒(LV-FOXP1和LV-GFP)包装由汉恒生物完成。包装得到的慢病毒按每次侵染细胞所需的量分装好，储存在-80℃冰箱中。慢病毒侵染人类骨髓MSC的过程简单描述如下：

(1)将人类骨髓MSC传代分板于6孔板中(1*10⁵个/孔)，过夜培养待细胞贴壁。

(2)待细胞汇合度达到50％时，将培养基换成1毫升含8μ g/mL Polybrene、不含任何抗生素的MSC培养基，于37℃、5％C02培养箱中孵育半小时。

(3)将病毒从-80℃冰箱中取出，放置于冰上融化。

(4)按MOI(Multiplicity of Infection，感染复数，表示每个细胞理论上分配到的病毒数)约20∶1的比例加入慢病毒原液。

(5)37℃培养箱中培养，小体积感染4小时，4小时过后补加1毫升含8μg/mLPolybrene、不含任何抗生素的MSC培养基，继续感染24小时。

(6)吸去含病毒的培养基，换成含青霉素、链霉素的MSC培养基，培养24小时，使病毒携带的抗性基因表达。

(7)加入含Puromycin的MSC培养基进行筛选培养，对于不同细胞，Puromycin的浓度也需要进行优化，本实施例中对人类骨髓间充质干细胞施加的Puromycin筛选浓度为1μg/mL。

(8)每2到3天换含Puromycin的新鲜筛选培养基一次，筛选5到7天。此时阳性细胞应该已经形成克隆，而阴性细胞应该全都被杀死。

(9)将感染并在筛选过程中存活的细胞按1∶2继续消化传代，待扩增到一定程度后即获得稳转细胞株，此时，继续消化传代，部分细胞继续进行下游实验，部分细胞用于冻存保种。

3)效果验证

如前述，把FOXP1 cDNA克隆进慢病毒载体，同时把GFP克隆做对照。包装好病毒后富集病毒，在培养基当中转染MSC细胞。MSC来源于不同年龄的骨髓供体，包括年轻人27岁男性，老人75岁女性，82岁女性，74岁男性。用抗生素筛选阳性克隆，然后每周传代一次进行扩增。同时对MSC继续细胞计数，进行population doubling统计。结果发现FOXP1过表达，对不同年龄的MSC，无论男性或女性，都能促进MSC的体外扩增(图1)。其中，在74岁男性供体来源的MSC当中过表达FOXP1，可以让MSC细胞恢复到27岁供体相当的扩增水平(图1D)。

不论年轻或老龄供体来源的MSC，传代5代以后，都会表现出自发的衰老症状，如衰老标记基因p16的表达上升。而本发明在74岁供体来源MSC中过表达FOXP1，传代5代以后还能明显抑制p16的表达(图2，MSC当中过表达FOXP1，在传代到第5代时，能显著抑制衰老基因p16的表达)。

衰老的骨髓MSC，一个重要特征就是它的成骨分化能力下降，而成脂分化能力上升。而在LV-FOXP1转染的MSC当中，在成骨分化诱导培养基当中，细胞的成骨分化能力明显提升，而在成脂诱导培养基中，细胞成脂分化能力受到抑制。MSC成骨分化能力可以通过碱性磷酸酶ALP染色，以及Col1，ALP，HEY1，HEYL基因的表达水平变化反映出来(图3A，B)。而MSC成脂分化能力可以通过油红Oil Red染色，以及PPAR_γ和FABP4蛋白的表达水平变化反映出来(图3A，C)。由图3可知，LV-FOXP1转染的MSC成骨分化能力上升，成脂能力下降；定量PCR显示成骨标记基因ALP，COL1表达水平上升，Notch信号基因HEY1，HEYL表达水平下降；Western blot显示脂肪标记PPAR_γ和FABP4蛋白的表达水平下降。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一种延缓人源骨髓间充质干细胞体外培养导致衰老的方法，其特征在于，在人源MSC细胞中提高FOXP1表达水平。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以病毒为载体，转染人源MSC，抗生素筛选阳性MSC克隆并传代扩大培养。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述病毒为LV、AAV或pMSCV病毒载体。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

S4、加入含Puromycin的MSC培养基进行筛选培养；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，在人源骨髓MSC传代培养液中按MOI为5～20∶1的比例加入含FOXP1的慢病毒原液。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，人源骨髓MSC传代培养液选用每1毫升含8μg/mL Polybrene、不含任何抗生素的MSC培养基。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S5中，感染并在筛选过程中存活的细胞按1∶3～1∶6比例继续消化传代。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用哺乳动物细胞表达质粒载体介导，在人源骨髓MSC中提高FOXP1表达水平，筛选到稳定MSC克隆并传代。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过同源重组方法，在人源骨髓MSC的基因组AAVS1，Rosa26，CCR5位点插入FOXP1 cDNA片段，在人源骨髓MSC中提高FOXP1表达水平，筛选到稳定MSC克隆并传代。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用Cas9/SgRNA介导的基因表达激活方式，在人源骨髓MSC中提高FOXP1表达水平，筛选到稳定MSC克隆并传代。