CN107523538A - 一种胚胎体外培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胚胎体外培养方法，具体步骤如下：1)在胚胎培养前将胚胎培养液放入培养皿中，置于CO2、O2和平衡N2的气氛中；2)将受精卵放入透明质酸酶中，静止，吸取部分上清液体弃掉，剩余液体在震荡器上震荡得到混合液；3)混合液中加入SOF‑HEPES，然后移至平皿中，将胚胎清洗多次后，放入步骤1)的培养皿中，培养第3天加入5％血清，待囊胚形成即可。本发明的一种胚胎体外培养方法中主要是去除矿物油的添加，解决覆盖矿物油对添加药物吸附的影响，使添加药物的真实作用效果得以体现，同时无矿物油添加培养体系也能达到体外胚胎培养的预期效果。

Description

一种胚胎体外培养方法
技术领域
本发明属于胚胎培养技术领域，具体涉及一种胚胎体外培养方法。
背景技术
卵母细胞体外培养是胚胎体外生产的主渠道，培养的效果受动物品种、培养液成份、操作熟练程度等多种因素影响。目前，动物卵母细胞体外培养通常是在四孔培养板或培养皿中添加培养液并在培养液上方覆盖矿物油进行培养。
但是在实际试验中我们发现矿物油会对培养液中添加的部分药物具有吸附作用，降低添加药物的作用效果，掩盖添加药物对牛胚胎发育的真实效果。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种胚胎体外培养方法。本发明的方法通过在胚胎体外培养方法中在培养液上方不覆盖矿物油的方法，使添加药物的真实作用效果得以体现，同时无矿物油添加培养体系也能达到体外胚胎培养的预期效果。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种牛胚胎体外培养方法。
本发明还要解决的技术问题是提供了所述的培养方法培养得到的胚胎。
技术方案：为了解决上述问题，本发明提供了一种胚胎体外培养方法，包括以下步骤：
1)在胚胎培养前将胚胎培养液放入培养皿中，置于CO2、O2和平衡N2的气氛中；
2)将受精卵放入透明质酸酶中，静止，吸取部分上清液体弃掉，剩余液体在震荡器上震荡得到混合液；
3)混合液中加入800～1000μl预先在二氧化碳培养箱中平衡处理的SOF-HEPES液体，然后用移液枪将含有SOF-HEPES的混合液移至平皿中，将胚胎清洗多次后，放入步骤1)所述的培养皿中，培养第3天加入3～5％血清，待囊胚形成即可。
其中，上述步骤1)的胚胎培养液的主要组成成分是KSOMaa和BSA。
KSOM培养基添加氨基酸，是一个成形产品，购买公司为Zenith Biotech，购买网址链接http://www.zenithbiotech.com/MediaForEmbryoCulture.html。
其中，上述BSA在胚胎培养液中的浓度为4mg/ml。
其中，上述步骤1)的培养皿为4孔培养皿，每孔胚胎培养液有300～500μl。
其中，上述步骤2)的透明质酸酶加入量为500～600μl，所述透明质酸酶浓度为1.0mg/ml。
其中，上述步骤3)中的胚胎清洗次数为3次，胚胎清洗方法为：分别用移液枪吸取SOF-HEPES液体100～200μl，做成液滴1和液滴2，用移液枪吸取预先在二氧化碳培养箱中平衡处理2h以上的胚胎培养液100～200μl，做成液滴3，用拣卵针在体式显微镜下拣取含有SOF-HEPES的混合液中的受精卵至液滴1，再用拣卵针将受精卵从液滴1 中拣取至液滴2，再从液滴2中拣取至液滴3，共完成3次清洗。
其中，在胚胎体外培养过程中胚胎培养液每天进行更换新鲜的胚胎培养液。
其中，上述胚胎为牛胚胎或小鼠胚胎，但本发明的方法并不仅限于牛或小鼠的胚胎，其他动物的胚胎均适用。
本发明内容还包括所述的培养方法培养得到的胚胎。
有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：本发明的一种胚胎体外培养方法中主要是在常规培养方法中去除矿物油的添加，解决覆盖矿物油对添加药物吸附的影响，使添加药物的真实作用效果得以体现，同时无矿物油添加培养体系也能达到体外胚胎培养的预期效果。
附图说明
图1、牛卵母细胞体外培养程序流程图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，通过结合实施例和附图进一步详述本发明的特点和优点。所该实施例仅是对本发明的解释，不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
实施例1：
本发明利用无矿物油添加培养体系开展牛胚胎体外培养，具体方法如下：
1.准备工作
在胚胎培养前3小时准备胚胎培养液，准备4孔培养皿，每孔500μl培养液，每孔放50个胚胎，无须覆盖矿物油，放入5％CO2、5％O2和平衡N2中；
2.胚胎体外培养操作
将受精卵收集好后，放入含600μl的透明质酸酶中，沉淀30s，吸取上清液体至100μl，震荡器上震荡5min；加入1ml SOF-HEPES到离心管中，将所有液体移至1000mm平皿中，将胚胎清洗3次后(胚胎清洗方法参见说明书发明内容部分)，放入上述胚胎培养板中，培养第3天加入5％血清，第7天判断囊胚形成率。
表1 SOF-HEPES(500ml)配置
成分 货号 浓度 添加量
NaCl S5886 107.7mM 3.145g
KCl P5405 7.16mM 0.265g
KH2PO4 P5655 1.19mM 0.080g
MgCl2-6H2O M2393 0.49mM 0.05g
Na Lactate L4263(liquid) 5.3mM 0.379mL
CaCl2-2H2O C7902 1.71mM 0.125g
Fructose F3510 0.5mM 0.045g
HEPES H4034 21mM 2.979g
MEM-NEAA M7145 1X 2.5mL
BME-EAA B6766 1X 5mL
NaHCO3 S5761 4mM 0.168g
Na pyruvate P4562 0.33mM 0.018g
Glutamax(Gibco) 35050 1mM 2.5mL
BSA A-3311 1mg/mL 0.5g
Gentamicin(10mg/mL stock) G-1397 5ug/mL 2.5mL
Water W1503 To 500mL
上述所有涉及药品和水均购自Sigma公司，所有药品加450ml水后开始调节PH值至7.4后，加水至500ml即可，过滤储存。
3、添加不同剂量的透明质酸酶对胚胎发育的影响
表2 不同剂量的透明质酸酶对胚胎发育的影响
4、添加不同浓度的FBS(犊牛血清)对囊胚发育的影响
表3 不同浓度的FBS(犊牛血清)对囊胚发育的影响
对比例1
常规牛胚胎培养方法：
将受精卵用移液枪移入1.5ml的离心管中，在震荡器上震荡1分钟，将受精卵用SOF-HEPES充分洗涤2次，再用胚胎培养液洗涤1次，每25个受精卵移入已平衡2h以上覆盖矿物油的50μl胚胎培养微滴中培养，在培养第3天加5％左右的犊牛血清，第7 天评估胚胎的发育情况。
实验例1
我们利用GSK-J4(一种细胞可渗透前药，其是组蛋白3第27位赖氨酸上三甲基化脱甲基酶的抑制剂)添加到牛胚胎培养液中，检验其对胚胎发育的影响，结果发现了矿物油对添加药物的吸附作用，具体胚胎发育率(％)结果如下：
(一)培养期间不更换培养液
在无矿物油覆盖和有矿物油覆盖的实验中，在牛胚胎发育至2细胞、4细胞、8细胞和囊胚等4个阶段的比率基本一致，说明是否添加矿物油覆盖培养液对于牛胚胎发育结果没有影响，从而证明的无矿物油添加的牛胚胎培养体系的可行性。结果如表4。
表4 胚胎培养液中不添加GSK-J4
在第一个实验的基础上，我们在培养液中添加5μm浓度的GSK-J4，观察GSK-J4 对牛胚胎的发育影响，结果显示，培养液上方无矿物油覆盖组中5μm GSK-J4能够显著抑制牛胚胎发育至4细胞、8细胞和囊胚，而有矿物油覆盖组其4细胞、8细胞和囊胚的形成率明显高于无矿物油覆盖组。说明：5μm浓度的GSK-J4在无矿物油覆盖的培养体系中能够起到抑制牛胚胎发育的效果，而添加矿物油覆盖组的高发育率印证了矿物油对于添加药物的吸附效果，导致影响减弱。结果如表5。
表5 胚胎培养液中添加浓度为5μm GSK-J4
我们也添加了10μm和15μm浓度的GSK-J4，影响牛胚胎发育的趋势与5μm组类似，再次验证了添加矿物油覆盖组的高发育率源于矿物油对于添加药物的吸附效果，导致其影响减弱。具体结果见表6和7。
表6 胚胎培养液中添加浓度为10μm GSK-J4
表7 胚胎培养液中添加浓度为15μm GSK-J4
(二)培养期间更换培养液
为了确保无矿物油覆盖的培养液在培养期内对牛胚胎培养的效果，我们对两组处理进行每天更换培养液处理，结果两组处理在不添加GSK-J4实验中，2细胞、4细胞、8 细胞和囊胚的发育率结果基本一致，再次验证了无矿物油覆盖能够达到传统牛胚胎培养中培养液上方覆盖矿物油的培养效果，说明不添加矿物油在减少操作程序，降低试验成本的基础上是可行的方案。结果见表8。
表8 胚胎培养液中不添加GSK-J4
我们采用每天更换培养液的方法进行胚胎培养试验，试验分覆盖矿物油和不覆盖矿物油两组，重复添加了5μm、10μm和15μm三个浓度的GSK-J4，结果胚胎发育率的结果与不更换培养液处理组类似。说明培养期间不添加矿物油且不更换培养液不影响胚胎的发育，具体结果见表9-11。
表9 胚胎培养液中添加浓度为5μm GSK-J4
表10 胚胎培养液中添加浓度为10μm GSK-J4
表11 胚胎培养液中添加浓度为15μm GSK-J4
但从每天更换培养液的各组别结果中发现，胚胎发育到至4细胞、8细胞和囊胚比例均低于不更换培养液组，说明未更换培养液组中的矿物油对GSK-J4的吸附，降低了其在培养阶段的作用效果，具体结果见表12-14。
表12 不覆盖矿物油且胚胎培养液中添加浓度为5μm GSK-J4
表13 不覆盖矿物油且胚胎培养液中添加浓度为10μm GSK-J4
表14 不覆盖矿物油且胚胎培养液中添加浓度为15μm GSK-J4
(三)培养液渗透压指标
培养液渗透压对牛胚胎的发育有较大的影响，为了确保无覆盖矿物油和不更换培养液能够达到培养效果，我们对培养液的渗透压进行了测试，结果均在正常渗透压 290-300mOsm/kg。说明无覆盖矿物油和不更换培养液的简便胚胎培养方法在胚胎培养期间不影响培养液的渗透压变化，该培养方式能够达到覆盖矿物油进行胚胎培养的效果。
表15 胚胎培养液的渗透压测定值
上述实验表明：培养液上方无矿物油覆盖并在培养过程中无须更换培养液，对于牛胚胎培养是一种简便有效的培养方法，且能避免矿物油对处理药物的吸附作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种胚胎体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在胚胎培养前将胚胎培养液放入培养皿中，置于CO2、O2和平衡N2的气氛中；
2)将受精卵放入透明质酸酶中，静止，吸取部分上清液体弃掉，剩余液体在震荡器上震荡得到混合液；
3)混合液中加入800～1000μl预先在二氧化碳培养箱中平衡处理的SOF-HEPES液体，然后用移液枪将含有SOF-HEPES的混合液移至平皿中，将胚胎清洗多次后，再用拣卵针将清洗后的胚胎放入步骤1)所述的培养皿中，培养第3天加入3～5％血清，待囊胚形成即可。
2.根据权利要求1所述的一种胚胎体外培养方法，其特征在于，所述步骤1)的胚胎培养液的主要组成成分为KSOMaa和BSA。
3.根据权利要求1所述的一种胚胎体外培养方法，其特征在于，所述步骤1)的培养皿为4孔培养皿，每孔胚胎培养液有300～500μl。
4.根据权利要求1所述的一种胚胎体外培养方法，其特征在于，所述步骤2)的透明质酸酶加入量为500～600μl，所述透明质酸酶浓度为1.0mg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种胚胎体外培养方法，其特征在于，所述步骤3)中的胚胎清洗次数为3次，胚胎清洗方法为：分别用移液枪吸取SOF-HEPES液体100～200μl，做成液滴1和液滴2，用移液枪吸取预先在二氧化碳培养箱中平衡处理2h以上的胚胎培养液100～200μl，做成液滴3，用拣卵针在体式显微镜下拣取含有SOF-HEPES的混合液中的受精卵至液滴1，再用拣卵针将受精卵从液滴1中拣取至液滴2，再从液滴2中拣取至液滴3，共完成3次清洗。
6.根据权利要求1所述的一种胚胎体外培养方法，其特征在于，在胚胎体外培养过程中胚胎培养液每天进行更换新鲜的胚胎培养液。
7.根据权利要求1所述的一种胚胎体外培养方法，其特征在于，所述胚胎为牛胚胎或小鼠胚胎。
8.权利要求1～7任一项所述的培养方法培养得到的胚胎。
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