CN103451149A - 转基因仓鼠及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于一种转基因仓鼠的制备方法，该方法是通过以下技术方案实现的：供卵鼠与雄鼠正常交配产生受精卵，取出受精卵在仓鼠专用培养液中培育，并显微注射绿色荧光蛋白基因，再回输至代孕鼠体内进行繁育。本发明弥补了现有技术中无法培育转基因仓鼠的技术。
Description
技术领域
本发明是关于基因工程领域的一个发明，特别是涉及一种转基因仓鼠及其制备方法。
背景技术
近数十年来，由于人类生活方式的改变，代谢性心血管病（糖脂代谢紊乱的动脉粥样硬化性心脑血管病）已经超过肿瘤成为人类死亡率最高的疾病。因此对代谢性心血管病的广泛深入研究已经到了刻不容缓的时期。而这样的研究虽然可以通过对临床病人的直接调研进行，但由于心血管系统的样本难以从病人身上获取，且各种有损伤的实验条件也不可能施加到病人身上，因此应用代谢性心血管病的动物模型来开展相应研究是必不可少的。
随着研究技术的发展，国内外众多科研机构研发出了多种基因修饰的基因工程小鼠用于代谢性心血管病的研究。这些小鼠模型在很大程度上可以模拟人类的疾病状况，大大深化了人们对代谢性心血管疾病本质的认识。
由于小鼠在心血管系统以及代谢上与人类的巨大差别，虽然应用这些基因修饰的基因工程小鼠推进了人们对人类代谢性心血管病的认识，但在这些模型上得到的很多信息，如果要直接应用于人类代谢性心血管病的临床防治上，还是有很大的限制。因此摆在我们面前的一个重要科学问题，是要继续研发出更接近人类代谢性心血管病，且具有与小鼠相似的易繁殖、易饲养、研究周期短等特点的模式动物。
在世界最大的默克制药公司科研部2012年发表的报告中，比较了20多种动物模型（包括多种灵长类和最常用的ApoE和LDL受体基因敲除小鼠）的脂代谢特点和对降脂药物的反应，发现小动物中的仓鼠与人类的相关代谢参数最相近。
仓鼠是一种小型啮齿类动物。与小鼠和大鼠不同，仓鼠的脂蛋白代谢特点在以下几个方面有人类相似：（1）血浆胆固醇酯转运蛋白（CETP）水平高；（2）具有肠道载脂蛋白B编辑功能；（3）肝脂酶锚定在肝脏内皮细胞发挥水解甘油三酯作用；（4）肝LDL受体活性较低。因此，和其它品种的鼠类相比，仓鼠对动脉粥样硬化的易感性明显要高。
通过大量文献检索，国内外目前尚无制备转基因仓鼠方法的报道。我们发现，美国马里兰大学分子神经病毒学实验室主任Robert G Rohwer教授曾于2002年在其“疯牛病蛋白的研究”项目中，委托加州著名生物技术公司TOSK Inc.以基因转座子技术制备用于疯牛病研究的转基因仓鼠。然而3年后的后续报告则提及，该公司未能制备成功转基因仓鼠。虽然他们并没有报道失败的原因，但通过和国内外同行交流了解到，吉林大学畜牧兽医学院、云南动物研究所以及匈牙利和法国曾经有研究组尝试仓鼠的胚胎操作，但由于仓鼠受精卵在体外发育过程中有一种特殊的“双细胞发育阻滞”（block of2cell development）现象，所以回输到体内的受精卵都不能发育为成熟仓鼠胚胎。而体外培养的受精卵大多停滞在双细胞期，因此双细胞阻滞是阻碍成功制备转基因仓鼠的主要原因。
因此，从现有技术来看，仓鼠在代谢性心血管病研究中具有重要的价值，且仓鼠的饲养和繁育成本相对低廉；但是，转基因仓鼠的研究在国内外仍然是空白。有鉴于此，本发明人基于从事此类技术研究多年丰富的实务经验及专业知识，并配合学理的运用，积极加以研究创新，以期创设一种新的转基因仓鼠及其制备方法，使其更具有实用性。经过发明人不断的研究、设计，在长期对仓鼠转基因技术优化的基础上，突破了仓鼠胚胎双细胞发育阻滞的技术瓶颈，成功制备了国际上第一个绿色荧光蛋白基因修饰仓鼠模型。
发明内容
本发明的主要目的在于，克服现有的转基因仓鼠制备方法存在的缺陷，而提供一种新的转基因仓鼠制备方法，所要解决的技术问题是解决现有技术中存在的“双细胞发育阻滞”障碍，从而能够顺利制备转基因仓鼠，使其具有产业上的利用价值。
本发明的另一目的在于，提供一种突破“双细胞发育阻滞”技术障碍而制备的仓鼠，从而为研究代谢性心血管病提供更多的动物模型。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种转基因仓鼠的制备方法，其主要包括如下步骤：收集单个受精卵；将受精卵于体外进行培育；以及在受精卵分裂成2个或2个以上的细胞后，送入仓鼠体内继续进行培育。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
前述的转基因仓鼠及其制备方法，其中所述的受精卵是仓鼠动情周期第三天交配后获得的。
前述的转基因仓鼠及其制备方法，其中所述的将受精卵于体外进行培育的培养液中钙离子浓度为1.5mM，培养温度为39℃。
前述的转基因仓鼠及其制备方法，其中所述的培养液为HECM-10培养基。
前述的转基因仓鼠及其制备方法，其中所述的培养液于4摄氏度下保存。
前述的转基因仓鼠及其制备方法，其中所述的培养液中的氨基酸配制成浓缩100倍的储备液，培养液中的其它成分直接配制。
前述的转基因仓鼠及其制备方法，其中所述的储备液于-4℃下保存。
前述的转基因仓鼠及其制备方法，其中所述的将受精卵于体外进行培育的条件为温度37.5℃下于10%的CO2条件下培养60小时。
前述的转基因仓鼠及其制备方法，其中所述的受精卵分裂成四个或八个细胞。
前述的转基因仓鼠及其制备方法，其中进一步包括使用荧光蛋白基因的慢病毒载体对受精卵进行显微注射的步骤。
借由上述技术方案，本发明种转基因仓鼠的制备方法的主要内容如下：
本发明的方法包括以下步骤：
（1）供卵鼠的制备；
（2）假孕鼠的制备；
（3）供卵鼠取卵；
（4）受精卵体外培育；
（5）受精卵回输；
（6）代孕鼠饲养。
选择动情周期第二天的雌性仓鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)40IU，注射PMSG72h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)40IU，并与正常雄鼠合笼一天。
将动情周期第一天即发情期的正常雌鼠与结扎雄鼠合笼。
取出的受精卵在仓鼠专用培养基中培育。
经由上述可知，本发明转基因仓鼠及其制备方法至少具有下列优点：
（1）优化了仓鼠受精卵体外培养条件，解决了仓鼠受精卵的“双细胞阻滞”问题；
（2）建立了仓鼠受精卵回输方法，成功获得了由代孕母仓鼠出生的体外培养受精卵生成的仓鼠后代；
（3）应用表达绿色荧光蛋白的慢病毒载体进行仓鼠受精卵的透明带注射，制备成功了国内外第一批转基因仓鼠。
转基因仓鼠的成功制备意味着人类从此可以制备基因修饰的仓鼠模型，从而开辟一个以转基因仓鼠作为更精确模拟人类疾病模型的新领域。
综上所述，本发明特殊的转基因仓鼠的制备方法，解决了仓鼠受精卵的“双细胞阻滞”问题，其具有上述诸多的优点及实用价值，并在同类方法中未见有类似的设计公开发表或使用而确属创新，其不论在工艺上或功能上皆有较大的改进，在技术上有较大的进步，并产生了好用及实用的效果，从而更加适于实用，而具有产业的广泛利用价值，诚为一新颖、进步、实用的新设计。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1显示的是本发明转基因仓鼠培育过程突破受精卵二细胞阻滞，正常受精卵在体外培养条件下发育成了四细胞（I）和八细胞（II）胚胎，这些受精卵回输给代孕乳母后顺利产出了幼崽（III）。
图2显示的是应用本发明技术，制备成功了表达绿色荧光蛋白的转基因仓鼠。图2（a）是本发明获得的转基因仓鼠的鉴定结果；图2（b）是本发明获得的转基因仓鼠中荧光蛋白的检测结果。
具体实施方式
请参考图1，本发明提出一种转基因仓鼠制备方法，在尝试了HCM（仓鼠卵细胞培养基）1-10号培养基均不能解决双细胞阻滞问题后，我们开始了系统的培养基和培养条件优化方法的筛选。在改变HECM-10培养基的钙离子浓度、改变培养温度、选择动情期受精卵等多种条件后，最后确定了以下条件：
（1）钙离子浓度为1.5mM的HECM培养液；（2）39℃的受精卵培养温度；（3）在动情周期第三天交配后收集的受精卵，以这种条件培养的受精卵有35%在72小时后发育成四细胞团，并有20%在96小时发育成8细胞团。
将四细胞和八细胞团分别回输给假孕代乳母仓鼠，8只仓鼠中有3只顺利怀孕足月，于18天后分别产下了4、4、8只仓鼠后代，并顺利发育成熟。
我们随后以表达绿色荧光蛋白的慢病毒基因载体，进行了仓鼠受精卵透明带下注射，以滴度1X109慢病毒载体注射的受精卵，可以在体外培养到八细胞以上。注射慢病毒的受精卵回输后，共得到3窝17只新生小鼠，其中4只在哺乳期死亡。发育成熟的13只仓鼠经基因型鉴定，共得到11只阳性小鼠。
如图2所示，在动物荧光观察盒中对部分仓鼠进行观察，可见H9、H15、H17、H19均有绿色荧光蛋白表达，其中H9号仓鼠有较强绿色荧光蛋白表达水平。图2（a）显示的是绿色荧光蛋白（GFP）转基因仓鼠基因型鉴定的结果，图中，H1-H3显示的是1月13日出生的，H7-H10显示的是1月20日出生的，H11-H19是2月3日出生的，M+是GFP阳性小鼠，M-是GFP阴性小鼠，H-是普通仓鼠。
实施例
1.动物模型仓鼠在湿度50-60%、温度22-24℃的SPF（无特定病原体）级动物房中饲养，光照周期为7:00-19:00光照、19:00-7:00黑暗。
2.确定雌鼠动情周期：雌性仓鼠8周龄型成熟并出现稳定的动情周期，动情周期为4天，动情周期的第一天为发情期，第二天阴道口会出现明显的白色粘稠的分泌物，是动情周期的标志。
3.超数排卵的供卵鼠选择：在超排时间和动情周期吻合时，选择体重在130-150克间，年龄在91-150日龄的雌性仓鼠。
4.供卵鼠超数排卵：转基因制备过程第一天，选择动情周期中第二天的雌性仓鼠在11:00-12:00时腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)40IU，在注射孕马血清促性腺激素72小时后，腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)40IU，与正常雄鼠合笼一天后并对雌鼠进行阴道涂片，出现精子表明交配成功，作为供卵鼠。
5.假孕代乳母鼠的准备：制备转基因过程的第三天的19:00-21:00，将动情周期第一天的正常雌鼠与已正常饲养4周的6周龄结扎雄鼠合笼，交配过程中有10次以上交配动作，雌鼠假孕诱导成功，可以作为代孕鼠。
6.受精卵体外培养基的制备：上午8：00，取优化的仓鼠胚胎培养基（hamster embryo culture medium-Liu,HECM-10-Liu）100μl/滴，覆盖石蜡油，置于培养箱中，用于受精卵培养。加热块上39℃预热M2培养基及HECM-10-Liu培养基，用于取卵操作。其中的M2培养基采用的是Sigma公司生产的培养基，具体成份（克/升）如表1所示。
表1
| 氯化钙2XH2O | 0.25137 |
| 硫酸镁 | 0.1649 |
| 氯化钾 | 0.35635 |
| 磷酸钾 | 0.162 |
| 碳酸氢钠 | 0.35 |
| 氯化钠 | 5.53193 |
| 牛白蛋白 | 4.0 |
| D-葡萄糖 | 1.0 |
| HEPES钠 | 5.42726 |
| 酚红 | 0.0106 |
| 丙酮酸钠 | 0.0363 |
| 混旋乳酸 | 2.95 |
| 青霉素钾 | 0.06 |
| 硫酸氯霉素 | 0.05 |
7.仓鼠专用培养基（HECM-10）培养基配方如下：NaCl113.8mmol/L、KCl3mmol/L、NaHCO325mmol/L、乳酸钠（sodium lactate）4.5mmol/L、CaCl21.5mmol/L、MgCl22mmol/L、谷氨酸（glutamate）0.01mmol/L、谷氨酰胺（glutamine）0.2mmol/L、甘氨酸（glycine）0.01mmol/L、组氨酸（histidine）0.01mmol/L、赖氨酸（lysine）0.01mmol/L、脯氨酸（proline）0.01mmol/L、丝氨酸（serine）0.01mmol/L、天冬酰胺（asparagines）0.01mmol/L、半胱氨酸（cysteine）0.01mmol/L、牛磺酸（taurine）0.5mmol/L、泛酸盐（pantothenate）0.003mmol/L、聚乙烯醇（PVA）0.1mg/ml。
8.上述培养基中所含氨基酸配成100x（应用时稀释100倍）的储备液，分装后于-4℃保存备用。其他成分直接配制。配制好的HECM-10-liu培养基4℃保存，两周内可用。
9.取卵：开始注射激素的第五天上午9:00麻醉供卵鼠，打开腹腔取出输卵管，置于预热的M2培养基中，体式显微镜下从输卵管壶腹部取出卵团，反复吹打卵团，得到单个的受精卵。
10.受精卵的体外培养观察实验：将上述所取的的受精卵移入HECM-10培养基中，37.5℃、10%CO2中培养60小时。12小时大约90%分裂到双细胞，36小时分裂到四细胞，48-60小时分裂到八细胞。
11.进行转基因仓鼠制备时，将荧光蛋白基因的慢病毒载体进行显微注射：取出受精卵后即转移到M2培养基中，培养基液滴上覆盖石蜡油，进行显微注射。将滴度为2x109、含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体10-100pl的液体注射至受精卵透明带下，见到透明带明显膨大为止。
12.受精卵回输：将假孕鼠麻醉，从背部开口拉出卵巢输卵管，将接受了显微注射后的受精卵体通过双侧输卵管伞口回输，每侧输卵管各回输15-20枚显微注射后的受精卵。
13.胚胎在代孕乳母仓鼠体内的发育：仓鼠孕期17天，动物房保持湿度50-60%、温度22-24℃，光照周期为7:00-19:00光照，19:00-7:00黑暗饲养。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种转基因仓鼠的制备方法，其主要包括如下步骤：
收集单个受精卵；
将受精卵于体外进行培育；
在受精卵分裂成2个或2个以上的细胞后，送入仓鼠体内继续进行培育。
2.根据权利要求1所述的转基因仓鼠的制备方法，其中所述的受精卵是仓鼠动情周期第三天交配后获得的。
3.根据权利要求1所述的转基因仓鼠的制备方法，其中所述的将受精卵于体外进行培育的培养液中钙离子浓度为1.5mM，培养温度为39℃。
4.根据权利要求1或3所述的转基因仓鼠的制备方法，其中所述的培养液为HECM-10培养基，其各组分的浓度配方如下：
仓鼠专用培养基HECM-10培养基配方如下，
5.根据权利要求4所述的转基因仓鼠的制备方法，其中所述的培养液于4摄氏度下保存。
6.根据权利要求4所述的转基因仓鼠的制备方法，其中所述的培养液中的氨基酸配制成浓缩100倍的储备液，培养液中的其它成分直接配制。
7.根据权利要求6所述的转基因仓鼠的制备方法，其中所述的储备液于-4℃下保存。
8.根据权利要求1或3所述的转基因仓鼠的制备方法，其中将受精卵于体外进行培育的条件为温度37.5℃下于10%的CO2条件下培养60小时。
9.根据权利要求1所述的转基因仓鼠的制备方法，其中所述的受精卵分裂成四个或八个细胞。
10.根据权利要求1-9中任一权利要求所述的转基因仓鼠的制备方法，其中进一步包括使用荧光蛋白基因的慢病毒载体对受精卵进行显微注射的步骤。
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