CN107043743A - 犬卵母细胞的体外成熟方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及犬卵母细胞的体外成熟(IVM)方法，尤其是涉及三阶段培养犬卵母细胞的体外成熟方法。

Description

犬卵母细胞的体外成熟方法
技术领域
本发明涉及犬卵母细胞的体外成熟(IVM)方法，尤其是涉及三阶段培养犬卵母细胞的体外成熟方法。
背景技术
犬繁殖生理与通常的其他哺乳动物有很大区别。犬是非季节单次发情动物，一年仅排卵1-2次，间隔为4-12个月。犬的繁殖周期具有较长的动情前期和发情期的特征(大约一周)，黄体期在循环的孕酮作用下平均持续2个月。至发情后期，黄体功能逐渐退化，使犬进入2-10个月的长时间乏情阶段。乏情时缺乏性行为或性腺活动，而且孕酮浓度到达最低点。从乏情中期到末期，下丘脑分泌促性腺释放激素(GnRH)增多，从而刺激促卵泡素(FSH)分泌量增加和促黄体素(LH)的释放。
FSH在开始发情前期对卵泡发生发挥重要作用，对于发情后期，LH峰促使成熟卵泡快速发育和排卵前黄体化，犬在LH峰40-50小时后排卵。发情行为和排卵是在雌激素循环下降和孕激素显著上升的作用下完成的。排卵前卵泡已经黄体化，此时大多数哺乳动物排出的卵母细胞已经成熟，处于第二次减数分裂中期(MII期)，而犬的卵母细胞第一次减数分裂才开始。由于犬排卵后的卵母细胞大部分处于GV(生发泡)期，尚未成熟，增加了其在输卵管中与精子受精的可能性，因此未成熟的卵母细胞也能受精，也能形成原核。犬科动物与它哺乳动物相比这些特殊的生殖生理特点，对于进行犬卵母细胞的体外成熟造成了相当大的难度。
国内外在犬科动物卵母细胞成熟方面均处于条件摸索阶段。1976年Mahi、Yanagimacbi首次报道了犬科动物卵母细胞的体外成熟培养，由此开始，研究人员开始对体外培养狐、犬卵母细胞进行了各种各样的尝试，例如采用TCM-199、SOF等常用的基础培养液进行培养。激素作为对卵母细胞成熟重要的影响因素，研究者进行了各种激素及激素组合的尝试，但到目前为止还没有找到合适的激素组合来提高卵母细胞的成熟率。为了提高犬卵母细胞体外达到MII期(第二次减数分裂中期)的成熟率，研究者开始尝试其它的培养方式。Hewitt(2001)首先关注输卵管环境对卵母细胞成熟的影响，用发情犬的输卵管组织与输卵管液进行与卵母细胞共培养，结果表明在共培养后减数分裂恢复率显著提高(EnglandG CW,Vemtegen JP,Hewitt DA.Pregnancy following in vitro fertilization ofcanine oocytesIJ].Vet Rec,2001,148:20-229)。Shimazu等(1993)研究证明，发情犬的输卵管上皮细胞共培养，培养48h、72h卵母细胞的成熟率能有明显的提高(48h MII期达16.7％，72h MII期达23.2％)(Yamadas,Shimazu Y,Kawano Y,et al.In vitromaturation and fertilization of dog ooeytes[J].Reprod Fertil,1993,47(SuPPI):227-235)。
研究人员虽然还在供体年龄、品种、繁殖周期、卵巢卵泡大小、培养基、体外成熟时间、添加蛋白、激素及共培养等方面对犬科动物卵母细胞体外成熟进行了研究，但是现有技术往往都是采用单一的培养方法或者单一的培养基，在成熟的不同阶段更换新鲜培养基，在单一的培养基中添加2-3种激素。虽然也有少数报道犬科动物卵母细胞的成熟分两个阶段进行，但是总的来说这样的成熟方案与其他哺乳动物采用的卵母细胞的体外成熟方法并无太大差别。然而，犬的卵母细胞在体内成熟过程是分阶段进行的，且主要以排卵后为成熟的重要阶段。因此采用单一培养基或激素配比无法模拟犬卵母细胞体内成熟的过程，无法满足犬卵母细胞体外成熟的要求，造成犬卵母细胞体外成熟率较低且质量较差，目前所有犬卵母细胞的体外成熟方案的成熟率仅为10-20％左右。
因此，非常需要开发有效提高犬卵母细胞体外成熟率的方法，也就是提高犬卵母细胞体外达到MII期(第二次减数分裂中期)成熟率的方法，从而建立犬卵母细胞的体外成熟体系，使犬成熟卵母细胞的来源更为广泛，代替原有通过手术法冲取成熟卵母细胞的方案。
发明内容
针对现有技术中犬卵母细胞体外成熟率较低且质量较差的缺陷，本发明的发明人对犬卵母细胞体外成熟方法进行了深入的研究，建立了犬卵母细胞的三阶段体外成熟方法，采用不同的基础培养基，添加不同种类的激素，并综合运用共培养法及激活法，提高了犬卵母细胞的体外成熟率。
第一方面，本发明提供了犬卵母细胞的三阶段体外成熟方法，所述方法包括如下步骤：(1)以NCSU-23作为基础培养基，添加发情母犬血清、EGF、FSH、LH及E2，每12小时换液1次，培养包裹三层以上卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体24小时；(2)采用NCSU-23培养基，添加BSA、EGF、PMSG、HCG及E2，对步骤(1)获得的培养细胞继续培养24小时；以及(3)采用离子霉素及6-DMAP对卵母细胞进行化学激活，激活后底部培养有输卵管上皮细胞的培养皿中，采用mSOF培养基添加BSA及EGF进行体外成熟。
第二方面，本发明提供了犬卵母细胞的三阶段体外成熟方法，所述方法包括如下步骤：(1)以NCSU-23作为基础培养基，添加10％发情母犬血清、10ng/mL的EGF、2IU/mL的FSH、2IU/mL的LH及2IU/mL的E2，每12小时换液1次，培养包裹三层以上卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体24小时，作为第一阶段；(2)采用NCSU-23培养基，添加0.8％的BSA、10ng/mL的EGF、10IU/mL的PMSG、10IU/mL的HCG及2IU/mL的E2，对步骤(1)获得的培养细胞继续培养24小时，作为第二阶段；以及(3)采用离子霉素及6-DMAP对卵母细胞进行化学激活，激活后，在底部培养有输卵管上皮细胞的培养皿中，采用添加0.8％BSA及10ng/mL EGF的mSOF培养基进行体外成熟24小时，作为第三阶段。
所述底部培养有输卵管上皮细胞的培养皿的制备方法为：获得母犬卵巢，在超净台中将输卵管从卵巢囊表面分离，然后采用手术缝合线将输卵管的一段结扎，用1mL注射器将0.1％的I型胶原酶注入输卵管内，然后将输卵管的另一端结扎，放入培养箱中消化0.5-2h，然后用含有10％胎牛血清的内皮培养基ECM终止消化，离心去除上清液后，放入35mm培养皿进行培养，每48小时换液一次，细胞生长至90％汇合时冻存。
参见上述第一方面和第二方面的犬卵母细胞的三阶段体外成熟方法，本发明将体外成熟分为3个阶段，采用2种不同的培养基，在成熟的前48h共计使用了5种激素，进行体外成熟；而且本发明在体外成熟的第三阶段将无激素培养、化学激活及输卵管上皮细胞共培养等综合应用于犬卵母细胞体外成熟，这在犬卵母细胞体外成熟中尚属首次。
本发明的犬卵母细胞的三阶段体外成熟方法使得犬卵母细胞的体外成熟率可稳定在40％，显著提高了犬卵母细胞的体外成熟率。犬卵母细胞体外成熟体系的建立，使犬成熟卵母细胞的来源更加广泛，替代了原有通过手术法冲取成熟卵母细胞的方案，极大降低了体细胞克隆犬的生产成本。
缩略语和关键术语定义：
IVM：体外成熟，是指将处于GV期的未成熟卵母细胞经过体外培养至可受精的MII期(第二次减数分裂中期)卵母细胞的过程。
NCSU-23：NCSU-23培养基，是一种常用于猪卵母细胞体外成熟的培养基，参见潘登科，影响猪体细胞克隆胚胎发育能力的因素研究，中国农业大学博士学位论文(2005)。
mSOF：改良的合成输卵管液，是一种常用于哺乳动物胚胎培养的培养基，参见Y.H.Choi等，Optimization of culture medium for cloned bovine embryos and itsinfluence on pregnancy and delivery outcome,Theriogenology,58(2002),1187-1197。
附图说明
图1：图示了切割法获得的犬卵母细胞。
图2：图示了犬成熟卵母细胞。
图3：图示了犬未成熟卵母细胞。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的保护范围。
输卵管上皮细胞系的建立：
手术法摘取母犬卵巢，在超净台中将输卵管从卵巢囊表面分离。然后采用手术缝合线将输卵管的一段结扎，用1mL注射器将0.1％的I型胶原酶注入输卵管内，然后将输卵管的另一端结扎。放入培养箱中消化0.5-2h。然后用含有10％胎牛血清的内皮培养基ECM终止消化，离心去除上清液后，放入35mm培养皿进行培养，每48小时换液一次，细胞生长至90％汇合时冻存。
卵母细胞的体外成熟：
犬卵巢采集后，放入37℃含有双抗的生理盐水中，尽快带回实验室。带回实验室后，用含有双抗的生理盐水清洗卵巢5遍，然后在培养皿中将卵巢从卵巢囊中剥离，放入含有双抗的DPBS中清洗5次，然后放入含有10％FBS的TCM199冲卵液中，用11号手术刀片反复切割卵巢，尽量将所有卵泡切开，用冲卵液反复冲洗切割后的卵巢，然后收集冲卵液，在体式显微镜下挑选圆形、包裹有卵丘细胞的卵母细胞。
体外成熟第一阶段(24小时)：
体外成熟第一天采用NCSU-23为基础培养基，添加10％发情母犬血清、10ng/mL的EGF、2IU/mL的FSH、2IU/mL的LH及2IU/mL的E2，每12小时换液1次，培养24小时。
体外成熟第二阶段(24小时)：
培养基采用NCSU-23培养基，添加0.8％的BSA、10ng/mL的EGF、10IU/mL的PMSG、10IU/mL的HCG及2IU/mL的E2，24小时后换液。
体外成熟第三阶段(24小时)：
采用离子霉素及6-DMAP对卵母细胞进行化学激活，激活后，在底部培养有输卵管上皮细胞的培养皿中，采用mSOF培养基添加0.8％的BSA及10ng/mL的EGF进行体外成熟24小时。
体外成熟完成后，采用透明质酸酶脱去卵丘细胞，在体式显微镜下观察极体排出情况，判断成熟率。然后将卵母细胞放进10μg/mL的Hochest33342中染色，用荧光显微镜观察每个卵母细胞鉴定核成熟阶段。
卵母细胞成熟判定：成熟卵母细胞卵膜光滑、清晰且完整，卵周隙明显，有第一极体排出，通过染色可见明显的极体及细胞核荧光信号(参见图2)；未成熟卵母细胞，卵周隙较小或无卵周隙，卵膜不清晰，胞质发散，无第一极体，染色仅可见细胞核荧光信号(参见图3)。
实施例1：
培养基配方：
mSOF培养基(100mL)：
成分 含量
NaCl 0.626g
KCl 0.05364g
MgCl2·6H2O 0.01017
KH2PO4 0.01632g
60％乳酸钠 12.5μL
葡萄糖 0.027g
CaCl2·2H2O 0.025g
NaHCO3 0.2100g
丙酮酸钠 0.0033g
谷氨酰胺 0.014615g
必须氨基酸 2％
非必须氨基酸 1％
酚红 100ml+100μl
牛血清白蛋白 0.8g
NCSU-23培养基(100mL)：
成分 含量
NaCl 0.6356g
KCl 0.0356g
MgSO4·7H2O 0.0294g
KH2PO4 0.0162g
CaCl2·2H2O 0.025g
葡萄糖 0.1g
谷氨酰胺 0.0146g
牛磺酸 0.0876g
亚牛磺酸 0.0546g
链霉素 0.005g
青霉素 0.0066g
非必须氨基酸 1％
酚红 100μL
TCM199培养基：
购自Gibco公司，货号11150，500mL/瓶。
输卵管上皮细胞系的建立
手术法摘取母犬卵巢，在超净台中将输卵管从卵巢囊表面分离。然后采用手术缝合线将输卵管的一段结扎，用1mL注射器将0.1％的I型胶原酶注入输卵管内，然后将输卵管的另一端结扎。放入培养箱中消化0.5-2h。然后用含有10％胎牛血清的内皮培养基ECM终止消化，离心去除上清液后，放入35mm培养皿进行培养，每48小时换液一次，细胞生长至90％汇合时冻存，作为输卵管上皮细胞系待用。
卵母细胞的三阶段体外成熟：
共采集20只母犬的卵巢40个，所有卵巢均来自中国农业大学动物医院，采自进行节育手术的家养母犬。卵巢放入装有37℃生理盐水的50mL离心管，然后放入37℃胚胎运输箱带回实验室。所有卵巢用含有双抗的生理盐水洗涤5次，然后放入含有10％胎牛血清、HEPES缓冲的TCM199溶液(HM)中，用11号手术刀反复切割卵巢，将卵巢表面所有卵泡划破，用HM反复冲洗。然后在配有热台的奥林帕斯体视显微镜(SZX12)下挑选包裹三层以上卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体，共采集卵母细胞276枚(参见图1)。然后，用第一阶段成熟培养液1(添加10％发情母犬血清、10ng/mL的EGF、2IU/mL的FSH、2IU/mL的LH及2IU/mL的E2)洗涤3次，放入四孔培养板中进行体外成熟，培养12小时后，将卵母细胞用胚胎吸管转移至新鲜的成熟培养液1中继续培养12小时。然后，用第二阶段成熟培养液2(添加0.8％的BSA、10ng/mL的EGF、10IU/mL的PMSG、10IU/mL的HCG及2IU/mL的E2)继续进行24小时的体外成熟。随后，将卵母细胞转入10μmol/L的离子霉素激活5min，然后移入含2mmol/L 6-DMAP的mSOF培养液内再激活4小时，然后将卵母细胞转入以上“输卵管上皮细胞系的建立”步骤建立的底面培养有输卵管上皮细胞的四孔板中，采用添加0.8％的BSA及10ng/mL的EGF的mSOF培养液进行24的第三阶段的体外成熟。三阶段体外成熟后，用0.1％的透明质酸酶将卵丘细胞去除干净，在体式显微镜下观察第一极体排出情况，成熟卵母细胞卵膜光滑、清晰且完整，卵周隙明显，有第一极体排出，通过染色可见明显的极体及细胞核荧光信号(参见图2)，统计成熟率。未成熟的卵母细胞，卵周隙较小或无卵周隙，卵膜不清晰，胞质发散，无第一极体，染色仅可见细胞核荧光信号(参见图3)。经过体外成熟，最终有113枚卵母细胞达到成熟的MII(第二次减数分裂中期)期，总成熟率为40.9％。
对比实施例1：
卵巢带回实验室后，沿卵巢囊孔剪开取其卵巢，用手术刀片切割卵巢皮质释放卵丘卵母细胞复合体。捡卵后用PBS洗两遍(含有2mg/mL丙酮酸，10％胎牛血清和50μg/mL链霉素)选择直径﹥110微米，由三层或更多层紧密卵丘包围，暗黑色均质的卵母细胞用于体外成熟培养。犬卵母细胞体外成熟的基础培养基为TCM199，添加2IU/mL的LH、2IU/mL的FSH和2IU/mL的雌二醇，液滴表面覆盖矿物油，放入38.5℃、100％湿度，5％的二氧化碳培养箱中进行体外培养。体外培养48小时后，卵母细胞移入透明质酸酶小滴中，用直径小于卵母细胞直径的端口胚胎吸管管轻轻吹吸，机械地剥离卵丘细胞从而获得裸卵。然后，把裸卵放进10μg/mL的Hochest33342染色，用荧光显微镜观察每个卵母细胞鉴定核成熟阶段。
本研究采用上述成熟方案进行犬卵母细胞体外成熟，共采集犬卵巢28对，采集卵母细胞231枚，经过48h的体外成熟，共计获得成熟卵母细胞37枚，平均成熟率16％。
将实施例1和对比实施例1相比较可以看出，采用本发明的犬卵母细胞的三阶段体外成熟方法，276枚卵母细胞，经72小时的体外成熟，共计获得成熟卵母细胞113枚，总成熟率为40.9％，显著高于目前现有技术中常用的培养方法获得的16％的平均成熟率。

Claims (4)

1.犬卵母细胞的三阶段体外成熟方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：(1)以NCSU-23作为基础培养基，添加发情母犬血清、EGF、FSH、LH及E2，每12小时换液1次，培养包裹三层以上卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体24小时；(2)采用NCSU-23培养基，添加BSA、EGF、PMSG、HCG及E2，对步骤(1)获得的培养细胞继续培养24小时；以及(3)采用离子霉素及6-DMAP对卵母细胞进行化学激活，激活后底部培养有输卵管上皮细胞的培养皿中，采用mSOF培养基添加BSA及EGF进行体外成熟。
2.犬卵母细胞的三阶段体外成熟方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：(1)以NCSU-23作为基础培养基，添加10％发情母犬血清、10ng/mL的EGF、2IU/mL的FSH、2IU/mL的LH及2IU/mL的E2，每12小时换液1次，培养包裹三层以上卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体24小时，作为第一阶段；(2)采用NCSU-23培养基，添加0.8％的BSA、10ng/mL的EGF、10IU/mL的PMSG、10IU/mL的HCG及2IU/mL的E2，对步骤(1)获得的培养细胞继续培养24小时，作为第二阶段；以及(3)采用离子霉素及6-DMAP对卵母细胞进行化学激活，激活后，在底部培养有输卵管上皮细胞的培养皿中，采用添加0.8％BSA及10ng/mL EGF的mSOF培养基进行体外成熟24小时，作为第三阶段。
3.根据权利要求1或2的犬卵母细胞的三阶段体外成熟方法，其特征在于所述底部培养有输卵管上皮细胞的培养皿的制备方法为：在超净台中将输卵管从离体获得的卵巢囊表面分离，然后将输卵管的一段结扎，用1mL注射器将0.1％的I型胶原酶注入输卵管内，然后将输卵管的另一端结扎，放入培养箱中消化0.5-2h，然后用含有10％胎牛血清的内皮培养基ECM终止消化，离心去除上清液后，放入35mm培养皿进行培养，每48小时换液一次，细胞生长至90％汇合时冻存。
4.根据权利要求1或2的犬卵母细胞的三阶段体外成熟方法，其特征在于所述mSOF培养基(100mL)的配方如下：NaCl，0.626g；KCl，0.05364g；MgCl2·6H2O，0.01017；KH2PO4，0.01632g；60％乳酸钠，12.5μL；葡萄糖，0.027g；CaCl2·2H2O，0.025g；NaHCO3，0.2100g；丙酮酸钠，0.0033g；谷氨酰胺，0.014615g；必须氨基酸，2％；非必须氨基酸，1％；酚红，100ml+100μl；牛血清白蛋白，0.8g；
所述NCSU-23培养基(100mL)的配方如下：NaCl，0.6356g；KCl，0.0356g；MgSO4·7H2O，0.0294g；KH2PO4，0.0162g；CaCl2·2H2O，0.025g；葡萄糖，0.1g；谷氨酰胺，0.0146g；牛磺酸，0.0876g；亚牛磺酸，0.0546g；链霉素，0.005g；青霉素，0.0066g；非必须氨基酸，1％；酚红，100μL。
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Denomination of invention: In vitro maturation method of canine oocytes

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