CN105255823A - 一种适用于羔羊卵母细胞体外成熟培养的方法及培养液 - Google Patents

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程国虎
张昊
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本发明属于生物学领域，具体涉及一种适用于羔羊卵母细胞体外成熟培养的方法及培养液。所述的培养液是在TCM199成熟基础液中分别添加5.0μg/mL的FSH和5.0μg/mL？LH。该培养液用于羔羊卵母细胞体外成熟培养，结果显示羔羊卵母细胞成熟率明显高于其他，提高了羔羊卵母细胞的成熟效果，为后续的胚胎培养实验奠定基础。

Description

一种适用于羔羊卵母细胞体外成熟培养的方法及培养液
技术领域
本发明属于生物学领域，具体涉及一种适用于羔羊卵母细胞体外成熟培养的方法及培养液。
背景技术
幼畜体外胚胎生产和移植技术(juvenileinvitroembryotransfer，JIVET)是集成了幼龄母畜超数排卵技术、卵母细胞体外成熟技术、体外受精技术、胚胎体外培养技术和胚胎移植技术等一系列繁殖技术为一体的生物技术体系。JIVET技术将幼龄母畜卵巢上大量的卵母细胞为卵源在体外培养生产胚胎，有利于缩短家畜繁殖的世代间隔，充分发掘优良遗传性状母畜的繁殖潜能，提高畜群的遗传改良速度与生产效率，为家畜育种提供丰富的遗传资源。
体外成熟是JIVET技术的一个重要环节，通过调节激素浓度等手段来提高体外成熟培养效果以达到细胞质和细胞核共同成熟的目标，能显著提高后期胚胎生长发育的潜力，极大地提高JIVET技术的生产效率。激素作为哺乳动物卵母细胞体内成熟的基础调节物，在卵母细胞体外成熟过程中发挥重要作用。促卵泡激素FSH和促黄体生成素LH是卵母细胞体外成熟液最常用的两种促性腺激素。大量研究表明FSH和LH在卵母细胞体外成熟培养中能协同作用促进成熟，但是不同的研究得出的添加最佳浓度并不一致，这与山羊品种、年龄、季节和地域等因素相关。
发明内容
本发明的目的是建立一种适用于羔羊卵母细胞体外成熟培养的方法，并提供一种羔羊卵母细胞体外成熟培养的培养液配方。
以江苏地方白山羊品种为动物模型，分别从成年母羊和羔羊卵巢中采集卵丘卵母细胞复合体(COCs)进行体外成熟培养。在TCM-199基础培养体系中通过添加不同浓度的FSH和LH(2.5μg/mL、5.0μg/mL、7.5μg/mL、10.0μg/mL和12.5μg/mL)，研究其对羔羊卵母细胞体外成熟的影响，并与成年母羊卵母细胞培养效果进行对比，旨在选择效果最佳的FSH和LH剂量配伍，建立一种简单、适用的羔羊卵母细胞体外成熟的方法。
在TCM-199基础培养体系里添加浓度为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5μg/mLFSH和LH，成熟培养后，其结果显示成熟液中添加不同浓度FSH和LH对卵母细胞成熟率有明显的影响(见表2)。其中成熟液中添加5.0μg/mLFSH和LH浓度的羔羊卵母细胞成熟率明显高于其他四组。对比成年羊的培养效果，结果可见，成年羊的FSH和LH的最佳添加剂量与羔羊不同，但两者最佳成熟率之间进行比较，差异不显著。由此可见，TCM-199基础培养体系中添加5.0μg/mLFSH和LH，可以作为一种适用于羔羊卵母细胞体外成熟培养的方法。
本发明所采用的技术方案是：一种适用于羔羊卵母细胞体外成熟培养的培养液，是在成熟基础液中分别添加5.0μg/mL的FSH和5.0μg/mLLH；所述成熟液基础液的配方是：TCM199，NaHCO32.2g/L，丙酮酸钠25.0mg/L，HEPES4.8g/L，青霉素钠和硫酸链霉素各100IU/ml。
本发明还公开了一种适用于羔羊卵母细胞体外成熟培养的方法，是将羔羊卵母细胞在体外采用上述的培养液进行成熟培养。
本发明通过在卵母细胞成熟液中添加不同浓度FSH和LH，研究FSH和LH对羔羊以及成年母羊卵母细胞体外成熟的影响，并对两者进行对比(以成年羊卵母细胞体外培养成熟率为参照)，完善了羔羊卵母细胞体外成熟技术，提高了羔羊卵母细胞的成熟效果，为后续的胚胎培养实验奠定基础。
附图说明
图1是电子显微镜下成熟卵母细胞照片400×。A为成年母羊成熟卵母细胞；B为羔羊成熟卵母细胞。
具体实施方式
1.试验材料
选择江苏地方白山羊品种，分别为健康的1～2岁成年母羊和1～2月龄羔羊，摘取新鲜的卵巢，装入样品袋，编号后放在冰块上，2～4h内带回实验室。
卵巢洗涤液：0.9％氯化钠注射液，青霉素钠100IU/ml，硫酸链霉素100IU/ml。
冲卵液PBS(改良杜氏磷酸缓冲液)：称取NaCl8.00g、KCl0.20g、KH2PO40.20g、Na2HPO4115mg、葡萄糖1g、丙酮酸钠36mg、MgCl2100mg、CaCl2100mg、BSA3g以及青霉素钠、硫酸链霉素各10万IU，加超纯水完全溶解后调节pH到7.2～7.4，继续加水定容至1L，用0.22μm滤器过滤，50ml无菌管分装备用。
成熟基础液：TCM199(商品名为MEDIUM199，SIGMA公司)，NaHCO32.2g/L，丙酮酸钠25.0mg/L，HEPES4.8g/L，青霉素钠和硫酸链霉素各100IU/ml。
0.1％透明质酸酶：准确称取0.01g透明质酸酶溶解于10mL不含血清的PBS中，混匀分装于PCR管，-20℃保存。
2.实验分组
成熟液基础培养体系：在TCM-199中添加NaHCO32.2g/L，丙酮酸钠25.0mg/L，HEPES4.8g/L，青霉素钠和硫酸链霉素各100IU/ml。试验分为五组，在成熟基础液中分别添加不同剂量的FSH和LH，见表1。
表1各试验组添加试剂的浓度
3.卵母细胞的收集
卵巢运回实验室后，用手术剪刀快速去除其表面多余组织，用38.5℃的卵巢洗涤液清洗3次后放入装有PBS的培养皿中。把培养皿放置在39℃的温控板上，挑选表面直径为1～5mm的卵泡，用无菌镊子固定住卵巢，用手术刀轻轻划破卵泡，再用注射器吸取PBS冲洗划破的卵泡，汇集冲洗液，静置1min后在体视显微镜下检卵，用口吸管挑选出形态正常、胞质均匀且包有1层以上完整卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，随机分组进行对比试验。
4.卵母细胞成熟培养
成熟培养采用微滴培养法，微滴上覆盖石蜡油。本试验选用35mm直径的培养皿，可以放置4个微滴，每个微滴50μl成熟液。把挑选好的卵丘-卵母细胞复合体用口吸管移入平衡2h之后的微滴中洗涤三次，放置在最后一个微滴中。最后把各试验组培养皿移入38.5℃，5％CO2，饱和湿度条件的培养箱中培养，成年羊卵母细胞培养24～26h，羔羊卵母细胞培养22～24h。培养时可先通过观察卵丘颗粒细胞的扩散状况来初步判断卵母细胞整体成熟效果是否良好，然后把卵丘-卵母细胞复合体放入透明质酸酶溶液微滴里，用枪头快速吹打以剥离颗粒细胞，收集卵母细胞裸卵在倒置显微镜下观察是否成熟，以细胞分出第一极体为成熟标准(图1)。
结果显示成熟液中添加不同浓度FSH和LH对卵母细胞成熟率有明显的影响(见表2)。其中成熟液中添加5.0μg/mLFSH和LH浓度的羔羊卵母细胞成熟率明显高于其他四组。对比成年羊的培养效果，结果可见，成年羊的FSH和LH的最佳添加剂量与羔羊不同，但两者最佳成熟率之间进行比较，差异不显著。由此可见，TCM-199基础培养体系中添加5.0μg/mLFSH和LH，可以作为一种适用于羔羊卵母细胞体外成熟培养的方法。
表2羔羊与成年母羊卵母细胞体外成熟率效果
注：上标有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，无相同字母表示差异显著(P<0.05)。

Claims (2)

1.一种适用于羔羊卵母细胞体外成熟培养的培养液，其特征在于：是在成熟基础液中分别添加5.0μg/mL的FSH和5.0μg/mLLH；所述成熟液基础液的配方是：TCM199，NaHCO32.2g/L，丙酮酸钠25.0mg/L，HEPES4.8g/L，青霉素钠和硫酸链霉素各100IU/ml。
2.一种适用于羔羊卵母细胞体外成熟培养的方法，其特征在于：羔羊卵母细胞在体外采用权利要求1所述的培养液进行成熟培养。
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