JP2019509065A - コロニー形成培地及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
多能性幹細胞 (PSC)、特に、胚性幹細胞 (ESC)及び人工多能性幹細胞 (iPSC)を含むヒトPSCは、in vitroにおけるヒトの発生を研究するため、及び新規な細胞ベースの治療用生成物を開発するための機会を提供する。治療用生成物の製造のための開始材料としてのPSCの使用は、in vitroで無制限に複製し、任意の細胞型に分化するPSCの能力の結果として、単一の細胞バンクから、実質的に無制限の数の細胞を製造する可能性を含む、幾つかの利点を有する。
本発明者等は、PSCをMSCに分化させる分化培地のための特定の組成物であって、そのようなMSCが、本明細書で開示された分化培地の非存在下で分化したMSCと比べて優れた免疫抑制性の性質を有する、組成を特定した。更に、該方法は、GMPスケール、即ち、治療用途のMSCを供給するために十分であるスケールに適用することができる。
(a)LiCl及びFGF2を含むがPDGFを含まないM-CFM中、正常酸素条件下で、間葉系コロニーを形成させるのに十分な時間、原始中胚葉細胞を培養すること;並びに
(b)MSCを製造するために、(a)の間葉系コロニーを接着培養することを含み、
(b)のMSCが、前記M-CFM中で製造されたのではないMSCと比べて、優れたT細胞免疫抑制性の性質を有する、方法を提供する。
(a')FGF2、及び任意選択で、PDGFを含むが、LiClを含まない培地中、正常酸素条件下で、間葉系コロニーを形成させるのに十分な時間、原始中胚葉細胞を培養すること;並びに
(b')MSCを製造するために(a')の間葉系コロニーを接着培養すること、
を含む方法によって製造されたMSCと比べて決定される。
(a)原始中胚葉細胞を形成するために、FGF2、BMP4、アクチビンA及びLiClを含む分化培地中、低酸素条件下で、約2日間、PSCを培養すること;
(b)(a)の分化培地を、LiCl及びFGF2を含むがPDGFを含まない間葉系コロニー形成培地 (M-CFM)で置換すること;
(c)(b)のM-CFM中、正常酸素条件下、間葉系コロニーを形成させるのに十分な時間、(b)の原始中胚葉細胞を培養すること;並びに
(d)MSCを製造するために、(c)の間葉系コロニーを接着して培養すること
を含み、該MSCが、前記M-CFM中で製造されたのではないMSCと比べて、優れたT細胞免疫抑制性の性質を有する、方法が開示される。
(e)(d)のMSCを増殖させること。
本発明者等は、特に、改良され化学的に定義されたゼノジェンフリーの間葉系コロニー形成プロトコールを含む、改良され化学的に定義されたゼノジェンフリーの分化プロトコールを定義した。驚くべきことに、改良されたプロトコールは、従来の分化及び間葉系コロニー形成プロトコールと比較した場合に、優れた免疫抑制性の性質を有するMSCを提供する。
1. ビトロネクチンでコートした(0.5 μg/cm2)プラスチック製品上で、E8完全培地 (DMEM/F12 基本培地+E8サプリメント)+1 μM H1152中でiPSCを解凍した。プレーティングしたiPSCを37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素)でインキュベートした。
2. ビトロネクチンでコートした (0.5 μg/cm2)プラスチック製品上で、E8完全培地 (ROCK阻害剤を含まない)中において、iPSCを3継代して増殖させ、分化プロセスを開始するのに先立って、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素)でインキュベートした。
3. iPSCを回収し、コラーゲンIVでコートした (0.5 μg/cm2)プラスチック製品上で、E8完全培地+10 μM Y27632中において、5×103細胞/cm2で、シングルの細胞/小コロニーとして、iPSCを播種し、37℃、5%CO2、20%O2 (正常酸素)で、24時間インキュベートした。
4. E8完全培地+10 μM Y27632を、分化培地で置換し、37℃、5%CO2、5%O2 (低酸素)、48時間インキュベートした。
5. 分化培地での接着培養からコロニー形成細胞をシングル細胞懸濁液として回収し、M-CFM懸濁培養に移し、37℃、5%CO2、20%O2 (正常酸素)、12日間インキュベートした。
6. 回収し、フィブロネクチン/コラーゲンIでコートした (0.67 μg/cm2フィブロネクチン、1.2 μg/cm2コラーゲンI)プラスチック製品上で、M-SFEM中にコロニーを播種し(継代0)、37℃、5%CO2、20%O2 (正常酸素)で、3日間インキュベートした。
7. コロニーを回収し、フィブロネクチン/コラーゲン1でコートしたプラスチック製品上で、M-SFEM中に、1.3×104細胞/cm2で、シングル細胞として播種し(継代1)、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素)で、3日間インキュベートした。
8. 回収し、フィブロネクチン/コラーゲン1でコートしたプラスチック製品上で、M-SFEM中に、1.3×104細胞/cm2で、シングル細胞として播種し(継代2)、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素)で、3日間インキュベートした。
9. 回収し、フィブロネクチン/コラーゲン1でコートしたプラスチック製品上で、M-SFEM中に、1.3×104細胞/cm2で、シングル細胞として播種し(継代3)、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素)で、3日間インキュベートした。
10. 回収し、フィブロネクチン/コラーゲン1でコートしたプラスチック製品上で、M-SFEM中に、1.3×104細胞/cm2で、シングル細胞として播種し(継代4)、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素)で、3日間インキュベートした。
11. 回収し、フィブロネクチン/コラーゲン1でコートしたプラスチック製品上で、M-SFEM中に、1.3×104細胞/cm2で、シングル細胞として播種し(継代5)、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素)で、3日間インキュベートした。
12. シングル細胞として回収し、最終産物を凍結した。
表7中で表示したIC50データは、LiClを補充したが、PDGFを補充していないM-CFM(即ち、PDGF-/LiCl+)が、免疫抑制性であるiPSC-MSCを製造するための、iPSCの分化に最適であることを示す。更に、より低濃度のアクチビンAはまた、iPSC-MSCの免疫抑制も改善した。
実施例2に従って製造されたMSCを、1194のmiRNA、及びmiR-127-3p、miR-145-5p、miR-181b-5p、miR-214-3p、miR-299-5pからなる独自のmiRNAパネルを含むマイクロRNA (miRNA)マイクロアレイに対する分析に供した。パネルの5つのmiRNAの各々は、71個のMSC試料の全てで発現していたが、94個の非MSC試料においては発現していなかった。それにより細胞をMSC又は非MSCとして分類することが可能となる。
MSCの免疫有効性を以下の通り評価する:様々なドナーに由来するヒトPBMCを、(免疫応答における個人間の多様性を最小化するために)リン酸緩衝生理食塩水中にプールし、2×107PBMC/mLの細胞密度で、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル (CFSE、2 μM)を用いて、暗黒下、37℃で15分間染色した。ヒト血液型ABの10%血清を補充したRPMI-1640培地を、等量添加することによって反応を停止する。プールした10%のヒト血小板溶解物、保存料を含まない2 IU/mLのヘパリン (Biochrom)、2 mM L-グルタミン、10 mM (4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)(HEPES;Gibco)、100 IU/mLのペニシリン (Sigma)及び100 μg/mLのストレプトマイシン (Sigma)を補充したRPMI-1640培地中に懸濁した、CFSEで標識した3×105のPBMCを、次いで、96ウェル平底プレート (Corning)中に、ウェル毎に3回反復でプレーティングする。T細胞増殖を、Gallios 10色フローサイトメーター及びKaluza G1.0ソフトウェア (両方ともCoulter)を使用して決定する。4〜7日後に、7-アミノアクチノマイシン-Dを含まない(7-AAD−;BD Pharmingen)生きたCD3-APC+ (eBioscience)T細胞を分析する。増殖キネティックス及び集団の分布を、Modfit 4.1ソフトウェア (Verity)を使用して分析する。
MSCの免疫有効性を以下の通り評価する:製造業者の指示に従って、CellTraceバイオレット (CTV;Invitrogen)を用いて、ヘルパーT (CD4+)リンパ球を染色し、次いで、96ウェルのU底プレート中、抗CD3/CD28でコートしたビーズ (Dynabeads、Invitrogen)を用いて、5:1のT細胞/ビーズ比で刺激する。次いで、応答性(Responder)CD4 T細胞を、参照標準としての(100 Gyで)放射線照射したKarpas 299細胞 (K299細胞;Sigma)、又はMSCと共にインキュベートする。共培養する細胞を、RPMI-1640培地中、37℃、5%CO2で、72時間インキュベートする。次いで、AnnexinV結合バッファー (BD Biosciences)を用いて細胞を洗浄し、Annexin Vフルオレセインイソチオシアネート(Annexin Vefluorescein isothiocyanate)又はAPC (BD Biosciences)を用いて、暗黒下、室温で15分間染色する。このインキュベーション後、ヨウ化プロピジウム (PI)(Molecular Probes)を用いて、細胞を染色し、次いで、直ちにLSRII Fortessa (BD Biosciences)上で取得する。FlowJoソフトウェア (バージョン8.8.6;Tree Star)を使用して、回収したデータを分析する。Annexin V陰性(Annexin Venegative)及びPI陰性のT細胞の集団によって、生存率を測定する。生存細胞の割合を、CTV 弱陽性 (増殖%)について分析する。式:抑制%=100−(a/b*100)(aはサプレッサー細胞の存在下での増殖%であり、bはサプレッサー細胞の非存在下での増殖%である)によって、T細胞増殖の抑制を計算する。
本開示に係る間葉系幹細胞 (MSC)を、心筋梗塞 (心臓発作)のラット実験モデルにおいて使用し、心臓発作後のラットの心臓を修復した。
合計11匹のラットにおいて心臓発作を誘発した後、28日超の期間で、心機能及び瘢痕サイズを評価した。開示に係るMSCを用いて4匹の動物を治療し、骨髄由来のMSCを用いて3匹の動物を治療し、更に4匹の動物にプラセボ(ビヒクル;対照)を投与した (図10)。
細胞の生着の評価 (図11及び12)によって以下のことが示された:
―ヒト核及びヒトミトコンドリア染色を使用して、BM-MSC及びPSC-MSC群における28日目での細胞の生着の証拠はなかった。
0日目と比較した、28日目での短縮率(FS %)を使用した機能評価 (図13及び14)によって以下のことが示された:
―ビヒクル群における、LV収縮性は、最小(無)変化であった
―BM MSC群における、LV収縮性
―PSC-MSC群における、LV収縮性
瘢痕サイズの評価 (図15)によって以下のことが示された:
―ビヒクル群及びBM-MSC群と比較して、PSC-MSC群 (ピクロシリウスレッド(picosirius red))においては、28日目に瘢痕サイズが明らかに低下した。
血管新生の評価 (図16)によって以下のことが示された:
―群間における血管サイズ及び数における明らかな相違はなかった (vWF染色)。
結果によって、MSCレシピエントにおいては、他の群の両方における動物と比較して、28日目で、心機能が改良され、瘢痕サイズが低下したことが示された。結果によって、開示に係るMSCが、心臓発作後の実質的な機能的及び構造的な改善を引き起こしたことが示された。
図17に示される実施例6の試験の改良においては、プログラムされた心室刺激(EPS)を使用して、不整脈が評価される。
動物を、無作為に治療群に割り当て、全てのケースにおいて、適切な治療手段を尾部静脈に注射した。0日目に、6週齢雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)マウスに、2.5Gyで軽く放射線照射し、次いで、4時間休憩させた。1000万のヒトPBMCの静脈(尾部静脈)移植によって、GvHDを誘発した。疾患誘発後、マウスを病原体フリーの条件下(マイクロアイソレーターケージ(micro-isolator cages))に収容し、実験手順の期間中、酸性化し、抗生物質を補充した水を与えた。試験設計は、表8に概要をまとめている。
iPSC-MSCを解凍し、洗浄し、滅菌PBS中に再懸濁した。日+14 (14日目、1用量投薬計画)又は日+14及び日+18 (14日目、18日目、2用量投薬計画)で、200万のiPSC-MSCを、尾部静脈から関連する動物に投与した。
5つの異なる基準:体重の減少、姿勢、活動、毛並み及び皮膚の完全性を含む、標準化されたスコア化システムを使用して、GvHDの重篤度を評価した。マウスを、各基準について、日々評価し、0 (最も軽い重篤度)〜2 (最も重い重篤度)でスコア化した。5つの基準についてスコアを加算することによって、臨床スコアを生成した。「8」の臨床スコアに到達した時、マウスを試験から除外し、人道的に安楽死させた。試験から除外した日を、致死的なGvHDが誘発された日として記録した。ログランク検定を適用したKaplan-Meier分析を使用して、生存利益(survival benefit)を決定した。≦0.05のp値を有意な差とみなした。
一用量又は二用量の投薬計画で治療されたマウスは、疾患症状の有意な軽減を示し、GvHD誘発後、日+24及び+25において、一用量と二用量の治療間で、有意な相違が更にみとめられた (図19)。
生存試験においては、一用量と二用量での治療によって、GVHD対照を上回る有意な生存利益が授与された (p<0.0001)。二用量の投薬計画を受けた動物の生存は、一用量で治療された動物を上回って相当改善されたが、この上昇は統計的有意性には到達しなかった (p=0.0715)(図20)。
これらの生存試験から、我々は、GvHDの前臨床モデルにおいては、一用量又は二用量でのいずれかの治療が施された場合、CYMERUSTMiPSC-MSCが、体重の減少からマウスを保護し、疾患の重篤度を有意に軽減し、強力な生存利益を提供すると結論付ける。
Claims (30)
- miR-145-5p、miR-181b-5p及びmiR-214-3pを発現するが、miR-127-3pやmiR-299-5pを発現しない、間葉系幹細胞 (MSC)。
- CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-表現型を有する、請求項1に記載のMSC。
- 間葉系幹細胞(MSC)の製造方法であって、該方法が以下:
(a)LiCl及びFGF2を含むがPDGFを含まない間葉系コロニー形成培地 (M-CFM)中、正常酸素条件下で、間葉系コロニーを形成させるのに十分な時間、原始中胚葉細胞を培養すること;並びに
(b)MSCを製造するために、(a)の間葉系コロニーを接着培養すること
を含み、(b)のMSCが、前記M-CFM中で製造されたのではないMSCと比べて、優れたT細胞免疫抑制性の性質を有する、方法。 - 前記原始中胚葉細胞が、間葉血管芽細胞(MCA)の潜在性を有する原始中胚葉細胞である、請求項3に記載の方法。
- 前記MCAの潜在性を有する原始中胚葉細胞が、EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRアルファ+表現型を有する、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記間葉系コロニーを形成するために十分な時間が約8日〜約14日、約10日〜約14日、約11〜約13日又は約12日である、請求項3〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記MSCのT細胞免疫抑制性の性質が、以下:
(a')FGF2、及び任意選択で、PDGFを含むが、LiClを含まない培地中、正常酸素条件下で、間葉系コロニーを形成させるのに十分な時間、原始中胚葉細胞を培養すること;並びに
(b')MSCを製造するために、(a')の間葉系コロニーを接着培養すること
を含む方法によって製造されたMSCと比べて決定される、請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記MSCのT細胞免疫抑制性の性質が、FGF2、BMP4、アクチビンA及びLiClを含む分化培地中、低酸素条件下で、約2日間、PSCから分化させた原始中胚葉細胞から製造されたMSCと比べて決定される、請求項3〜7のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞免疫抑制性の性質が、ヘルパーT(CD4+)リンパ球の増殖の抑制を含む、請求項3〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記M-CFMが、約1 mMのLiClを含む、請求項3〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記M-CFMが、約5 ng/mL〜約100 ng/mLのFGF2、又は約10 ng/mL〜約50 ng/mLのFGF2、約10 ng/mL又は約20 ng/mLのFGF2を含む、請求項3〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記M-CFMが、約1 mMのLiCl及び約10 ng/mLのFGF2、又は約1 mMのLiCl及び約20 ng/mLのFGF2を含む、請求項3〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 原始中胚葉細胞を培養することに先立って、以下:
原始中胚葉を形成するために、PSCを、FGF2、BMP4、アクチビンA及びLiClを含む分化培地中、低酸素条件下で、約2日間培養すること;並びに
分化培地を、LiCl及びFGF2を含むがPDGFを含まないM-CFMで置換すること
を含む、多能性幹細胞 (PSC)を原始中胚葉細胞に分化させることを更に含む、請求項3〜12のいずれか一項に記載の方法。 - 前記細胞がヒトのである、請求項3〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PSCが、人工PSC(iPSC)である、請求項13又は請求項14に記載の方法。
- 前記分化培地が、以下:
約10 ng/mL〜約50 ng/mLのFGF2、若しくは約50 ng/mLのFGF2;
約50 ng/mL〜約250 ng/mLのBMP4、若しくは約50 ng/mLのBMP4;
約1 ng/mL〜約15 ng/mLのアクチビンA、約10 ng/mL〜約15 ng/mLのアクチビンA、約12.5 ng/mLのアクチビンA、若しくは約1.5 ng/mLのアクチビンA;及び/又は
約1 mM〜約2 mMのLiCl
を含む、請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。 - 前記分化培地が、以下:
約50 ng/mLのFGF2;
約50 ng/mLのBMP4;
約1.5 ng/mLのアクチビンA;及び
約2 mMのLiCl
を含む、請求項13〜16のいずれか一項に記載の方法。 - コラーゲンIV及び/又はテネイシンC上で培養することを含む、請求項3〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 間葉系コロニー及び/又はMSCを継代することを更に含む、請求項3〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 継代することが以下:
間葉系コロニー及び/若しくはMSCを、約3日間培養すること;
フィブロネクチン及び/若しくはコラーゲンI上で、間葉系コロニー及び/若しくはMSCを培養すること;並びに/又は
1、2、3、4、5若しくは6継代
を含む、請求項19に記載の方法。 - 請求項3〜20のいずれか一項に記載の方法によって製造されたMSC。
- 請求項1、2又は21のいずれか一項に記載のMSCを含む、MSCの集団。
- 請求項1、2若しくは21のいずれか一項に記載のMSC、又は請求項22に記載のMSCの集団を含む、治療用組成物。
- 請求項1、2若しくは21のいずれか一項に記載のMSC、請求項22に記載のMSCの集団、又は請求項23に記載の治療用組成物を含む容器を含む、キット。
- 約1 mMのLiCl、及び約5 ng/mL〜約100 ng/mLのFGF2又は約10 ng/mL〜約50 ng/mLのFGF2、約10 ng/mLのFGF2又は約20 ng/mLのFGF2を含むが、PDGFを含まない、間葉系コロニー形成培地 (M-CFM)。
- 約1 mMのLiCl及び約10 ng/mLのFGF2、又は約1 mMのLiCl及び約20 ng/mLのFGF2を含む、請求項25に記載のM-CFM。
- 水を含む液体と混合した場合に、約1 mMのLiCl、及び約5 ng/mL〜約100 ng/mLのFGF2又は約10 ng/mL〜約50 ng/mLのFGF2、約10 ng/mLのFGF2又は約20 ng/mLのFGF2を含むが、PDGFを含まないM-CFMを生成する、LiCl及びFGF2を含むがPDGFを含まない組成物。
- 水を含む液体と混合した場合に、約1 mMのLiCl及び約10 ng/mLのFGF2、又は約1 mMのLiCl及び約20 ng/mLのFGF2を含むM-CFMを生成する、請求項27に記載の組成物。
- 例えば、移植片対宿主病、全身性エリテマトーデス(SLE)、クローン病、多系統萎縮症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脳卒中、心血管障害、整形外科的障害、又は移植された固形臓器の拒絶等の状態を治療するための医薬の製造における、請求項1、2若しくは21のいずれか一項に記載のMSC、又は請求項22に記載のMSCの集団の使用。
- 例えば、移植片対宿主病、全身性エリテマトーデス(SLE)、クローン病、多系統萎縮症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脳卒中、心血管障害、整形外科的障害、又は移植された固形臓器の拒絶等の状態の治療方法であって、請求項1、2若しくは21のいずれか一項に記載のMSC、請求項22に記載のMSCの集団、又は請求項23に記載の治療用組成物を、対象に投与することを含む、方法。
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