CN113493763A - 可应用于基因编辑的小鼠卵巢原代细胞培养基及体外培养方法 - Google Patents
可应用于基因编辑的小鼠卵巢原代细胞培养基及体外培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种可应用于基因编辑的小鼠卵巢原代细胞培养基及体外培养方法。针对现有缺乏一种可用于高效基因编辑的小鼠原代细胞体外培养方法的问题，本发明提供了一种可应用于基因编辑的小鼠卵巢原代细胞培养基，组成包括：BSA存储液，L‑抗坏血酸，胰岛素，转铁蛋白，亚硒酸钠，胎牛血清，表皮细胞生长因子EGF，重组蛋白RSPO1，纤维母细胞生长因子10，N‑乙酰‑L‑半胱氨酸，烟酰胺，人Wnt‑3a蛋白，青霉素和链霉素双抗，DMEM/F‑12(1:1)完全培养基。采用本发明培养基对卵巢原代细胞进行培养，细胞存活率高，得到的细胞能够用于基因编辑，效率高达90％，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种可应用于基因编辑的小鼠卵巢原代细胞培养基及体外培养方法。
背景技术
卵巢是雌性动物的生殖器官，其主要功能是产生卵子和分泌类固醇激素，卵巢上皮和间质由颗粒细胞、卵母细胞、卵泡膜细胞、间质细胞等各类细胞组成。细胞相互作用，协同调控雌性动物甾体激素的合成，相互维持细胞的生存、生长、发育、成熟，保证卵巢正常的生理功能。对卵巢颗粒细胞、卵母细胞、卵泡膜细胞、间质细胞等原代细胞培养技术是研究生殖学的重要方法。
目前，有关卵巢原代细胞的培养技术的研究还较少。专利CN 106701659A公开了一种猪卵巢颗粒细胞原代培养的方法，其包括以下步骤：收集卵巢，抽吸卵泡液，离心收集细胞；重悬细胞，离心收集细胞，使细胞分散，重复此过程23遍；将细胞放于培养箱中培养；培养24h后细胞换液，吸走溶液、未贴壁细胞和卵母细胞，润洗一次，加入新鲜的溶液继续培养，细胞每培养24h换液一次。该方法主要是针对猪卵巢的颗粒细胞培养进行了调整，提高了颗粒细胞的存活率，未必适用于卵巢其他细胞的培养；并且该方法培养的细胞并没有研究细胞冻存后细胞复苏的培养效果，也没有研究是否可进行基因编辑。
目前，还未见有可应用于基因编辑的卵巢细胞的体外培养方法，亟待开发。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：现有缺乏一种可用于高效基因编辑的小鼠原代细胞体外培养方法的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种小鼠卵巢原代细胞培养基，包括以下成分：BSA存储液，L-抗坏血酸，胰岛素，转铁蛋白，亚硒酸钠，胎牛血清，表皮细胞生长因子EGF，重组蛋白RSPO1，纤维母细胞生长因子10，N-乙酰-L-半胱氨酸，烟酰胺，人Wnt-3a蛋白，青霉素和链霉素双抗，DMEM/F-12完全培养基。
其中，上述小鼠卵巢原代细胞培养基中，所述DMEM/F-12完全培养基为DMEM/F-12(1:1)完全培养基。
其中，上述小鼠卵巢原代细胞培养基中，BSA浓度为100～300μg/ml，L-抗坏血酸浓度为20～40μg/ml，胰岛素浓度为0.25～2g/L，转铁蛋白浓度为0.55～1.1g/L，亚硒酸钠浓度为0.0003～0.001g/L，胎牛血清浓度为10～20％，表皮细胞生长因子EGF浓度为20～100ng/ml，重组蛋白RSPO1浓度为150～500ng/ml，纤维母细胞生长因子10浓度为5～30ng/ml，N-乙酰-L-半胱氨酸浓度为0.5～2mM，烟酰铵5-20mmol/L，人Wnt-3a蛋白浓度为10～50ng/ml，青霉素50～100U/ml，链霉素50-100μg/ml，腺苷酸环化酶激活剂0.2～5umol/L，所有试剂于冰浴中，添加至DMEM/F-12完全培养基中，配制成50ml培养基。
本发明还提供了一种小鼠卵巢原代细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：于冰浴中配制DMEM/F-12完全培养基50ml，其中添加BSA，控制浓度为100～300μg/ml；添加L-抗坏血酸，控制浓度为20～40μg/ml；添加胰岛素，控制浓度为0.25～2g/L；添加转铁蛋白，控制浓度为0.55～1.1g/L；添加亚硒酸钠，控制浓度为0.0003～0.001g/L；添加胎牛血清，控制浓度为10％～20％；添加表皮细胞生长因子EGF，控制浓度为20～100ng/ml；添加重组蛋白RSPO1，控制浓度为150～500ng/ml；添加纤维母细胞生长因子10，控制浓度为5～30ng/ml；添加N-乙酰-L-半胱氨酸，控制浓度为0.5～2mM；添加烟酰胺，控制浓度为5～20mmol/L；添加人Wnt-3a蛋白，控制浓度为10～50ng/ml；添加青霉素，控制浓度为50～100U/ml；添加链霉素，控制浓度为50～100μg/ml；添加腺苷酸环化酶激活剂，控制浓度为0.2～5umol/L；配制完成后，于4℃冰箱保存。
本发明还提供了一种小鼠卵巢原代细胞体外培养的方法，包括以下步骤：
a、配制上述小鼠卵巢原代细胞培养基；
b、分离小鼠卵巢组织消化后的原代细胞，置于含有胶原酶的消化液中消化30～60min，过滤，离心，弃上清，采用步骤a的培养基重悬细胞，在37℃、含3～8％CO2条件下培养；
c、待孔内细胞密度到80～90％时，弃培养基，PBS润洗，加入100ul 0.25％的胰蛋白酶-EDTA，于37℃消化2～3分钟；采用完全培养基吹打细胞，再按1:2的比例在37℃、含3～8％CO2条件下进行传代培养。
其中，步骤b所述胶原酶为50mg胶原酶Ⅰ和25mg胶原酶Ⅳ的混合物。
其中，步骤b所述过滤采用100um细胞筛进行过滤。
其中，步骤b所述离心条件为300～800g，0～20℃，5～10min。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种可应用于基因编辑的小鼠卵巢原代细胞培养基以及体外培养方法，通过特别的设计培养基，在培养基中添加了胰岛素，转铁蛋白，亚硒酸钠，表皮细胞生长因子EGF，重组蛋白RSPO1，纤维母细胞生长因子10，N-乙酰-L-半胱氨酸，烟酰胺，人Wnt-3a蛋白等成分，能够促进细胞的生长和存活，体外培养得到的细胞状态好而且存活率较高，细胞冻存后复苏再进行培养效果仍旧很好。并且，采用本发明的体外培养方法，得到的细胞可进行基因编辑，并且感染效率达到90％以上，基因编辑效率较高，效果好。本发明为高效提供可进行基因编辑的小鼠卵巢细胞提供了基础，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1小鼠卵巢原代细胞铺板后2小时细胞开始贴壁状态；
图2培养24小时后的小鼠卵巢原代细胞状态；
图3培养2天的小鼠卵巢原代细胞生长状态；
图4培养3天的小鼠卵巢原代细胞生长状态；
图5培养3天的小鼠卵巢原代细胞局部细胞生长状态-1；
图6培养3天的小鼠卵巢原代细胞局部细胞生长状态-2；
图7培养7天的小鼠卵巢原代细胞生长状态；
图8培养10天的小鼠卵巢原代细胞生长状态；
图9复苏小鼠卵巢原代细胞2小时后的细胞状态；
图10复苏小鼠卵巢原代细胞24小时后的细胞状态；
图11小鼠卵巢原代细胞复苏2天的细胞生长状态；
图12小鼠卵巢原代细胞复苏3天的细胞生长状态；
图13对小鼠卵巢原代细胞基因编辑感染2天的荧光强度；
图14对小鼠卵巢原代细胞基因编辑感染3天的荧光强度；
图15对小鼠卵巢原代细胞基因编辑感染10天的荧光强度；
图16对基因编辑后小鼠卵巢原代细胞目的基因编辑序列扩增。
图17对基因编辑后小鼠卵巢原代细胞全基因PCR产物利用T7核酸内切酶酶切鉴定。
具体实施方式
本发明提供了一种小鼠卵巢原代细胞培养基，包括以下成分：BSA存储液，L-抗坏血酸，胰岛素，转铁蛋白，亚硒酸钠，胎牛血清，表皮细胞生长因子EGF，重组蛋白RSPO1，纤维母细胞生长因子10，N-乙酰-L-半胱氨酸，烟酰胺，人Wnt-3a蛋白，青霉素和链霉素双抗，DMEM/F-12完全培养基。
特别的，本发明开发了一种新的培养基，在DMEM/F-12(1:1)完全培养基中加入了胰岛素，转铁蛋白，亚硒酸钠，表皮细胞生长因子EGF，重组蛋白RSPO1，纤维母细胞生长因子10，N-乙酰-L-半胱氨酸，烟酰胺，人Wnt-3a蛋白等成分，其中转铁蛋白能为细胞内化和细胞代谢提供所需的铁；亚硒酸钠可作为细胞生存保护剂，通过降低Bax/Bcl-2比值、抑制Fas、Caspase-3等细胞因子，并通过降低细胞氧化损伤，缓解细胞的氧化应激状态等抑制细胞凋亡；表皮细胞生长因子EGF是一种由导管腔上皮细胞分泌的多肽，通过结合细胞膜表面受体EGFR，激活PI3K、MAPK或PLC-γ信号通路；重组蛋白RSPO1通过配体-受体结合途经与细胞膜表面受体LGR结合，正调控Wnt信号通路；纤维母细胞生长因子10可通过与受体FGFR2b结合，正调控细胞有丝分裂；N-乙酰-L-半胱氨酸作为细胞培养的抗氧化剂；烟酰胺作为辅酶NAD+的前体，细胞摄入后可通过补救途径快速合成NAD+；人Wnt-3a蛋白可通过配体-受体结合途经与细胞膜表面受体FZD以及LRP5/6结合，抑制β-catenin的泛素化，促进其核内定位；腺苷酸环化酶激活剂(FORSKOLIN)能够提高细胞内第二信使cAMP水平，激活PKA等信号通路。通过上述成分的有效配合，共同使得本发明培养基能够促进细胞的生长和存活，体外培养得到的细胞状态好而且存活率较高，细胞冻存后复苏再进行培养效果仍旧很好。采用本发明的培养基对小鼠卵巢原代细胞进行培养后，得到的细胞可进行基因编辑，并且感染效率达到90％以上。
其中，上述小鼠卵巢原代细胞培养基中，BSA浓度为100～300μg/ml，L-抗坏血酸浓度为20～40μg/ml，胰岛素浓度为0.25～2g/L，转铁蛋白浓度为0.55～1.1g/L，亚硒酸钠浓度为0.0003～0.001g/L，胎牛血清浓度为10～20％，表皮细胞生长因子EGF浓度为20～100ng/ml，重组蛋白RSPO1浓度为150～500ng/ml，纤维母细胞生长因子10浓度为5～30ng/ml，N-乙酰-L-半胱氨酸浓度为0.5～2mM，烟酰铵5-20mmol/L，人Wnt-3a蛋白浓度为10～50ng/ml，青霉素50～100U/ml，链霉素50-100μg/ml，腺苷酸环化酶激活剂0.2～5umol/L，所有试剂于冰浴中，添加至DMEM/F-12(1:1)完全培养基中，配制成50ml培养基。
本发明还提供了一种小鼠卵巢原代细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：于冰浴中配制DMEM/F-12(1:1)完全培养基50ml，其中添加BSA，控制浓度为100～300μg/ml；添加L-抗坏血酸，控制浓度为20～40μg/ml；添加胰岛素，控制浓度为0.25～2g/L；添加转铁蛋白，控制浓度为0.55～1.1g/L；添加亚硒酸钠，控制浓度为0.0003～0.001g/L；添加胎牛血清，控制浓度为10％～20％；添加表皮细胞生长因子EGF，控制浓度为20～100ng/ml；添加重组蛋白RSPO1，控制浓度为150～500ng/ml；添加纤维母细胞生长因子10，控制浓度为5～30ng/ml；添加N-乙酰-L-半胱氨酸，控制浓度为0.5～2mM；添加烟酰胺，控制浓度为5～20mmol/L；添加人Wnt-3a蛋白，控制浓度为10～50ng/ml；添加青霉素，控制浓度为50～100U/ml；添加链霉素，控制浓度为50～100μg/ml；添加腺苷酸环化酶激活剂，控制浓度为0.2～5umol/L；配制完成后，于4℃冰箱保存。
本发明还提供了一种小鼠卵巢原代细胞体外培养的方法，包括以下步骤：
a、配制上述小鼠卵巢原代细胞培养基；
b、分离小鼠卵巢组织消化后的原代细胞，置于含有胶原酶的消化液中消化30～60min，过滤，离心，弃上清，采用步骤a的培养基重悬细胞，在37℃、含3～8％CO2条件下培养；
c、待孔内细胞密度到80～90％时，弃培养基，PBS润洗，加入100ul 0.25％的胰蛋白酶-EDTA，于37℃消化2～3分钟；采用完全培养基吹打细胞，再按1:2的比例在37℃、含3～8％CO2条件下进行传代培养。
其中，步骤b所述胶原酶为50mg胶原酶Ⅰ和25mg胶原酶Ⅳ的混合物。
其中，步骤b所述过滤采用100um细胞筛进行过滤。
其中，步骤b所述离心条件为300～800g，0～20℃，5～10min。
下面将通过实施例对本发明的具体操作方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例中，BSA溶液购自上海联迈生物工程有限公司，抗坏血酸(L-Ascorbicacid)白色晶体粉末，加水溶解(0.05mg/ml)购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，ITS(胰岛素1.00g/L、转铁蛋白0.55g/L、亚硒酸钠0.00067g/L)细胞培养添加物购自赛业(广州)生物科技有限公司，FBS(Gibco)胎牛血清(澳洲)购自上海加科生物科技有限公司，EGF表皮细胞生长因子购自爱必信(上海)生物科技有限公司，重组蛋白(RSPO1))购自艾美捷科技有限公司，FGF10纤维母细胞生长因子10重组蛋白购自上海联迈生物工程有限公司，N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetylcysteine)购自上海麦克林生化科技有限公司，30％WNT3α人Wnt-3α蛋白购自上海惠诚生物科技有限公司，青霉素和链霉素(Penicillin andstreptomycin)双抗(gibco)、DMEM/F-12(1:1)完全培养基(gibco)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。其余试剂和原料未说明的均为普通市售产品。
实施例1 配制小鼠卵巢原代细胞培养基
于冰浴中配制DMEM/F-12(1:1)完全培养基50ml，其中，控制BSA浓度为150μg/ml，L-抗坏血酸浓度为30μg/ml，胰岛素浓度为1g/L，转铁蛋白浓度为0.55g/L，亚硒酸钠浓度为0.0065g/L，胎牛血清(10％～20％)，表皮细胞生长因子EGF浓度为50ng/ml，重组蛋白RSPO1浓度为250ng/ml，纤维母细胞生长因子10浓度为15ng/ml，N-乙酰-L-半胱氨酸浓度为1mM，烟酰铵10mmol/L，人Wnt-3a蛋白浓度为20ng/ml，青霉素75U/ml，链霉素80μg/ml，腺苷酸环化酶激活剂2μmol/L，在冰浴条件下混合均匀，于4℃冰箱保存。
实施例2 分离小鼠卵巢组织消化后的原代细胞并进行原代培养
具体的操作步骤如下：
(1)对超净台以及实验器械进行消毒灭菌。
(2)选取年龄在4-8周的C57的雌鼠2只(北京维通利华实验动物技术有限公司)对其颈椎脱臼处死后，用75％的酒精浸泡小鼠体表2分钟；吸水纸吸掉小鼠体表外多余的酒精。
(3)在超净台内，将小鼠置于干净操作板上。一只手持着镊子提起小鼠腹部皮肤，另一只手用剪开小鼠的腹部皮肤，暴露小鼠腹腔。
(4)找到小鼠左右两侧的子宫，取下卵巢。
(5)将取好得卵巢组织放置到盛含有双抗(100u/ml青霉素+100u/ml链霉素)预冷无菌的PBS溶液，剔除周围结缔组织，并剪成1mm X 1mm X 1mm组织块。摘取到小鼠卵巢组织后要仔细剔除其周围结缔组织和脂肪组织，以免对后续细胞培养有感染。
(6)取50mg胶原酶Ⅰ和25mg胶原酶Ⅳ于50ml的BD管，用双无DMEM培养基定容至50ml，0.22um滤器过滤，于4℃冰箱保存，使用时加入100ul脱氧核糖核酸酶I/10ml。两种混合的胶原酶一定要在其完全溶解后，再进行过滤以免影响消化酶溶液的浓度，致使组织消化不彻底；
(7)将组织块置于消化液中，37℃摇床消化60分钟。
(8)加入等体积双无DMEM培养基终止消化后，100um细胞筛过滤取上清，在400g，4℃条件下离心10分钟。
(9)去上清，取2ml小鼠卵巢原代细胞完全培养基重悬细胞，并转移至24孔板中，于37℃、含5％CO2的培养箱内培养。
(10)1～2小时后细胞可贴壁生长(图1)，24小时后，观察卵巢各类原代细胞的形态和生长状况(图2)，培养48小时，小鼠卵巢原代细胞贴壁生长情况(图3)，培养第3天，原代细胞贴壁生长良好(图4-6)，培养7天和10天，小鼠卵巢原代细胞长势良好(图7、图8)。
实施例3 卵巢原代细胞计数以及存活率的测定
具体操作步骤如下：
(1)取10ul细胞悬液，加入10ul台盼蓝混匀。
(2)将混合液加入计数板内，用自动细胞计数仪测出细胞存活率。
实施例4 卵巢原代细胞传代培养
具体操作步骤如下：
(1)观察3天内，24孔板中卵巢原代细胞的生长状态，待孔内细胞密度到80％-90％时，进行传代培养。
(2)弃旧培养液，200ul PBS润洗。
(3)弃PBS，于每个孔中加入100ul 0.25％的胰蛋白酶-EDTA，37℃，消化3分钟。此时一定要严格控制0.25％胰蛋白酶-EDTA消化时长，以免对细胞造成不可逆的损伤。
(4)于每个孔中加入1ml完全培养基，终止消化。
(5)按1：2进行传代到新的24孔内，或按1:1传代到六孔板。
(6)于37℃、5％CO2条件下，卵巢原代细胞完全培养基中培养，可于六孔板传代到平皿中(10cm培养皿)继续培养。
实施例5 卵巢原代细胞冻存后复苏培养
具体操作步骤如下：
1、从液氮内取出冻存的卵巢原代细胞，37℃快速解冻。
2、将解冻后的细胞，于10％FBS+DMEM培养基(8ml)中重悬。
3、400g，4℃条件下离心5分钟，弃掉多余上清液。
4、用小鼠卵巢原代细胞完全培养基重悬细胞，铺到六孔板，于37℃、5％CO2条件下，培养2h，观察细胞状态(图9)。
5、每天观察复苏后小鼠卵巢原代细胞生长情况，复苏后培养第1天，细胞状态良好(图10)，第2天和第3天，细胞贴壁生长良好(图11-12)。
实施例6 采用CRISPR Cas9技术，编辑卵巢原代细胞基因
具体操作步骤如下：
(一)构建质粒，包装病毒
(1)将目的基因sgRNA连接到TtG的质粒上sgRNA-TtG质粒，再与152Cas9的质粒组成双质粒系统。
(2)将构建好的sgRNA-TtG质粒和152Cas9质粒分别进行病毒包装。
(3)取293T细胞系，以1:2传代到六孔板中，于37℃、5％CO2条件下，培养15小时，待293T细胞生长到六孔板孔面积的70～80％即可包装病毒。
(4)分两组包装病毒。
(a)sgRNA-TtG质粒和病毒衣壳质粒(Vsvg和Plc)以及CaCl2溶液按100ul体系在EP管内混合，再混入100ul 2X HBS。
(b)并采用同样方式和比例包装另一组，152Cas9质粒与病毒衣壳质粒(Vsvg和Plc)以及CaCl2溶液。
(5)将两组液体分别滴加到293T细胞中，再于37℃、5％CO2中培养24h。
(6)更换新鲜的10％FBS+DMEM 293T完全培养基。
(7)每隔6小时，于30小时、36小时、42小时、48小时、54小时、60小时六个时间点收集细胞上清液。
(8)将收集好的上清液，用0.22ul滤器祛除细胞碎片，于4℃留存备用。
(二)sgRNA-TtG和152Cas9病毒共感卵巢原代细胞
(1)将培养贴壁生长的卵巢原代细胞24孔板，选择两个孔。并标记为实验组和对照组。
(2)弃旧培养基，实验组加入500ul sgRNA-TtG和500ul 152Cas9两种病毒溶液，1:1000加入1ul聚凝胺(终浓度为5μg-10μg/ml)。
(3)对照组加入1ml新鲜培养基，1:1000加入1ul聚凝胺。
(4)31℃，2000rmp，离心60分钟。
(5)37℃，培养24小时，弃旧培养基，加入1ml新鲜卵巢原代细胞完全培养基。
(6)每天观察卵巢原代细胞生长状态，卵巢原代细胞感染2～3天，荧光细胞比例增多(图13、图14)。
(7)每隔3天更换一次培养基，直至第10天，感染效率达到峰值(图15)，细胞状态佳，取少量细胞鉴定基因编辑效率。
(三)具体的细胞基因编辑步骤如下：
(1)取卵巢原代细胞裂解后，提取全基因组DNA，并溶解于超纯水中。
(2)利用编辑基因的sgRNA引物，进行PCR扩增(图16)。
(3)扩增目的基因核酸片段，用T7核酸内切酶鉴定突变效果(T7核酸内切酶能识别错配的DNA并切割不完全配对DNA、十字型结构DNA、Holliday结构以及异源双链DNA等，可用于基因编辑鉴定)。与对照组(图17S4组)相比，试验组小鼠(图17Ulk-KO组)的基因编辑效率高。
综上可知，本发明提供了一种可应用于基因编辑的小鼠卵巢原代细胞培养方法，通过适宜的培养基与培养方法的结合，共同使得细胞培养存活率高，冻存后复苏的细胞仍能很好的培养效果。本发明培养方法简单，得到的细胞可应用于基因编辑，基因编辑效率高，具有广阔的应用前景。
Claims (7)
1.小鼠卵巢原代细胞培养基，其特征在于，包括以下成分：BSA存储液，L-抗坏血酸，胰岛素，转铁蛋白，亚硒酸钠，胎牛血清，表皮细胞生长因子EGF，重组蛋白RSPO1，纤维母细胞生长因子10，N-乙酰-L-半胱氨酸，烟酰胺，人Wnt-3a蛋白，青霉素和链霉素双抗，DMEM/F-12完全培养基。
2.根据权利要求1所述的小鼠卵巢原代细胞培养基，其特征在于：BSA浓度为100～300μg/ml，L-抗坏血酸浓度为20～40μg/ml，胰岛素浓度为0.25～2g/L，转铁蛋白浓度为0.55～1.1g/L，亚硒酸钠浓度为0.0003～0.001g/L，胎牛血清浓度为10～20％，表皮细胞生长因子EGF浓度为20～100ng/ml，重组蛋白RSPO1浓度为150～500ng/ml，纤维母细胞生长因子10浓度为5～30ng/ml，N-乙酰-L-半胱氨酸浓度为0.5～2mM，烟酰铵5-20mmol/L，人Wnt-3a蛋白浓度为10～50ng/ml，青霉素50～100U/ml，链霉素50-100μg/ml，腺苷酸环化酶激活剂0.2～5umol/L，所有试剂于冰浴中，添加至DMEM/F-12完全培养基中，配制成50ml培养基。
3.权利要求1或2所述的小鼠卵巢原代细胞培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：于冰浴中配制DMEM/F-1完全培养基50ml，其中添加BSA，控制浓度为100～300μg/ml；添加L-抗坏血酸，控制浓度为20～40μg/ml；添加胰岛素，控制浓度为0.25～2g/L；添加转铁蛋白，控制浓度为0.55～1.1g/L；添加亚硒酸钠，控制浓度为0.0003～0.001g/L；添加胎牛血清，控制浓度为10％～20％；添加表皮细胞生长因子EGF，控制浓度为20～100ng/ml；添加重组蛋白RSPO1，控制浓度为150～500ng/ml；添加纤维母细胞生长因子10，控制浓度为5～30ng/ml；添加N-乙酰-L-半胱氨酸，控制浓度为0.5～2mM；添加烟酰胺，控制浓度为5～20mmol/L；添加人Wnt-3a蛋白，控制浓度为10～50ng/ml；添加青霉素，控制浓度为50～100U/ml；添加链霉素，控制浓度为50～100μg/ml；添加腺苷酸环化酶激活剂，控制浓度为0.2～5umol/L；配制完成后，于4℃冰箱保存。
4.小鼠卵巢原代细胞体外培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、配制权利要求1或2所述的小鼠卵巢原代细胞培养基；
b、分离小鼠卵巢组织消化后的原代细胞，置于含有胶原酶的消化液中消化30～60min，过滤，离心，弃上清，采用步骤a的培养基重悬细胞，在37℃、含3～8％CO2条件下培养；
c、待孔内细胞密度到80～90％时，弃培养基，PBS润洗，加入100ul 0.25％的胰蛋白酶-EDTA，于37℃消化2～3分钟；采用完全培养基吹打细胞，再按1:2的比例在37℃、含3～8％CO2条件下进行传代培养。
5.根据权利要求4所述的小鼠卵巢原代细胞体外培养的方法，其特征在于：步骤b所述胶原酶为50mg胶原酶Ⅰ和25mg胶原酶Ⅳ的混合物。
6.根据权利要求4所述的小鼠卵巢原代细胞体外培养的方法，其特征在于：步骤b所述过滤采用100um细胞筛进行过滤。
7.根据权利要求4所述的小鼠卵巢原代细胞体外培养的方法，其特征在于：步骤b所述离心条件为300～800g，0～20℃，5～10min。
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