CN105557621B - 快速高效获得无菌哺乳动物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种快速高效获得无菌哺乳动物的方法，包括：a).获得雄性哺乳动物的精子并使所得精子获能；b).获得雌性哺乳动物的卵子；c).利用步骤a)获得的精子与步骤b)获得的卵子制备受精卵；d).获得无精雄性哺乳动物；e).制备假孕雌性哺乳动物；f).利用步骤c)获得的受精卵制备胚胎；g).获得含有步骤f)所得胚胎的假孕雌性哺乳动物；和h).无菌培养步骤g)获得的雌性哺乳动物，得到无菌哺乳动物。该方法具备时间短、见效快、效率高、饲养群体小的优点，从而能快速高效地提供无菌哺乳动物用于各种用途。

Description

快速高效获得无菌哺乳动物的方法

技术领域

本发明涉及实验动物科学领域。具体地说，本发明涉及一种快速高效获得无菌哺乳动物的方法以及所获得的无菌哺乳动物的用途。

背景技术

随着医学和生物学的迅猛发展，作为生命科学支撑条件的实验动物学也得到了前所未有的重视，不但实验动物学研究内容进一步拓展、加深；而且对于高级别的实验动物的需求也越来越多，要求越来越严格。从普通级别实验动物的被取消，到清洁级动物，无特定病原体动物(Specific pathogen-free animal,SPF)的大量需求，再到无菌动物包括各种已知微生物的实验动物(悉生动物)，为生命科学的研究的精细化、数量化、稳定可重复性提供了支撑。

然而，各种高级别的实验动物必须饲养在特定的SPF屏障系统中，而无菌动物饲养的条件更加严格，稍有不慎很容易感染细菌病毒，即使是非致病菌，也造成了微生物等级的下滑。低级别的实验动物必须通过环境消毒配合生物净化的手段来重新获得高级别实验动物。

传统的生物净化为剖腹取胎，即将待净化的动物交配怀孕，等到接近临盆的时候，剖腹，连同子宫和胎儿通过净化药液进入隔离手术操作器内，剖开子宫取出胎儿，待胎儿能自由呼吸后传送给带奶母鼠，哺乳到断奶。这种传统的剖腹取胎的方式的缺点在于：1、当发生大规模污染时，不能尽快的恢复较大的种群，需要时间间隔较长；2、剖腹取胎容易造成剖腹过程中仔鼠死亡，主要由于仔鼠肺部不能及时张开自主呼吸；3、剖腹取胎的仔鼠容易被带奶母鼠吃仔，因为带奶母鼠天然的母性，会将不是自己所生的仔鼠咬死，甚至吃仔。

现有技术中虽然也有一些其它替代方法，但对于最高级别的实验动物-无菌动物而言，这些方法依然存在存活率低(不足50％)、净化所需要时间周期长(60天左右)、种群大(制备代乳母鼠的雌鼠及与之交配的雄鼠；需要生物净化的雌鼠及与之交配的雄鼠)等缺陷。

因此，本领域急需一种快速、高效、简便而且成功率高的无菌哺乳动物制备方法，从而能够用于生物学或医学研究工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、高效、简便而且成功率高地制备无菌哺乳动物的制备方法，以及采用本发明方法制备得到无菌哺乳动物作为标准实验动物的用途。

在第一方面，本发明提供一种无菌哺乳动物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

a).获得雄性哺乳动物的精子并使所得精子获能；

b).获得雌性哺乳动物的卵子；

c).利用步骤a)获得的精子与步骤b)获得的卵子制备受精卵；

d).获得无精雄性哺乳动物；

e).制备假孕雌性哺乳动物；

f).利用步骤c)获得的受精卵制备胚胎；

g).获得含有步骤f)所得胚胎的假孕雌性哺乳动物；和

h).无菌培养步骤g)获得的雌性哺乳动物，得到无菌哺乳动物。

在优选的实施方式中，步骤d)、e)和f)在36℃-37℃的温度以及45％-70％的湿度下进行。

在优选的实施方式中，步骤d)、e)和f)在36.5℃-37℃的温度以及50％-60％的湿度下进行。

在优选的实施方式中，步骤b)所述的雌性哺乳动物是超排卵雌性哺乳动物。

在优选的实施方式中，所述超排卵雌性哺乳动物是通过给予药物获得，或者是经遗传改造获得的，或者商品化购得。

在优选的实施方式中，步骤d)所述的无精雄性哺乳动物通过给予药物获得，或者是经遗传改造获得，或者商品化购得。

在优选的实施方式中，步骤f)制备的胚胎是2-8细胞期胚胎，优选2细胞期胚胎。

在优选的实施方式中，所述哺乳动物选自小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、狗、或猴。

在优选的实施方式中，所述哺乳动物是小鼠、大鼠或豚鼠。

在优选的实施方式中，所述方法还包括利用步骤h)获得的无菌哺乳动物制备悉生哺乳动物。

在优选的实施方式中，本发明方法获得无菌哺乳动物的存活率为≥30％，优选≥50％；最优选≥70％。

在第二方面，本发明提供通过本发明第一方面所述方法制备的哺乳动物作为标准实验动物的用途。

在优选的实施方式中，所述哺乳动物可用于研究某些疾病的病原、研究微生物与宿主、微生物间的拮抗作用、研究病毒病、研究细菌学、免疫发生发展机制、放射医学等等。

在优选的实施方式中，所述哺乳动物选自小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、狗、或猴；优选地，所述哺乳动物是小鼠、大鼠或豚鼠。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现在特定的温度和湿度下，结合体外受精-胚胎移植技术，可以迅速、方便地完成低微生物级别的生物净化工作；由于胚胎直接移植给高级别的假孕母兽，这样可以让假孕母兽自然分娩，自然哺乳，避免了剖腹取胎中出现的仔兽的死亡和被死亡，从而显著提高仔鼠的存活率。在此基础上完成了本发明。

本文所用的术语，“悉生动物”(Gnotobiotic animal)，也称为已知菌动物或已知菌丛动物(Animal with Known Bacterial Flora)，是指采用与无菌动物相同的方法取得饲养(剖腹取胎，在隔离器内饲养)、但明确给予已知微生物的动物，即，含有已知的单菌(Monoxenie)、双菌(Dixenie)、三菌(Trixenie)或多菌(Polyxenie)的动物。

悉生动物的培育、悉生状态的维持、悉生动物与其体内外栖息体或栖息体间以宿主为载体展开的相互竞争、拮抗的复杂生态过程，以及这种过程导致的后果的控制和利用，称为悉生动物学。实验动物在现代化发展过程中，吸取悉生动物的净化与悉生工程的屏障技术，发展了以控制动物体内外微生物寄生虫为核心的实验动物的环境控制，并以这种生物控制为标准，把实验动物分为以下几个级别：1)无菌实验动物(Germ-free animal)；2)悉生实验动物(Gnotobiotic animal)：包括无抗体实验动物(Antibody-free animal)、已知微生物体实验动物(Gnotophoric animal)；3)无特定病原体实验动物(Specificpathogen-free animal)；4)清洁级实验动物(Cleaning animal)；和5)普通级实验动物(Conventional animals)。2001年颁布的《实验动物质量管理办法》和《实验动物许可证管理办法》中明确不再提供普通级实验动物，实验动物必须达到清洁级或以上标准。

高级别实验动物在医学和生命科学的运用，保证了实验结果的可靠性、可重复性、精确性，并能以最小数量的实验动物获得最多的、可用的实验数据，这也符合国际实验动物领域一直宣传的3R原则(减量化(reducing)，再利用(reusing)和再循环(recycling))。清洁级实验动物是目前国内科研工作主要要求的标准实验动物，适用于大多数科研实验。无特定病原体实验动物(SPF)是理想的健康动物，用它来研究，可排除疾病或病原的干扰，适用于所有科研实验、生物制品生产及检定，是国际公认的标准实验动物。

本文所用的术语“无菌动物”(GF)是指不能检出任何活的微生物和寄生虫的动物。从微生物学的观点看，通常实验动物的体内和体外带有寄生虫，体内还常带有细菌和病毒，而且还都难于排除某些潜在的传染病。此外，普通实验动物的血清中含有抗体。所以用普通动物进行医学科学研究，将会存在各种各样的干扰，实验结果往往不确切。使用无菌动物作实验就可以克服普通实验所存在缺点，使实验结果正确可靠。无菌动物是一种非常规动物，仅适用于特殊研究目的，如微生物与宿主、微生物间的相互作用，免疫发生发展机制，放射医学等方面的研究。例如，无菌动物可用于研究某些疾病的病原：无菌动物可提供组织培养的无菌组织；可提供具有某一种菌的已知菌动物；也可研究病原体的致病作用与机体本身在内的关系，如猫瘟病毒，正常猫易感染，无菌则不易受感，说明感染受肠道微生物的影响；研究微生物间的拮抗作用：菌群之间的拮抗作用是生物屏障的一种。生物屏障可能比物理屏障更有效。生物屏障原理为生物间的拮抗作用。如利用无菌动物来研究哪种菌可拮抗假单孢菌，对放射研究甚为重要，因照射后常出现此菌。又如在把无菌动物放入SPF环境前，先分别给无菌动物喂以大肠杆菌、乳酸杆菌、链球菌、白色葡萄球菌、梭状芽孢杆菌等五种菌群，再观察这些菌群间的拮抗作用；研究病毒病：无菌动物是研究病毒病、病毒性质、纯病毒、安全疫苗和单一特异性抗血清的有用工具；或研究细菌学：尤其是肠道正常菌丛细胞间的相互拮抗性及细胞和宿主间的关系的研究。

由于无菌动物体内无任何可检出的微生物，使实验简洁明确，给研究带来极大方便。在精确试验中，鉴于动物体内外的寄生虫与微生物会干扰试验的结果，最好选择无菌动物或悉生动物(GA)。

然而，饲养在隔离器内的高级别的实验动物很容易受到各种因素的污染，例如进出隔离器的水、饲料没有高压消毒彻底，造成污染而降低微生物级别；其它因素，例如隔离器组装不严密，隔离器本身零部件以及环境消毒不彻底、工作人员操作的不规范，都会造成高级别的实验动物感染细菌、病毒、甚至是致病菌，严重影响动物质量、影响各种动物实验结果，甚至影响相关工作人员的健康。这时，必须采取生物净化的方法来恢复实验动物种群的微生物质量。

传统的生物净化方式主要是剖腹取胎，利用绝大部分细菌病毒不能通过胎盘垂直传播，首先选择需要生物净化的雌雄鼠，交配，同时选择高微生物级别的恰当的雌雄鼠，提前一天交配，选择配上的母鼠作为未来仔鼠的代乳母鼠。代乳母鼠等待其自然分娩，而待净化的母鼠，在分娩当天，接近其分娩的时刻(注意观察，等到母鼠快要耻骨联合开时)，立刻无痛处死母鼠，剖腹取出子宫，连同子宫内的胎儿通过消毒液槽进入隔离手术操作包，在隔离操作包内剖开子宫，清洗仔鼠口鼻处的消毒粘液，待其自然呼吸后，用传递罐传到代乳母鼠窝内。为了能让代乳母鼠哺乳，代乳母鼠的仔鼠剔除一部分，用代乳母鼠的尿液等涂在待哺乳仔鼠身上，以免代乳母鼠吃掉后来的仔鼠。该传统净化方式有几个明显的缺点：1、剖腹取胎的时间的选择，如果需要生物净化的品系的怀孕母鼠处死太早，容易造成胎儿小而死亡率增加；选择时间过晚，母鼠产道已开，则净化没有意义；2、代乳母鼠选择，代乳母鼠需要和待净化的品系的母鼠同步，提前一天或二天交配，如果代乳母鼠没有配上，那么待净化品系也不能交配，需要时间较长；3、剖腹取胎的过程当中，容易造成刚出生的仔鼠因为呼吸道中呛入粘液等而窒息死亡；4、当小鼠种群发生大规模的污染时，通过剖腹取胎的方式来进行生物净化，需要供体胚胎和代乳母鼠的同步，这需要较大规模的供体品系和代乳母鼠，来保证供受体的同步化；5、代乳母鼠的天性决定了母鼠只会照顾自己的子代，对于供体仔鼠很容易被代乳母鼠作为入侵者咬死或者吃掉。

针对以上所述现有技术中的缺点，发明人在特定温度和湿度下采用体外受精(invitro fertilization,IVF)方式获得胚胎，并利用体外获得的胚胎与假孕雌性哺乳动物获得无菌哺乳动物，从而能快速、高效、简便而且成功率高地获得无菌哺乳动物。在具体的实施方式中，所述特定的温度和湿度是36℃-37℃的温度以及45％-70％的湿度。在优选的实施方式中，所述特定的温度和湿度是36.5℃-37℃的温度以及50％-60％的湿度下进行。

本文所用的术语，“体外受精技术”是指在体外模拟体内环境，完成精子的体外获能，精卵的体外受精和受精卵的体外发育过程。具体来说，就是采集雄性哺乳动物的精子，在获能液中获能后，与经过超排卵的卵团，在合适的培养液中受精，待其受精后，转移到合适的培养液中，发育到2-8细胞期胚胎，优选2细胞期胚胎。

本文所用的术语，“假孕雌性哺乳动物”是指将无菌的发情雌性哺乳动物与无菌的无精雄性哺乳动物交配，见栓后确定为假孕状态。假孕雌性哺乳动物，例如假孕鼠体内黄体功能可维持二周，造成雌鼠类似怀孕的状态。如果该假孕雌性哺乳动物包含有与母体内环境合适的胚胎，则该胚胎可在其体内着床，并正常发育，正常分娩。将该假孕雌性哺乳动物麻醉后，通过传递罐，传递到特定温度和湿度下的无菌环境中，在该环境中完成无菌的胚胎操作。获得含胚胎的假孕雌性哺乳动物后，直接用传递罐传递到隔离饲养包内进行饲养，假孕雌性哺乳动物自然分娩后，就可以得到高微生物级别或者无菌的子代，子代的微生物级别与假孕雌性哺乳动物的级别相同。在具体的实施方式中，所述假孕雌性哺乳动物的见栓率约为40％；在优选的实施方式中，所述假孕雌性哺乳动物的见栓率约为70％。

在具体的实施方式中，可以进一步采用超数排卵技术，对待净化的雌性哺乳动物进行超排，促使其在外源激素，例如孕马血清、人绒毛膜性腺激素的作用下，排出超过正常卵数(例如，10-12枚)二三倍的卵子。进而与已经体外获能的精子受精，这样运用较少的雌性哺乳动物与一到两只雄性哺乳动物，就可以完成整个品系或种群的净化，大大的节约时间和饲养空间、人力成本等，对于待净化品系，可以只留有小群体，而不需要大群饲养，也减少了对环境、人员和其他品系的污染机会。在其它实施方式中，也可以利用经遗传改造而超数排卵的转基因雌性哺乳动物。制备这种转基因雌性哺乳动物是本领域技术人员公知的，而且可以通过商业渠道购得或向特定的厂商订购，例如，上海斯莱克实验动物有限责任公司。

本文所用的术语，“无精雄性哺乳动物”是指不产生精子或不产生有活性的精子的雄性哺乳动物。本领域技术人员知晓获得此类无精雄性哺乳动物的方法，例如，在一种实施方式中，可给予雄性哺乳动物各种抑制或杀灭精子的药物从而获得不产生精子或不产生有活性的精子的雄性哺乳动物。在另一实施方式中，也可遗传改造雄性哺乳动物，从而提供所述无精雄性哺乳动物。制备这种转基因雄性哺乳动物是本领域技术人员公知的，而且可以通过商业渠道购得或向特定的厂商订购，例如，上海斯莱克实验动物有限责任公司。当然，为了操作的简便以及出于成本的考虑，也可采用结扎等本领域技术人员已知的常规技术手段获得所述无精雄性哺乳动物。但本发明不限于这种技术。

在体外受精获得胚胎以及获得假孕雌性哺乳动物后，就可利用它们制备得到含有胚胎的雌性哺乳动物。本领域技术人员知晓获得这种含有胚胎的雌性哺乳动物的方式。当然，本领域技术人员也知晓，可通过许多提供动物模型制备服务的公司，例如上海斯莱克实验动物有限责任公司，来获得含胚胎的雌性哺乳动物。

本发明采用体外受精技术，所需时间短，不需要像传统剖腹取胎那样需要等到待净化品系雌性哺乳动物怀孕，例如母鼠21天怀孕，只要待净化品系雌性哺乳动物超排三天后就可以做体外受精，体外受精需要约22h，然后直接可用于获得含胚胎的假孕雌性哺乳动物。时间比传统的剖腹取胎缩短了75％。由于胚胎是早期的2-8细胞期胚胎，通过胚胎-母体的互动，其在假孕雌性哺乳动物体内着床，使得假孕雌性哺乳动物成为真孕雌性哺乳动物，从而自然分娩，幼仔在这样的条件下，会得到雌性哺乳动物的悉心照顾并及时哺乳，自然分娩的幼仔存活率高，不存在吃仔，咬死幼仔的情况。

对于使用过的假孕雌性哺乳动物和无精雄性哺乳动物，可以继续饲养在独立隔离包内以便反复使用，从而使得饲养的种群数量比传统的剖腹取胎减少约50％。

在体外受精过程中，待净化品系的哺乳动物的精子和卵子的采集都在无菌的矿物油下操作，培养液滴也在无菌的矿物油覆盖下，精卵受精和胚胎培养均在彻底消毒的培养箱中进行，从而确保整个过程的无菌状态。

在具体的实施方式中，本发明的无菌哺乳动物选自小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、狗、或猴。在优选的实施方式中，本发明的无菌哺乳动物选自小鼠、大鼠、或豚鼠。

与现有的通用剖腹取胎的存活率相比(一般为50-60％)，在优选的实施方式中，本发明方法获得无菌哺乳动物的存活率为≥50％，优选≥60％；最优选≥80％。

鉴于本发明的内容以及现有技术的知识，本领域技术人员知晓在获得无菌哺乳动物的基础上，可以进一步制备含有已知的单菌、双菌、三菌或多菌的悉生哺乳动物。

本发明的优点：

1.充分利用雌性动物，使得有限的雌性动物产生尽量多的卵子；

2.充分利用雄性动物，甚至一只雄性动物就可以一次产生大批量的胚胎；

3.可以将大批量的胚胎变成幼仔；

4.在特定温度和湿度下，幼仔的存活率显著升高；

5.时间短、见效快、效率高、饲养群体小；

6.哺乳动物的饲养与传统的无菌动物的饲养相同，无需额外的设备或饲料。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.无菌小鼠的获得

1.雄鼠采精和精子获能

适龄待净化雄鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证：SCXK(沪)2012-0002；使用许可证：SYXK(沪)2012-0002)，10周以上均可，1-2只，颈椎脱臼处死，洁净操作台分离附睾，于无菌矿物油里挑出精子，到HTF培养液滴中，培养箱获能1.5h；

HTF培养液的成分：见下表：

药品名称	来源	产品编号	mM	mg/100ml
					NaCl	Sigma	S5886	101.6	593.8
KCl	Sigma	P5405	4.69	35
					MgSO4.7H2O	Sigma	P7774	0.2	4.9
KH2PO4	Sigma	P5655	0.37	5.4
					CaCl2	Sigma	C5670	2.04	57
NaHCO3	Sigma	S5761	25	210
					Glucose	Sigma	G7021	2.78	50
Na-lactate(ml)	Sigma	L1375	21.4	0.34
					Na-pyruvate	Sigma	P4562	0.33	3.7
Penicillin G	Sigma	P4687		7.5
					Streptomycin	Sigma	S1277		5
BSA	Calbiochem	126579		400
					0.5％Phenol red(ml)	Sigma	P0290		0.04
H2O	Sigma	W1503

2.雌鼠超数排卵

适龄待净化雌鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证：SCXK(沪)2012-0002；使用许可证：SYXK(沪)2012-0002)，从4周到6个月均可，给予孕马血清(pregnant mare serum,PMSG)，48h后给予人绒毛膜性腺激素(human chorionicgonadotropin，hCG)，14h后，颈椎脱臼处死，洁净操作台分离输卵管，在无菌矿物油覆盖的HTF受精液滴里分离卵子-卵丘细胞复合体，培养箱待用。

3.精卵受精

用高压灭菌的枪头吸取10ul的精子悬浮液，加到含有卵子-卵丘细胞复合体的培养液中，培养箱培养过夜，第二天观察二细胞胚胎数量，并将二细胞在超净工作台内挑选到洁净EP管内的培养液滴内，培养箱待用。

4.无精雄鼠的制备

在无菌条件下，在36.5℃-37℃温度和50％-60％湿度下，利用6-8周无菌雄鼠获得无精雄鼠，再传递到无菌隔离包内饲养二周；

5.假孕鼠的制备

将10只8周及以上的无菌雌鼠，在体外受精的当天挑选发情雌鼠与无精雄鼠交配，次日发现阴道栓者(外阴红肿，阴道口可见白色凝结物，主要由精囊腺和前列腺分泌物凝固后形成的栓子状结构，主要是防止精液的倒流，看到阴栓，即可判定雌鼠假孕成功)定为假孕鼠(共6只)，假孕鼠麻醉后无菌传递罐传递到36.5℃-37℃温度和50％-60％湿度下的无菌隔离器内待用。

6.胚胎的制备

在36.5℃-37℃温度和50％-60％湿度下，利用体视显微镜(NIKON,SM645型号)将已经挑选好的二细胞期胚胎，放入高温消毒的EP管内，传递到36.5℃-37℃温度和50％-60％湿度下的隔离器内，用枪头将液滴连同胚胎一起吸出，体视显微镜下毛细管吸出胚胎待用；

7.获得含有胚胎的假孕雌鼠

利用制备得到的假孕雌鼠以及体外受精得到的胚胎获得含有胚胎的假孕雌鼠。

8.获得无菌仔鼠

将获得的含有胚胎的假孕雌鼠用无菌传递罐传回到隔离操作包内，待其自然怀孕产子。仔鼠断奶后，检测为无菌，从而得到无菌仔鼠(共计30只，存活率为100％)，即可用于无菌动物的扩群。

实施例2.无菌小鼠的获得

在36℃-37℃温度和55％-65％湿度下，对86只雌鼠重复实施例1，共计获得假孕雌鼠40只；产仔雌鼠37只；获得仔鼠189只，存活率为100％。

对比例1.

对48只雌鼠重复实施例1，但区别在于在24℃-30℃温度和75％-85％湿度下进行无精雄性哺乳动物、假孕雌性哺乳动物以及胚胎的制备，共计获得假孕雌鼠10只；产仔雌鼠8只；获得仔鼠32只，存活16只，存活率为50％。

对比例2.

对48只雌鼠重复实施例1，但区别在于在30-35℃温度和70-80％湿度下进行无精雄性哺乳动物、假孕雌性哺乳动物以及胚胎的制备，共计获得假孕雌鼠10只；产仔雌鼠8只；获得仔鼠40只，存活26只，存活率为65％。

综上所述，发明人出乎意料地发现在特定的温度和湿度下，进行无精雄性哺乳动物、假孕雌性哺乳动物以及胚胎的制备，可以显著提供所得无菌仔鼠的存活率。而在其它温度和湿度下进行操作，会对所得无菌仔鼠的存活率有负面影响。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种无菌哺乳动物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a).获得雄性哺乳动物的精子并使所得精子获能；

b).获得雌性哺乳动物的卵子；

c).利用步骤a)获得的精子与步骤b)获得的卵子制备受精卵；

d).获得无精雄性哺乳动物；

e).制备假孕雌性哺乳动物；

f).利用步骤c)获得的受精卵制备胚胎；

g).获得含有步骤f)所得胚胎的假孕雌性哺乳动物；和

h).无菌培养步骤g)获得的雌性哺乳动物，得到无菌哺乳动物；

其特征在于，步骤d)、e)和f)在36℃-37℃的温度以及45％-70％的湿度下进行。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d)、e)和f)在36.5℃-37℃的温度以及50％-60％的湿度下进行。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)所述的雌性哺乳动物是超排卵雌性哺乳动物。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤f)制备的胚胎是2-8细胞期胚胎。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤f)制备的胚胎是2细胞期胚胎。

6.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物选自小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、狗、或猴。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是小鼠、大鼠或豚鼠。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括利用步骤h)获得的无菌哺乳动物制备悉生哺乳动物。