CN114438015B - 一种来源于卵巢的人颗粒细胞系及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种来源于卵巢的人颗粒细胞系及其制备方法与应用。该人颗粒细胞系为来源于卵巢的人颗粒细胞hGC‑YH，已于2021年12月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.45005。本发明所述的人颗粒细胞系贴壁率高、均匀度高、成活率高、稳定性强，是研究卵母细胞成熟机制、多囊卵巢综合症发病机制、女性生殖功能保护机理，及筛选促性腺激素治疗药物的良好实验材料。

Description

一种来源于卵巢的人颗粒细胞系及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于细胞技术领域。具体涉及一种来源于卵巢的人颗粒细胞系及其制备方法与应用。
背景技术
人卵巢颗粒细胞(granulosa cells，GCs)围绕于卵母细胞周围，其在不同阶段产生类固醇激素和生长因子，以旁分泌的方式调节卵泡生长发育。除此之外，卵巢GCs凋亡与卵泡闭锁密切相关。随着不孕患者日益增多，在辅助生殖治疗中，提高获取卵子的质量成为重点和难点。对卵巢GCs进行体外培养，进而对其增殖、凋亡等特点进行分析，可以为临床提高卵子质量提供新的思路。目前人们对人GCs体外培养的研究较少，GCs在体外能否进行连续传代，传代后是否保持其特性仍不确定；而且，目前尚无人颗粒细胞系的建立的报道。
因此，本发明意在提供一种可以在体外稳定传代的人卵巢颗粒细胞系。
发明内容
本发明的一个目的在于不仅能够将人颗粒细胞从卵巢中分离出来，体外进行原代培养，更能够进行传代培养，获得在体外可以稳定传代的人卵巢颗粒细胞系。
本发明的另一个目的在于提供上述来源于卵巢的人颗粒细胞系的应用为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
经过筛选，本发明获得了特性稳定、细胞均匀度高、细胞成活率高的来源于卵巢的人颗粒细胞系，该人颗粒细胞系为来源于卵巢的人颗粒细胞hGC-YH，已于2021年12月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，并证明存活，其保藏编号为CGMCC No.45005，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。
进一步地，本发明还提供了一种上述人颗粒细胞系的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)卵泡液的收集：收集行控制性促排卵患者穿刺取卵时的卵泡液；
(2)颗粒细胞沉淀混合物的制备：将所述卵泡液置于离心管中，离心，去上清液，沉淀物为人颗粒细胞、红细胞和白细胞的混合物；
(3)密度梯度离心法分离获取颗粒细胞：将所述颗粒细胞沉淀混合物吹打混匀后，加于3倍体积淋巴细胞分离液液面上，3000r/min离心10min，然后吸取上层白色层；加入PBS缓冲液，吹打混匀，1500r/min离心5min，去上清液，沉淀物即为人颗粒细胞；
(4)原代培养：用颗粒细胞完全培养液重悬步骤(3)获得的人颗粒细胞，在显微镜下进行细胞计数，调整细胞浓度为2×105个/ml，接种于培养皿中，置于孵箱中培养，隔天更换培养液；
(5)传代培养：当人颗粒细胞密度达到80％～90％时，弃上清，PBS洗涤，加入0.25％EDTA-胰蛋白酶消化，显微镜下观察细胞脱壁变圆时，用等体积颗粒细胞完全培养液终止消化，离心，PBS洗涤；弃上清后用颗粒细胞完全培养液重悬细胞，接种于培养皿，置孵箱中培养，每2-3天传一次代，体外培养到10代以后，细胞生长稳定，即获得稳定传代的人颗粒细胞系。
进一步的，上述方法中，所述颗粒细胞完全培养液是将DMEM/F12培养液89mL、胎牛血清(FBS)10mL、细胞用青链霉素(SK)1mL混合均匀制得。
第二方面，本发明还要求保护上述来源于卵巢的人颗粒细胞系在制备研究卵母细胞成熟机制、多囊卵巢综合症发病机制、女性生殖功能保护机理的细胞模型中的应用，以及在制备筛选促性腺激素治疗药物的细胞模型中的应用。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明来源于卵巢的人颗粒细胞系hGC-YH是从促排卵后穿刺取卵获得的卵泡液中分离建立的细胞系，具有颗粒细胞的特性，为人颗粒细胞。(2)在原代培养时期，由于颗粒细胞经历一个从体内到体外微环境的改变过程，颗粒细胞不容易存活，颗粒细胞的传代更是困难，现有技术中没有可以稳定传代的人卵巢颗粒细胞。而本发明利用密度梯度离心法分离出人颗粒细胞，并进行体外培养、扩增及连续传代，经过体外稳定传代10代以后，获得了可以稳定传代的人卵巢颗粒细胞系hGC-YH。(3)本发明细胞系贴壁率高、均匀度高、成活率高、稳定性强，是研究卵母细胞成熟机制、多囊卵巢综合症发病机制、女性生殖功能保护机理等的良好实验材料。(4)本发明细胞系稳定表达FSHR，可以作为筛选促性腺激素治疗药物的细胞模型。
保藏说明
参据的生物材料(株)：hGC-YH
建议的分类命名：人颗粒细胞
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2021年12月3日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.45005。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1：hGC-YH原代培养第1天的形态图。
图2：hGC-YH原代培养第5天的形态图。
图3：hGC-YH的P1代形态图。
图4：hGC-YH的P2代形态图。
图5：hGC-YH的P3代形态图。
图6：hGC-YH传代后培养的细胞增殖曲线图。
图7：hGC-YH的免疫荧光鉴定图。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面将通过具体的实施例进一步说明本发明的方案，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容，但不限于此。
实施例1来源于卵巢的人颗粒细胞的分离、原代培养、扩增培养及传代培养
一、标本来源
来源于首都医科大学附属北京妇产医院生殖医学科行辅助生殖技术治疗的不孕患者杨某某，获得本人的知情同意。
二、试剂
DMEM/F12培养液(Gibco，美国)；PBS缓冲液(Gibco，美国)；胎牛血清(FBS，Hyclone，美国)；细胞用青链霉素(HyClone，美国)；0.25％EDTA-胰蛋白酶(Sigma，美国)；淋巴细胞分离液(天津灏洋生物)；卵泡刺激素受体(FSHR)抗体(Proteintech，美国)。
颗粒细胞完全培养液的配制：DMEM/F12培养液89mL、胎牛血清(FBS)10mL、细胞用青链霉素(SK)1mL混合均匀。
三、方法
1.卵泡液的收集：
收集行控制性促排卵患者穿刺取卵时的卵泡液。
2.颗粒细胞沉淀混合物的制备：
将收集的卵泡液，1500r/min离心5min，上清液(即卵泡液)收集储存在-20℃备用，沉淀物即为人颗粒细胞、红细胞和白细胞的混合物。
3.密度梯度离心法分离获取颗粒细胞
将含有少量卵泡液的沉淀物吹打混匀后，将沉淀物缓慢加于3倍体积淋巴细胞分离液液面上，3000r/min离心10min，离心后吸取上层白色层(即颗粒细胞层)，加入PBS缓冲液，吹打混匀，1500r/min离心5min，去上清液，沉淀物即为人颗粒细胞。
4.原代培养
用颗粒细胞完全培养液(DMEM/F12+10％胎牛血清+1％细胞用青链霉素)重悬步骤(3)获得的人颗粒细胞，调整细胞浓度为2×105个/ml，接种于培养皿中。置于37℃、5％CO2的孵箱中培养，隔天更换培养液。
5.颗粒细胞的传代培养和扩增：
当人颗粒细胞的密度达到80％～90％时，去培养液，PBS洗涤2次，加入0.25％EDTA-胰蛋白酶，37℃消化3min。用等体积颗粒细胞完全培养液终止消化后，1500r/min离心5min，PBS洗涤两次。弃上清后用颗粒细胞完全培养液重悬细胞，按1:3比例接种于培养皿，镜下观察细胞密度，隔天更换培养液。连续传代培养至第10代以后，细胞生长稳定。
6.颗粒细胞的生长曲线绘制：
将人颗粒细胞以1.5×105/孔的密度均匀接种于24孔板，每3天换液。分别于培养的第1、3、5、7天(D1、D3、D5、D7)同一时间取3孔细胞，用0.25％EDTA-胰蛋白酶消化后计数，取平均值。以培养天数为横轴，细胞量为纵轴描绘生长曲线。
7.颗粒细胞的鉴定：
采用免疫荧光染色检测FSHR的表达。GCs均匀接种于爬片，72h后用PBS缓冲液洗3min×3次；4％多聚甲醛固定30min，PBS缓冲液3min×3次；0.1％Triton处理20min，PBS缓冲液3min×3次；3％FBS孵育30min；FSHR兔多克隆抗体(1:200)孵育，4℃过夜；PBS缓冲液洗3min×3次，荧光标记的二抗(1:200)常温避光孵育1h；PBS缓冲液洗3min×3次，用含有DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察。用PBS代替一抗作为阴性对照。
四、实验结果
收集行控制性促排卵穿刺取卵时的卵泡液中分离的人颗粒细胞，目前在体外连续传代已传代至20多代，已于2021年12月3日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，并证明存活，其保藏编号为CGMCC No.45005，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。
具体如下：
1.颗粒细胞的获取
收集的卵泡液经离心后获得沉淀物，沉淀物经密度梯度离心法获得人颗粒细胞。
2.颗粒细胞原代培养生长形态
分离的人颗粒细胞在接种后24h，显微镜下观察贴壁率约达70％，细胞呈单层贴壁生长，形状为多角形，伸出伪足相互连接，聚集成片；细胞折光性好，核大且圆，细胞质的颗粒均匀且丰富；在培养的第5天，细胞数量增加。(图1，图2)。
3.颗粒细胞连续传代情况
人颗粒细胞可进行连续传代，镜下观察细胞形态，逐渐由上皮样向成纤维样转变。P1代，GCs呈典型的上皮样形态，细胞紧密相连，形态不规则或呈多角形，中间有圆形核，见图3；P2代，GCs仍以上皮样形态为主，但出现成纤维状的细胞，呈短梭形或三角形，胞质向外伸出凸起，见图4；P3代，GCs以成纤维状为主，并在之后传代的过程中细胞均保持成纤维状，见图5。
4.颗粒细胞原代及传代培养增殖情况
人颗粒细胞传代培养在第1～5天为快速增殖期，第7天细胞增殖达到顶峰，之后进入平台期，见图6。
5.颗粒细胞的免疫荧光鉴定结果
免疫荧光检测来源于卵巢的人颗粒细胞的FSHR表达情况。结果显示FSHR在胞质内均阳性表达，胞质呈红染；胞核呈蓝染，见图7。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (3)

1.一种来源于卵巢的人颗粒细胞系，其特征在于，所述细胞系为人颗粒细胞hGC-YH，其保藏编号为CGMCC No.45005。
2.权利要求1所述的来源于卵巢的人颗粒细胞系在制备研究卵母细胞成熟机制、多囊卵巢综合症发病机制、女性生殖功能保护机理的细胞模型中的应用。
3.权利要求1所述的来源于卵巢的人颗粒细胞系在制备筛选促性腺激素治疗药物的细胞模型中的应用。
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