CN103202232B - 一种高效产业化生产番薯脱毒组培苗的方法 - Google Patents

一种高效产业化生产番薯脱毒组培苗的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效产业化生产番薯脱毒组培苗的方法，包括以下步骤：（1）材料培养（2）材料消毒（3）外植体芽诱导（4）继代增值培养（5）病毒检测（6）生根培养（7）炼苗、移栽。本发明根据病毒在植株顶端生长点的数量远远少于植株下部的成熟部位的原理，加大取生长点的代数，达到脱毒的目的。本发明采用低激素浓度、改良MS基本培养基和三天的暗培养的方法，大大降低了脱毒组培苗的变异率，加快了组培苗的生长速度，缩短了繁殖周期，扩繁速度高，生产成本低。

Description

一种高效产业化生产番薯脱毒组培苗的方法
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种高效产业化生产番薯脱毒组培苗的方法。
背景技术
番薯(Ipomoea batatas Lam.)是一种重要的粮食、饲料和工业原料作物，具有产量高、营养丰富、稳产性好等优点。然而，由于番薯病毒病的广泛存在，以及生产中番薯以薯块进行无性繁殖，造成病毒病的蔓延，从而造成番薯产量降低、品质下降、种性退化。目前科研上主要通过茎尖离体培养获得脱毒种苗，但此方法运用于产业化大批量生产，扩繁速度慢，变异率高，生产成本高。
发明内容
本发明的目的是提供了一种方法简单、成本低、变异率低、扩繁速度快、缩短了繁殖周期的高效产业化生产番薯脱毒组培苗的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种高效产业化生产番薯脱毒组培苗的方法，包括以下步骤：
（1）材料培养
从大田取回待脱毒番薯的20～30㎝长的茎段，扦插在大棚苗床上，让其生长新枝；过程中，每星期浇一次营养液，每5天用50%多菌灵或百菌清500倍喷叶及周围环境，每天晚上用75%酒精喷一次周围环境，以保棚内环境清洁；待新长出的枝长到8～10㎝时，剪下新枝，重新扦插到新的培养基上，用同样的方法让它长出新枝；
（2）材料消毒
待二次扦插苗的新枝长到8㎝以上时，取两三节长的茎段，剪下后放入消毒过的密封玻璃瓶中密封，拿到超净工作台，用75%酒精浸19～20秒，再用0.1%升汞消毒5～7分钟，最后用无菌水冲洗4～5次；
（3）外植体芽诱导
切取1㎝消毒过的外植体的腋节位接种到外植体芽诱导培养基，接种后先进行三天时间的暗培养，温度28±2℃，然后，在光周期16小时以上、光强2000LX以上的条件下培养；
（4）继代增值培养
外植体培养25天，薯苗长至3㎝～6㎝时，取每株生长点2～4mm单独培养于继代增殖培养基，剩余茎段单节培养于继代增殖培养基，接种后先进行三天暗培养，温度设28±2℃，然后，在光周期16小时以上、光强2000LX以上的条件下培养；光照培养三天后便可生根，下代再取生长点和单节茎段培养，12～15天或20天继代一次，增殖系数可达4～5倍；
（5）病毒检测
增殖第三、四代后便进行病毒检测，首先采用目测法，淘汰弱苗和显症苗，然后随机抽样采用指示植物法进行鉴定，随机抽样脱毒率低于100%，则加大培养代数，直至随机抽样脱毒率达100%；
（6）生根培养
取每株生长点2～4mm接到生根培养基，增强光照时间和光照强度，或放在自然光下培养生根；
（7）炼苗、移栽
生根好后的苗在放在自然光下炼苗1周，再打开瓶口放3～5天，然后洗净培养基，剪去过长的根，放入0.2%高锰酸钾浸泡1～2分钟，取出凉干后，栽入培养土，然后再盖一层拱膜，每天都要让其通风排气，保持培养土湿润，湿度在80～85%，待其长到5～8片新叶移栽大田。
外殖体芽诱导的培养基配方为：MS+6-BA0～0.5mg/L+IBA0～0.5mg/L+白糖30g/L+活性碳3～6g/L+琼脂6g/L；
继代增殖培养的培养基配方为：改良MS+IBA0～0.5mg/L+白糖30g/L+琼脂6g/L；
生根培养的培养基配方为：改良2/3MS+IBA0～0.5mg/L+白糖30g/L+琼脂6g/L+活性碳3～6g/L；
改良MS培养基配方(单位：mg／L）
成分 使用浓度(单位：mg／L）
硝酸铵NH4NO3 1700-2000
硝酸钾KNO3 1500-1850
氯化钙CaCl2·2H2O 500-700
硫酸镁MgSO4·7H2O 100-300
磷酸二氢钾KH2PO4 200-400
碘化钾KI 0.4-1.0
硼酸H3BO3 7-10
硫酸锰MnSO4·4H2O 10-30
硫酸锌ZnSO4·7H2O 6-12
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.1-0.5
硫酸铜CuSO4·5H2O 0.001-0.05
氯化钴CoCl2·6H2O 0.001-0.005
硫酸亚铁FeSO4·7H2O 12-30
乙二胺四乙酸钠Na2-EDTA 15-40
肌醇 50-90
盐酸硫胺素 0.01-0.2
盐酸吡哆醇 0.01-0.3
甘氨酸 2-4
烟酸 0-0.4
改良2/3MS培养基配方(单位：mg／L）
成分 使用浓度(单位：mg／L）
硝酸铵NH4NO3 1100-1400
硝酸钾KNO3 1000-1300
氯化钙CaCl2·2H2O 300-450
硫酸镁MgSO4·7H2O 100-200
磷酸二氢钾KH2PO4 100-200
碘化钾KI 0.4-1.0
硼酸H3BO3 7-10
硫酸锰MnSO4·4H2O 10-30
硫酸锌ZnSO4·7H2O 6-12
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.1-0.5
硫酸铜CuSO4·5H2O 0.001-0.05
氯化钴CoCl2·6H2O 0.001-0.005
硫酸亚铁FeSO4·7H2O 12-30
乙二胺四乙酸钠Na2-EDTA 15-40
肌醇 50-90
盐酸硫胺素 0.01-0.2
盐酸吡哆醇 0.01-0.3
甘氨酸 2-4
烟酸 0-0.4
本发明根据病毒在植株顶端生长点的数量远远少于植株下部的成熟部位的原理，加大取生长点的代数，达到脱毒的目的。本发明采用低激素浓度、改良MS基本培养基和三天的暗培养的方法，大大降低了脱毒组培苗的变异率，加快了组培苗的生长速度，缩短了繁殖周期，扩繁速度高，生产成本低。
具体实施方式
本发明高效产业化生产番薯脱毒组培苗的方法，包括以下步骤：
1、材料培养
从大田取回待脱毒番薯的20～30㎝长的茎段，扦插在大棚苗床上，让其生长新枝。过程中，每星期浇一次营养液，每5天用50%多菌灵（或百菌清）500倍喷叶及周围环境，周围环境最好每天下班前用75%酒精每天晚上喷一次，以保棚内环境清洁。
待新枝长到8～10㎝时，剪下新枝，重新扦插到新的基质，用同样的方法让它长出新枝。
2、材料消毒
待二次扦插苗的新枝长到8㎝以上时，取两三节长的茎段，剪下后放入消毒过的密封玻璃瓶中密封好，拿到工作台前，用75%酒精浸20秒左右，再用0.1%升汞消毒5～7分钟，最后用无菌水冲洗4～5次。
3、外植体芽诱导
切取1㎝左右的消毒过的外植体的腋节位接种到外植体芽诱导培养基，接种后先进行三天时间的暗培养，温度28±2℃，然后，在光周期16小时以上、光强2000LX以上的条件下培养。
4、继代增殖培养
外植体培养25天左右，薯苗长至3㎝～6㎝时，取每株生长点2～4mm左右单独培养于继代增殖培养基，剩余茎段单节培养于继代增殖培养基，接种后先进行三天暗培养，温度设28±2℃，然后，在光周期16小时以上、光强2000LX以上的条件下培养；光照培养三天后便可生根，下代再取生长点和单节茎段培养，一般12～15天或20天继代一次都可，增殖系数可达4～5倍。
5、病毒检测
一般增殖第三、四代后便可进行病毒检测。首先采用目测法，淘汰弱苗和显症苗，然后随机抽样采用指示植物法进行鉴定。随机抽样脱毒率低于100%，则加大培养代数，直至随机抽样脱毒率达100%。
6、生根培养
取每株生长点2～4mm左右接到生根培养基，增强光照时间和光照强度，或放在自然光下培养生根。
7、炼苗、移栽
生根好后的苗在放在自然光下炼苗1周，再打开瓶口放3～5天，然后洗净培养基，剪去过长的根，放入0.2%高锰酸钾浸泡1～2分钟，取出凉干后，栽入培养土。然后再盖一层拱膜，但每天都要让其通风排气，保持培养土湿润，湿度在80～85%左右，不能过大，否则容易腐烂，待其长到5～8片新叶即可移栽大田。
培养基配方
外殖体芽诱导：MS+6-BA0～0.5mg/L+IBA0～0.5mg/L+糖30g/L+活性碳3～6g/L+琼脂6g/L
继代增殖培养：改良MS+IBA0～0.5mg/L+糖30g/L+琼脂6g/L
生根培养：改良2/3MS+IBA0～0.5mg/L+糖30g/L+琼脂6g/L+活性碳3～6g/L。
表1.本发明的方法和普通茎尖培养的比较
Figure GDA0000410779910000061
本发明的方法经过实践：①每年都重新从地里取材，一般三、四代就可以脱毒，即使是农民长期自留薯块种植的品种，病毒含量比较高，也一般十四代就可以脱毒；②本发明的方法要到30代以后才开始出现变异，一般产业化生产，每年都重新取材消毒，达不到30多代，不会有变异苗出现。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (2)

1.一种高效产业化生产番薯脱毒组培苗的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）材料培养
从大田取回待脱毒番薯的20～30㎝长的茎段，扦插在大棚苗床上，让其生长新枝；过程中，每星期浇一次营养液，每5天用50%多菌灵或百菌清500倍喷叶及周围环境，每天晚上用75%酒精喷一次周围环境，以保棚内环境清洁；待新长出的枝长到8～10㎝时，剪下新枝，重新扦插到新的培养基上，用同样的方法让它长出新枝；
（2）材料消毒
待二次扦插苗的新枝长到8㎝以上时，取两三节长的茎段，剪下后放入消毒过的密封玻璃瓶中密封，拿到超净工作台，用75%酒精浸19～20秒，再用0.1%升汞消毒5～7分钟，最后用无菌水冲洗4～5次；
（3）外植体芽诱导
切取1㎝消毒过的外植体的腋节位接种到外植体芽诱导培养基，接种后，先进行三天时间的暗培养，温度28±2℃，然后，在光周期16小时以上、光强2000LX以上的条件下培养；
（4）继代增值培养
外植体培养25天，薯苗长至3㎝～6㎝时，取每株生长点2～4mm单独培养于继代增殖培养基，剩余茎段单节培养于继代增殖培养基，接种后，先进行三天时间的暗培养，温度设28±2℃，然后，在光周期16小时以上、光强2000LX以上的条件下培养，光照培养三天后便可生根，下代再取生长点和单节茎段培养，12～15天或20天继代一次，增殖系数可达4～5倍；
（5）病毒检测
增殖第三、四代后便进行病毒检测，首先采用目测法，淘汰弱苗和显症苗，然后随机抽样采用指示植物法进行鉴定，随机抽样脱毒率低于100%，则加大培养代数，直至随机抽样脱毒率达100%；
（6）生根培养
取每株生长点2～4mm接到生根培养基，增强光照时间和光照强度，或放在自然光下培养生根；
（7）炼苗、移栽
生根好后的苗在放在自然光下炼苗1周，再打开瓶口放3～5天，然后洗净培养基，剪去过长的根，放入0.2%高锰酸钾浸泡1～2分钟，取出凉干后，栽入培养土，然后再盖一层拱膜，每天都要让其通风排气，保持培养土湿润，湿度在80～85%，待其长到5～8片新叶移栽大田。
2.如权利要求1所述的一种高效产业化生产番薯脱毒组培苗的方法，其特征在于：
外殖体芽诱导的培养基配方为：MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+白糖30g/L+活性碳3～6g/L+琼脂6g/L；
继代增殖培养的培养基配方为：改良MS+IBA0.5mg/L+白糖30g/L+琼脂6g/L；
生根培养的培养基配方为：改良2/3MS+IBA0.5mg/L+白糖30g/L+琼脂6g/L+活性碳3～6g/L；
改良MS培养基配方:
成分 使用浓度，单位：mg／L 硝酸铵NH4NO3 1700-2000 硝酸钾KNO3 1500-1850 氯化钙CaCl2·2H2O 500-700 硫酸镁MgSO4·7H2O 100-300 磷酸二氢钾KH2PO4 200-400 碘化钾KI 0.4-1.0 硼酸H3BO3 7-10 硫酸锰MnSO4·4H2O 10-30 硫酸锌ZnSO4·7H2O 6-12
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.1-0.5 硫酸铜CuSO4·5H2O 0.001-0.05 氯化钴CoCl2·6H2O 0.001-0.005 硫酸亚铁FeSO4·7H2O 12-30 乙二胺四乙酸钠Na2-EDTA 15-40 肌醇 50-90 盐酸硫胺素 0.01-0.2 盐酸吡哆醇 0.01-0.3 甘氨酸 2-4 烟酸 0-0.4
改良2/3MS培养基配方
成分 使用浓度，单位：mg／L 硝酸铵NH4NO3 1100-1400 硝酸钾KNO3 1000-1300 氯化钙CaCl2·2H2O 300-450 硫酸镁MgSO4·7H2O 100-200 磷酸二氢钾KH2PO4 100-200 碘化钾KI 0.4-1.0 硼酸H3BO3 7-10 硫酸锰MnSO4·4H2O 10-30 硫酸锌ZnSO4·7H2O 6-12 钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.1-0.5 硫酸铜CuSO4·5H2O 0.001-0.05 氯化钴CoCl2·6H2O 0.001-0.005 硫酸亚铁FeSO4·7H2O 12-30 乙二胺四乙酸钠Na2-EDTA 15-40 肌醇 50-90
盐酸硫胺素 0.01-0.2 盐酸吡哆醇 0.01-0.3 甘氨酸 2-4 烟酸 0-0.4
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