CN114208770A - 一种获取无菌小鼠的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获取无菌小鼠的方法，涉及实验动物科学领域。通过体外受精获得受精卵，将发育成熟的受精卵通过胚胎移植技术移植到雌鼠的输卵管中，从而获得原雌鼠哺育的本源鼠仔，由此避免了代乳时鼠仔需要对供体雌鼠的适应期长(仔鼠进行母鼠识别)等问题的发生，提升了小仔的成活率。本发明提供的方法借助无菌传递窗将胚胎和受体假孕雌鼠传至无菌隔离包中，在无菌隔离包中实验胚胎的无菌转移，从而极大程度上避免了污染现象的发生。
Description
技术领域
本发明涉及实验动物科学领域，具体而言，涉及一种获取无菌小鼠的方法。
背景技术
目前获取无菌小鼠的方法包括如下步骤，流程参照图1所示：(1)根据目标小鼠的品系规定，在SPF生产规模种群中根据母鼠上次生仔日期寻找孕鼠，并通过摸胎技术对孕鼠子宫内的小仔转态做一个判断，选择适合的孕鼠；(2)、准备好剖腹产手术所需要的手术器械、准备好热水、制作并安装好渡槽，提前打开电热板；(3)、通过进一步摸胎技术发现孕鼠子宫内小仔状态最佳的时候准备开始剖腹产，配置39℃左右3％过氧乙酸；(4)、然后取出孕鼠子宫通过渡槽传入到无菌手术包救仔；(5)、等待小仔呼吸平稳，准备传入已经选择代乳的隔离包内代乳或授乳包内人工授乳；(6)、1周后对已获得小仔隔离包进行微生物检测，合格后继续饲养。
现有的获取无菌小鼠方法需要通过剖腹产来完成，存在供体数少、剖腹产代乳难、污染率高、小仔成活率低等问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种获取无菌小鼠的方法以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种获取无菌小鼠的方法，其包括：处死超排后的雌鼠和雄鼠，获得输卵管和附睾，取出卵子和精子体外受精后进行平衡并制备胚胎，通过无菌传递窗将胚胎和受体假孕雌鼠传入无菌隔离包内，吸取胚胎使其进入受体假孕雌鼠的输卵管，然后将携带胚胎的受体假孕雌鼠传入饲养包进行饲养。
发明人提供了一种获取无菌小鼠的方法，通过体外受精获得受精卵，将发育成熟的受精卵通过胚胎移植技术移植到雌鼠的输卵管中，从而获得原雌鼠哺育的本源鼠仔，由此避免了代乳时鼠仔需要对供体雌鼠的适应期长(仔鼠进行母鼠识别)等问题的发生，提升了小仔的成活率。本发明提供的方法借助无菌传递窗将胚胎和受体假孕雌鼠传至无菌隔离包中，在无菌隔离包中实验胚胎的无菌转移，从而极大程度上避免了污染现象的发生。
此外，本发明提供的方法也极大程度上精简了繁冗的受精卵获取步骤和胚胎转移步骤，从整体上提高了无菌小鼠的获取效率。本发明提供的方法也无须繁复的摸肽确认孕鼠子宫内小仔状态，无须为剖宫产选择最佳的剖宫时机，从根本上删减了胚胎转移前的剖宫处理步骤。本领域的技术人员借助本发明提供的方法可以更快捷的实现雌鼠中受精卵的收集，避免了由于剖宫时机不当造成小仔存活率低，也打破了供体数目对于无菌小鼠获取的技术上的限制，采用本发明提供的方法，本领域的技术人员可以直接取自然受精交配的受精卵进行体外培养，成熟后的受精卵直接无菌条件下胚胎移植到受体雌鼠的输卵管中，产仔后也无需寻找新的雌鼠进行哺乳，极大程度上提升了无菌小仔成活率。而无菌小鼠成活率地提升对于生命科学领域的基础研究具有重要意义。
本发明的目的在于：解决传统无菌净化小鼠只能通过剖腹产来完成，同时还解决了在新品系的获取时供体数少、剖腹产代乳难、污染率高、小仔成活率低等问题。
本发明提供的方法也可用于濒危动物资源的种质保存和快速建群。为净化种群的快速建立提供了捷径。
在其他实施方式中，也可以采用自然交配后获取的胚胎，通过无菌传递窗将胚胎和受体假孕雌鼠传入无菌隔离包内，进行后续胚胎进入输卵管、饲养。
在本发明应用较佳的实施方式中，选择雌鼠进行超排获得卵子，选择雄鼠获得精子然后通过体外授精的方法获得受精卵；在显微镜下用胚胎体外操作液和含双抗的DPBS溶液清洗受精卵；清洗后将受精卵移入胚胎培养液平衡。
胚胎体外操作液为M2培养液、CZB培养液或KSOM培养液，胚胎培养液为M16培养液。
M2培养液可以满足不在二氧化碳平衡条件下，使得受精卵处于恒定的pH条件中。M2培养液有助于受精卵收集过程中维持卵母卵丘细胞复合体内的稳态，M2培养液可以满足显微镜下长时间的二氧化碳培养箱外操作的需求。
在本发明应用较佳的实施方式中，清洗受精卵是指：先将由胚胎体外操作液冲出的受精卵在含有双抗的DPBS中清洗，然后再次置于新的胚胎体外操作液中清洗。
通过在含双抗的DPBS溶液中清洗以去除受精卵表面的杂质，在其他实施方式中，也可以选择在其他的清洗液中进行清洗。包括不限于：HBSS等含双抗的可用于细胞胚胎缓冲盐溶液。双抗可以防止胚胎污染。
在一种可选的实施方式中，将含双抗的DPBS溶液清洗后的受精卵置于新的胚胎体外操作液中重复清洗2-3次，以获得发育完整的受精卵。
在本发明应用较佳的实施方式中，平衡的条件为：37℃±0.5℃、5％CO2的培养箱中进行。培养箱中培养的pH为7.2-7.4。在培养箱中培养时，需要采用矿物油进行覆盖，以隔绝受精卵与外部环境。平衡的时间为30min-600min。
在本发明应用较佳的实施方式中，平衡后，对胚胎培养液进行预热，并在生物安全柜中将胚胎转移至冻存管中进行密封，用于后续传递至无菌隔离包中。
预热的温度是37℃。
在本发明应用较佳的实施方式中，采用手持气控方式吸取胚胎使其进入受体假孕雌鼠的输卵管内进行胚胎的着床发育。
在本发明应用较佳的实施方式中，胚胎为原核期-囊胚期细胞期的胚胎。
在本发明应用较佳的实施方式中，方法还包括对培养胚胎的试剂、无菌隔离包、转移胚胎的试剂、饲养包进行微生物采样检测。所有微生物检测合格后，在18d-20d(从移植胚胎的时间起算)获得新生的无菌小鼠。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过体外受精获得受精卵，将发育成熟的受精卵通过胚胎移植技术移植到雌鼠的输卵管中，从而获得原雌鼠哺育的本源鼠仔，由此避免了代乳时鼠仔需要对供体雌鼠的适应期长(仔鼠进行母鼠识别)等问题的发生，提升了小仔的成活率。本发明提供的方法借助无菌传递窗将胚胎和受体假孕雌鼠传至无菌隔离包中，在无菌隔离包中实验胚胎的无菌转移，从而极大程度上避免了污染现象的发生。
此外，本发明提供的方法也极大程度上精简了繁冗的受精卵获取步骤和胚胎转移步骤，从整体上提高了无菌小鼠的获取效率。本发明提供的方法也无须繁复的摸肽确认孕鼠子宫内小仔状态，无须为剖宫产选择最佳的剖宫时机，从根本上删减了胚胎转移前的剖宫处理步骤。本领域的技术人员借助本发明提供的方法可以更快捷的实现雌鼠中受精卵的收集，避免了由于剖宫时机不当造成小仔存活率低，也打破了供体数目对于无菌小鼠获取的技术上的限制，采用本发明提供的方法，本领域的技术人员可以直接取自然受精交配的受精卵进行体外培养，成熟后的受精卵直接无菌条件下胚胎移植到受体雌鼠的输卵管中，产仔后也无需寻找新的雌鼠进行哺乳，极大程度上提升了无菌小仔成活率。而无菌小鼠成活率地提升对于生命科学领域的基础研究具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为现有剖腹手术获取无菌小鼠的技术路线图；
图2为实施例1提供的获取无菌小鼠的技术路线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本文所用的术语“无菌动物”(GF)是指不能检出任何活的微生物和寄生虫的动物。从微生物学的观点看，通常实验动物的体内和体外带有寄生虫，体内还常带有细菌和病毒，而且还都难于排除某些潜在的传染病。此外，普通实验动物的血清中含有抗体。所以用普通动物进行医学科学研究，将会存在各种各样的干扰，实验结果往往不确切。使用无菌动物作实验就可以克服普通实验所存在缺点，使实验结果正确可靠。无菌动物是一种非常规动物，仅适用于特殊研究目的，如微生物与宿主、微生物间的相互作用，免疫发生发展机制，放射医学等方面的研究。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种获取无菌小鼠的方法，技术路线参照图2所示，具体包括如下依次进行的步骤：
①、提前对日常所用的培养胚胎的试剂及麻醉剂做2次以上的无菌验证(参照常规的无菌验证方法)；
②、对无菌移植所需要的隔离包进行清洗和仪器物品进行高压或者过氧化氢灭菌，灭菌7天后进行微生物采样，2周后进行第二次微生物采样；
③、选择合适周龄的雌雄鼠，对雌鼠进行超数排卵。步骤如下：
雌鼠3.5-4周龄，12-15g，间隔48h腹腔注射PMSG和HCG；
雄鼠，3-6个月，实验前先试配然后至少单放一周；
④、通过处死供体雄鼠，取出精子放入c-TYH精子获能皿中；
通过处死供体雌鼠，取出雌鼠两侧输卵管，放入HTF受精皿中。
⑤、在显微镜下用显微镊取出输卵管中的卵子团；
⑥、取适量获能后的精子放入HTF受精皿中；
⑦、将受精皿中体外受精后的胚胎放入含有双抗的DPBS中清洗，挑选出完好的受精卵放入M2培养液中再次清洗2-3个液滴，获得发育完整的受精卵；
⑧、将获得的发育完整的受精卵(胚胎)放置于覆盖矿物油的M16培养基中，放入37℃、5％CO2、pH为7.2-7.4的培养箱中平衡30min以上；
⑨、将新的M2培养液提前预热至37摄氏度，在生物安全柜将胚胎转移至冻存管中密封；
⑩、将传递窗灭菌后，经过传递窗将受体假孕雌鼠和冻存管传入无菌隔离包内；
本实施例的怀孕率、生在率和存活率如下表所示：
本发明最大的优势在于提高无菌小鼠的获取效率，减少新品系无菌小鼠的获取时间。通过IVF少量的供体可获取大量的无菌胚胎，再将无菌的胚胎细胞移植到无菌的受体鼠上，使之自然生仔；省去的传统剖腹产摸胎不准确，准备无菌手术包及提前选择代乳鼠或者人工授乳等一系列的操作。此外，无菌胚胎只需要将无菌的胚胎细胞移植到无菌的受体内，减去了人工代乳的不确定性，减少了子宫传递、小仔传递过程中感染微生物的风险，保证了无菌受体自然生仔的小仔成功率。
对比例1
重复实施例1，区别仅在于，步骤⑧、将获得的发育完整的受精卵(胚胎)放置于覆盖矿物油的M16培养基中，放入37℃、7％CO2、pH为7.2-7.4的培养箱中平衡30min。无菌仔鼠共获得20只，存活率为74.8％。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种获取无菌小鼠的方法，其特征在于，其包括：处死超排后的雌鼠和雄鼠，获得输卵管和附睾，取出卵子和精子体外受精后将受精卵进行清洗平衡以获得可用胚胎，通过无菌传递窗将胚胎和受体假孕雌鼠传入无菌隔离包内，吸取胚胎使其进入所述受体假孕雌鼠的输卵管，然后将携带胚胎的所述受体假孕雌鼠传入饲养包进行饲养。
2.根据权利要求1所述的获取无菌小鼠的方法，其特征在于，选择雌鼠进行超排获得卵子，选择雄鼠获得精子然后通过体外授精的方法获得受精卵；在显微镜下用胚胎体外操作液和含双抗的DPBS溶液清洗受精卵；清洗后将受精卵移入胚胎培养液平衡。
3.根据权利要求2所述的获取无菌小鼠的方法，其特征在于，所述胚胎体外操作液为M2培养液、CZB培养液或KSOM培养液，所述胚胎培养液为M16培养液。
4.根据权利要求2所述的获取无菌小鼠的方法，其特征在于，所述清洗受精卵是指：先将由胚胎体外操作液冲出的受精卵在含有双抗的DPBS中清洗，然后再次置于新的胚胎体外操作液中清洗；
优选地，在新的胚胎体外操作液中重复清洗2-3次。
5.根据权利要求2所述的获取无菌小鼠的方法，其特征在于，所述平衡的条件为：37℃±0.5℃、5％±0.5％CO2的培养箱中进行。
6.根据权利要求5所述的获取无菌小鼠的方法，其特征在于，所述平衡的时间为30min-600min。
7.根据权利要求5所述的获取无菌小鼠的方法，其特征在于，所述平衡后，对所述胚胎培养液进行预热，并在生物安全柜中将所述胚胎转移至冻存管中进行密封，用于后续传递至无菌隔离包中。
8.根据权利要求1所述的获取无菌小鼠的方法，其特征在于，采用手持气控方式吸取胚胎使其进入所述受体假孕雌鼠的输卵管内进行胚胎的着床发育。
9.根据权利要求8所述的获取无菌小鼠的方法，其特征在于，所述胚胎为原核-囊胚细胞期的胚胎。
10.根据权利要求1所述的获取无菌小鼠的方法，其特征在于，所述方法还包括对培养胚胎的试剂、无菌隔离包、转移胚胎的试剂、饲养包进行微生物采样检测。
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