CN108517313B - 一种用于培养扩增牙髓干细胞的血清/血浆替代物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于人牙髓干细胞培养扩增的血清/血浆/血小板替代物，所述替代物包括：（1）5‑羟色胺类物质；（2）玻连蛋白；（3）前列腺素类物质；（4）柠檬酸或柠檬酸盐。使用该替代物培养牙髓干细胞，避免了因培养体系批次间差异，造成所培养的间充质干细胞性质不同的可能性。此外，使用该体系培养牙髓干细胞，在细胞治疗过程中将避免因动物血清或血浆引起的人畜共患病，以及因细胞治疗引起的人体免疫反应的风险。本发明的血清/血浆/血小板替代物，不仅适用于人牙髓干细胞培养扩增，也适于其它组织来源间充质干细胞的培养，应用前景广阔。

Description

一种用于培养扩增牙髓干细胞的血清/血浆替代物
技术领域
本发明属于细胞生物学领域细胞增殖范畴，具体一种用于人牙髓干细胞培养扩增的血清/血浆/血小板替代物，培养包括牙髓干细胞在内的人间充质干细胞培养时，使用的一种胎牛血清/血浆、或人血清/血浆以及富血小板的人血浆替代物，从而达到快速培养扩增人间充质干细胞尤其是牙髓干细胞的目的。
背景技术
间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）是一种成体干细胞，具有成骨、成脂肪和呈软骨能力。除多向分化能力外，体外培养的MSC尚具有以下功能：（1）基于促血管新生机制的组织修复能力；（2）基于旁分泌机制的免疫调节作用；（3）基于旁分泌及细胞间接触机制的造血支持作用。因此，MSC不但适用于骨和软骨的修复，可用于植物抗宿主病、系统性红斑狼疮等免疫相关疾病的治疗，以及处理因糖尿病及冠心病引起的微小血管阻塞。鉴于此，在美国NIH注册的有关MSC的临床试验已经近800项。在加拿大、新西兰、韩国、日本等国家，政府已经批准MSC作为一个药物，用于移植物抗宿主病、溃疡性结肠炎、骨关节炎、心肌梗塞等疾病的治疗。国内也有研究者将MSC或牙髓干细胞以药物的形式，申报国家食品与药物监督管理局，开展相关的临床试验，有些申请已经获得批准。因此，作为一种细胞药物，MSC包括牙髓干细胞具有广阔的应用前景。
研究发现，多种组织或器官中存在MSC，如骨髓、脂肪、脐带、胎盘、牙髓、肌肉、肝脏、心脏等。目前，常用的组织来源包括骨髓、脂肪、脐带、胎盘及牙髓。这些不同组织来源的MSC，常有不同的名称，如脂肪干细胞、胎盘干细胞及牙髓干细胞等，其实，都应属于间充质干细胞的范畴。与脂肪、骨髓、脐带和胎盘等组织不同，一枚牙齿中牙髓含量极少，所含MSC数量极低。另外，我国FDA发布的细胞产品质量指导原则中，建议尽量不使用异种血清（常指胎牛血清）扩增细胞。因此，将牙髓干细胞应用于临床，尤其是以药物形式用于临床，首先要解决的是培养扩增的问题。培养扩增牙髓干细胞必然面对两个难题：（1）培养扩增时宜选用无血清培养基；（2）使用这种培养基在大量扩增牙髓干细胞的同时，要维系细胞的“干性”（stemness）。
为避免异种血清引起的人畜共患病及免疫反应等问题，有人提出使用浓缩人血小板替代牛血清，用于牙髓干细胞的培养，并获得了满意的效果，获得的干细胞数量是使用相同浓度胎牛血清培养所获得细胞数量的2倍（Govindasamy V, et al. Human plateletlysate permits scale-up of dental pulp stromal cells for clinicalapplications. Cytotherapy, 2011; 13:1221-33）。然而，浓缩血小板是一种血液制品，在没有灭活病毒的情况下，仍然有传播传染病的风险；而常规的灭活程序，如白蛋白制备程序，60℃孵育12小时，常使多种细胞因子失活，使浓缩血小板丧失了支持细胞增殖的能力。另外，血小板个体来源不同，其作用能否保证稳定，亦即，能否保障所获得MSC的批次间稳定性等，也是必须考虑的问题。因此，利用一种化学成分清楚、无血清成分的培养基培养扩增牙髓MSC，对治疗的安全性和有效性，都是十分必要的。
发明内容
本发明之目的在于提供一种胎牛血清/血浆、或人血清/血浆以及富血小板的人血浆替代物，从而配制一种或几种无血清、化学成分清晰的培养基，适用于培养间充质干细胞，尤其是牙髓来源的间充质干细胞。
为解决上述技术问题，本发明采取的方案如下。
一种用于培养扩增牙髓干细胞的血清/血浆替代物，（1）5-羟色胺类物质；（2）玻连蛋白；（3）前列腺素类物质；（4）柠檬酸或柠檬酸盐。
所述的 5-羟色胺类物质为五羟色胺、3-(2-氨乙酸)吲哚、3-(2-氨乙酸)吲哚马来酸氢盐、3-(2-氨乙酸)吲哚草酸氢盐 、3-(2-氨乙酸)吲哚盐酸盐或N-乙酰五羟色胺中的一种，用量范围为0.01-100μM。最优用量范围为0.2-1μM。
所述玻连蛋白为天然玻连蛋白或其重组活性片段，用量范围为0.1-100mg/L。最优用量范围为1-10mg/L。
所述的前列腺素类物质为前列腺素E-1或前列腺素E-2，用量范围为0.5-500ng/ml，最优用量范围为10-100ng/ml。
所述的柠檬酸或柠檬酸盐，用量范围为5-600mg/L，最优用量范围为10-50mg/L。
包含所述的血清/血浆替代物的培养基，用于牙髓干细胞或其他充质干细胞培养扩增。
本发明的优点在于：
浓缩人血小板作为胎牛血清的替代物，可以快速培养扩增间充质干细胞（包括牙髓干细胞），但是，其化学成分不确定（chemically-undefined），且有传播传染病的风险。那么，能否选择浓缩血小板中支持间充质干细胞增殖的关键成分，用于间充质干细胞尤其是牙髓干细胞的扩增呢。基于该创新思路，我们提供了一种化学成分清晰（chemically-defined）且不含天然蛋白质分子的人血小板替代物，用于间充质干细胞，尤其是人牙髓干细胞的体外培养。本发明所提供的胎牛血清/血浆、或人血清/血浆以及富血小板的人血浆替代物（简称替代物），不仅成分明确，且不含动物或人血清或血浆，不含天然的动物血清或血浆中的蛋白质分子。使用该培养基培养牙髓干细胞，细胞增殖速度快，且维系了细胞的干性。所获得的干细胞，不可能被血清或血浆携带的病原体污染，避免了传染病的传播，以及因异种蛋白引起的免疫反应。因此，该培养基用于包括牙髓干细胞在内的间充质干细胞培养扩增，是细胞治疗应用于临床的安全性有效保障，具有重要的应用价值。
附图说明
图1. 不同培养基培养的原代人牙髓干细胞的形态；将消化后的牙髓分别接种于含10%小牛血清的alpha-MEM（A），或含替代物的无血清培养基（B）中，一周后出现贴壁细胞，呈集落样生长。标示：100μm。
图2. 不同培养基培养的人牙髓干细胞表型分析结果；Control：阴性对照。A：10%小牛血清-alpha-MEM培养的细胞；B：含血小板替代物的无血清培养基培养的细胞。纵坐标：细胞数；横坐标：相对荧光强度。图中所提供的百分比代表相对阳性细胞数。
图3. 不同培养体系人牙髓干细胞增殖特点；无血清：为含替代物的无血清培养基。10%BS为含10%小牛血清的alpha-MEM。纵坐标：细胞数，×105个。横坐标：P0-P5分别代表原代（P0）至第五代（P5）的细胞。
图4. 不同培养体系培养的人牙髓干细胞体外成骨能力；10%血清为含10%小牛血清的alpha-MEM。无血清为含替代物的无血清培养基。标示：100μm。
具体实施方式
本发明提供一种用于培养扩增牙髓干细胞的替代物，替代胎牛血清/血浆、或人血清/血浆以及富血小板的人血浆。使用该替代物配制的培养基组成包括：
（1）已经商业化的基础培养基，如alpha-MEM，低糖DMEM，DMEM/F12或几种基础培养基的组合。这些培养基或其组合均可以用于人MSC的培养，不在本发明保护范畴。
（2）无血清培养基必需包含的物质，如胰岛素、转铁蛋白、激素、脂类物质、维生素、白蛋白、氨基酸、微量元素等。这些物质已经应用于包括间充质干细胞在内的多种细胞的无血清培养，是常见人细胞无血清培养必需的成分。这些成分及其组合不在本发明保护范畴之内。
（3）人间充质干细胞增殖必需的细胞因子，如碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblast growth factor，bFGF）、转化生长因子beta（transforming growth factorbeta，TGF-beta）、胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，BBPDGF）表皮细胞生长因子（epidermalgrowth facor，EGF）。这些物质是无血清条件下培养人间充质干细胞所必需的，虽然是富血小板血浆内的成分，也可以来源于血小板，但其作用明确，这些物质或其不同组合不在本发明保护范围之内。
（4）所谓血清/血浆替代物，是人血小板或活化血小板释放的、除上述细胞生长因子外的化学成分，这些成分包括：五羟色胺类物质（serotonin）、玻连蛋白（vitronectin，VTN）、前列腺素类物质（prostaglandin）、柠檬酸盐（citrate）或柠檬酸（citric acid）。本发明保护范围在于上述成分或其组合，用于人间充质干细胞尤其是牙髓干细胞的培养扩增。
这些物质的具体作用如下：
（1）五羟色胺类物质：五羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT），又称血清素（serotonin），是肠上皮细胞、神经元和肥大细胞分泌的一种生物胺。在血液中白蛋白的协助下，五羟色胺被储存于血小板。当血小板活化时，五羟色胺被释放。有研究表明，五羟色胺促进血管平滑肌细胞及平滑肌样细胞增殖（Circulation. 1997; 96:2280-6），而间充质干细胞可以分化为血管平滑肌样细胞。也有学者认为，间充质干细胞本身就是血管平滑肌样细胞（Stem Cells. 2002; 20:205-14）。因此，在本发明中，五羟色胺或其衍生物，如3-(2-氨乙酸)吲哚、3-(2-氨乙酸)吲哚马来酸氢盐、3-(2-氨乙酸)吲哚草酸氢盐 、3-(2-氨乙酸)吲哚盐酸盐、N-乙酰五羟色胺（N-Acetyl-5-hydroxytryptamine）等，作为血小板作用于MSC的成分，用于培养扩增MSC。5-HT用量范围为0.01-100μM，推荐用量为0.1-10μM，最适宜用量为0.2-1μM。
（2）玻连蛋白（vitronectin，VTN）：玻连蛋白又称血清扩散因子（serum spreadingfactor），是促进体外培养细胞贴壁生长的主要因子之一。体内的玻连蛋白主要存在于两个部位，即血液及血小板颗粒中。血小板活化过程中释放其中的玻连蛋白。VTN用量范围为0.1-100mg/L，推荐用量为1-10mg/L。
（3）前列腺素类物质：前列腺素（prostaglandin，PG）是一类脂类小分子物质，几乎所有的有核细胞均可以合成前列腺素，其作用对象包括血小板、内皮细胞、子宫、肥大细胞、免疫细胞等。血小板中含有大量的PG，在活化状态下，正常人富血小板血浆中单一PGE-2含量就可以达到ng/ml级别（Thrombosis and Haemostasis 2004; 92:1358-67）。PG类物质，如PGE-2，是MSC免疫调节的主要效应分子之一，同时，也是调节MSC增殖的重要物质，使用酶抑制剂处理MSC，使MSC分泌PGE-2含量减少，MSC增殖速度变慢（Sci Rep 2016; 6:26298）。在接近完全融合状态下，MSC培养上清中PGE-2浓度在1.0-1.5ng/ml之间。本发明中使用PGE-2刺激牙髓干细胞增殖，PGE-2用量范围为0.5-500ng/ml，推荐用量为1.0-100ng/ml，最适宜用量为40-100ng/ml。
（4）柠檬酸或柠檬酸盐：柠檬酸又称枸橼酸，是一种水溶性的三羧酸，在血清制备过程中，常使用柠檬酸或柠檬酸盐作为一种抗凝剂；另外，白蛋白常吸附柠檬酸盐，是天然白蛋白中的“杂质”。一般商用培养基中并不添加柠檬酸或柠檬酸盐，但是，近年来的研究发现它在细胞培养中的作用是明确的。柠檬酸可以螯合铁离子，利于细胞铁转运。柠檬酸还是生物合成胆固醇、类固醇、辅酶Q等生物分子的必需前体物质之一。此外，柠檬酸可能与生物合成糖蛋白有关。在收集人外周血或单采收集人血小板时，采集200ml血液制品加入的柠檬酸总量为0.61g。本发明中，柠檬酸用量范围为5-600mg/L，推荐范围为10-300mg/L，优选范围为10-50mg/L。
以下是利用本发明方案为基础的实施例。实施例给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
下述实施例及试验中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1
一、利用不同培养基原代培养扩增人牙髓干细胞
1. 实验材料
标本：乳牙由福建省武警总医院口腔科提供，牙齿标本采集符合医院伦理和技术委员会关于人体标本使用的规定。
材料：小牛血清购自Sigma公司（美国）。重组人纤连蛋白（fibronectin，FN）片段为北京科昕生物科技有限公司产品。重组人白蛋白为河北省石家庄市华北制药产品，为药用辅料，用量为2g/L。alpha-MEM为Invitrogen公司Gibco（美国）产品，胰岛素-转铁蛋白-硒溶液（ITS，货号I3146）购自Sigma公司。乙醇胺和O-磷酸乙醇胺均为Sigma产品，终浓度分别为4μl/L和6mg/L，与ITS混合后置4℃保存。脂类混合物购自Sigma公司，货号为L0288，含花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、棕榈酸、十四烷脂肪酸、胆固醇、维生素E等，按照1:1000使用。重组人bFGF为双鹭药业有限公司产品（北京），商品名为扶济复，使用浓度为10ng/ml。重组人TGF-beta1和IGF-1为北京科昕生物科技有限公司产品，使用浓度为1ng/ml和50ng/ml。PDGF-BB和EGF均为人源重组细胞生长因子，为美国Peprotech公司产品，购自北京达科为生物技术有限公司，使用浓度分别为10ng/ml和5ng/ml。氢化可的松琥珀酸钠为天津生物化学制药有限公司生产，为注射用粉针剂，50mg/支，使用浓度为10-7M/L。氨基酸混合液、维生素混合液均为美国Invitrogen公司Gibco产品，用量分别是2wt.%和1wt.%。5-HT、PGE-2和柠檬酸均为Sigma公司产品。Vitronectin XF™为加拿大Stemcell公司经销，购自杭州百通生物技术有限公司。
2. 试剂的配制：
（1）无血清培养基基础培养基，含ITS、乙醇胺、O-磷酸乙醇胺、脂类混合物、重组人bFG、重组人TGF-beta1、重组人 PDGF-BB、重组人EGF、重组人IGF-1和氢化可的松琥珀酸钠，剂量如上。另外，在培养基中添加白蛋白等成分，具体如下表所示。表中成分是无血清条件下培养MSC必需的物质，已经有多篇文章报导，不在本发明保护范围。
表1.无血清培养基中基础培养基的组成
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（2）5-HT和PGE-2混合液，以二甲基亚砜溶解，配置成1000×溶液，置于-20℃避光保存。使用时滴加于培养基中，终浓度分别为44μg/L和40μg/L。
（3）柠檬酸和Vitronectin水溶液，以注射用水溶解，配置成1000×溶液，置于-20℃避光保存。使用时滴加于培养基中，终浓度分别为15mg/L和10mg/L。
（4）无血清培养基的配制：在上述无血清培养基基础培养基中，加入5-HT（44μg/L）、PGE-2（40μg/L）、柠檬酸（15mg/L）和Vitronectin（10mg/L），即为干细胞无血清培养基完全培养基。
（5）向alpha-MEM培养基中加入终浓度为10%的小牛血清（Sigma），即为含血清培养基，作为阳性对照。
3. 实验步骤
（1）培养板的处理：无血清培养的6孔板需要预处理。具体如下：使用生理盐水配制重组人FN浓度为1mg/ml，按照1ml/孔加入6孔板中，4℃放置过夜。次日，吸去FN溶液，加入生理盐水洗涤三次。置于超净台中吹干1小时。使用时，含替代物的无血清培养基悬浮牙髓细胞后，加入预铺板的6孔板中。目的在于促使牙髓干细胞在无血清培养条件下的贴壁。
（2）人牙髓干细胞的分离：按照常规方法，即分散酶和胶原酶消化法进行。简言之，将牙髓置于3mg/ml胶原酶I和4mg/ml分散酶中，37℃震荡（120转/分）2小时，70μm细胞筛过滤后按照2×108细胞/ml悬浮于alpha-MEM培养基中。
（3）细胞培养：将消化获得的细胞按照107细胞/皿，接种于处理的6孔培养板中，每孔2ml。培养基分别为含血清培养基（阳性对照）和完全无血清培养基。培养1周后，去除非贴壁细胞，用无血清基础培养基或含10%小牛血清的alpha-MEM换液。并照相。
培养第10天，细胞密度达到80%左右，常规方法传代。
3.实验结果
结果如图1所示。培养一周时，使用含10%FCS的alpha-MEM培养基（图1A），或含5-HT、PGE-2、柠檬酸与Vitronectin的无血清完全基础培养基培养的体系（图1B），均出现贴壁的成纤维样细胞，并可见由多个成纤维样细胞组成的集落。形态学分析结果提示，所获得细胞与文献报告的牙髓干细胞一致（Gronthos S,et al. Postnatal human dental pulpstem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97:13625-30）。
二、不同体系培养牙髓干细胞的表型分析
1. 实验材料
试剂：重组人FN片段购自北京科昕生物科技有限公司，无血清基础培养基成分如实验一所述。小牛血清为Sigma公司提供。Alpha-MEM为Gibco公司产品。FITC标记的小鼠抗人CD73和CD105单克隆抗体，PE标记的小鼠抗人CD31和CD45均为美国BD公司产品。
细胞：如实验一描述所获得的细胞。不同培养基传代培养。
2. 实验步骤
1）如实验一所述培养牙髓干细胞，待细胞密度达到80%左右时，0.05%胰蛋白酶消化获取细胞。
2）计细胞数，使用不同培养基（有血清和无血清）悬浮细胞。
3）按照105/皿/10ml接种于直径为100mm的培养皿中进行传代培养。
4）培养体系分别为：（1）含10%小牛血清的alpha-MEM；（2）含5-HT、PGE-2、柠檬酸与Vitronectin的无血清基础培养基，具体用量为5-HT 44μg/L，PGE-2 40μg/L，柠檬酸15mg/L, Vitronectin 10mg/L。按照实验一中的方法，在使用无血清培养基接种细胞前，使用FN预铺板培养皿，用于无血清培养体系的培养。这些细胞称为第一代细胞。
5）细胞密度达到80%融合时，胰蛋白酶消化收获细胞，如上所述传代培养。这些细胞称为第二代细胞。
6）同上，当细胞密度接近80%，收集细胞，生理盐水洗涤两次。收集的细胞为第三代细胞。
7）加入小鼠抗人CD73，CD105，CD31和CD45抗体，室温避光反应20分钟。
8）生理盐水洗涤两次。
9）流式细胞仪（FACSCalibur，BD，美国）收集细胞。
10）以未加抗体的细胞为对照，FlowJo 7.6.1软件分析结果。
3. 结果
流式细胞学分析结果显示，两种体系培养的细胞均一地表达CD73和CD105，不表达CD31和CD45。与既往文献报道一致，证明培养的细胞符合牙髓干细胞的表面标记。
三、不同培养基培养对人牙髓干细胞的扩增效果
1. 实验材料
标本：乳牙由福建省武警总医院口腔科提供，牙齿标本采集符合医院伦理和技术委员会关于人体标本使用规定。
材料：小牛血清购自Sigma公司（美国）,使用时以alpha-MEM配成10%溶液，作为细胞培养阳性对照。无血清培养基基础培养基配方如实验一所述。实验组培养基为含5-HT、PGE-2、柠檬酸与Vitronectin的无血清基础培养基，具体用量为5-HT（44μg/L）、PGE-2（40μg/L）、柠檬酸（15mg/L）和Vitronectin（10mg/L）。
2. 实验步骤
1）人牙髓干细胞的分离按照实验一所述方法进行。
2）培养体系分别为含5-HT、PGE-2、柠檬酸与Vitronectin的无血清基础培养基及含10%小牛血清（Sigma）的alpha-MEM，后者作为实验阳性对照。
3）无血清培养的6孔板需要预处理如前所述。
4）培养1周后，去除非贴壁细胞，换用（1）含5-HT、PGE-2、柠檬酸和Vitronectin的无血清基础培养基或；（2）含10%小牛血清的alpha-MEM。
5）培养第11天，细胞密度达到90%左右，胰蛋白酶消化收集细胞，台盼蓝拒染法计活细胞数。
6）当细胞密度达到90%左右时，按照实验二的方法传代，并每次计活细胞数。
7）细胞传至第5代时，计活细胞数。停止传代，收集的细胞用于下述成骨分化实验。
3. 结果
结果显示，无血清培养基培养的细胞数在P0代时即高于阳性对照组，随着传代次数的增加，两组细胞增殖速度变缓。第五代时，无血清组细胞总数约为对照组的1.23倍。提示，在所述条件下，细胞在无血清培养基中获得了良好的扩增效果。
四、不同培养基培养的细胞体外成骨能力
1．实验材料
标本：人牙髓干细胞由实验三所述获得，分别培养于无血清培养基及含血清的培养基中，培养第5代时用于下述实验。完全无血清培养基的配制同实施例3，即在基础培养基中（成分同表1）加入5-HT（44μg/L）、PGE-2（40μg/L）、柠檬酸（15mg/L）和Vitronectin（10mg/L）。含血清培养基是含10%小牛血清的alpha-MEM，作为实验阳性对照。
试剂：分化诱导试剂包括维生素C、磷酸甘油、地塞米松等均为美国Sigma产品。NBT-BCIP试剂盒由北京索莱宝科技有限公司提供。
2. 实验步骤
按照本实验室所描述的方法进行MSC成骨诱导分化（Stem Cells 2003; 21:527-35），体外培养10天时，去除培养上清，1%多聚甲醛固定，使用NBT-BCIP试剂盒染色。光学显微镜下观察，拍照。
3. 结果
经不同体系培养的牙髓干细胞，具有体外成骨能力。两种体系培养的细胞符合牙髓干细胞标准。
实施例2、不同体系培养牙髓干细胞的表型分析
1. 实验材料
试剂：重组人FN片段购自北京科昕生物科技有限公司，无血清基础培养基成分如实施例1所述。小牛血清为Sigma公司提供。Alpha-MEM为Gibco公司产品。FITC标记的小鼠抗人CD73和CD105单克隆抗体，PE标记的小鼠抗人CD31和CD45均为美国BD公司产品。
细胞：如实验一描述所获得的细胞。不同培养基传代培养。
2. 实验步骤
1）如实验一所述培养牙髓干细胞，待细胞密度达到80%左右时，0.05%胰蛋白酶消化获取细胞。
2）计细胞数，使用不同培养基（有血清和无血清）悬浮细胞。
3）按照105/皿/10ml接种于直径为100mm的培养皿中进行传代培养。
4）培养体系分别为：（1）含10%小牛血清的alpha-MEM；（2）含5-HT、PGE-2、柠檬酸与Vitronectin的无血清基础培养基，具体用量为5-HT 80μg/L，PGE-2 80μg/L，柠檬酸20mg/L, Vitronectin 5mg/L。按照实施例1的方法，在使用无血清培养基接种细胞前，使用FN预铺板培养皿，用于无血清培养体系的培养。这些细胞称为第一代细胞。
5）细胞密度达到80%融合时，胰蛋白酶消化收获细胞，如上所述传代培养。这些细胞称为第二代细胞。
6）同上，当细胞密度接近80%，收集细胞，生理盐水洗涤两次。收集的细胞为第三代细胞。
7）加入小鼠抗人CD73，CD105，CD31和CD45抗体，室温避光反应20分钟。
8）生理盐水洗涤两次。
9）流式细胞仪（FACSCalibur，BD，美国）收集细胞。
10）以未加抗体的细胞为对照，FlowJo 7.6.1软件分析结果。
3. 结果
流式细胞学分析结果如图2所示，两种体系培养的细胞均一地表达CD73和CD105，不表达CD31和CD45。与既往文献报道一致，证明培养的细胞符合牙髓干细胞的表面标记。
实施例3、不同培养基培养对人牙髓干细胞的扩增效果
1. 实验材料
标本：乳牙由福建省武警总医院口腔科提供，牙齿标本采集符合医院伦理和技术委员会关于人体标本使用规定。
材料：小牛血清购自Sigma公司（美国）,使用时以alpha-MEM配成10%溶液，作为细胞培养阳性对照。无血清培养基基础培养基配方如实验一所述。实验组培养基为含5-HT、PGE-2、柠檬酸与Vitronectin的无血清基础培养基，具体用量为5-HT 60μg/L，PGE-2 60μg/L，柠檬酸20mg/L，Vitronectin 10mg/L。
2. 实验步骤
1）人牙髓干细胞的分离按照实验一所述方法进行。
2）培养体系分别为含5-HT、PGE-2、柠檬酸与Vitronectin的无血清基础培养基及含10%小牛血清（Sigma）的alpha-MEM，后者作为实验阳性对照。
3）无血清培养的6孔板需要预处理如前所述。
4）培养1周后，去除非贴壁细胞，换用（1）含5-HT、PGE-2、柠檬酸和Vitronectin的无血清基础培养基或；（2）含10%小牛血清的alpha-MEM。
5）培养第11天，细胞密度达到90%左右，胰蛋白酶消化收集细胞，台盼蓝拒染法计活细胞数。
6）当细胞密度达到90%左右时，按照实施例2的方法传代，并每次计活细胞数。
7）细胞传至第5代时，计活细胞数。停止传代，收集的细胞用于下述成骨分化实验。
3. 结果
结果如图3所示，无血清培养基培养的细胞数在P0代时即高于阳性对照组，随着传代次数的增加，两组细胞增殖速度变缓。第五代时，无血清组细胞总数约为对照组的1.23倍。提示，在所述条件下，细胞在无血清培养基中获得了良好的扩增效果。
实施例4、不同培养基培养的细胞体外成骨能力
1．实验材料
标本：人牙髓干细胞由实施例3所述获得，分别培养于无血清培养基及含血清的培养基中，培养第5代时用于下述实验。完全无血清培养基的配制同实施例3，即在基础培养基中（成分同表1）加入5-HT 60μg/L，PGE-2 60μg/L，柠檬酸20mg/L，Vitronectin 10mg/L。含血清培养基是含10%小牛血清的alpha-MEM，作为实验阳性对照。
试剂：分化诱导试剂包括维生素C、磷酸甘油、地塞米松等均为美国Sigma产品。NBT-BCIP试剂盒由北京索莱宝科技有限公司提供。
2. 实验步骤
按照本实验室所描述的方法进行MSC成骨诱导分化（Stem Cells 2003; 21:527-35），体外培养10天时，去除培养上清，1%多聚甲醛固定，使用NBT-BCIP试剂盒染色。光学显微镜下观察，拍照。
3. 结果
如图4所示， 经不同体系培养的牙髓干细胞，具有体外成骨能力。两种体系培养的细胞符合牙髓干细胞标准。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种用于培养扩增牙髓干细胞的血清/血浆替代物，其特征在于：所述替代物包括：（1）5-羟色胺类物质；（2）玻连蛋白；（3）前列腺素类物质；（4）柠檬酸或柠檬酸盐；
所述的 5-羟色胺类物质为五羟色胺、3-(2-氨乙酸)吲哚、3-(2-氨乙酸)吲哚马来酸氢盐、3-(2-氨乙酸)吲哚草酸氢盐 、3-(2-氨乙酸)吲哚盐酸盐或N-乙酰五羟色胺中的一种，用量范围为0.01-100μM；
所述玻连蛋白为天然玻连蛋白，用量范围为0.1-100mg/L；
所述的前列腺素类物质为前列腺素E-1或前列腺素E-2，用量范围为0.5-500ng/ml；
所述的柠檬酸或柠檬酸盐，用量范围为5-600mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种用于培养扩增牙髓干细胞的血清/血浆替代物，其特征在于：所述的 5-羟色胺类物质的用量范围为0.2-1μM。
3.根据权利要求1所述的一种用于培养扩增牙髓干细胞的血清/血浆替代物，其特征在于：所述玻连蛋白为天然玻连蛋白，用量范围为1-10mg/L。
4.根据权利要求1所述的一种用于培养扩增牙髓干细胞的血清/血浆替代物，其特征在于：所述的前列腺素类物质用量范围为10-100ng/ml。
5.根据权利要求1所述的一种用于培养扩增牙髓干细胞的血清/血浆替代物，其特征在于：所述的柠檬酸或柠檬酸盐，用量范围为10-50mg/L。
6.如权利要求1所述的血清/血浆替代物用于牙髓干细胞培养扩增中的应用。
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