CN105532479A - 马铃薯茎尖分化培养基及其制备方法 - Google Patents

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周洪友
于卓
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Abstract

本发明提供一种马铃薯茎尖分化培养基及制备方法。所述培养基的配方中含有L-半胱胺酸盐酸盐，以1L培养基计算，所述L-半胱胺酸盐酸盐的含量为0.1mg。所述配方为①或②：①：MS培养基+IAA？0.1mg/L+6-BA？0.1mg/L+GA3？0.1mg/L+L-半胱胺酸盐酸盐0.1mg/L+30g/L蔗糖+5-7g/L琼脂粉；②：MS培养基+NAA？0.1mg/L+6-BA？0.1mg/L+GA3？0.1mg/L+L-半胱胺酸盐酸盐0.1mg/L+30g/L蔗糖+5-7g/L琼脂粉。本发明在马铃薯组培用培养基(MS培养基)中添加L-半胱氨酸盐酸盐，作为抗氧剂，减少褐化现象，以增加马铃薯茎尖分生组织的成苗率。

Description

马铃薯茎尖分化培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于组织培养材料技术领域，具体涉及马铃薯茎尖分化培养基及制备方法。
背景技术
马铃薯病毒病是马铃薯生产中的重要病害，是引起马铃薯种性退化的主要原因。感染病毒的马铃薯通过块茎无性繁殖进行世代积累和传递，致使块茎种性变劣，产量不断下降。生产中一旦发生，没有很好的防治办法。带毒种薯是唯一的初侵染来源，因此，控制种薯带毒率是控制该病害行之有效的办法。
病毒主要在植物体内的维管束和细胞间移动，植物茎尖生长点尚未形成维管束、且病毒在细胞间移动的较慢，不能赶上茎尖生长点生长的速度，且在茎尖分生组织中，病毒不能进行复制，因此，茎尖生长点没有病毒。植物茎尖生长点细胞在离体情况下，在一定营养的物质，激素和其他适宜的外界条件下，可再生成一个完整植株。据此原理将马铃薯茎尖生长点剥离，放入适宜的培养基和环境条件下培养，使其分化成苗，为组织培养技术，此技术不仅能脱去病毒，也能脱去所有的真菌和细菌，能彻底控制马铃薯病毒病和其它所有病害。
国内主要采用MS培养基进行马铃薯茎尖培养。一些附加成分，植物生长调节剂的种类和浓度对于茎尖生长发育的影响很大。细胞分裂素有利于离体茎尖成活和生长，生长素用来控制茎尖成活和苗分化。因不同品种对激素反应不同，所以使用的激素种类和浓度不能一概而论。
马铃薯组织培养技术在我国已经很成熟，但是，分生组织成苗慢，成苗率低的问题还需要进一步的改进。马铃薯组培过程中的褐变现象也是一项难以克服的技术问题。褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成褐色醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其它酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后致使变褐死亡。能否有效地控制褐变是马铃薯组培成功的关键。
抗氧剂(防褐剂)可能阻遏外植体切口处酚类物质的合成、分泌及氧化，而保持组织块的生物活性，对马铃薯的褐化有不同程度的抑制作用，同时也受控于外植体材料种类和培养基类型等其他因素。
L-半胱氨酸盐酸盐是一种重要的有机化工中间体，在生物化学、医药、食品、饲料以及化妆品等行业具有广泛的用途。具有钝化多酚氧化酶的作用，有很强的抗氧化能力。它有防止和推迟食品褐变，以及解毒、防晒、预防和治疗放射线对人体损伤等作用。在组织培养中未见有使用的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种马铃薯茎尖分化培养基，所述培养基能增加马铃薯茎尖分生组织分化率。
本发明所提供的马铃薯茎尖分化培养基的配方中含有L-半胱胺酸盐酸盐。
以1L培养基计算，所述L-半胱胺酸盐酸盐的含量为0.1mg。
所述马铃薯茎尖分化培养基的配方，为下述配方①或配方②：
配方①：MS培养基+IAA0.1mg/L+6-BA0.1mg/L+GA30.1mg/L+L-半胱胺酸盐酸盐0.1mg/L+30g/L蔗糖+5-7g/L琼脂粉；
配方②：MS培养基+NAA0.1mg/L+6-BA0.1mg/L+GA30.1mg/L+L-半胱胺酸盐酸盐0.1mg/L+30g/L蔗糖+5-7g/L琼脂粉。
其中，IAA为吲哚-3-乙酸，NAA为萘乙酸，6-BA为细胞分裂素，GA3为赤霉素，
MS培养基的配方单为：mg/L工作液浓度，
大量元素：
硝酸钾1900、硝酸铵1650、磷酸二氢钾170、硫酸镁(7H2O)370、无水氯化钙332.2；
微量元素：
碘化钾0.83、硼酸6.2、硫酸锰(1H2O)16.9、硫酸锌(7H2O)8.6、钼酸钠(7H2O)0.25、硫酸铜(5H2O)0.025、氯化钴(6H2O)0.025；
铁盐：
乙二胺四乙酸二钠37.3、硫酸亚铁27.8；
有机成分：
肌醇100、甘氨酸2、盐酸硫胺素(VB1)0.1、盐酸吡哆醇(VB6)0.5、烟酸(VB5)0.5。
所述马铃薯茎尖分化培养基的pH为5.8。
本发明所提供的马铃薯茎尖分化培养基是按照包括下述步骤的方法制备得到的：
按照上述配方配置培养基，分装，于115℃灭菌20min，即可。
所述分装采用试管进行，所述试管的规格为1.8cm×18cm，每个试管中分装有培养基15ml。
具体地，所述马铃薯茎尖分化培养基的制备方法为：
按照表1的用量，每种药品分别单独称量溶解后，如果药品溶解较慢，可以用水浴加热溶解，制成大量元素的20倍浓缩液500ml，微量元素、有机成分、铁盐的200倍浓缩液500ml，生长调节剂200倍浓缩液100ml。其中NAA必须用酒精预溶，再加水配成溶液。6-BA必须用NaOH预溶，再加水配成溶液。
以1L培养基计算，先加入5-7g琼脂粉，用700ml左右的蒸馏水加热至琼脂粉融化，稍冷凉后，再分别缓慢加入取大量元素50ml、微量元素、有机成分、铁盐和生长调节剂各5ml，再加入蔗糖30g，期间不断搅拌至蔗糖溶解，然后定容至1000ml，调节pH为5.8。分装至1.8cm×18cm的试管中，每个试管15ml，于115℃灭菌20min，灭完后立即从灭菌锅中取出。
表1培养基的成分(MS+生长调节剂)
所述马铃薯茎尖分化培养基在马铃薯茎尖分化成苗中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明在马铃薯组培用培养基(MS培养基)中添加L-半胱氨酸盐酸盐，作为抗氧剂，减少褐化现象，以增加马铃薯茎尖分生组织的成苗率。尤其是含有NAA的培养基，在加入了L-半胱氨酸盐酸盐后，增加了愈伤组织成苗的速度，对于2种培养基(含有NAA的培养基和含有IAA的培养基)都增加了马铃薯茎尖生长点分化成苗率。
另外，培养基制作过程中温度太高，会造成碳水化合物的水解，糖转化为酮糖，美拉德反应，糖碳化等现象，也会形成一些物质影响马铃薯茎尖分生组织分化成苗。因此，培养基制作过程中的操作技巧也是茎尖组织分化成苗的关键。本发明在培养基的制作和灭菌过程都避免了高温，尽量避免了培养基的变质。
附图说明
图1为陇薯5号在含NAA和L-半胱氨酸盐酸盐(左)和含IAA和L-半胱氨酸盐酸盐(右)培养基中的生长情况。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1马铃薯不同品种在同种培养基(不含L-半胱氨酸盐酸盐)上的出愈和分化情况
选择27个马铃薯品种(见表2)进行茎尖剥离脱毒试验。
以MS为基础培养基，加入植物生长调节剂NAA(0.1mg/L)、6-BA(0.1mg/L)和GA3(0.1mg/L)，再加入3％的蔗糖和0.7％的琼脂粉，调pH为5.8，按照上述试验步骤，制作培养基，培养基用18cm×1.8cm的试管分装，每试管15ml，经115℃灭菌20min，每个试管接种带有2个叶原基的马铃薯茎尖生长点一个，每个品种接20个试管，置于25℃，2000lx光照条件下培养，光照时间为16h/d。观察马铃薯组培苗的出愈和分化情况。
结果如表2所示，不同马铃薯品种的愈伤组织生长和分化情况差异很大，只有一个品种07-5出愈率高分化快，90％分化成苗。其它的品种成苗率较低，7个品种长出大的愈伤组织，但愈伤组织慢慢变褐，最终都没有分化成苗。可见愈伤组织变褐是影响马铃薯茎尖分生组织分化成苗的关键因素。
表2不同马铃薯品种的出愈和分化情况
实施例2不同培养基对马铃薯茎尖诱导效果的比较
试验用马铃薯品种陇薯5号，基础培养基为MS，在MS中分别加入①0.1mg/LIAA、②0.1mg/LNAA、③0.1mg/LIAA+0.1mg/LL-半胱氨酸盐酸盐、④0.1mg/LNAA+0.1mg/LL-半胱氨酸盐酸盐，按照3％的比例加入蔗糖，0.7％的比例加入琼脂粉，调pH为5.8，制作、分装培养基，接种茎尖生长点和培养条件同实施例1。
结果表明(见表3)，含有NAA的培养基愈伤组织出愈速度快，且愈伤组织大，出愈率高，但是分化率较低，只有34％，但是一旦成苗，幼苗生长健壮。含有IAA的培养基愈伤组织出愈速度慢，且愈伤组织小，出愈率低，但是苗分化率较高，达到61％，多数不形成愈伤组织，直接分化成苗，可是分化的苗细弱，根细且少(图1)。2种培养基中分别添加L-半胱胺酸盐酸盐后，苗相对较壮，出愈率分别增加了33.3％和19.0％，苗分化时间也提前5d左右，苗分化率分别提高了23.0％和35.3％。
表3不同培养基对陇5愈伤组织出愈和苗分化的影响
实施例3培养基灭菌温度对马铃薯出愈和幼苗分化的影响
试验选马铃薯品种陇薯5号，基础培养基为MS，在MS中分别加入①0.1mg/LIAA+0.1mg/LL-半胱氨酸盐酸盐、②0.1mg/LNAA+0.1mg/LL-半胱氨酸盐酸盐，按照3％的比例加入蔗糖，0.7％的比例加入琼脂粉调pH为5.8，制作、分装培养基同实施例1，分别在110℃、115℃和121℃下灭菌20min，接种茎尖生长点和培养条件同实施例1。观察培养基的愈伤组织生长状况和苗分化情况，调查培养基污染率。
结果显示，2种培养基在110℃灭菌20min时，培养基有20％污染。115℃和121℃灭菌20min时培养基灭菌彻底，但是和灭菌115℃的相比，2种不同成分的培养基在121℃灭菌20min时，愈伤组织变褐色的较多，幼苗的分化率降低，因此，最好的灭菌时间应选115℃，20min。
实施例4培养基酸碱度(pH)对马铃薯出愈和幼苗分化的影响
按照实施例3制备2种培养基，pH分别调为5.6、5.8、6.0、6.2，分装培养基同实施例1，在115℃下灭菌20min，接种茎尖生长点和培养条件同实施例1。观察培养基的愈伤组织生长状况和苗分化情况，调查培养基污染率。
结果显示，pH为5.8的培养基长势最好，出愈和分化出苗较快，且分化率最高。

Claims (8)

1.一种马铃薯茎尖分化培养基，其含有L-半胱胺酸盐酸盐。
2.根据权利要求1所述的马铃薯茎尖分化培养基，其特征在于：以1L培养基计算，所述L-半胱胺酸盐酸盐的含量为0.1mg。
3.根据权利要求1或2所述的马铃薯茎尖分化培养基，其特征在于：所述马铃薯茎尖分化培养基为①或②：
①中还含有IAA、6-BA、GA3，IAA、6-BA和GA3在所述马铃薯茎尖分化培养基中的浓度均为0.1mg/L；
②中还含有NAA、6-BA、GA3，NAA、6-BA和GA3在所述马铃薯茎尖分化培养基中的浓度均为0.1mg/L；
其中，IAA为吲哚-3-乙酸，NAA为萘乙酸，6-BA为细胞分裂素，GA3为赤霉素。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的马铃薯茎尖分化培养基，其特征在于：所述马铃薯茎尖分化培养基的基础培养基为MS固体培养基。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的马铃薯茎尖分化培养基，其特征在于：所述马铃薯茎尖分化培养基的pH为5.8。
6.制备权利要求1-5中任一项所述的马铃薯茎尖分化培养基的方法，包括下述步骤：
按照所述配方配置培养基，分装，于115℃灭菌20min，即可。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述分装采用试管进行，所述试管的规格为1.8cm×18cm，每个试管中分装有培养基15ml。
8.权利要求1-5中任一项所述的马铃薯茎尖分化培养基在马铃薯茎尖分化成苗中的应用。
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