CN112941106A

CN112941106A - 一种通过foxp1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法

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Publication number: CN112941106A
Application number: CN202110275408.XA
Authority: CN
Inventors: 郭熙志; 凌世烽
Original assignee: Ankeli Chongqing Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Ankeli Chongqing Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2021-03-15
Filing date: 2021-03-15
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2041-03-15
Also published as: CN112941106B

Abstract

本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法。包括以下步骤：(1)分离和培养人源脐带间充质干细胞；(2)将质粒、供体DNA、脂质体加入到步骤(1)得到的培养液中进行转染；(3)将步骤(2)转染后的人源脐带间充质干细胞转入含青霉素、链霉素的人源脐带间充质干细胞培养基进行培养；(4)将步骤(3)培养后的人源脐带间充质干细胞进行筛选培养；(5)将步骤(4)培养后的人源脐带间充质干细胞消化传代，待扩增至获得稳传的细胞株即可。与现有技术相比，本发明能明显促进间充质干细胞增殖速度快1倍，延缓其细胞衰老进程达50％的效率。

Description

一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种非造血系统的成体多能干细胞，Friedenstein最早提出MSCs的概念，用于定义一群干细胞，可以在体外形成成纤维细胞克隆聚落(CFU-F)，还能进行成骨细胞，软骨细胞和脂肪细胞三系分化(Friedenstein etal.，1966)。它具有高度的自我更新能力，同时具有向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的能力(Caplan,2017)。大部分研究将成骨、成脂肪和成软骨的三系分化能力作为定义间充质干细胞的“金标准”(Bianco et al.，2008b)。MSC细胞表面标记包括CD73，CD90和CD105，但不表达CD11b，CD14，CD34，CD45，和HLA-DR。

目前，MSCs已经被广泛应用于组织损伤修复，退行性疾病治疗和免疫抑制的研究(Trounson and McDonald,2015)。截止到2020年目前，世界范围内在ClinicalTrials.gov上登记的MSCs相关的临床试验已超过930项，其中国内的超过200项。MSC可以用来移植治疗各种疾病(Ankrum and Karp，2010；Newman et al.，2009；Uccelli et al.，2008)，包括关节损伤(Barry，2003)；心肌缺血(Amado et al.，2005)，成骨发育不全症(Horwitz et al.，2002)，移植免疫排斥(Newman et al.，2009)等。

目前这些MSCs细胞治疗效果并不理想，在临床上广泛应用存在障碍，主要有如下原因：其一，原代的MSCs来源和数量有限，其次依靠传统方法从骨髓，脐带血等组织分离的MSCs，其细胞群体异质性比较大；同时体外扩增容易出现增殖性衰老(replicativesenescence)，移植入体内的MSCs存活时间短(Mao et al.,2019)，不能有效地修复受损的组织(Duffield et al.,2005)。MSC体外传代培养过程中，前6-8代细胞相对正常(Khoo etal.，2008)，但长时间传代培养容易导致形态和分化能力发生改变，如MSC传代10-15代后，它仍能保留成骨分化的潜能，但成脂分化能力却丧失了(Digirolamo et al.，1999)。人源MSC的传代培养还会导致增殖潜力的不断下降，端粒长度缩短等衰老症状(Baxter et al.，2004；Digirolamo et al.，1999；Mets and Verdonk，1981)。这些体外培养导致的MSC衰老和增殖潜力下降，限制了MSC的移植和临床治疗应用。

我们的前期研究发现，FOXP1是一类新型的MSCs抗衰老因子(Li et al.,2017)。FOXP1在MSCs中的表达水平，随衰老进程而下降。FOXP1蛋白可能通过直接抑制p16INK4a的表达，调控MSCs的衰老。在人源脐带间充质干细胞s细胞当中过表达FOXP1基因，能明显促进MSCs自我更新和增殖，延缓其衰老进程。通过细胞生物学或遗传学方法，改变MSC细胞当中衰老相关基因的表达水平，可以通过病毒载体，哺乳动物细胞表达质粒等方法转染细胞。我们根据这些发现，已经申请了专利(201611085228.0)，通过病毒和表达质粒等方式过表达FOXP1，延缓MSCs的衰老。

近年来，以CRISPR/Cas9技术为代表的基因编辑技术在多种疾病的基因治疗中获得巨大的成功(De Ravin et al.,2017；Gori et al.,2015；Karimian et al.,2019；Khosravi et al.,2019；Wang et al.,2020；Xue et al.,2016)。因此，运用CRISPR/Cas9技术，结合我们最新的研究成果，对FOXP1基因进行适当的基因编辑，延缓其衰老进程，获得抗衰老功能强化型的MSCs，增强其抗衰老能力和器官修复能力，具有重大的价值。

现有通过基因编辑和突变延缓和抵御MSC衰老的方法有如下几种：

1)NRF2是调控间充质干细胞衰老的重要抗氧化剂。抑制NRF2的表达可以延缓衰老(Kubben et al.,2016)。去乙酰化酶Sirt6，通过与NRF2相互作用，也调节干细胞的衰老进程(Pan et al.,2016)。通过CRISPR/Cas9突变NRF2蛋白当中被Sirt6调节的部分氨基酸位点，可以获得抗衰老功能强化型MSCs。这些干细胞在体外增殖，体内移植后的存活能力显著增强(Yang et al.,2017)。

2)FOXO3是一个重要的长寿基因。通过基因编辑获得携带FOXO3点突变的人胚胎干细胞ESC，其衍生的血管内皮细胞具有更强的再生能力(Yan et al.,2019)。

3)通过对早衰基因进行编辑。早衰症Hutchinson–Gilford progeria syndrome(HGPS)是由核纤层LaminA蛋白突变导致DNA损伤激活，诱导细胞衰老，导致早衰症(Kudlowet al.,2007)。文献报道，以腺病毒为载体，通过基因编辑的方法，替换和修补病人诱导的iPSCs和它诱导分化的间充质干细胞的衰老(Liu et al.,2011)。

4)通过对MSCs进行重编程，以延缓细胞衰老。OCT4是维持胚胎干细胞属性，诱导多能干细胞(iPSCs)重要蛋白因子，对成熟细胞进行重编程的因子之一。通过慢病毒载体过表达OCT4，可以延缓人源毛囊间充质干细胞的体外衰老(Lu et al.,2019)。或者将重编程因子OSKM(Oct4，Sox2，Klf4，and c-Myc)敲入到人类基因组位点，使得老年人的iPSCs产生的MSCs细胞获得年轻化，延缓细胞衰老(Spitzhorn et al.,2019)。但是在人源间充质干细胞当中，这个方法没有获得预期功能(Gobel et al.,2018)。

5)通过对MSCs甲基化修饰改变，以延缓MSCs衰老。甲基化修饰是许多基因位点在细胞衰老状态下特征。通过慢病毒载体，过表达甲基转移酶(NNT和NMNAT3)，可以延缓人源MSCs的衰老(Son et al.,2016)。

6)MicroRNA处理：通过给MSCs转染过表达，或者敲低系列microRNA，如miR-195，miR-34a，miR-29b-3p，miR-29c-3p，miR-141-3p，miR-10a，miR-1292等，可以一定程度上改善和延缓MSCs衰老。但是单独1-2个miRNA效果不佳，需要组合使用(Zhou et al.,2020)。

7)激活细胞自噬，延缓MSCs衰老。细胞自噬活动下降，是细胞衰老伴随的现象之一。通过敲低AMIP3基因，促进细胞自噬，可以延缓MSCs的衰老(Kim et al.,2019)。

然而，上述方法存在如下问题：1)使用病毒载体，如慢病毒，或者腺病毒载体进行转染细胞，提供供体DNA以便CRISPR/Cas9，进行DNA进行重组。例如对早衰基因HGPS，重编程因子OSKM，甲基转移酶等进行基因过表达，或者突变编辑。这些操作所使用的病毒载体都具有在细胞基因组上进行随机插入的风险，或者在实验过程中给操作人员带来风险。2)传统的基因编辑和突变，采用野生型Cas9基因介导，容易产生脱靶效应和基因变异，给细胞安全带来影响。3)使用microRNA进行细胞转染和处理，单独1-2个miRNA效果不佳，组合使用容易导致脱靶效应。

FOXP1转录因子在胚胎发育、细胞周期调节、肿瘤生成等过程中起着重要作用。其中，FOXP1参与了胚胎干细胞多能性维持、心肌发育、B细胞和T细胞形成以及脊髓神经元的迁移等过程。FOXP1对人的恶性肿瘤和细胞分化也起着重要作用，同时还是肿瘤抑制因子。

在人源脐带间充质干细胞当中敲除FOXP1基因，小鼠表现出明显的骨质疏松，成骨分化能力下降，同时骨髓中脂肪细胞的比例显著上升；人源脐带间充质干细胞自我更新能力下降，p16INK4a表达水平上升；同时还表现出其他一系列的衰老症状。所以，FOXP1调控间充质干细胞(MSC)的分化和衰老的进程。

因此，如何通过基因编辑技术提供一种能提升人源脐带间充质干细胞的体外扩增能力，大幅延缓人源脐带间充质干细胞的衰老症状，增加人源脐带间充质干细胞的体外传代次数的方法，以解决人源脐带间充质干细胞体外传代伴随的衰老和增殖潜能下降问题，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法，本发明主要通过人工染色体episomal为载体携带Cas9n--FOXP1sgRNA，转染人源脐带间充质干细胞，抗生素筛选阳性MSC克隆，并传代扩大培养，鉴定FOXP1点突变细胞聚落。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法，包括以下步骤：

(1)分离和培养人源脐带间充质干细胞；

(2)将含有episomal-Cas9n-FOXP1sgRNA载体的质粒、供体DNA、脂质体，加入到步骤(1)得到的人源脐带间充质干细胞的培养液中进行转染；

(3)将步骤(2)转染后的人源脐带间充质干细胞转入含青霉素、链霉素的人源脐带间充质干细胞培养基进行培养；

(4)将步骤(3)培养后的人源脐带间充质干细胞加入到含Puromycin的人源脐带间充质干细胞培养基进行筛选培养；

(5)将步骤(4)培养后的人源脐带间充质干细胞加入到不含Puromycin的人源脐带间充质干细胞培养基进行消化传代，待扩增至获得稳传的细胞株即可。

优选的，所述步骤(1)中，分离和培养人源脐带间充质干细胞，按1:3～1:6比例稀释传代培养。

优选的，所述步骤(2)中，供体DNA包含有FOXP1基因组位点的T176G、T277G、K393G中至少一个点突变。

优选的，所述步骤(3)中，培养时间为40-60h。

优选的，所述步骤(4)中，培养时间为5-10d。

优选的，所述步骤(5)中，按1:2～1:6比例进行稀释消化传代。

优选的，所述步骤(2)中，先将供体DNA与脂质体按1：2混合后再加入到人源脐带间充质干细胞的培养液中。

优选的，T176G、T277G、K393G点突变的FOXP1-176供体DNA序列如SEQ ID NO.19所示、FOXP1-277供体DNA序列如SEQ ID NO.20所示、FOXP1-393供体DNA序列如SEQ ID NO.21所示。

优选的，所述脂质体为Invitrogene lipo3000或者其类似商品；所述电穿孔缓冲液为Bio-Rad Gene PulserElectroporationBuffer或其类似商品。

优选的，所述步骤(2)中，还可将含有episomal-Cas9n-FOXP1sgRNA载体的质粒、供体DNA、电穿孔缓冲液加入到步骤(1)得到的人源脐带间充质干细胞的培养液中运用电击转染方法进行转染。

优选的，先将供体DNA与电穿孔缓冲液，按1：2-3混合后再加入到人源脐带间充质干细胞的培养液中。

进一步的，所述供体DNA为线性供体DNA，涵盖突变位点左右各约0.5kb。

进一步的，所述步骤(2)中，供体DNA包含有FOXP1基因组位点的第176位的T(苏氨酸)替换为G(甘氨酸)、第277位的T(苏氨酸)替换为G(甘氨酸)、第393位的K(赖氨酸)替换为G(甘氨酸)中至少一个点突变。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：

1、本发明以人工染色体episomal为载体，通过CRISPR/Cas9n技术，对间充质干细胞的FOXP1基因的3个关键氨基酸位点进行编辑和突变，以达到延缓和抵御细胞衰老，提升其治疗疾病潜力的目的。与现有技术相比，本发明能明显促进间充质干细胞增殖速度快1倍，延缓其细胞衰老进程达50％的效率。在利用CRISPR/Cas9基因编辑原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，利用其他Cas9衍生的基因编辑蛋白，如Rad51-Cas9n，PrimeEditing，单碱基编辑器等，这些方法对FOXP1基因组(T176，T277，K393)点突变和编辑，也应视为本发明的保护范围。

2、本发明提供了一种全新的延缓人源间充质干细胞(MSC)衰老的新方法。利用人工染色体载体episomal表达Cas9n和2个FOXP1相关sgRNA，在人源脐带间充质干细胞当中，通过基因编辑高效的在人源FOXP1基因组位点引入如下T176G，T277G，K393G三个点突变，获得分别携带这些点突变的人源间充质干细胞。这些携带不同FOXP1点突变的细胞，都表现出不同的促进其增殖，延缓其衰老的特征。本方法有望为间充质干细胞的工程化改造，提升其临床治疗和器官修复、免疫抑制功能提供技术路线。

3、本方法所使用的人工染色体为载体，避免了其插入和破坏细胞基因组的问题。采用的Cas9n缺刻酶与双sgRNA介导的方式，脱靶效应非常低，细胞的遗传操作很安全。

4、本发明主要着重于解决人源脐带间充质干细胞体外传代伴随的衰老和增殖潜能下降问题。正常情况下，不同供体来源的人源脐带间充质干细胞在传代5-8代以后会伴随增殖潜能和细胞分裂速度下降，DNA损伤积累，分泌SA-βgal增多等变化。这些问题不利于人源脐带间充质干细胞的体外大规模扩增和临床注射应用。

5、本发明能有效提升人源脐带间充质干细胞的体外扩增能力，能大幅延缓人源脐带间充质干细胞的衰老症状，增加人源脐带间充质干细胞的体外传代次数。

6、FOXP1转录因子在胚胎发育、细胞周期调节、肿瘤生成等过程中起着重要作用。其中，FOXP1参与了胚胎干细胞多能性维持、心肌发育、B细胞和T细胞形成以及脊髓神经元的迁移等过程。FOXP1对人的恶性肿瘤和细胞分化也起着重要作用，同时还是肿瘤抑制因子。

在人源脐带间充质干细胞当中敲除FOXP1基因，小鼠表现出明显的骨质疏松，成骨分化能力下降，同时骨髓中脂肪细胞的比例显著上升；人源脐带间充质干细胞自我更新能力下降，p16^INK4a表达水平上升；同时还表现出其他一系列的衰老症状。因此，FOXP1调控间充质干细胞(MSC)的分化和衰老的进程。

因此，本发明主要通过人工染色体episomal为载体携带Cas9n-FOXP1sgRNA，转染人源脐带间充质干细胞，抗生素筛选阳性MSC克隆，并传代扩大培养，鉴定FOXP1点突变细胞聚落。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1中A为：FOXP1(T176G)，B为：FOXP1(K393G)两个突变位点和测序示意图；

图2为携带FOXP1(T176G)，FOXP1(K393G)两个突变位点的MSCs细胞衰老状态评估。发现FOXP1(K393G)细胞P10代后衰老速度降低一半；其中，A为MSCs传代到P10后，进行半乳糖苷酶(SA-βGal)染色；B为统计SA-βGal阳性的MSCs细胞比例；C为传代到P10后，通过p16，p21，p27等细胞周期因子定量PCR，分析细胞衰老状态；D为传代到P15后，通过p16，p21，p27等细胞周期因子定量PCR，分析细胞衰老状态；

图3为通过γ-H2AX和Ki67免疫荧光标记，发现FOXP1(K393G)的MSCs细胞增殖能力上升，DNA损伤累积增加明显降低；

图4为通过细胞计数，发现P15代后FOXP1(T176G)的MSCs细胞增殖速度增加约1倍，FOXP1(K393G)的人源脐带间充质干细胞细胞增殖速度增加约50％；

图5为Episomal-Cas9n-FOXP1sgRNA载体构建方法流程图；

图6为episomal-Cas9n质粒图谱：

图7为gRNA-U6质粒图谱(Xie et al.,2017)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本实施例涉及一种通过FOXP1基因编辑，延缓人源脐带间充质干细胞(MSC)衰老的方法。利用人工染色体episomal-Cas9n载体，串联插入FOXP1基因突变位点附近的2个反向sgRNA；同时PCR制备包含突变位点左右各约500bp同源臂的donor DNA。将episomal-Cas9n-FOXP1sgRNA与donor DNA共同转染人源脐带间充质干细胞，稀释细胞培养并形成单细胞克隆，并经过抗生素筛选后，鉴定携带FOXP1(T176G，T277G，K393G)点突变的人源脐带间充质干细胞。

所述方法包括以下步骤：

1)分离和培养人源脐带间充质干细胞

(1)取出15cm dish(直径为15cm的培养皿)，将胎儿脐带用剪刀剪碎，吸弃培养基，然后将剪碎的胎儿脐带加入到15cm dish中。

(2)每个15cm dish加入15ml DPBS，轻轻晃动后，吸干净液体。

(3)每个15cm dish中加入事先37℃水浴加热的TrypLE 4ml，充分摇匀，使TrypLE铺满整个15cm dish。

(4)将步骤(3)的15cm dish放入37℃，5％CO₂培养箱消化4分钟。

(5)取出15cm dish，加8ml完全培养基(α-MEM+10％FBS+1％双抗(等比例的青霉素和链霉素溶液)+1％谷氨酰胺)终止消化。

(6)用10ml移液管吹打细胞，并将细胞及液体一起转移至50ml离心管。

(7)对步骤(6)的细胞进行计数。

(8)计数完成后将上述50ml离心管放置离心机中，1000rpm，离心5分钟。

(9)离心完毕，取出50ml离心管，吸弃上清，留细胞沉淀。

(10)用1ml完全培养基吹打细胞沉淀，混匀细胞，加完全培养基重悬细胞至每毫升含1x10⁶个细胞。

(11)缓慢加入新的完全培养基19ml。

(12)吸取1ml细胞悬液加入含有19ml完全培养基的15cm dish中，即1x10⁶细胞接种到新的15cm dish中，记做Pn+1(n为传代前代次)。

(13)将步骤(12)得到的15cm dish放入37℃，5％CO₂培养箱培养。隔天换液，以后每三天换液。待细胞长至80％融合时，即可冻存或再次传代。

2)episomal-Cas9n-FOXP1sgRNA载体转染细胞

本实施例涉及的episomal-Cas9n-FOXP1sgRNA载体，和供体DNA，由本人构建，储存在-80℃冰箱中。

载体的构建方法如下：

(1)Episomal-Cas9n-FOXP1sgRNA载体构建方法：

克隆步骤：

1.以sgRNA-U6为载体模板，FOXP1-XX-sgRNA1/sgRNA2为引物，PCR扩增，将扩展产物用Sap1酶切，回收酶切PCR产物。

2.将episomal-Cas9n载体用BspQ1酶切，回收载体片段。然后与上述PCR酶切产物连接，转化鉴定得到episomal-Cas9n-FOXP1sgRNA。

3.测序确认2个sgRNA片段在epiCRISPR-Cas9n质粒当中的插入序列(图5为构建流程图)。

(2)FOXP-donor构建步骤:用高保真Taq酶(FOXP1-176 donor DNA序列如SEQ IDNO.19所示；FOXP1-277 donor DNA序列如SEQ ID NO.20所示；FOXP1-393 Donor DNA序列如SEQ ID NO.21所示)

1.用人类基因组DNA，引物DonorFOXP1-XX-for1/rev1组合，扩增PCR产物400bp

2.用人类基因组DNA，引物Donor FOXP1-XX-for2/rev 2组合，扩增PCR产物400bp

纯化前一轮PCR产物，混合DNA为模板，用引物Donor FOXP1-xx-for1/rev2,扩增PCR产物为850bp。episomal-Cas9n和U6-sgRNA质粒图谱见文献(Xie et al.,2017)。

(3)SgRNA与供体DNA扩增引物如下：

FOXP1-SgRNA引物序列如下(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.18所示)：

foxp1-176-sgrna1:cgctcttcgccggcaggtggctacccagcaggttttagagctagaaatagcaa

foxp1-176-sgrna2:cgctcttctaactctcattttttcttcctgatcggtgtttcgtcctttccac

foxp1-277-sgrna1:cgctcttcgccgctcagtccacactcccaaaagttttagagctagaaatagcaa

foxp1-277-sgrna2:cgctcttctaactaataatgaacccacatgcccggtgtttcgtcctttccac

foxp1-393-sgrna1:cgctcttcgccgtctctccaagtccgcatcgggttttagagctagaaatagcaa

foxp1-393-sgrna2:cgctcttctaactgcagttgaatctggtatcacggtgtttcgtcctttccac

donor-foxp1-176-for1:gagtagttaaaagcttctgc

donor-foxp1-176-rev1:ctgctgaaaagccaactgctggccagccacctgctgttgctgtaa

donor-foxp1-176-for2:ttacagcaacagcaggtggctggccagcagttggcttttcagcag

donor-foxp1-176-rev2:cattctcttactccaagagt

donor-foxp1-277-for1:gtagttcatgttgtcataatag

donor-foxp1-277-rev1:tggactgagagctgtccattgccagaggcatgtgggttcatta

donor-foxp1-277-for2:taatgaacccacatgcctctggcaatggacagctctcagtcca

donor-foxp1-277-rev2:ggagcaatgtagagtaacat

donor-foxp1-393-for1:acttcttcagatctacaccag

donor-foxp1-393-rev1:gagaagcctccgatgcggacccggagagagtgacacttgatac

donor-foxp1-393-for2:gtatcaagtgtcactctctccgggtccgcatcggaggcttctc

Donor-FOXP1-393-Rev2:aggtttcagcatgcttgcatac

FOXP1蛋白，UniProt蛋白数据库序列号：Q9H334(FOXP1_HUMAN),677aa,>sp|Q9H334|FOXP1_HUMAN Forkhead box protein P1 OS＝Homo sapiens OX＝9606GN＝FOXP1PE＝1SV＝1

载体和供体DNA(donor DNA)转染人源脐带间充质干细胞的过程简单描述如下：

(1)将上述步骤1)中得到的人源脐带间充质干细胞传代分板于6孔板中(1*10⁵个/孔)，过夜培养待细胞贴壁。

(2)待细胞汇合度达到50％时，将培养基换成1毫升含8μg/mL Polybrene、不含任何抗生素的MSC培养基，于37℃、5％CO₂培养箱中孵育半小时。

(3)将质粒从-80℃冰箱中取出，放置于冰上融化。

(4)把质粒2μg episomal-Cas9n-FOXP1sgRNA，2μg供体DNA与Invitrogenelipo3000，按1：2混合，转染细胞。或者质粒2μgepisomal-Cas9n-FOXP1sgRNA，2μg供体DNA与Bio-Rad Gene Pulser Electrorporation Buffer混合，按Bio-Rad公司提供的protocol标准进行细胞电击转染。

(5)37℃培养箱中培养，转染4小时过后补加1毫升含8μg/mL Polybrene、不含任何抗生素的MSC培养基，继续感染24小时。

(6)吸去含质粒DNA的培养基，换成含青霉素、链霉素的MSC培养基，培养24小时，使病毒携带的抗性基因表达。

(7)加入含Puromycin的MSC培养基进行筛选培养，本实施例中对人类间充质干细胞施加的Puromycin筛选浓度为1μg/mL。

(8)每2到3天换含Puromycin的新鲜筛选培养基一次，至阳性细胞已经形成克隆，而阴性细胞全都被杀死。

(9)将感染并在筛选过程中存活的细胞按1:2继续消化传代，待扩增到一定程度后即获得稳定细胞克隆聚落，此时，继续消化传代。部分细胞可继续进行下游实验，部分细胞可用于冻存保种。

3)FOXP1点突变MSCs细胞鉴定

对上述步骤2)得到的稳定细胞克隆聚落列举DNA，PCR扩增FOXP1(T176G，T277G，K393G)各个突变位点附近基因组DNA，测序，鉴定基因编辑与突变。

4)MSCs增殖与抗衰老效果验证

如前述，利用episomal-Cas9n-FOXP1sgRNA与供体DNA共同转染人源脐带间充质干细胞，稀释细胞培养并形成单细胞克隆，并经过抗生素筛选后，鉴定分别携带FOXP1(T176G，T277G，K393G)点突变的人源脐带间充质干细胞克隆聚落。然后每周传代一次进行扩增。同时对MSC继续细胞计数，进行population doubling统计。

人源脐带间充质干细胞，传代10代以后，都会表现出自发的衰老症状。例如，细胞衰老相关的半乳糖苷酶(SA-βGal)表达增加，衰老标记基因p16/p21/p27等表达水平升高，而细胞增殖能力下降(Ki67荧光标记)，DNA损伤累积增加明显(γ-H2AX荧光标记)。

在人源脐带间充质干细胞传代到第10-15代以后，FOXP1(T176G)细胞增殖速度相对与对照细胞几乎增加了1倍(图4)，而细胞衰老速度不变(图2，图3)，；FOXP1(K393G)细胞增殖速度增加了约50％，衰老速度下降了一半(图2，图3)。

以上这些数据，充分的证明了FOXP1基因这几个位点的基因编辑，能延缓人源脐带间充质干细胞衰老，促进其体外增殖。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 安可来(重庆)生物医药科技有限公司

<120> 一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgctcttcgc cggcaggtgg ctacccagca ggttttagag ctagaaatag caa 53

<210> 2

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgctcttcta actctcattt tttcttcctg atcggtgttt cgtcctttcc ac 52

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgctcttcgc cgctcagtcc acactcccaa aagttttaga gctagaaata gcaa 54

<210> 4

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgctcttcta actaataatg aacccacatg cccggtgttt cgtcctttcc ac 52

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgctcttcgc cgtctctcca agtccgcatc gggttttaga gctagaaata gcaa 54

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgctcttcta actgcagttg aatctggtat cacggtgttt cgtcctttcc ac 52

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gagtagttaa aagcttctgc 20

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctgctgaaaa gccaactgct ggccagccac ctgctgttgc tgtaa 45

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttacagcaac agcaggtggc tggccagcag ttggcttttc agcag 45

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cattctctta ctccaagagt 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtagttcatg ttgtcataat ag 22

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tggactgaga gctgtccatt gccagaggca tgtgggttca tta 43

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

taatgaaccc acatgcctct ggcaatggac agctctcagt cca 43

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggagcaatgt agagtaacat 20

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

acttcttcag atctacacca g 21

<210> 16

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gagaagcctc cgatgcggac ccggagagag tgacacttga tac 43

<210> 17

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtatcaagtg tcactctctc cgggtccgca tcggaggctt ctc 43

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aggtttcagc atgcttgcat ac 22

<210> 19

<211> 850

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gagtagttaa aagcttctgc cggtgcaggc agggagggag gcaacttgtt cttttacacc 60

tcaaaggttc ggggttcaga ccccttcaga ctagagtgat gcagtcttct ctctagtgtg 120

cataattaaa aatttcaaag tctaaaagtt tacatcttga tgacaaaact cagacctttc 180

aaactggggg gaaagctggc ttgatggacg aattatgtgt ttatgggagc gggcagtaga 240

aagataacac gctcatctcc ccacccctcc tcagaggagg tatgctttgt cccttttaaa 300

ccttgacacg gagccctcca ctgagctcca gtgaccattc tcagcatttg atgatgatgg 360

tgagttttga agtgtccata cttttaacct tccttgggaa gtggccatct cattttttct 420

tcctgatttc ttacagcaac agcaggtggc tggccagcag ttggcttttc agcagcagct 480

tttacagatg cagcagttac agcagcagca cctcctgtct ttgcagcgcc aaggccttct 540

gacaattcag cccgggcagc ctgcccttcc ccttcaacct cttgctcaag gtatgcgttg 600

attttacaga aggcatagct ctgtgaagac tttgggtgga ggtggtgggt tgtctcttgg 660

tatatttgtt aaggacattg tccatcaaaa catgcacata gattctttta agaaaagtgg 720

agtgggataa tgatggaccc atgtagaagg tgaaatgctt gttgatgcca aaatgaagtc 780

tcagggtggt ctgaaggctt agctgtaaca gagcaatccc actgttggac actcttggag 840

taagagaatg 850

<210> 20

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tttgtagttc atgttgtcat aatagtatag ttgaacaaat ttattttgag cccttctttg 60

tgtctaaaac taaggtaaca tctatctact tttcatcaaa attgagaaat aacacttggg 120

atggttagag gcatactgtt gtggcaaagt aactgtgttt tgagtcactt tcacctgagt 180

cttttatgtg cgatgagggc aacttccact cagttgctcg gtaagaggac acacttttta 240

ctaccgcatc tgccgtagtt gggaggggaa aaaaaactgc acacaccgaa aaacccccct 300

aacactaggc tttgtttact gactctttga tttaattgct gtttgaagag gacggaatta 360

gctgttaatt gatttaatta tccaatttgt ttgtttcagg catgattcca acagaactgc 420

agcagctctg gaaagaagtg acaagtgctc atactgcaga agaaaccaca ggcaacaatc 480

acagcagttt ggatctgacc acgacatgtg tctcctcctc tgcaccttcc aagacctcct 540

taataatgaa cccacatgcc tctggcaatg gacagctctc agtccacact cccaaaaggg 600

aaaggtagga accagccact gagatgggtc caaaactgcc tttaacatga gaggggtggg 660

tggccctgcc tcgtcatatc tcagtgatcc ctaattggat ccatgtgact tgaatgtgca 720

tataattact gaggaatgta ttcagtatgg tttgggtgtg aagcatctaa ttattttcac 780

cttttcaaca tggaattagc acttatgtag atctactctc agcttaggaa cccgggcaga 840

agtcgtgtag tttctcattg gatgggttgg atttccaggc ttccaggcct actccttctg 900

ccaagtgctc actccgtaca agctgaattc cttggctgga agtgccttct aagggaatag 960

tagtgtctgc tgtgggcaat tttgaattat ggtttgagaa aacatagaac ttatgttact 1020

ctacattgct ccccttgaag gctgggcgcc 1050

<210> 21

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tctgctggac acttcttcag atctacacca gcgtatccca actggtgtca cctaaaatac 60

tcagcttcac tggtattgct aaggacttct ctccctcttt gaggttgaca aggcctgatg 120

ggcgatcaaa gcctataggt gagacatcac aatgaaataa atgtcttgac tcagggtttc 180

tcacactccc tcaggtaggt aacccctttt tgagcctgta aacacccatg tagcagcctt 240

tggaaaagag accgctgcca gagatatctt acactgcatc ctaagtgaat tcacgcagga 300

ctcaccgtgt gtttcggttc atggtaaaca taccatctac atagaggaag aaacggtgcc 360

cacgcatcct ctgtgttact cctgctagat gtggttcctg ggttgctctg gttttctgaa 420

ggtcttctaa gacgttgttt ttttccttgc agttgaatct ggtatcaagt gtcactctct 480

ccgggtccgc atcggaggct tctccacaga gcttacctca tactccaacg accccaaccg 540

cccccctgac tcccgtcacc caaggcccct ctgtcatcac aaccaccagc atgcacacgg 600

tgggacccat ccgcaggcgg tactcagaca aatacaacgt gcccatttcg tcaggtagat 660

actccacctt ttgcctcacg tagagttgta atctgcaatt cttgtagacc agcccctttt 720

gaaaaagtga taattaatag gacaatgatt cttattcagc agatattgcg cagaaccaag 780

aattttataa gaacgcagaa gttagaccac catttacata tgcatcttta attaggcagg 840

taagtaaata acacagtata tgaaattctg tcagaaggta tatgtgtaca tggatatata 900

ttgatgaagt agatttaaaa accgtttagt atgcaagcat gctgaaacct tttctataag 960

gttttttaaa actgcaatat ataacataat tgcttttgat 1000

Claims

1.一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分离和培养人源脐带间充质干细胞；

(2)将含有episomal-Cas9n-FOXP1sgRNA载体的质粒、供体DNA、脂质体加入到步骤(1)得到的人源脐带间充质干细胞的培养液中进行转染；

2.根据权利要求1所述的一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，分离和培养人源脐带间充质干细胞，按1:3～1:6比例稀释传代培养。

3.根据权利要求1所述的一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，供体DNA包含有FOXP1基因组位点的T176G、T277G、K393G中至少一个点突变。

4.根据权利要求1所述的一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，培养时间为40-60h。

5.根据权利要求1所述的一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，培养时间为5-10d。

6.根据权利要求1所述的一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，按1:2～1:6比例进行稀释消化传代。

7.根据权利要求1所述的一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，先将供体DNA与脂质体混合后再加入到人源脐带间充质干细胞的培养液中。

8.根据权利要求1所述的一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法，其特征在于，T176G、T277G、K393G点突变的FOXP1-176供体DNA序列如SEQ ID NO.19所示、FOXP1-277供体DNA序列如SEQ ID NO.20所示、FOXP1-393供体DNA序列如SEQ ID NO.21所示。

9.根据权利要求1所述的一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，还可将含有episomal-Cas9n-FOXP1sgRNA载体的质粒、供体DNA、电穿孔缓冲液加入到步骤(1)得到的人源脐带间充质干细胞的培养液中运用电击转染方法进行转染。

10.根据权利要求9所述的一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法，其特征在于，先将供体DNA与电穿孔缓冲液，按1：2-3混合后再加入到人源脐带间充质干细胞的培养液中。