KR102552211B1 - 생체 외 랫트 난소 제조 방법 - Google Patents

생체 외 랫트 난소 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 본 발명의 생체 외 난소 제조용 배양액 및 이를 이용한 본 발명의 생체 외 난소 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명의 생체 외 난소 제조용 배양액을 이용하면 마우스 및 랫트로부터 분리한 생식선으로부터 생체 외 난소를 효율적으로 제조할 수 있으며, 이를 이용하여 제조한 생체 외 난소는 체내 난소와 동일하게 난포를 형성하고 난자를 생성할 수 있으므로, 이를 난자 생산을 위한 생체 외 장기로서 유용하게 활용할 수 있다.

Description

생체 외 랫트 난소 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING IN VITRO RAT 0VARY}
본 발명은 생체 외 난소 제조용 배양액 및 이를 이용한 생체 외 난소 제조 방법에 관한 것이다.
최근 출산 연령이 높아지고, 식습관의 변화 및 스트레스 등 다양한 원인에 의한 난임으로 인해 저출산 문제가 사회적인 문제로 알려져 있다. 이러한 난임 극복을 위한 치료 방법에는 보조 생식술, 인공수정 및 체외배양 시스템을 통한 체외수정과 배아 생성 등이 알려져 있다. 더욱이 여성이 평생 배란할 수 있는 난자의 개수는 300 내지 500개 정도로 정해져 있어, 많은 양의 난자를 생성하기 어려운 문제와 윤리적인 문제로 난자 취득의 어려움이 있어왔다.
한편, 생명공학 또는 유전자 조작기술의 발달에 따라 원하는 형질들로 조합한 다양한 재조합 생명체들의 여러가지 생산 성공사례가 발표되어 왔고, 최근에는 예컨대 양 등과 같은 복제 동물들의 생산에 성공한 사례들이 속속 보고되었다. 체세포 핵 이식을 통한 포유동물 복제기술은 영국 로슬린연구소의 윌멋(Wilmut) 박사에 의해 6세 된 암컷 양에서 채취한 유선세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 핵 이식란을 생산한 후 생체 내 이식을 통하여 체세포 복제 동물인 돌리를 탄생시킴으로써 최초로 성공하였다. 이후 소, 마우스, 염소, 돼지 및 토끼 등에서 체세포 핵이식 방법에 의한 복제된 산자 생산이 보고되었다(WO9937143A2, EP930009A1, WO9934669A1, WO9901164A1 및 US5,945,577). 복제 동물을 생산하는 기술은 상업적 유용성뿐 아니라, 생체의학과 생물학 연구에 있어서도 그 중요성은 압도적이다. 복제 동물 생산기술의 산업적 적용분야는 고품질의 축산식품 생산, 고부가가치의 약리활성물질 생산, 각종 병원균에 대한 생체저항력 향상동물 생산, 질환 모델 동물의 생산 및 유전자치료 분야에 이르기까지 매우 광범위하다. 복제 동물의 다양한 용도 중에서도, 인간과 생리학적으로 유사성을 가진 복제돼지를 이용하여 질병치료의 새로운 시스템 개발 관한 관심도는 증가하고 있다.
이와 같이, 최근 가축의 체외수정, 형질전환기술 및 복제동물 생산 실험이 전 세계에서 행해지고 있으나, 체외에서 난자를 형성할 때 체내 난자를 그대로 분리하여 배양하거나 미성숙란을 체외에서 조작하는 것이 일반적이다. 따라서, 현재까지 체외에서 생식선으로부터 난소를 형성하는 연구는 미비한 실정이다.
본 발명의 목적은 생체 외 난소 제조용 배양액을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 생체 외 난소 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 생체 외 난소를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 난자의 생체 외 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 생체 외 난소 제조용 배양액을 제공한다.
또한, 본 발명은 생체 외 난소 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 생체 외 난소를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 생체 외 난소를 이용한 난자의 생체 외 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 생체 외 난소 제조용 배양액을 이용하면 마우스 및 랫트로부터 분리한 생식선으로부터 생체 외 난소를 효율적으로 제조할 수 있으며, 이를 이용하여 제조한 생체 외 난소는 체내 난소와 동일하게 난포를 형성하고 난자를 생성할 수 있으므로, 이를 난자 생산을 위한 생체 외 장기로서 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 체외 난소를 형성하기 위해 배아에서 생식선을 분리한 것을 나타낸 도이다:
A: SD 암컷 랫트 (좌), 임신 15일차 자궁 (중) 및 15.5 dpc 배아 (우);
B: 15.5 dpc 배아로부터 분리된 생식선 및 중신을 제거한 생식선; 및
C: 트랜스-웰에 올려진 3등분으로 분리된 랫트 생식선.
도 2는 마우스 및 랫트 생식선의 배양 이미지를 나타낸 도이다:
A: a-MEM 배양액으로 배양된 랫트 생식선 (상) 및 StemPro 배양액으로 배양된 랫트 생식선 (하); 및
B: a-MEM 배양액으로 배양된 마우스 생식선 (좌) 및 StemPro 배양액으로 배양된 마우스 생식선 (우).
도 3은 난포 형성 효율을 비교한 도이다:
A: a-MEM 배양액 또는 StemPro 배양액으로 배양된 랫트의 난포 개수; 및
B: a-MEM 배양액 또는 StemPro 배양액으로 배양된 랫트의 체외 난소 크기.
도 4는 랫트 체외 형성 난포 및 난자를 확인한 도이다:
A: StemPro 배양액에서 형성된 난소로부터 분리된 난포; 및
B: 체외 형성 난포로부터 분리된 난자.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.
일 측면에서, 본 발명은 FBS 및 L-아스코르브산(L-ascorbic acid)을 유효성분으로 함유하는 생체 외(in vitro) 난소 제조용 배양액에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 배양액은 FBS를 10% 함유할 수 있으며, 페니실린스트렙토마이신, 글루타맥스(Glutamax) 및 β-머캅토에탄올(β-Mercaptoethanol)을 추가로 함유할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 배양액은 난포 형성 및 난소 형성 효율이 높고 난포의 갯수 및 난소의 크기를 증가시킬 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 a) 인간을 제외한 암컷 포유동물의 배아에서 생식선을 분리하는 단계; b) 생식선을 3등분하는 단계; 및 c) 본 발명의 생체 외 난소 제조용 배양액에서 배양하는 단계를 포함하는, 생체 외(in vitro) 난소 제조 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 포유동물은 랫트, 마우스, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지 및 염소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 비인간 동물일 수 있으며, 랫트 또는 마우스인 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 상기 배아는 11 내지 16 dpc(days post coitum)의 배아일 수 있다.
일 구현예에서, 생식선을 생식선의 전체 길이를 기준으로 3등분할 수 있다.
일 구현예에서, 3등분한 생식선을 본 발명의 생체 외 난소 제조용 배양액에서 3 내지 4주 동안 배양할 수 있으며, 트랜스-웰에서 배양할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단계 c) 이후에 난포 형성 또는 난소 생성을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 방법으로 제조한 인간을 제외한 포유동물의 생체 외 난소에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 생체 외 난소에서 난자를 채취하는 단계를 포함하는, 난자의 생체 외 생산 방법에 관한 것이다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 마우스 및 랫트으로부터 생식선 분리
트(쥐, rat)의 생체 외(in vitro) 난소를 형성하기 위해, 11.5 내지 15.5 dpc의 SD 암컷 랫트의 배아로부터 생식선을 분리하였다. 랫트의 생식선 분리 효율 및 난소 형성에 유리한 배아 시기는 15.5 dpc인 것으로 확인하였다 (도 1).
실시예 2. 생체 외 난소 최적 배양액 도출
상기 실시예 1에서 분리한 생식선의 배양시 배양액에 따른 체내 난소를 모사한 생체 외 난소의 형성 정도를 확인하기 위해, 3등분한 생식선을 a-MEM 또는 StemPro 배양액에서 3-4주간 트랜스-웰에서 배양한 뒤 난포 형성 정도 및 난포 갯수를 비교하였다.
그 결과, 랫트 생식선을 a-MEM 배양액에서 배양한 경우 난포 형성율이 매우 낮았으며 난소의 크기도 4주 동안 배양한 경우 감소한 반면, StemPro 배양액에서 배양한 경우에는 난포의 갯수 및 난소의 크기도 적절하게 증가하여 (도 2 및 3), StemPro 배양액이 생체 외 난소를 형성하기에 효율적인 것으로 확인되었다. 마우스 체외 형성 실험에서도 StemPro 배양액이 난포 형성 및 난소 형성 효율이 더 높은 것으로 확인되었다 (도 2).
실시예 3. 생체 외 난소의 난자 형성 확인
상기 실시예를 통해 StemPro 배양액으로 생체 외 형성한 랫트 난소로부터 단일 난포를 분리하여 난포의 형태를 확인하고 난포 내의 난자를 분리하여 확인하였다. 그 결과, 체내 난소에 존재하는 난포와 동일한 형태를 지닌 것으로 확인되었으며, 난자도 체내에서와 동일하게 발달된 것으로 나타났다 (도 4).
상기의 실시예들을 통해, 최적 조건으로 랫트로부터 생체 외 난소를 형성(제조)하였으며, 제조한 랫트 생체 외 난소에서 난포 및 난자 발달이 효율적으로 형성된 것을 확인할 수 있었다.

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. a) 인간을 제외한 암컷 포유동물의 11 내지 16 dpc(days post coitum)의 배아에서 생식선을 분리하는 단계;
    b) 생식선을 생식선의 전체 길이를 기준으로 3등분하는 단계;
    c) FBS, L-아스코르브산(L-ascorbic acid), 페니실린스트렙토마이신, 글루타맥스(Glutamax) 및 β-머캅토에탄올(β-Mercaptoethanol)을 유효성분으로 함유하는 생체 외(in vitro) 난소 제조용 배양액에서 3 내지 4주 동안 배양하는 단계; 및
    d) 상기 단계 c) 이후에 난포 형성 또는 난소 생성을 확인하는 단계를 포함하는, 생체 외 난소 제조 방법.
  4. 삭제
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  9. 삭제
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AFRICAN JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY VOL. 8 (20), PP. 5627_5631, 19 OCTOBER, 2009
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PNAS, AUGUST 9, 2016, VOL. 113, NO. 32, P.9021_9026 [DOI/10.1073/PNAS.1603817113]

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