CN110872571B - 将人源脂肪干细胞分化成胰岛β细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人源脂肪干细胞分化成胰岛β细胞的方法，包括分离、培养人源脂肪干细胞：在第一培养基中诱导培养2天；在第二培养基中诱导培养3天；在第三培养基中诱导培养2天；本发明所诱导分化的胰岛β细胞存活率高。

Description

将人源脂肪干细胞分化成胰岛β细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种将人源脂肪干细胞分化成胰岛β细胞的方法。
背景技术
脂肪干细胞，近十年成为治疗用干细胞的明星细胞，因其易于取材，体外培养老化率低，低免疫原性，免疫调节能力，多向分化潜能等优势吸引了临床医生和科研工作者的兴趣。糖尿病是由于胰岛β细胞破坏或胰岛素抵抗所致的胰岛素绝对或相对缺乏。补充胰岛素是Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病的传统治疗手段。胰岛素治疗虽能控制症状、延缓或减少并发症的发生，但不能使糖尿病彻底治愈。长期使用胰岛素会产生诸如失明、肾衰、肥胖等严重的并发症以及产生胰岛素抵抗，并且每天注射胰岛素本身也会给患者带来极大的痛苦。采用产生胰岛素的β细胞的替代治疗是与正常生理条件最接近的治疗，既能有效控制血糖，又能防止、逆转并发症。胰腺移植手术复杂，需要终生使用免疫抑制剂，不大容易被早期患者接受；胰岛移植虽然可多次移植，手术并发症及手术风险均降低，但胰岛的供体来源不足。
干细胞具备的增殖能力和分化潜能使其成为胰岛素分泌细胞的潜在来源，还可以解决免疫排斥的难题。胰腺干细胞、胚胎干细胞、骨髓干细胞、脐血干细胞等可定向诱导分化为胰岛β细胞，或使用药物增加胰岛β细胞再生进而发挥治疗糖尿病作用。干细胞治疗糖尿病研究已取得了一定进展，部分实验已纠正糖尿病动物的高血糖状态。但尚需深入研究胰岛的发育和分化机制，从中获得信息用于诱导胚胎干细胞向β细胞分化,程序性、针对性应用诱导因子以取得更高的分化率,获得更健康更成熟的胰岛素分泌细胞。人源脂肪干细胞较其他细胞具有明显的临床优势，故以脂肪干细胞体外诱导为胰岛β细胞进行临床前动物研究，将为人源脂肪干细胞用于临床治疗糖尿病奠定基础。
发明内容
为了解决目前的糖尿病治疗方法产生并发症及胰岛素抵抗的问题，本发明的目的是提供一种人源脂肪干细胞分化成胰岛β细胞的方法，通过从糖尿病患者体内提取脂肪干细胞，诱导分化成胰岛β细胞，再重新移植入糖尿病患者体内来治疗糖尿病，避免了并发症及免疫排斥反应的发生。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种诱导培养基，其特征在于，包括第一培养基、第二培养基和第三培养基，所述第一培养基包含17.5mM-23mM的葡萄糖，10ng/ml-20ng/ml的表皮生长因子，10ng/ml-20ng/ml的碱性成纤维生长因子，所述第二培养基包含10mM-20mM的尼克酰胺，4nM-8nM的激活素A，10nM-20nM的胰高血糖素，10nM-20nM延伸素4，100PM-150PM的肝细胞生长因子，20mM-25mM的葡萄糖，2％-3％的B27细胞培养添加剂，2％-3％的N2细胞培养添加剂，10％-20％的牛血清，所述第三培养基包含10mM-20mM的尼克酰胺，4nM-8nM的激活素A，10nM-20nM的胰高血糖素，10nM-20nM延伸素4，100PM-150PM的肝细胞生长因子，3.5mM-5.5mM的葡萄糖，2％-3％的B27细胞培养添加剂，2％-3％的N2细胞培养添加剂，10％-20％的牛血清，上述的百分数均为体积百分数。
采用上述的诱导培养基，能够显著提高人源脂肪干细胞分化为胰岛β细胞的存活率和分化效率。
本发明的第二方面，提供一种将人源脂肪干细胞分化成胰岛β细胞的方法，采用上述的诱导培养基诱导人源脂肪干细胞分化为胰岛β细胞。
优选的是，所述的方法，包括
分离、培养人源脂肪干细胞：
在包含17.5mM-23mM的葡萄糖，10ng/ml-20ng/ml的表皮生长因子，10ng/ml-20ng/ml的碱性成纤维生长因子的第一培养基中诱导培养2天；
在包含10mM-20mM的尼克酰胺，4nM-8nM的激活素A，10nM-20nM的胰高血糖素，10nM-20nM延伸素4，100PM-150PM的肝细胞生长因子，20mM-25mM的葡萄糖，2％-3％的B27细胞培养添加剂，2％-3％的N2细胞培养添加剂，10％-20％的牛血清的第二培养基中诱导培养3天；
在包含10mM-20mM的尼克酰胺，4nM-8nM的激活素A，10nM-20nM的胰高血糖素，10nM-20nM延伸素4，100PM-150PM的肝细胞生长因子，3.5mM-5.5mM的葡萄糖，2％-3％的B27细胞培养添加剂，2％-3％的N2细胞培养添加剂，10％-20％的牛血清的第三培养基中诱导培养2天，上述的百分数均为体积百分数。
采用上述人源脂肪干细胞分化成胰岛β细胞的方法，诱导时间短，只需7天即可检测到胰岛素(insulin)表达阳性细胞，同时胰岛β细胞的成活率高至60％-80％。
与现有技术相比，本发明实现的有益效果：本发明的诱导培养基不含对细胞造成毒性的物质，如DMSO，所诱导分化的胰岛β细胞存活率高；本发明的诱导培养基将人体脂肪干细胞分化为胰岛β细胞，诱导时间短，诱导7天即可检测到胰岛素(insulin)表达阳性细胞；本发明的诱导培养基诱导产生的胰岛β细胞能够显著降低STZ(链脲佐菌素)诱导的1型糖尿病小鼠的血糖水平。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式来进一步详细说明本发明：
图1所示为人源脂肪干细胞的干细胞相关蛋白标记物的表达情况；
图2所示为人源脂肪干细胞诱导分化情况；(A)为诱导3天后胰岛素表达情况；(B)为诱导7天后胰岛素表达情况；
图3所示为STZ诱导Ⅰ型糖尿病小鼠模型的血糖变化情况；
图4所示为植入胰岛β细胞后，STZ诱导Ⅰ型糖尿病小鼠中血糖随时间变化情况及植入组与未植入组的区别。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入地研究，意外地发现人源脂肪干细胞通过三步诱导可以分化为胰岛β细胞，所使用的诱导培养基生物安全性高，不包括对细胞有毒性的物质，如DMSO等，所诱导产生的胰岛β细胞活性及成活率高。
本文中的延伸素4购自sigma公司，英文名为Extendin4。
诱导培养基包括第一培养基、第二培养基和第三培养基。
第一培养基包含17.5mM-23mM的葡萄糖，10ng/ml-20ng/ml的表皮生长因子，10ng/ml-20ng/ml的碱性成纤维生长因子。
浓度高于17.5mM的葡萄糖，有利于细胞停泊在一个位置生长，增加细胞的黏附度，减少细胞的迁移能力和漂浮可能性。在第一步诱导过程中，细胞受到诱导压力会发生由长梭型到圆型细胞形态的转变，脂肪干细胞容易漂浮。
第二培养基包含10mM-20mM的尼克酰胺，4nM-8nM的激活素A，10nM-20nM的胰高血糖素，10nM-20nM延伸素4，100PM-150PM的肝细胞生长因子，20mM-25mM的葡萄糖，2％-3％的B27细胞培养添加剂，2％-3％的N2细胞培养添加剂，10％-20％的牛血清，上述的百分数均为体积百分数。
在该诱导培养条件下，已发生形态转变的脂肪干细胞持续向功能性胰岛β细胞分化，具备了部分胰岛β细胞前体细胞的属性，能够较少量地分泌胰岛素，但不能充分分泌胰岛素。
第三培养基包含10mM-20mM的尼克酰胺，4nM-8nM的激活素A，10nM-20nM的胰高血糖素，10nM-20nM延伸素4，100PM-150PM的肝细胞生长因子，3.5mM-5.5mM的葡萄糖，2％-3％的B27细胞培养添加剂，2％-3％的N2细胞培养添加剂，10％-20％的牛血清，上述的百分数均为体积百分数。
经过该培养基的进一步诱导，人源脂肪干细胞已初步具备胰岛素分泌能力，但需要体内微环境的激活，方可成为功能性胰岛β细胞，该阶段的细胞仍属于胰岛β细胞前体细胞。
一、人源脂肪干细胞的分离
采用差速贴壁分离方法进行人源脂肪干细胞的分离和后续扩增培养，并应用流式细胞仪及细胞免疫组化方法检测细胞的特性，检测结果如图1。从图1中可知，人源脂肪干细胞呈涡旋样形态生长，表达干细胞相关的标记蛋白Sox2,Oct4，c-Myc和Nanog，同时表达间充质干细胞的表面标记蛋白CD29,CD44,CD105,不表达血液干细胞标记蛋白CD45。
二、人源脂肪干细胞诱导结果分析
实施例1
选取正常培养的人源脂肪干细胞第3-5代，进行铺板培养过夜后，将正常培养基换为第一培养基，进行预诱导2天；之后换为第二培养基，持续三天后，换为第三培养基；继续诱导2天。
其中，第一培养基包含17.5mM的葡萄糖，10ng/ml的表皮生长因子，20ng/ml的碱性成纤维生长因子。
其中，第二培养基包含18mM的尼克酰胺，5nM的激活素A，20nM的胰高血糖素，20nM延伸素4，100PM的肝细胞生长因子，20mM的葡萄糖，2％的B27细胞培养添加剂，3％的N2细胞培养添加剂，10％的牛血清。
其中，第三培养基包含15mM的尼克酰胺，4nM的激活素A，10nM的胰高血糖素，15nM延伸素4，100PM的肝细胞生长因子，3.5mM的葡萄糖，2％的B27细胞培养添加剂，2％的N2细胞培养添加剂，20％的牛血清，上述的百分数均为体积百分数。
实施例2
选取正常培养的人源脂肪干细胞第3-5代，进行铺板培养过夜后，将正常培养基换为第一培养基，进行预诱导2天；之后换为第二培养基，持续三天后，换为第三培养基；继续诱导2天。
其中，第一培养基包含23mM的葡萄糖，15ng/ml的表皮生长因子，15ng/ml的碱性成纤维生长因子。
其中，第二培养基包含10mM的尼克酰胺，8nM的激活素A，15nM的胰高血糖素，15nM延伸素4，120PM的肝细胞生长因子，22mM的葡萄糖，2.5％的B27细胞培养添加剂，2％的N2细胞培养添加剂，15％的牛血清。
其中，第三培养基包含20mM的尼克酰胺，5nM的激活素A，20nM的胰高血糖素，10nM延伸素4，120PM的肝细胞生长因子，5.5mM的葡萄糖，3％的B27细胞培养添加剂，3％的N2细胞培养添加剂，10％的牛血清，上述的百分数均为体积百分数。
实施例3
选取正常培养的人源脂肪干细胞第3-5代，进行铺板培养过夜后，将正常培养基换为第一培养基，进行预诱导2天；之后换为第二培养基，持续三天后，换为第三培养基；继续诱导2天。
其中，第一培养基包含20mM的葡萄糖，20ng/ml的表皮生长因子，10ng/ml的碱性成纤维生长因子。
其中，第二培养基包含20mM的尼克酰胺，4nM的激活素A，10nM的胰高血糖素，10nM延伸素4，150PM的肝细胞生长因子，25mM的葡萄糖，3％的B27细胞培养添加剂，2.2％的N2细胞培养添加剂，20％的牛血清。
其中，第三培养基包含10mM的尼克酰胺，8nM的激活素A，15nM的胰高血糖素，20nM延伸素4，150PM的肝细胞生长因子，4mM的葡萄糖，2.5％的B27细胞培养添加剂，2.2％的N2细胞培养添加剂，15％的牛血清，上述的百分数均为体积百分数。
收集实施例3诱导方法获得的中间体细胞和胰岛β细胞前体细胞进行细胞免疫组化分析，分析结果如图2所示。由图2可知，当人源脂肪干细胞经过3天诱导后，部分细胞形态由长梭形变为盘状，并低表达insulin；当人源脂肪干细胞经过7天诱导后，90％以上的细胞形态完全转变，由长梭形变为圆盘状，与胰岛β细胞或前体细胞高度相似，并高表达insulin。证明诱导后产生的细胞具有表达分泌胰岛素的能力，确定其为胰岛β细胞前体细胞。
三、STZ诱导建立Ⅰ型糖尿病小鼠模型
一次性大剂量腹腔注射STZ(160mg/kg)后的两周内通过尾静脉采血检测空腹血糖水平，结果如图3，其中Ctr为正常小鼠，作为参照组。从图3中可知，STZ诱导的小鼠血糖接近16mg/ml，表明成功地制备了高血糖的1型糖尿病小鼠模型。
四、胰岛β细胞用于治疗高血糖的Ⅰ型糖尿病小鼠
以实施例3诱导的胰岛β细胞为例，进行Ⅰ型糖尿病小鼠治疗效果分析。
选取正常小鼠四组，分别标号为A、B、C、D，其中A组为正常组，不作任何处理，B、C、D采用STZ诱导建立Ⅰ型糖尿病小鼠模型，在STZ诱导前4天，分别对A、B、C、D组进行血糖测定，测定结果如图4，从图4中可知，每只小鼠的血糖浓度值相当；STZ诱导19天后再进行血糖测定，此时A组小鼠的血糖浓度上升较小，B、C、D组的血糖上升非常明显，进一步验证了Ⅰ型糖尿病小鼠模型的建立，此时B组肾包膜下移植人源脂肪干细胞，C组肾包膜下移植实施例3诱导的胰岛β细胞前体细胞，D组肾包膜下移植PBS(磷酸缓冲液)，对B、C组的移植量均为5×105个细胞。移植10天(诱导29天)后A组血糖浓度变化仍然很小，B、C组相对于移植细胞前血糖浓度明显降低，表明人源脂肪干细胞和胰岛β细胞前体细胞均能降低1型糖尿病小鼠的血糖浓度，而胰岛β细胞前体细胞相对于人源脂肪干细胞效果更好；D组相对于移植细胞前血糖浓度未出现明显降低。
故，采用胰岛β细胞前体细胞对1型糖尿病小鼠具有治疗作用。
上述的具体实施方式只是示例性的，是为了更好地使本领域技术人员能够理解本专利，不能理解为是对本专利包括范围的限制；只要是根据本专利所揭示精神的所作的任何等同变更或修饰，均落入本专利包括的范围。

Claims (3)

1.一种诱导培养基，其特征在于，包括第一培养基、第二培养基和第三培养基，所述第一培养基包含17.5mM-23mM的葡萄糖，10ng/ml-20ng/ml的表皮生长因子，10ng/ml-20ng/ml的碱性成纤维生长因子，所述第二培养基包含10mM-20mM的尼克酰胺，4nM-8nM的激活素A，10nM-20nM的胰高血糖素，10nM-20nM延伸素4，100PM-150PM的肝细胞生长因子，20mM-25mM的葡萄糖，2％-3％的B27细胞培养添加剂，2％-3％的N2细胞培养添加剂，10％-20％的牛血清，所述第三培养基包含10mM-20mM的尼克酰胺，4nM-8nM的激活素A，10nM-20nM的胰高血糖素，10nM-20nM延伸素4，100PM-150PM的肝细胞生长因子，3.5mM-5.5mM的葡萄糖，2％-3％的B27细胞培养添加剂，2％-3％的N2细胞培养添加剂，10％-20％的牛血清，上述的百分数均为体积百分数。
2.将人源脂肪干细胞分化成胰岛β细胞的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的诱导培养基诱导人源脂肪干细胞分化为胰岛β细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括
分离、培养人源脂肪干细胞：
在包含17.5mM-23mM的葡萄糖，10ng/ml-20ng/ml的表皮生长因子，10ng/ml-20ng/ml的碱性成纤维生长因子的第一培养基中诱导培养2天；
在包含10mM-20mM的尼克酰胺，4nM-8nM的激活素A，10nM-20nM的胰高血糖素，10nM-20nM延伸素4，100PM-150PM的肝细胞生长因子，20mM-25mM的葡萄糖，2％-3％的B27细胞培养添加剂，2％-3％的N2细胞培养添加剂，10％-20％的牛血清的第二培养基中诱导培养3天；
在包含10mM-20mM的尼克酰胺，4nM-8nM的激活素A，10nM-20nM的胰高血糖素，10nM-20nM延伸素4，100PM-150PM的肝细胞生长因子，3.5mM-5.5mM的葡萄糖，2％-3％的B27细胞培养添加剂，2％-3％的N2细胞培养添加剂，10％-20％的牛血清的第三培养基中诱导培养2天。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101570741A (zh) * 2009-06-15 2009-11-04 浙江大学 胰岛素样分泌细胞的制备法及所用的组合培养基
CN102618491A (zh) * 2012-03-21 2012-08-01 协和干细胞基因工程有限公司 诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液及诱导方法和用途
CN104862268A (zh) * 2015-05-27 2015-08-26 贵州北科泛特尔生物科技有限公司 将人脂肪干细胞分离并诱导成胰岛β细胞的培养基及其使用方法
WO2016138464A9 (en) * 2015-02-27 2017-11-09 Salk Institute For Biological Studies Reprogramming progenitor compositions and methods of use therefore

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101570741A (zh) * 2009-06-15 2009-11-04 浙江大学 胰岛素样分泌细胞的制备法及所用的组合培养基
CN102618491A (zh) * 2012-03-21 2012-08-01 协和干细胞基因工程有限公司 诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液及诱导方法和用途
WO2016138464A9 (en) * 2015-02-27 2017-11-09 Salk Institute For Biological Studies Reprogramming progenitor compositions and methods of use therefore
CN104862268A (zh) * 2015-05-27 2015-08-26 贵州北科泛特尔生物科技有限公司 将人脂肪干细胞分离并诱导成胰岛β细胞的培养基及其使用方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Islet-Like Cell Aggregates Generated from Human Adipose Tissue Derived Stem Cells Ameliorate Experimental Diabetes in Mice;Vikash Chandra et al.,;《PLoS ONE》;20110607;第6卷(第6期);第1-12页 *
体外诱导人脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞分化的实验研究;武晓佳;《中国学位论文全文数据库》;20100919;第8页第1.4.2节，第15页最后一段，第29-30页第2节 *
干细胞分化为胰岛细胞的研究进展;王廷杰等;《中国生物制品学杂志》;20100531;第23卷(第5期);第540页左栏第1段 *
脂肪干细胞诱导分化的现状及前景;赵娜;《中国组织工程研究》;20150205;第19卷(第6期);第969-974页 *

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