CN102405831B - 一种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的固体培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的固体培养基，属于农业生物技术领域。它包括以下组分：硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、碘化钾、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、硫酸铁、乙二胺四乙酸二纳、烟酸、盐酸吡哆醇、甘氨酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白、酵母提取物、蔗糖、6-苄氨基腺嘌呤、玉米素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、赤霉素、倍力凝。该培养基用于马铃薯茎尖的培养，试验效果好，基本无愈伤组织产生，成苗率高，大大减少了茎尖再生植株的变异，保证了马铃薯品种的完整的原始性状和遗传背景；并且这种培养方式采用一步成苗法，较原有方式缩短了培养时间，降低了污染几率。

Description

一种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的固体培养基
技术领域
本发明涉及一种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的固体培养基，属于农业生物技术领域。
背景技术
马铃薯（Solanum tuberosum L.）原产于南美洲安第斯山，约在16世纪70年代传入中国，在中国已有400多年的栽培历史。它是世界第四大作物，中国第五大作物，在中国和世界都有广泛的种植面积。马铃薯的淀粉含量高达12%～20%，蛋白质含量为1.5%～2%，Vc含量为10～20mg/100g鲜重，不仅是粮菜兼用的优良作物，而且还是轻工业、食品工业和医药工业不可缺少的重要原料。
马铃薯植株在生产过程中，易受多种病毒的侵染。马铃薯感染病毒后，植株的生长势、产量都逐代下降，严重情况下几乎没有商品产量。因此，在马铃薯种植几代后，就要对其进行脱毒。另外为了保存一种新的品种资源，也需要对其进行脱毒。目前，对于脱毒的方式，主要是茎尖剥离组织培养技术和其他附加的处理技术。而现阶段的茎尖成苗过程中，主要是先产生愈伤组织，再更换生芽培养基成苗。在此过程存在两个弊端，一是极易产生愈伤组织，通过愈伤组织再生的植株可能会发生变异，这些变异可能会改变品种本身的优良性状；二是由于中间需要更换培养基，延长了培养时间，增加了污染几率。
发明内容
为了保证马铃薯品种原始性状和遗传背景，缩短培养时间，减少污染率，就要改变茎尖的再生方式。本发明针对现有技术的不足，提供了一种茎尖的无愈伤固体培养基，以期减少茎尖再生植株的变异。
本发明技术方案如下：
一种用于培养马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖和倍力凝；其特征是，无机物包括浓度范围在165～2108mg/L的大量元素氮、磷、钾、硫、钙、镁，浓度范围在0.025～38mg/L的微量元素；有机物包括谷氨酰胺、水解酪蛋白、酵母提取物、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸中的一种或其组合；植物激素包括玉米素、赤霉素、6-苄氨基腺嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丁酸中的一种或其组合。
所述的大量元素氮、磷、钾、硫、镁、钙，优选的为氮、磷、钾、硫、镁、钙的硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氯化物。所述的微量元素为碘、硼、锰、锌、钠、铜、铁、钼、钴。
一种用于培养马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖和倍力凝；其特征是，包括以下组分：
（1）无机物
Figure GDA00002139489000021
Figure GDA00002139489000031
（2）有机物
Figure GDA00002139489000032
（3）植物激素
Figure GDA00002139489000041
（4）蔗糖 25～35g/L；
（5）倍力凝 3.5～4.5g/L。
优选的，该种用于培养马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖、倍力凝；其特征是，包括以下组分：
（1）无机物
Figure GDA00002139489000042
Figure GDA00002139489000051
（2）有机物
Figure GDA00002139489000052
（3）植物激素
Figure GDA00002139489000053
（4）蔗糖 30g/L；
（5）倍力凝 4g/L。
本发明进一步技术方案：
该种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖、倍力凝；其特征是，包括以下组分：
（1）无机物
Figure GDA00002139489000061
（2）有机物
Figure GDA00002139489000071
（3）植物激素
玉米素   0.2～0.5mg/L
赤霉素   0.5～1.0mg/L
吲哚丁酸 0～0.1mg/L；
（4）蔗糖 30g/L；
（5）倍力凝 4g/L。
配制方法：按照配方准确称量各组分，所用试剂为分析纯，加去离子水充分溶解，定容，调整pH至5.8～6.0，分装，121℃灭菌15分钟。
本发明还提供所述培养基用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的方法，具体操作过程如下：
待剥离样品的准备：块茎自然通过休眠后，分别播种于花盆内。待幼苗长到3-4cm时剪切下来。去掉所有叶片，用自来水连续冲洗15分钟以上，然后用0.1%的生汞表面灭菌10分钟（也可用次氯酸钠溶液），最后在无菌条件下用无菌水彻底冲洗3-5次。
剥离茎尖：无菌条件下，在解剖镜下将含有1个叶原基的生长点，大小约为0.1～0.2mm，接种到本发明培养基上。然后在温度为22±2℃,光照强度700lx，光照时间8h/d，相对湿度65～75%的培养室内培养。
本发明将大量元素里的铵态氮和硝态氮进行了调节，并增加了有机添加物，主要是调节了激素种类和水平，由于新选用的培养基各种因素的综合作用，应用改良后的培养基，茎尖培养成苗基本无愈伤组织产生（见表1），解决了长期困扰马铃薯茎尖再生变异的关键技术难题，保证了脱毒马铃薯品种的原始性状和遗传背景。另外，该培养基上成苗快，缩短了培养时间。
表1 马铃薯茎尖再生培养基改良前后出愈率及成苗率的比较
注：出愈率为形成愈伤组织的外植体数占总接种茎尖数的百分比，成苗率为成苗的株数占总接种茎尖数的百分比。
具体实施方式
实施例1
一种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基：
（1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二纳37.3mg/L；
（2）有机物：肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L；
（3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤0.2mg/L，吲哚丁酸0.05mg/L，赤霉素0.1mg/L；
（4）蔗糖 30g/L；
（5）倍力凝 4g/L。
配制方法：按照配方准确称量各组分，加去离子水充分溶解，定容，调整pH 至5.8～6.0，分装，121℃灭菌15分钟。
还可以先将无机物、有机物和植物激素配成母液，再按照配方准确称量其余组分，加去离子水充分溶解，定容，调整pH 至5.8～6.0，分装，灭菌。
实施例2
一种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基：
（1）无机物：同实施例1；
（2）有机物：同实施例1；
（3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/L，吲哚丁酸0.2mg/L，赤霉素0.2mg/L；
（4）蔗糖 30g/L；
（5）倍力凝 4g/L。
配置方法：同实施例1。
实施例3
一种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基：
（1）无机物：同实施例1；
（2）有机物：同实施例1；
（3）植物激素：玉米素0.5mg/L，赤霉素1.0mg/L；
（4）蔗糖 30g/L；
（5）倍力凝 4g/L。
配置方法：同实施例1。
实施例4
一种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基：
（1）无机物：同实施例1；
（2）有机物：同实施例1；
（3）植物激素：吲哚乙酸0.1mg/L，赤霉素0.5mg/L；
（4）蔗糖 30g/L；
（5）倍力凝 4g/L。
配制方法：同实施例1。
实施例5
一种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基：
（1）无机物：硝酸钾2108mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二纳37.3mg/L；
（2）有机物：谷氨酰胺250mg/L，水解酪蛋白100mg/L，酵母提取物250mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L；
（3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤0.2mg/L，吲哚丁酸0.05mg/L，赤霉素0.1mg/L；
（4）蔗糖 30g/L；
（5）倍力凝 4g/L。
配置方法：同实施例1。
实施例6
一种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基：
（1）无机物：硝酸钾2108mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二纳37.3mg/L；
（2）有机物：谷氨酰胺500mg/L，水解酪蛋白300mg/L，酵母提取物500mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L；
（3）植物激素：玉米素0.5mg/L，赤霉素1.0mg/L；
（4）蔗糖 30g/L；
（5）倍力凝 4g/L。
配置方法：同实施例1。
实施例7
一种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基：
（1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二纳37.3mg/L；
（2）有机物：谷氨酰胺100mg/L，水解酪蛋白100mg/L，酵母提取物100mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L；
（3）植物激素：吲哚乙酸0.1mg/L，赤霉素0.5mg/L；
（4）蔗糖 30g/L；
（5）倍力凝 4g/L。
配置方法：同实施例1。
对比例：采用现有技术（先诱导愈伤组织，然后分化成苗），
诱导愈伤组织培养基配方：
（1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二纳37.3mg/L；
（2）有机物：肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L；
（3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤1.5mg/L，萘乙酸1mg/L；
（4）蔗糖 30g/L；
（5）琼脂：6g/L。
分化成苗培养基配方：
（1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二纳37.3mg/L；
（2）有机物：肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L；
（3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤1.5mg/L，萘乙酸0.5mg/L，赤霉素5mg/L；
（4）蔗糖 30g/L；
（5）琼脂：6g/L。
（引自杨春，愈伤组织再生马铃薯苗脱毒体系的建立，中国马铃薯，2008，22（3）：137～139）
实施例8
将实施例1～7的培养基用于马铃薯茎尖无愈伤成苗，具体操作步骤如下：
待剥离样品的准备：块茎自然通过休眠后，分别播种于花盆内。待幼苗长到3-4cm时剪切下来。去掉所有叶片，用自来水连续冲洗15分钟以上，然后用0.1%的生汞表面灭菌10分钟（也可用次氯酸钠溶液），最后在无菌条件下用无菌水彻底冲洗3-5次。
剥离茎尖：无菌条件下，在解剖镜下将含有1个叶原基的生长点，大小约为0.1-0.2mm，接种到本发明培养基上。然后在温度为22±2℃,光照强度700lx，光照时间8h/d，相对湿度65-75%的培养室内培养。
实验结果见表2
表2 马铃薯茎尖再生培养基改良前后出愈率和成苗率情况比较
Figure GDA00002139489000131
注：出愈率为形成愈伤组织的外植体数占总接种茎尖数的百分比，成苗率为成苗的株数占总接种茎尖数的百分比。

Claims (3)

1.一种用于培养马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基，包括以下组分：
（1）无机物
Figure FDA00002139488900011
（2）有机物
Figure FDA00002139488900021
（3）植物激素
6-苄氨基腺嘌呤0.1-0.2mg/L+吲哚丁酸0.05-0.2mg/L+赤霉素0.1-0.2mg/L；
或者玉米素0.5mg/L+赤霉素1.0mg/L；
或者吲哚乙酸0.1mg/L+赤霉素0.5mg/L；
（4）蔗糖 25～35g/L；
（5）倍力凝 3.5～4.5g/L。
2.如权利要求1所述的用于培养马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基，其特征是，包括以下组分：
（1）无机物
Figure FDA00002139488900022
Figure FDA00002139488900031
（2）有机物
（3）植物激素
6-苄氨基腺嘌呤0.2mg/L+吲哚丁酸0.05mg/L+赤霉素0.1mg/L；
（4）蔗糖 30g/L；
（5）倍力凝 4g/L。
3.如权利要求1～2任一项所述的用于培养马铃薯茎尖无愈伤成苗的培养基的配制方法，其特征是，按照配方准确称量各组分，所用试剂为分析纯，加去离子水充分溶解，定容，调整pH至5.8～6.0，分装，121℃灭菌15分钟。
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