CN111040989A

CN111040989A - 一种鸭卵巢颗粒细胞的分离培养方法

Info

Publication number: CN111040989A
Application number: CN202010057220.3A
Authority: CN
Inventors: 张蕾; 朱睿; 章敬旗; 王健; 张海波
Original assignee: Jiangsu Agri Animal Husbandry Vocational College
Current assignee: Jiangsu Agri Animal Husbandry Vocational College
Priority date: 2020-01-19
Filing date: 2020-01-19
Publication date: 2020-04-21

Abstract

本发明涉及卵巢颗粒细胞的分离培养技术领域，具体涉及一种鸭卵巢颗粒细胞的分离培养方法，所述鸭卵巢颗粒细胞的分离培养方法，包括以下步骤：（1）将母鸭颈部放血处死，取出完整的卵巢；（2）剪取完整的排卵前卵泡，得到单颗排卵前卵泡；（3）将冲洗干净的单颗排卵前卵泡剪开，刮除卵黄后冲洗5次；（4）分别采用透明质酸酶和胰蛋白酶对清洗后的颗粒细胞层进行消化；（5）对消化后的颗粒细胞层进行重悬，并将细胞悬液加入培养基中用移液器反复吹打以使细胞分散；（6）对重悬后的细胞悬液进行恒温箱培养。采用本发明提供的分离培养方法得到的鸭卵巢颗粒细胞纯度高，活力高，且鸭卵巢颗粒细胞的成活率高。

Description

一种鸭卵巢颗粒细胞的分离培养方法

技术领域

本发明涉及卵巢颗粒细胞的分离培养技术领域，具体涉及一种鸭卵巢颗粒细胞的分离培养方法。

背景技术

随着畜牧业大规模集约化生产的快速发展，鸭的产蛋量是制约鸭产业化发展的极为重要的因素之一，亟待育种工作者解决。卵巢是雌性动物的主要繁殖器官，卵巢上卵泡的周期性变化是其最主要的生理活动。鸭的等级卵泡有严格的阶级发育体系，依次经由原始卵泡、小白卵泡、大白卵泡、小黄卵泡、大黄卵泡以及排卵前卵泡发育成熟。在这个过程中，鸭可以通过调控等级卵泡的数量及其闭锁来调节排卵的速度，进而影响其自身的产蛋性能。

卵泡颗粒细胞是卵泡发育和维持正常功能的重要条件，对维持卵巢繁殖功能发挥着极其重要的作用。有研究者发现，卵泡闭锁退化的过程是由卵泡中颗粒细胞的凋亡触发的，颗粒细胞的凋亡最终会导致卵泡的闭锁。在卵泡颗粒细胞中可以分泌类固醇激素、促卵泡素和促黄体素等激素，还可以产生一些细胞因子（孕酮、干细胞生长因子和表皮生长因子等），调控着卵泡和卵母细胞的生长发育。因此，探寻一种鸭卵巢颗粒细胞体外分离培养的方法，对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡机制进行深入的研究，对于阐明卵巢颗粒细胞对家禽的产蛋性能所发挥的调控机制有着重要的理论和实际意义。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种鸭卵巢颗粒细胞的分离培养方法，解决了目前尚未有完善及高效的鸭卵巢颗粒细胞分离培养方法的问题。

为了实现上述目的，本发明提供一种鸭卵巢颗粒细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

（1）将母鸭颈部放血处死，取出完整的卵巢，并用1%双抗DPBS溶液进行冲洗；并将冲洗干净的卵巢置于加有 37℃的1%双抗DPBS溶液的保温容器中，4小时内转移至细胞间；

（2）剪取完整的排卵前卵泡，单颗置于含有1%双抗DPBS溶液的培养皿中，剥离卵泡外的细膜和血管，得到单颗排卵前卵泡，接着用1%双抗PBS溶液冲洗；

（3）将冲洗干净的单颗排卵前卵泡剪开，刮除卵黄后含有1%双抗DPBS溶液的60 mm 新培养皿中依次冲洗5次；

（4）分别采用透明质酸酶和胰蛋白酶对清洗后的颗粒细胞层进行消化；

（5）对消化后的颗粒细胞层进行重悬，并将细胞悬液加入培养基中用移液器反复吹打以使细胞分散；

（6）吸取重悬后的细胞悬液用细胞筛过滤，收集过滤后的细胞悬液检测颗粒细胞密度，而后调整其密度在1×10⁶个/孔，35 mm培养皿分装，每皿吸取细胞悬液2mL，8%胎牛血清的培养基1mL，37℃、5% CO2恒温箱培养；

（7）培养24h换半液，48h 倒置显微镜下观察细胞形态，待颗粒细胞生长汇合率达到50%，换全液加入10% 胎牛血清的培养基继续培养。

优选条件下，所述母鸭为280-330日龄的母鸭。

优选条件下，在步骤（4）中，所述采用透明质酸酶对颗粒细胞层进行消化的方法为：将清洗后的颗粒细胞层置于5 mL 离心管中，加入1mL 1g/L的透明质酸酶，用眼科剪持续剪碎组织3min，并用移液器反复吹打使细胞分散，置于37℃水浴消化3min，而后加入1mL10% 胎牛血清的培养基终止消化。

优选条件下，在步骤（4）中，所述消化还包括：所述采用胰蛋白酶对颗粒细胞层进行消化的方法为：1500 rmp离心5 min，弃上清，加入1mL 0.25%胰蛋白酶，移液器反复吹打使细胞分散，置于37℃水浴消化3min，而后加入1mL 10% 胎牛血清的培养基终止消化。

优选条件下，所述步骤（5）的具体步骤为：将消化后的颗粒细胞层加入2 mL 10%胎牛血清的培养基进行重悬，并将细胞悬液用移液器移至10 mL 离心管中，再次加入3 mL 8%胎牛血清的培养基，用移液器反复吹打以使细胞分散。

优选条件下，在步骤（6）中，所述细胞筛为200目细胞筛。

优选条件下，在步骤（7）中，所述胎牛血清的浓度为10%。本发明还提供一种饲料，包括所述的用于增强体质、提高抗应激能力的饲料添加剂。

上述方法中所述含有胎牛血清的培养基中胎牛血清浓度为其体积百分比，培养基中的培养液为DMEM培养液。

通过上述技术方案，本发明具有以下技术效果：

本发明是针对鸭卵巢颗粒细胞分离培养而设计的方法，该分离培养方法具有以下优点。

（1）采用本发明提供的分离培养方法得到的鸭卵巢颗粒细胞纯度高，活力高，且鸭卵巢颗粒细胞的成活率高。

（2）本发明的提供的方法简单易行，经济实用，可操作性好。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

实施例1

一种鸭卵巢颗粒细胞分离培养方法，具体步骤如下：

（1）将健康的产蛋期（280-330日龄）高邮鸭母鸭，颈部放血处死，用75%酒精棉擦拭腹部羽毛，而后剪开皮肤，取出完整的卵巢，再用1%双抗的杜氏磷酸缓冲液（Dulbecco'sPhosphate Buffered Saline，DPBS）进行冲洗；

（2）将冲洗干净的卵巢置于加有 37℃ 1%双抗DPBS溶液的保温容器中，4小时内转移至细胞间；

（3）用高温消毒的眼科剪剪取完整的排卵前卵泡，单颗置于含有1%双抗DPBS溶液的60mm培养皿中，正置体式显微镜下用超细镊剥离卵泡外的细膜和血管，10mL注射器加1%双抗PBS溶液冲洗；

（4）将冲洗干净的单颗排卵前卵泡用眼科剪纵向剪开，用高温消毒的药品勺将大部分卵黄成分轻轻刮除，颗粒细胞层位于卵黄底部、卵泡膜上层，用高温消毒的镊子夹取颗粒细胞层放入含有1%双抗DPBS溶液的60 mm 新培养皿中依次冲洗5次，将卵黄洗净；

（5）将清洗后的颗粒细胞层置于5 mL 离心管中，加入1mL 1g/L的透明质酸酶，用眼科剪持续剪碎组织3min，并用移液器反复吹打使细胞分散，置于37℃水浴消化3min，而后加入1mL 10%FBS（胎牛血清）的培养基终止消化；

（6）1500 rmp离心5 min，弃上清，加入1mL 0.25%胰蛋白酶，移液器反复吹打使细胞分散，置于37℃水浴消化3min，而后加入1mL 10%FBS的培养基终止消化；

（7）1500 rmp离心5 min，弃上清，加入2 mL 10%FBS（胎牛血清）的培养基重悬细胞，并将细胞悬液用移液器移至10 mL 离心管中，再次加入3 mL 8%FBS的培养基，用移液器反复吹打以使细胞分散；

（8）吸取上述重悬后的细胞悬液用200目细胞筛过滤，收集过滤后的细胞悬液于10 mL离心管中，用血球计数板检测颗粒细胞密度，而后调整其密度在1×10⁶个，35 mm培养皿分装，每皿吸取细胞悬液2mL，8%FBS的培养基1mL，37℃、5% CO₂恒温箱培养；

（9）培养24h换半液，48h 倒置显微镜下观察细胞形态，待颗粒细胞生长汇合率达到50%左右，换全液加入10%FBS的培养基继续培养。

实验例

颗粒细胞免疫荧光鉴定。

（1）取出培养48h的鸭卵巢颗粒细胞，采用1%双抗DPBS溶液洗3次，每次3min，隔段时间轻摇一次，倒掉双抗DPBS溶液，加4％的多聚甲醛固定30min之后倒掉多聚甲醛，用1%双抗DPBS溶液清洗3次，3min/次，保湿避光。

（2）将鸭卵巢颗粒细胞在穿透液(0.05％的TritonX-100和1％的Tween-20溶于PBS溶液中)室温孵育30min后，倒掉穿透液，用1%双抗DPBS溶液清洗2次，2min/次；加入封闭液，37℃封闭1h，倒掉封闭液，用1%双抗DPBS溶液洗3次，3min/次。

（3）加入一抗稀释液兔抗鸭IgG，(一抗按照2μL:800μL一抗稀释液稀释)4℃孵育过夜，注意避光孵育，保湿。

（4）倒掉一抗孵育液，1%双抗DPBS溶液清洗3次，3min/次，加入二抗稀释液(1μL:800μL)37℃孵育1h，倒掉二抗稀释液，1%双抗DPBS溶液清洗3次，3min/次，注意避光孵育。加入用1%双抗DPBS溶液稀释好的DAPI(1ng/mL)核染溶液500μL，室温避光孵育10min，倒掉核染溶液，1%双抗DPBS溶液清洗3次，3min/次。

（5）观察在做成功的样品上在24h内镜检其细胞荧光。

实验结果：在倒置显微镜下对鸭颗粒细胞进行观察发现，刚分离出来的颗粒细胞呈椭圆形，饱满，透亮度好，培养24h的颗粒细胞贴壁良好，体积变大。颗粒细胞培养72h后虽然形态发生变化，但应用FITC免疫荧光鉴定发现，培养的细胞为颗粒细胞。DAPI核染后在荧光显微镜下观察，能清晰的看见细胞核。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种鸭卵巢颗粒细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（6）吸取重悬后的细胞悬液用细胞筛过滤，收集过滤后的细胞悬液检测颗粒细胞密度，而后调整其密度在1×10⁶个/孔，35 mm培养皿分装，每皿吸取细胞悬液2mL，8%胎牛血清的培养基1mL，37℃、5% CO₂恒温箱培养；

2.根据权利要求1所述的鸭卵巢颗粒细胞的分离培养方法，其特征在于，所述母鸭为280-330日龄的母鸭。

3.根据权利要求1所述的鸭卵巢颗粒细胞的分离培养方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述采用透明质酸酶对颗粒细胞层进行消化的方法为：将清洗后的颗粒细胞层置于5 mL离心管中，加入1mL 1g/L的透明质酸酶，用眼科剪持续剪碎组织3min，并用移液器反复吹打使细胞分散，置于37℃水浴消化3min，而后加入1mL 10% 胎牛血清的培养基终止消化。

4.根据权利要求3所述的鸭卵巢颗粒细胞的分离培养方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述消化还包括：所述采用胰蛋白酶对颗粒细胞层进行消化的方法为：1500 rmp离心5min，弃上清，加入1mL 0.25%胰蛋白酶，移液器反复吹打使细胞分散，置于37℃水浴消化3min，而后加入1mL 10% 胎牛血清的培养基终止消化。

5.根据权利要求1所述的鸭卵巢颗粒细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤（5）的具体步骤为：将消化后的颗粒细胞层加入2 mL 10%胎牛血清的培养基进行重悬，并将细胞悬液用移液器移至10 mL 离心管中，再次加入3 mL 8% 胎牛血清的培养基，用移液器反复吹打以使细胞分散。

6.根据权利要求1所述的鸭卵巢颗粒细胞的分离培养方法，其特征在于，在步骤（6）中，所述细胞筛为200目细胞筛。

7.根据权利要求1所述的鸭卵巢颗粒细胞的分离培养方法，其特征在于，在步骤（7）中，所述胎牛血清的浓度为10%。