CN101492669B

CN101492669B - 牛精子克隆胚胎的方法

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Publication number: CN101492669B
Application number: CN2009100605234A
Authority: CN
Inventors: 杨利国; 王滇; 肖遥; 张鑫; 霍立军
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2009-01-15
Filing date: 2009-01-15
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2029-01-15
Also published as: CN101492669A

Abstract

本发明具体涉及牛精子克隆胚胎的新方法。步骤如下：(1)将采集的牛卵巢洗后将卵丘-卵母细胞复合体抽出，体外培养，使卵母细胞培养发育至第二次减数分裂中期(2)对卵母细胞的细胞核染色和荧光定位，并去核得到去核的牛卵母细胞；(3)采集优秀种公牛的精液，或取自性控优秀种公牛的商用精液置液氮罐中贮存；(4)解冻精液并做获能处理，置于卵母细胞注射液中；(5)将两个获能精子注入去核牛卵母细胞的胞质内，得到精子重构胚；(6)将精子重构胚激活培养。本发明克服了传统核移植中供体细胞只能是体细胞单一模式，是利用双精子取代体细胞作为供体注入去核牛卵母细胞胞质内生产牛胚胎的一种新方法。

Description

牛精子克隆胚胎的方法

技术领域

本发明涉及哺乳动物繁殖技术领域，具体涉及一种利用牛精子克隆胚胎的新方法。

背景技术

自成功利用体细胞核移植技术获得成活的克隆羊[1]以来，多种哺乳动物甚至包括一些灵长类哺乳动物相继克隆成功。尽管动物克隆技术存在效率低的问题[2]，但却很好的证明了卵母细胞质和供体细胞核能够支持整个胚胎发育过程。并且体细胞核移植技术在再生医学、新药物开发、动物育种等方面具有革命性的应用前景，故现在动物克隆技术仍是国内外的研究热点。

然而，国内外有关动物生殖细胞克隆的研究相对较少。并且考虑到原生殖细胞处于基因组印记消除状态，现今生殖细胞克隆技术一般仅局限于利用动物胚胎期的原生殖细胞进行克隆。Kato等选用妊娠期14.5-16.5天的小鼠胎儿原生殖细胞作为供体进行核移植，重构胚发育至妊娠期9.5天[3]。随后，Lee等报道，利用妊娠期11.5-13.5天的原生殖细胞作为供体而生产的重构胚能发育至妊娠期11.5天[4]。在利用妊娠期10.5天的原生殖细胞进行克隆的尝试失败后[5]，Yamazaki等根据他们的研究结果推断原生殖细胞并不适合作为核移植的供体。但同样是用妊娠期10.5天的原生殖细胞作为供体进行核移植，Miki等却成功的获得具有生育能力的后代[6]，证明了原生殖细胞克隆是可以成功的。

目前，国内外尚无利用哺乳动物精子进行动物克隆的相关报道。理论上，精子克隆能够使得后代中的遗传物质几乎全部来自于父本或母本，而且利用性控精液进行动物克隆还能控制后代性别。这些是生殖细胞克隆技术的诱人之处，但同时也有可能是该技术将面临的挑战。Surani等[7]和McGrath等[8]的研究表明，由于基因组印记的存在使得父源和母源基因组对小鼠的胚胎发育都是必需的。而Hoppe和Illmensee却称成功的生产出遗传物质全部来自与父本或母本的单性生殖小鼠[9，10]。近来，Kono等也报道了孤雌生殖小鼠的诞生[11]，引起了世界性的关注。由此看来，精子克隆虽然在理论上可能存在挑战，但这都是能够克服的，况且小动物上的理论也不一定适用于大动物。

动物精子克隆技术的研究无论在科学机制探讨上，还是在技术推广应用上，都具有非常重大的意义和价值。首先，该技术是首次在哺乳动物去核的中期II卵母细胞中通过显微操作注射进两个精子。这两个精子能否发生去致密而形成两个雄原核，然后两个雄原核相互融合并激发重构胚卵裂？两套来自父本的基因组能否支持重构胚顺利通过胚胎发育的早期阻滞，并发育至分娩，产下具有生育能力的后代？其次，在家畜动物精子克隆胚发育的整个过程中，重构胚的印记状态具有什么样的变化规律？这些问题都有待解决。再次，在动物育种技术的推广方面，精子克隆比体细胞克隆具有更多优势。种公畜的精子比种公畜的体细胞系更容易获得、保存、运输。精子克隆技术还可以选用来自两个不同品系家畜的精子，从而加快家畜的品种改良。况且，性控精子克隆技术还能实现后代性别的控制。这些都是体细胞克隆所无法比拟的。最后，就像体细胞核移植技术成功用于转基因动物的生产一样[12-16]，精子克隆技术同样也能应用于生产转基因动物，甚至是转基因性控动物，从而为转基因动物生产开辟一条新道路。

发明内容

本发明的目的是利用牛的精子代替体细胞作为供体用于核移植，从而生产精子克隆胚利用牛卵细胞去核，利用精子在体外获能，通过核移植方法生产获得牛精子克隆胚胎。

本发明是这样实现的：

一种牛精子克隆胚胎的方法，其步骤包括：

(1)将采集回的牛卵巢用磷酸缓冲液洗后将卵丘-卵母细胞复合体抽出，置于成熟培养液中进行体外培养，使所述的卵母细胞培养发育至第二次减数分裂中期，用透明质酸酶对卵丘-卵母细胞复合体脱颗粒细胞处理；

(2)先对步骤(1)的卵母细胞的细胞核染色，置于卵母细胞去核液中，再对细胞核进行荧光定位，准确吸取所述的细胞核，得到去核的牛卵母细胞；

(3)采集同一头优秀种公牛的精液，或采集同一品种的不同个体的两头优秀种公牛的精液，或采集不同品种的两头优秀种公牛的精液，或购买性控优秀种公牛的商用精液，将所述的种公牛精液置液氮罐中贮存备用；

(4)将所述的种公牛精液在37℃下解冻，用精子获能液使所述的精子获能，置于卵母细胞注射液中备用；

(5)用显微操作针一次性将步骤(4)所述的两个获能精子注入去核牛卵母细胞的胞质内，得到精子重构胚；

(6)将步骤(5)构建好的精子重构胚用激活培养基-1和激活培养基-2进行体外人工激活，使重构胚融合，然后，将激活后的精子重构胚置于胚胎培养液中培养；

其中：

步骤(1)的成熟培养液组分及配比如下：

以TCM-199商品培养基为基本培养基，附加胎牛血清10％，乙基哌嗪乙磺酸25mmol，丙酮酸钠0.55mg/mL，青霉素100IU/mL，链霉素100IU/mL，促卵泡素0.1IU/mL、促黄体素0.1IU/mL、雌激素1μg/mL、表皮生长因子100ng/mL，调pH至7.0-7.2；

步骤(1)的磷酸缓冲液组分及配比如下：氯化钠8.0g/L+氯化钾0.2g/L，磷酸氢钠1.15g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，调pH至7.0-7.2；

步骤(2)的卵母细胞去核液：基础液为成熟培养液，添加5μg/mL细胞松弛素B，以重量/体积计的10％聚乙烯吡咯烷酮；

步骤(4)的精子获能液：BO基础液+6mg/mL牛血清白蛋白，5mM咖啡因，60ug/mL肝素；

步骤(5)的卵母细胞注射液：基础液为步骤(1)的成熟培养液，添加按重量/体积计的10％聚乙烯吡咯烷酮；

步骤(6)的激活培养基-1和激活培养基-2的组分及配比如下：

激活培养基-1：

基础液为成熟培养液附加离子霉素5μmol/L，调pH至7.0-7.2；

激活培养基-2：

基础液为成熟培养液附加二甲基氨基嘌呤2mmol/L，调pH至7.0-7.2；

步骤(6)的胚胎培养液组分及配比如下：

氯化钠107.63mmol/L，氯化钾7.16mmol/L，磷酸二氢钾1.19mmol/L，硫酸镁1.51mmol/L，青霉素钠0.012g/L，硫酸链霉素50μg/L，乳酸钠5.35mmol/L，碳酸氢钠25.00mmol/L，丙酮酸钠7.27mmol/L，氯化钙1.78mmol/L，肌醇2.77mmol/L，酚10.0μg/mL，枸杞酸钠0.34mmol/L，必需氨基酸30.0μl/ml，非必需氨基酸10μl/m L，L-谷氨酰胺0.20mmol/L，牛血清白蛋白3mg/mL，调pH至7.0-7.2；

其中BO基础液配方 mg/100ml

NaCl 655.0；

KCl 30.0；

CaCl₂.2H₂O 33.0；

MgCl₂.6H₂O 10.6；

NaH₂PO₄.2H₂O 12.98；

NaHCO₃ 310.8；

葡萄糖 275.5；

丙酮酸钠 16.5；

青霉素 100IU/ml；

链霉素 100IU/ml；

补充六蒸水至100ml。

作为优选方案之一，在本发明的步骤(4)中注入牛卵母细胞的两个精子来自同一个体种公牛。

作为优选方案之二，在本发明的步骤(4)中注入牛卵母细胞的两个精子来自同一品种的不同个体的种公牛。

作为优选方案之三，在本发明的步骤(4)中注入牛卵母细胞的两个精子来自不同品种的种公牛。

作为优选方案之四，在本发明的步骤(4)中注入牛卵母细胞的两个精子来自于商用的种公牛的两个X-精子或是1个X-精子和1个Y-精子的组合。

作为本发明的关键操作步骤，下列的技术特征是重要的：上述的卵母细胞去核率必需保证100％；

本发明的有益效果是：

本发明采用传统的核移植方式和步骤，只是在供体上我们采用的是精子来代替体细胞，本发明的供体是优秀种公牛的精子，精子采用常规的体外获能方法；在去核的操作中改进了现有的盲吸法去核不完全的缺点，我们在去核方面采用先染色，后荧光定位核，在准确吸核，我们既保障了去核率在100％，又降低了对操作人员试验操作技能的要求和增加了试验的准确性。从而证明了我们得到的克隆胚胎完全是精子克隆胚胎。本发明经过十五次的试验已经证明了利用精子作为供体通过核移植方法是可以得到精子克隆胚胎的，现在我们已经获得16-细胞期的克隆胚胎2枚，4-细胞期的精子克隆胚胎10枚，2-细胞期的精子克隆胚胎30枚，后面的工作我们还在进行中。

更详细的技术方案见《具体实施方式》。

附图说明

图1：是本发明的牛精子重构胚胎的技术路线图。

图2：是成熟卵母细胞的显微观察图像(光学显微镜100x)。

图3：是荧光照射定位核显微观察图像(光学显微镜200x)。

图4：是本发明实施例中精子克隆胚胎发育至2期，4期的显微观察图像(光学显微镜100x)。

图5：是本发明实施例中精子克隆胚胎发育至16期显微观察图像(光学显微镜200x)。

具体实施方式

实施例1

1、采样：将从湖北省武汉市江南牛屠宰场采集的健康黄牛母牛卵巢保存于39℃的磷酸缓冲液(配方见《发明内容》)，3小时内带回实验室；

2、牛卵母细胞收集与培养：用注射器(商业购买的兽用16号针头)从牛卵巢表面2-8mm卵泡中吸取牛卵丘细胞-卵母细胞复合体，将该牛卵丘细胞-卵母细胞复合体经成熟培养液(配方见《发明内容》)洗涤3遍，转入100μl成熟培养液(配方见《发明内容》所述)微滴中培养22h(培养条件是：39℃、相对湿度为100％，5％CO₂培养箱)；

3、牛卵母细胞的成熟度判定：将在成熟培养液中培养了22h的牛卵母细胞在0.1％透明质酸酶处理成熟卵母细胞的脱净外围卵丘细胞。然后将胞质均匀，形状规则，脂滴含量丰富并且排除第一极体的牛卵母细胞转入含有10μg/mL细胞松弛素B的50μl的卵母细胞去核液微滴(配方见《发明内容》所述)中。用石蜡油石蜡油覆盖该微滴，置于39℃，相对湿度为100％，5％CO₂的培养箱中培养备用。在直径为60mm的培养皿盖中制作去核和注精子微滴；

4、供体精子的准备：取优秀种牛的冷冻精液或商用性控精液(精液来源参见《发明内容》所述)，35℃水浴解冻20秒，将精液沿离心管管壁轻轻推入离心管底部，将加有精液和5mlBO液的离心管在CO₂培养箱倾斜45放置10～60min，使离心管底部有活力的精子尽可能上浮至液面上部，然后取出离心管，吸取上层约4.5ml含有精子的BO液移至另一离心管，再加入1mlBO液，离心(1500r/min，5min)，弃上清液，用150μl精子获能液(配方见《发明内容》所述)悬浮分离精子，并调整精子浓度为1×10³个/ml。在CO₂培养箱孵育获能。

5、将步骤3中获得成熟的牛卵母细胞去核：先用荧光染色剂Hoechst33342染色成熟的牛卵母细胞15minutes，然后用持卵针吸住固定一个卵母细胞在荧光照射定位核，利用常规的显微注射针把牛卵母细胞核准确吸出，去核操作应控制在3秒内，如此反复的操作，最后将成功去核的牛卵母细胞重新放置成熟培养液中培养3～4h后转移到卵母细胞注射液(配方见《发明内容》所述)微滴中，培养10min。

6、精子重构胚的构建：先将步骤4)获能的精子注入注精子微滴做供体，再用常规的显微注射针吸两个形态正常的精子作为供体，然后用固定针固定一个牛卵母细胞，用常规的显微注射针刺入牛卵母细胞胞质内增加压力使精子释放进入胞质内，然后将构建的精子重组胚胎转移到微滴的一边并释放，重复以上步骤直到所有去核卵母细胞的显微操作完成为止(所述精子的选择参见《发明内容》所述)。

7、将步骤6所得的精子重构胚转到成熟培养液的微滴中培养(使其休整)3-4h。

8、将步骤7所得的细胞膜完整的精子重构胚转移到激活培养基-1中激活5min，然后转移到激活培养基-2中3-4h(配方见《发明内容》所述)，激活完成后转入胚胎培养液(配方见《发明内容》所述)微滴中培养，观察记录发育情况，获得如图2、图3和图4的结果。

参考文献

[1]Wilmut I，et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells[J].Nature，1997，385(6619)：810-813.

[2]Wakayama T.Production of cloned mice and ES cells from adult somatic cells by nuclear transfer：how to improve cloning efficiency？[J].J Reprod Dev，2007，53(1)：13-26.

[3]Kato Y，et al.Development potential of mouse primordial germ cells[J].Development，1999，128：1823-1832.

[4]Lee J，et al.Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day11.5primordial germ cells[J].Development，2002，129：1807-1817.

[5]Yamazaki Y，et al.Reprogramming of primordial germ cells begins before migration into thegentital ridge，making these cells inadequate donors for reproductive cloning[J].Proc NatlAcad Sci USA，2003，100(21)：12207-12212.

[6]Miki H，et al.Birth of mice produced by germ cell nuclear transfer[J].Genesis，2005，41：81-86.

[7]Surani MA，et al.Development of reconstitued mouse eggs suggests imprinting of the genomeduring gametogenesis[J].Nature，1984，308：548-550.

[8]McGrath J and Solter D.Completion of mouse embryogenesis requires both the materanl andparternal genomes[J].Cell，1984，37：179-183.

[9]Hoppe PC and Illmensee K.Microsurgically produced homozygous-diploid uniparentalmice[J].Proc Natl Acad Sci USA，1977，74(12)：5657-5661.

[10]Hoppe PC and Illmensee K.Full-term development after transplantation of parthenogeneticembryonic nuclei into fertilized mouse eggs[J].Proc Natl Acad Sci USA，1982，79：1912-1916.

[11]Kono T，et al.Birth of parthenogenetic mice that can develop to adulthood[J].Nature，2004，428：860-864.

[12]Lai L，et al.Production of α-1，3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfercloning[J].Science，2002，295：1089-1092.

[13]龚国春，等.利用体细胞核移植技术生产转基因牛[J].科学通报，2003，48(24)：2528-2533.

[14]Donna KS，et al.Production of α-1，3-galactosyltansferase null pigs by means of nucleartransfer with fibroblasts bearing loss of heterozygosity mutations[J].Proc Natl Acad SciUSA，2004，101(19)：7335-7340.

[15]Lai L，et al.Generation of cloned transgenic pigs rich in omega-3fatty acids[J].NatBiotechnol，2006，24(4)：435-436.

[16]Yin XJ，et al.Generation of cloned transgenic cats expressing red fluorescenceprotein[J].Biol Reprod，2008，78(3)：425-431.

Claims

1.牛精子克隆胚胎的方法，其步骤包括：

(5)用显微操作针一次性将两个由步骤(4)获得的获能精子注入去核牛卵母细胞的胞质内，得到精子重构胚；

其中：

步骤(1)的成熟培养液组分及配比如下：

步骤(4)的卵母细胞注射液：基础液为步骤(1)的成熟培养液，添加按重量/体积计的10％聚乙烯吡咯烷酮；

步骤(6)的激活培养基-1和激活培养基-2的组分及配比如下：

激活培养基-1：

基础液为成熟培养液附加离子霉素5μmol/L，调pH至7.0-7.2；

激活培养基-2：

步骤(6)的胚胎培养液组分及配比如下：

氯化钠107.63mmol/L，氯化钾7.16mmol/L，磷酸二氢钾1.19mmol/L，硫酸镁1.51mmol/L，青霉素钠0.012g/L，硫酸链霉素50μg/L，乳酸钠5.35mmol/L，碳酸氢钠25.00mmol/L，丙酮酸钠7.27mmol/L，氯化钙1.78mmol/L，肌醇2.77mmol/L，酚红10.0μg/mL，枸杞酸钠0.34mmol/L，必需氨基酸30.0μl/ml，非必需氨基酸10μl/mL，L-谷氨酰胺0.20mmol/L，牛血清白蛋白3mg/mL，调pH至7.0-7.2；

其中BO基础液配方 mg/100ml

NaCl 655.0；

KCl 30.0；

CaCl₂·2H₂O 33.0；

MgCl₂·6H₂O 10.6；

NaH₂PO₄·2H₂O 12.98；

NaHCO₃ 310.8；

葡萄糖 275.5；

丙酮酸钠 16.5；

青霉素 100IU/ml；

链霉素 100IU/ml；

补充六蒸水至100ml。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中注入牛卵母细胞的两个精子来自同一个体种公牛。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中注入牛卵母细胞的两个精子来自同一品种的不同个体的种公牛。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中注入牛卵母细胞的两个精子来自不同品种的种公牛。

5.根据权利要求1所述的的方法，其特征在于，步骤(5)中注入牛卵母细胞的两个精子来自于商用的种公牛的两个X-精子或是1个X-精子和1个Y-精子的组合。