CN103275929A

CN103275929A - 一种诱导家禽卵泡体外排卵的方法

Info

Publication number: CN103275929A
Application number: CN2013101111331A
Authority: CN
Inventors: 冯京海; 张敏红; 姜礼文; 熊艳丹
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2013-04-02
Filing date: 2013-04-02
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2033-04-02
Also published as: CN103275929B

Abstract

本发明提出了一种用于诱导家禽成熟卵泡体外排卵的方法。本发明提供一种诱导家禽成熟卵泡体外排卵的培养基的制备方法，为将胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、青霉素、链霉素、促黄体素、促卵泡素、孕酮、雌激素与M199培养基混合，在无菌条件下配制成液态培养基。本发明实验证明，从产蛋高峰期蛋鸡(产蛋后30分钟内)卵巢中分离的成熟卵泡(F1)，应用本发明提供的培养基，可在体外培养2-4h内诱导排卵。本发明提供的培养基中促性腺激素和类固醇激素与家禽体内正常生理环境接近，因此可广泛应用于家禽卵泡发育生物学的研究。

Description

一种诱导家禽卵泡体外排卵的方法

技术领域

本发明涉及用于诱导家禽成熟卵泡体外排卵的方法，更具体地，本发明涉及应用促性腺激素和类固醇激素制备诱导家禽体外排卵培养基的方法。

技术背景

我国蛋鸡、蛋鸭的饲养量居世界第一位。蛋用家禽卵巢内卵泡的发育直接影响产蛋性能。通过研究家禽卵泡发育机制及影响因素，将有助于进一步提高蛋用家禽的生产性能。另外，与哺乳动物相比，禽类排卵后卵巢上没有黄体的形成，因此卵泡可以连续发育、成熟、排卵，并且禽类卵泡颗粒细胞层和膜细胞层易于分离，有利于研究卵泡发育过程中不同卵泡细胞功能、细胞间的相互作用及其基因表达的变化，是一种研究卵泡发育生物学的良好模型。

目前哺乳动物卵泡的体外培养、成熟以及排卵技术已经非常成熟，由于哺乳动物和家禽在卵泡发育调控机制上差别较大，不能直接套用哺乳动物的方法诱导家禽体外排卵。而目前有关家禽卵泡的体外培养、成熟以及排卵研究较少。Moudgal和Razdan(1981)曾利用促黄体素和儿茶酚胺诱导蛋鸡卵泡体外排卵，其目的是验证蛋鸡排卵过程中卵泡上α肾上腺素受体的调控作用。如果研究家禽排卵过程中相关因素的调控机制，还需要构建一种模拟家禽正常生理状态的体外诱导排卵的方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种诱导家禽成熟卵泡体外排卵的培养基的制备方法。

本发明提供的培养基制备方法包括如下步骤：将胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、青霉素、链霉素、促黄体素、促卵泡素、孕酮、雌激素与M199培养基混合，在无菌条件下配制成液态培养基。其中所述胰岛素在所述培养基中的浓度为10μg/mL，所述转铁蛋白在所述培养基中的浓度为5.5μg/mL，所述亚硒酸钠在所述培养基中的浓度为5ng/mL，所述青链霉素在所述培养基中的浓度为1％(体积百分含量)，所述促黄体素为垂体促黄体素，其在所述培养基中的浓度为2.67-2.70单位/mL，所述促卵泡素为垂体促卵泡素，其在所述培养基中的浓度为0.33-0.35单位/mL，所述孕酮为黄体酮注射液，其在所述培养基中的浓度为0.5×10^-3mg/mL，所述雌激素为苯甲酸雌二醇注射液，其在所述培养基中的浓度为6.7-7.0×10^-5mg/mL。

所述M199培养基可商购，也可按如下方法配制：

50mg/L甘氨酸、25mg/L L-丙氨酸、70mg/L L-盐酸精氨酸、30mg/L L-天冬氨酸、0.1mg/L L-半胱氨酸盐酸盐·H₂O、26mg/L L-胱氨酸·2HCL、75mg/L L-谷氨酸、100mg/L L-谷氨酰、21.88mg/L L-左氨酸盐酸盐·H₂O、10mg/L L-羟基脯氨酸、40mg/L L-异亮氨酸、60mg/L L-亮氨酸、70mg/L L-赖氨酸盐酸盐、15mg/L L-蛋氨酸、25mg/L L-苯丙氨酸、40mg/L L-脯氨酸、25mg/L L-丝氨酸、30mg/L L-苏氨酸、10mg/L L-色氨酸、58mg/L L-酪氨酸二钠盐、25mg/L L-缬氨酸、0.01mg/L维生素E磷酸盐、0.05mg/L VC、0.01mg/L生物素、0.5mg/L氯化胆碱、0.01mg/L D-泛酸钙、0.01mg/L叶酸、0.01mg/L维生素K₃、0.025mg/L烟酰胺、0.025mg/L盐酸、0.05mg/L对氨基苯甲酸、0.025mg/L盐酸吡哆醛、0.025mg/L盐酸吡哆醇、0.01mg/L核黄素、0.01mg/L盐酸硫胺素、0.1mg/L VitA、0.1mg/L VitD₂、0.05mg/L肌醇、200mg/L无水氯化钙、0.7mg/L九水硝酸铁、97.67mg/L无水硫酸镁、400mg/L氯化钾、2200mg/L碳酸氢钠、6100mg/L氯化钠、140mg/L无水磷酸二氢钠、0.5mg/L D-2-脱氧核糖、10mg/L腺嘌呤、0.2mg/L腺嘌呤核苷酸二钠盐、1mg/L腺甘三磷酸、0.2mg/L胆固醇、1000mg/L D-葡萄糖、0.05mg/L谷胱甘肽、0.3mg/L鸟嘌呤盐酸盐、5960mg/L HEPES、0.4mg/L次黄嘌呤、20mg/L酚红、0.5mg/L核酸、50mg/L醋酸钠、0.3mg/L胸腺嘧啶、20mg/L吐温-80、0.3mg/L尿嘧啶、0.34mg/L黄嘌呤和超纯水混合得到培养基。

本发明的另一个目的是提供一种模拟家禽正常生理状态下，诱导家禽成熟卵泡体外排卵的方法。

本发明提供的方法包括如下步骤：无菌条件下分离家禽成熟F1卵泡(保证卵泡柄的完整)，冲洗干净后在所述培养基中培养，诱导成熟卵泡体外排卵。

其中所述成熟卵泡来自产蛋高峰期的家禽，包括蛋鸡、种鸡、蛋鸽及种鸽、蛋鸭及种鸭、种鹅。其中所述成熟卵泡为家禽卵巢中发育最大的卵泡，获取时间为连续产蛋过程中前一枚蛋产后30分钟内。

所述清洗采用4℃含1％双抗的DPBS(gibco，C14190500BT)清洗两遍，其中双抗和DPBS为商购。

其中DPBS也可按如下方法配制：0.2g/L KCl、8.0g/L NaCl、0.2g/L KH₂PO₄、1.15g/L Na₂HPO₄和超纯水混合后，调节PH至7.35，得到不含钙镁的DPBS。

所述培养温度为39℃，所述培养在5％ CO₂条件下进行。

本发明的实验证明，依照本发明提供的方法及其培养基，可在培养2-4h内诱导卵泡排卵。其培养基中促性腺激素和类固醇激素与家禽体内正常生理环境接近，因此可广泛应用于家禽卵泡发育生物学的研究。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实例：

1、实验动物的饲养与选取

产蛋高峰期蛋鸡(25周龄-40周龄)，光照时间为16小时，日采食量为120g，给予充足洁净的饮水。观察其产蛋间隔，一般为24小时多一点的时间产一枚蛋，并且连续产蛋周期在30天以上。处于此种状态的高峰期蛋鸡，F1成熟时间及程度容易掌握。

2、F1卵泡的获取

选取符合上述条件的高峰期蛋鸡8只，其中4只在产蛋后10分钟内颈静脉放血致死，4只在产蛋后30分钟内颈静脉放血致死，用10％84消毒液清洗腹部羽毛至完全湿润，置于超净工作台中，用75％的酒精绵球擦拭腹部羽毛。用灭过菌的手术剪剖开腹部皮肤，换另外一把灭过菌的手术剪剖开脂肪，暴露卵泡和输卵管等，将卵巢取出放入4℃含1％双抗的DPBS(gibco，货号：C14190500BT)中，此时输卵管中无卵泡。

将卵巢置于90mm直径的灭菌后的玻璃平皿中，将F1卵泡连同卵泡颈用手术剪取下来，再放入4℃含1％双抗的DPBS中清洗两次。观察F1卵泡，保证其卵泡膜、卵泡颈的完整性。

3、体外培养及排卵体系的建立

1)培养基配制：

青霉素和链霉素(gibco，货号：15140)、注射用垂体促黄体素(LH)(规格：200单位，宁波三生药业，批号：120123)、注射用垂体促卵泡素(FSH)(规格：100单位，宁波三生药业，批号：110313)、黄体酮注射液(P₄)(规格：1ml:5mg，宁波三生药业，批号：120310)、苯甲酸雌二醇注射液(E₂)(规格：2ml:4mg，宁波三生药业，批号：120207)、ITS(ITS液体培养基含有胰岛素1mg/mL、转铁蛋白0.55mg/mL、亚硒酸钠0.5μg/mL，sigma，货号：13146)与M199培养基(M199液体培养基含有Earle平衡盐、碳酸氢钠2200mg/L、L-谷氨酰胺、HEPES 2mM，gibco，货号：12340-030)混合，得到培养基。其中所述青霉素和链霉素在所述培养基中的含量是1％(体积百分含量)，所述ITS液体培养基在所述培养基中的含量是1％(体积百分含量)，其中4中所述激素在所述培养基中的浓度分成高低2个剂量，高剂量为LH 2.70单位/mL、FSH 0.35单位/mL、P₄ 0.5×10^-3mg/mL、E₂ 7.0×10^-5mg/mL，低剂量为LH 2.67单位/mL、FSH 0.33单位/mL、P₄ 0.5×10^-3mg/mL、E₂ 6.7×10^-5mg/mL。

2)将步骤2得到的卵泡在上述培养基中培养，39℃，5％CO₂培养，观察排卵时间。

4、排卵结果

实验证明，依照本发明提供的方法及其培养基，可在体外培养2-4h内诱导卵泡排卵。F1卵泡获取时间对体外诱导排卵时间有明显影响，产蛋后30分钟获取的F1卵泡较为成熟，因此排卵时间短，超过30分钟，增加家禽自然排卵的几率。培养基中高低剂量的促性腺激素和类固醇激素与家禽体内正常生理环境接近，对排卵时间无显著影响，因此可广泛应用于家禽卵泡发育生物学的研究。

Claims

1.一种诱导家禽成熟卵泡体外排卵的方法，包括使用诱导家禽体外排卵的培养基。

2.根据权利要求1的方法，其中所述成熟卵泡为家禽卵巢中发育最大的卵泡。

3.根据权利要求1的方法，其中所述成熟卵泡获取时间为连续产蛋过程中前一枚蛋产后30分钟内。

4.根据权利要求1的方法，其中所述成熟卵泡来自产蛋高峰期的家禽，包括蛋鸡、种鸡、蛋鸽及种鸽、蛋鸭及种鸭、种鹅。

5.根据权利要求1至4的任一方法，其中所述诱导家禽体外排卵的培养基为胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、血清、促黄体素、促卵泡素、孕酮、雌激素、水和M199培养基的混合物。

6.根据权利要求5的方法，其特征在于：

所述胰岛素在所述培养基中的浓度为10μg/mL，所述转铁蛋白在所述培养基中的浓度为5.5μg/mL，所述亚硒酸钠在所述培养基中的浓度为5ng/mL，所述青链霉素在所述培养基中的浓度为1％(体积百分含量)，所述促黄体素为垂体促黄体素，其在所述培养基中的浓度为2.67-2.70单位/mL，所述促卵泡素为垂体促卵泡素，其在所述培养基中的浓度为0.33-0.35单位/mL，所述孕酮为黄体酮注射液，其在所述培养基中的浓度为0.5×10-3mg/mL，所述雌激素为苯甲酸雌二醇注射液，其在所述培养基中的浓度为6.7-7.0×10-5mg/mL。

7.根据权利要求1-6中任一所述方法，包括如下步骤：将离体家禽成熟卵泡在权利要求5和6所述的培养基中培养。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于：所述培养温度为39℃，所述培养在5％CO₂条件下进行。