CN113462637A - 一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞生物学技术，具体涉及小鼠卵巢颗粒细胞提取及培养方法。技术方案的具体步骤：（1）向雌性小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG；（2）用颈椎脱臼法处死小鼠，分离小鼠卵巢，PBS清洗，显微镜下去除其周围脂肪被膜；（3）在混合操作液中用注射器针头刺破卵泡使颗粒细胞和卵母细胞释放出来，筛网过滤，滤液离心弃上清；（4）混合完全培养基重悬细胞沉淀接种，操作液为DME/F‑12 1:1(1X)+3%胎牛血清+2%青链霉素混合液+2%支原体清除剂。进一步，小鼠采用3周龄，体重10‑13g，未成熟的雌性小鼠，PMSG的注射量为5‑10IU，注射方法为腹腔注射，PMSG的注射量优选为8IU，断颈处死小鼠时间是在注射后46‑48h后。本发明提供的机械法操作简便，耗时短，而且获得的卵巢颗粒细胞得率高。
Description
技术领域
本研究属于细胞生物学技术，具体涉及一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及培养方法。
背景技术
卵泡主要由卵母细胞、颗粒细胞和卵泡膜细胞构成，颗粒细胞是卵巢中的一种体细胞，其在卵泡中的发育早于其他细胞，当其形态和数量达到一定水平，卵母细胞才开始发育，所以颗粒细胞是启动卵泡发育的关键因素。同时颗粒细胞表达各种促性腺激素受体进一步调节卵泡的生长和成熟，亦是卵泡闭锁的发起者。因此，颗粒细胞可作为研究女性及雌性动物生殖内分泌变化、生理功能调控及评估体外药效药理的良好细胞模型。目前有关体外分离对小鼠卵巢颗粒细胞的体外培养研究较少，且效果不稳定，本发明旨在提供一种简便廉效的小鼠卵巢颗粒细胞的分离培养方法。
发明内容
发明解决的技术问题：
本发明公开了一种小鼠卵巢颗粒细胞的分离及培养方法，包括步骤如下：注射PMSG后将小鼠断颈椎处死，取出卵巢，用PBS冲去血污；显微镜下去除其周围脂肪和被膜；在混合操作液中用注射器针头刺破卵泡使颗粒细胞和卵母细胞释放出来，收集后离心，用混合培养基重悬细胞。采用本方案可以很好的将颗粒细胞分离，且能获得较纯的颗粒细胞，具有切实可行，可操作性强，稳定可靠，重复性好等优点。
技术方案：
一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及培养方法，具体步骤为：
（1）向雌性小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG；
（2）用颈椎脱臼法处死小鼠，分离小鼠卵巢，PBS清洗，显微镜下去除其周围脂肪和被膜；
（3）在混合操作液中用注射器针头刺破卵泡使颗粒细胞和卵母细胞释放出来，筛网过滤，滤液离心弃上清；
（4）混合完全培养基重悬细胞沉淀接种，
操作液为DME/F-12 1:1(1X)+3%胎牛血清+2%青链霉素混合液+2%支原体清除剂。
进一步，小鼠采用3周龄，体重10-13g，未成熟的雌性小鼠。
进一步，PMSG的注射量为5-10IU，注射方法为腹腔注射。
进一步，PMSG的注射量为8IU。
进一步，断颈处死小鼠时间是在注射后46-48h后。
进一步，混合完全培养基为DMEM/F-12 1:1(1X)+15%胎牛血清+1%青链霉素（1:100）+1%支原体清除剂混合液。
更进一步，细胞首次换液时间为24-48h，以后每40-48h更换一次培养基。
有益效果：
本发明提供一种机械法获得小鼠卵巢颗粒细胞的方法，不仅操作简便，耗时短，而且获得的卵巢颗粒细胞得率高。
本发明还提供一种混合完全培养基培养卵巢颗粒的方法，成分简单，增加了卵巢颗粒细胞的生存期，大大降低细胞污染率。
附图说明
图1为采用本发明的方法提取培养的颗粒细胞FSHR染色鉴定（x100）。
图2为采用本发明的方法提取培养的卵巢颗粒细胞明场（×100）。
具体实施例
本发明选择3周龄，10-15g未成熟的雌性小鼠，分离卵巢颗粒细胞。
具体操作如下：
原代颗粒细胞提取：
1、取3周龄未成熟的雌性小鼠，腹腔注射PMSG 8IU，46-48h后断颈处死小鼠.
2、固定小鼠，75％的酒精浸泡10s消毒后，无菌条件下迅速取下卵巢，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline, PBS）冲去血污，将干净的卵巢放入混有2%青链霉素+2%支原体清除剂的PBS（37 ℃预热）的35mm培养皿中，于显微镜下迅速地去除卵巢周围的包膜及组织等附着物，将剥离后的卵巢转至新的PBS缓冲液中清洗3次；
3、将卵巢转移至含有操作液的35mm培养皿中，37℃温育10-15min；
4、解剖镜下用1mL注射器针头轻轻刺破卵泡，释放颗粒细胞和卵母细胞，收集至15mL离心管中；
5、200目筛网过滤，收集滤液，1000-1500rpm离心5min，PBS清洗3次。
6、1000-1500rpm/min离心5min,用混合培养基重悬细胞。
7、吸取台盼蓝溶液按照1:9比例加入细胞悬液中染色，血球计数板计活细胞数，调整细胞数量，按照5*105/mL细胞密度接种到均匀涂布鼠尾胶原的6孔细胞培养板中，混匀，每孔加入2ml混合完全培养基。
8、用75 % 的酒精棉将培养板擦拭干净后，置于培养箱恒温培养，培养箱条件为37℃，5 % 的CO2。培养6小时后弃培养液，PBS充分洗涤冲去贴壁不牢细胞，完全培养基继续培养。
9、首次换液后37℃每培养40-48h更换一次完全培养基。
10、细胞形态观察，见图2。
11、在细胞接种后，每天在显微镜下观察细胞形态，并拍照。每个时间段用显微镜详细观察、记录细胞形态及生长情况。
原代卵巢颗粒细胞鉴定
1.将胰酶消化后的细胞将胰酶消化后的细胞接种于细胞爬片上，培养 48 h 后取出爬片，PBS洗涤3 次，每次3min;
2.4%多聚甲醛4 ℃固定 20 min，1*PBS清洗 3 次,每次3min;
3.0. 2% Triton 100×细胞通透液（1*PBS液进行稀释），在室温条件下摇床上孵育通透 15 min，PBS 清洗3次，每次3 min;
4.3%正常山羊血清 37 ℃封闭 30 min，PBS 清洗3次，每次 3 min; 加入 100 μLFSHＲ兔多克隆抗体( 1∶ 50) ，4℃孵育过夜12h，
5.PBS清洗3次，每次5min;加入100μL FITC标记的鼠抗兔抗体 (1∶100) ，37℃孵育1h，1*PBS清洗3次，每次5min;
6.依次浸入ddH2O、50%乙醇、75%乙醇、100%乙醇进行脱水处理，浸入5s,1*PBS稀释DAPI染核(1ng/mL)，使用抗荧光衰减封片剂DaKo封片，激光共聚焦拍照，得颗粒细胞照片（见图1）。
原代颗粒细胞传代：
1.原代颗粒细胞培养4天后，细胞融合约70%-80%，用不含酚红胰酶消化3min；颗粒细胞变圆后，添加2倍完全培养基混合液停止培养。
2.细胞混悬液吸取至15ml离心管，1000rpm,3min离心。弃去上清，完全培养液吹打混匀，按照1:2进行传代。原代卵巢颗粒细胞可传至2-3代，细胞形态及功能良好，适于继续进行实验。
Claims (7)
1.一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及培养方法，具体步骤为：
（1）向雌性小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG；
（2）用颈椎脱臼法处死小鼠，分离小鼠卵巢，PBS清洗，显微镜下去除其周围脂肪和被膜；
（3）在混合操作液中用注射器针头刺破卵泡使颗粒细胞和卵母细胞释放出来，筛网过滤，滤液离心弃上清；
（4）混合完全培养基重悬细胞沉淀接种，
其特征在于，操作液为DME/F-12 1:1+3%胎牛血清+2%青链霉素混合液+2%支原体清除剂。
2.如权利要求1所述的一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及培养方法，其特征为小鼠采用3周龄，体重10-13g，未成熟的雌性小鼠。
3.如权利要求2所述的一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及培养方法，其特征为PMSG的注射量为5-10IU，注射方法为腹腔注射。
4.如权利要求3所述的一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及培养方法，其特征为PMSG的注射量为8IU。
5.如权利要求2-4所述的任一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及培养方法，其特征为处死小鼠时间是在注射后46-48h后。
6.如权利要求5所述的一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及培养方法，其特征为混合完全培养基为DMEM/F-12 1:1+15%胎牛血清+1%青链霉素+1%支原体清除剂混合液。
7.如权利要求6所述的一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及培养方法，其特征为细胞首次换液时间为24-48h，以后每40-48h更换一次培养基。
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