CN110312789A - 用于卵母细胞体外成熟的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于卵母细胞的培养基及其用途。具体地，公开了用于体外培养卵母细胞的培养基，其中所述培养基包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM‑CSF)。培养基中GM‑CSF的存在提高了卵母细胞的成熟和/或发育能力，使其适合用于随后的辅助生殖技术。还公开了提高卵母细胞的成熟和/或发育能力的方法。

Description

用于卵母细胞体外成熟的组合物和方法

优先权声明

本申请要求2016年12月9日提交的澳大利亚临时专利申请号2016905096的优先权，其内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明通常涉及用于卵母细胞的成熟的组合物和方法。特别地，本发明涉及利用改进的成熟培养基的组合物和体外方法，所述改进的成熟培养基提高了受精前卵母细胞的成熟。

背景技术

在哺乳动物中，未成熟卵子(卵母细胞)在卵巢内的卵泡中生长和发育。未成熟的卵母细胞代谢地与体颗粒细胞(somatic granulosa cells)结合，所述体颗粒细胞围绕卵母细胞并培育卵母细胞发育直至排卵。基本上，卵母细胞的成熟取决于其与伴随的体颗粒细胞(一旦卵母细胞排卵称为卵丘细胞)的关联，体颗粒细胞不仅支持卵母细胞的生长和发育，而且还调节减数分裂的进展。

在排卵前发育期间卵母细胞的细胞质和核的成熟是密切相关的，但是差异可区分的过程对于成功受精、胚胎发育，和对于胚胎植入、发育到足月和生出健康后代的能力是至关重要的。

在细胞质发育期间，卵母细胞的直径基本上从约15μm增加至100μm，对应于体积增加300倍。在这个阶段，卵母细胞在转录和翻译上都非常活跃。例如，成熟的小鼠卵母细胞含有比平均体细胞多～200倍的RNA和～50-60倍的蛋白质。卵母细胞中mRNA的含量也高，与体细胞中～2-3％的mRNA含量相比，为～15-20％。

卵母细胞的核成熟发生在促性腺激素黄体生成激素激增之后，并且涉及核膜的溶解，染色体浓缩，随后向在赤道板中移动，以及在纺锤体中微管组装。

现在西方国家的很大一部分儿童是使用辅助生殖技术出生的，辅助生殖技术包括使用体外受精(in vitro fertilization，IVF)。IVF通常采用激素刺激女性卵巢的形式，以产生多个生长的卵泡，从这些排卵前的卵泡中收集卵细胞，在体外使用精子使收集的卵细胞受精，并将所得胚胎引入子宫。鉴于许多这些步骤发生在生殖道之外，模仿卵母细胞的自然环境是最大化IVF计划成功的重要考虑因素。

在标准IVF程序中使用的大剂量的促性腺激素或其他卵巢卵泡刺激剂可导致卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)的病症，其发生在进行IVF周期的大约5％的女性中。OHSS通常是温和且自限性的。在某些情况下，需要紧急就医。严重时，该病症可能会危及生命，需要住院治疗，静脉注射液，缓解疼痛和其他药物。在极少数情况下，可能会出现来自腿部凝块的肺栓塞或严重脱水的并发症。

受精前卵母细胞的体外成熟(In vitro maturation，IVM)越来越多地用于IVF的辅助治疗，这大大降低了治疗期间激素施用的需要。IVM涉及从接受低水平促性腺激素或甚至没有促性腺激素的患者的较小卵泡中去除卵细胞。用于获取卵子的程序需要修改的患者管理系统和卵细胞收集程序。

具有多囊卵巢综合征病症的女性需要IVM胜于IVF，以避免由施用促性腺激素或其他卵巢卵泡刺激剂引起的卵巢过度刺激。IVM也适用于那些被建议在不孕症治疗期间尽量减少卵泡刺激的女性，并且用于接受化疗且需要保留生育能力的女性癌症患者。IVM对患者也更方便，因为它需要较少的药物施用，这通常由患者自己进行。因此，IVM具有成本优势，因为药物使用成本最小化。

然而，IVM相对于IVF在建立怀孕和活产中的效率降低。虽然最近对患者管理有了一些改进，但实验室技术几乎没有进展，尽管目前的IVM方法不能复制在成熟的卵泡和生殖道中的环境。

在非人类哺乳动物中，动物胚胎的体外生产(in vitro production，IVP)具有多种目的，例如家畜和驯养品种的遗传改良，稀有品种的遗传拯救，以及用于操作的平台技术，如从有性精子中产生有性胚胎，或通过体细胞核移植进行克隆。体外生产胚胎的基本技术是卵母细胞的体外成熟。IVP有可能取代目前的常规技术，如多次排卵和胚胎移植(multiple ovulation and embryo transfer，MOET)，其中(类似于人类临床应用)需要促性腺激素治疗。然而，由于生产可移植阶段胚胎的效率相对较低，这种胚胎的胚胎移植后结果不佳以及这种胚胎冷冻和解冻(储存)后的结果不佳，阻碍了采用IVP用于育种和其它用途。用于动物胚胎IVP的卵母细胞的不成熟反映了这些不良结果。

因此，非常需要用于体外使卵母细胞成熟的新组合物和方法，例如以提高辅助生殖技术的有效性。

本说明书中包括对文献、操作、材料、设备、物品等的讨论仅仅是为了提供本发明的背景。没有暗示或表示任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分或者是与本发明相关的领域中的公知常识，因为它在本申请的每个权利要求的优先权日之前存在。

发明内容

本发明部分地基于以下发现：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在提高卵母细胞的体外成熟和发育能力方面是有效的。这使得能够配制和制备用于卵母细胞体外成熟的培养基，包括作为生殖技术应用的一部分。

因此，在第一方面，本发明提供了一种卵母细胞体外成熟培养基，所述培养基包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

在第二方面，本发明提供了一种用于提高卵母细胞体外成熟的培养基，所述培养基包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

在第三方面，本发明提供了用于提高卵母细胞成熟的体外培养基，所述培养基包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

在本发明第一至第三方面的一些实施方式中，GM-CSF提高了培养基中培养的卵母细胞的发育能力。发育能力可以例如通过卵裂率的提高，按时胚泡发育和/或发育到胚泡阶段来体外测量。

在本发明前述方面的一些实施方式中，源自培养基中培养的卵母细胞的胚胎具有提高的胚泡内细胞团数、提高的胚泡率、提高的滋养外胚层细胞数、提高的胚泡总细胞数和提高的生存力中的一个或多个。

在本发明前述方面的一些实施方式中，源自培养基中培养的卵母细胞的胚泡具有减少的DNA损伤。DNA损伤的减少可能反过来降低异常基因表达或使异常基因表达正常化，所述异常基因表达可能是体外培养的后果。

在本发明前述方面的一些实施方式中，在将源自培养基中培养的卵母细胞的胚胎移植至代孕者后，提高了在所述代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

在本发明前述方面的一些实施方式中，卵母细胞选自人卵母细胞、牛卵母细胞、猪卵母细胞、马卵母细胞、犬卵母细胞、猫卵母细胞、鼠卵母细胞、羊卵母细胞和非人灵长类动物卵母细胞。

在本发明前述方面的一些实施方式中，卵母细胞来自老年和/或肥胖受试者。

在本发明前述方面的一些实施方式中，所述GM-CSF是物种特异性的。在一些实施方式中，培养基中存在的GM-CSF的量为约0.1ng/ml至约100ng/ml。

在第四方面，本发明提供了卵母细胞体外成熟的方法，所述方法包括在本发明第一至第三方面中任一方面的培养基中培养卵母细胞。

在第五方面，本发明提供了通过本发明第四方面的方法成熟的卵母细胞。

在第六方面，本发明提供了从本发明第五方面的卵母细胞产生的胚胎或非人动物。

在第七方面，本发明提供了一种提高卵母细胞体外成熟的方法，所述方法包括在包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的培养基中培养所述卵母细胞。

在第八方面，本发明提供了一种提高卵母细胞体外发育能力的方法，所述方法包括在包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的培养基中培养所述卵母细胞。

在本发明第七和第八方面的一些实施方式中，源自卵母细胞的胚胎具有提高的胚泡内细胞团数、提高的胚泡率、提高的滋养外胚层细胞数、提高的胚泡总细胞数和提高的生存力中的一个或多个。

在本发明第七和第八方面的一些实施方式中，源自培养基中培养的卵母细胞的胚泡具有减少的DNA损伤。

在本发明第七和第八方面的一些实施方式中，在将源自培养基中培养的卵母细胞的胚胎移植至代孕者后，提高了在所述代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

在一些实施方式中，所述方法用作辅助生殖技术的一部分。

在本发明第七和第八方面的一些实施方式中，卵母细胞选自人卵母细胞、牛卵母细胞、猪卵母细胞、马卵母细胞、犬卵母细胞、猫卵母细胞、鼠卵母细胞、羊卵母细胞和非人灵长类动物卵母细胞。

在本发明第七和第八方面的一些实施方式中，所述卵母细胞来自老年和/或肥胖受试者。

在本发明的第七和第八方面的一些实施方式中，所述GM-CSF是物种特异性的。在一些实施方式中，培养基中存在的GM-CSF的量为约0.1ng/ml至约100ng/ml。

在第九方面，本发明提供了一种通过辅助生殖技术从卵母细胞产生胚胎的方法，所述方法包括：

(a)从受试者的卵巢收集卵母细胞；

(b)在包含GM-CSF的培养基中体外培养所述卵母细胞；和

(c)通过使所述卵母细胞体外受精从所述卵母细胞产生胚胎。

在一些实施方式中，在所述胚胎移植至代孕者后，提高了在所述代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

在本发明第九方面的一些实施方式中，所述卵母细胞从老年和/或肥胖受试者中收集。

在一些实施方式中，在使所述卵母细胞受精之前，在包含GM-CSF的培养基中培养用于辅助生殖技术的精子。

在一些实施方式中，卵母细胞的受精在包含GM-CSF的培养基中进行。

在本发明第九方面的一些实施方式中，所述方法还包括一旦在包含GM-CSF的培养基中产生所述胚胎就培养的步骤。

在第十方面，本发明提供了涉及卵母细胞的辅助生殖方法，所述方法包括在包含GM-CSF的培养基中体外培养卵母细胞的步骤。

在第十一方面，本发明提供了涉及卵母细胞的辅助生殖方法，所述方法包括通过在包含GM-CSF的培养基中体外培养卵母细胞使所述卵母细胞体外成熟的步骤。

在本发明第十和第十一方面的一些实施方式中，所述方法包括用已经在包含GM-CSF的培养基中培养的精子使所述卵母细胞体外受精的步骤。

在本发明第十和第十一方面的一些实施方式中，该方法还包括在包含GM-CSF的培养基中体外培养源自卵母细胞的胚胎的步骤。在一些实施方式中，在所述胚胎移植至代孕者后，提高了所述在代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

在本发明第十和第十一方面的一些实施方式中，所述卵母细胞从老年和/或肥胖受试者中收集。

在第十二方面，本发明提供一种粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，用于在培养基中使用或在培养基中使用时，用于提高卵母细胞的体外成熟或用于提高卵母细胞的体外发育能力。

在本发明第十二方面的一些实施方式中，源自培养基中培养的卵母细胞的胚胎具有提高的胚泡内细胞团数、提高的胚泡率、提高的滋养外胚层细胞数、提高的胚泡总细胞数和提高的生存力中的一个或多个。

在本发明第十二方面的一些实施方式中，源自培养基中培养的卵母细胞的胚泡具有减少的DNA损伤。

在一些实施方式中，GM-CSF在培养基中用作辅助生殖技术的一部分。在一个实施方式中，辅助生殖技术是体外受精。

在本发明第十二方面的一些实施方式中，在将源自培养基中培养的卵母细胞的胚胎移植至代孕者后，提高了在所述代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

在本发明第十二和第十三方面的一些实施方式中，卵母细胞选自人卵母细胞、牛卵母细胞、猪卵母细胞、马卵母细胞、犬卵母细胞、猫卵母细胞、鼠卵母细胞、羊卵母细胞和非人灵长类动物卵母细胞。

在本发明第十二方面的一些实施方式中，卵母细胞来自老年和/或肥胖受试者。

在本发明的第十二和第十三方面的一些实施方式中，GM-CSF是物种特异性的。在一些实施方式中，培养基中存在的GM-CSF的量为约0.1ng/ml至约100ng/ml。

在第十三方面，本发明提供一种粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在制备培养基中的用途，所述培养基用于提高卵母细胞的体外成熟或用于提高卵母细胞的体外发育能力。

在一些实施方式中，源自培养基中培养的卵母细胞的胚胎具有提高的胚泡内细胞团数、提高的胚泡率、提高的滋养外胚层细胞数、提高的胚泡总细胞数和提高的生存力中的一个或多个。

在本发明第十三方面的一些实施方式中，源自培养基中培养的卵母细胞的胚泡具有减少的DNA损伤。

在一些实施方式中，培养基用作辅助生殖技术的一部分。在一个实施方式中，辅助生殖技术是体外受精。

在本发明第十三方面的一些实施方式中，在将源自培养基中培养的卵母细胞的胚胎移植至代孕者后，提高了在所述代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

在本发明第十三方面的一些实施方式中，卵母细胞选自人卵母细胞、牛卵母细胞、猪卵母细胞、马卵母细胞、犬卵母细胞、猫卵母细胞、鼠卵母细胞、羊卵母细胞和非人灵长类动物卵母细胞。

在本发明第十三方面的一些实施方式中，卵母细胞来自老年和/或肥胖受试者。

在本发明第十三方面的一些实施方式中，GM-CSF是物种特异性的。在一些实施方式中，培养基中存在的GM-CSF的量为约0.1ng/ml至约100ng/ml。

在第十四方面，本发明提供了一种组合产品，用于或当使用时用于提高卵母细胞的体外成熟或提高卵母细胞的体外发育能力，所述组合产品包含：

(i)培养基；

(ii)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；并且可选地

(iii)用于在包含所述GM-CSF的所述培养基中培养卵母细胞的说明书。

在第十五方面，本发明提供了一种组合产品，用于或当使用时用于提高卵母细胞的体外成熟或提高卵母细胞的体外发育能力，所述组合产品包含：

(i)包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的培养基；和

(ii)用于在所述培养基中培养卵母细胞的说明书。

在本发明第十四和第十五方面的一些实施方式中，源自包含GM-CSF的培养基中培养的卵母细胞的胚胎具有提高的胚泡内细胞团数、提高的胚泡率、提高的滋养外胚层细胞数、提高的胚泡总细胞数和提高的生存力中的一个或多个。

在本发明第十四和第十五方面的一些实施方式中，源自培养基中培养的卵母细胞的胚泡具有减少的DNA损伤。

在一些实施方式中，组合产品用作辅助生殖技术的一部分。在一个实施方式中，辅助生殖技术是体外受精。

在本发明的第十四和第十五方面的一些实施方式中，在将源自培养基中培养的卵母细胞的胚胎移植至代孕者后，提高了在所述代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

在本发明的第十四和第十五方面的一些实施方式中，卵母细胞选自人卵母细胞、牛卵母细胞、猪卵母细胞、马卵母细胞、犬卵母细胞、猫卵母细胞、鼠卵母细胞、羊卵母细胞和非人灵长类动物卵母细胞。

在本发明第十四和第十五方面的一些实施方式中，卵母细胞来自老年和/或肥胖受试者。

在本发明的第十四和第十五方面的一些实施方式中，GM-CSF是物种特异性的。

附图说明

为了进一步理解本发明的方面和优点，应结合附图参考以下详细描述。

图1-示出了向卵母细胞成熟培养基中添加GM-CSF对培养第8天孵出的胚泡比例的影响的图表。与对照相比，向卵母细胞成熟培养基中添加2ng/ml和10ng/ml牛GM-CSF使胚胎培养第8天孵出的牛胚泡的比例分别提高了45.4％和149.0％。0ng(对照；黑色)，2ng/mlGM-CSF(白色)和10ng/ml GM-CSF(灰色)。数值是重复五次的平均值+SEM。

图2-示出了向卵母细胞成熟培养基中添加GM-CSF对胚泡内细胞团、滋养外胚层和总细胞数的影响的图表。向卵母细胞成熟培养基中添加GM-CSF使鼠胚泡ICM和总细胞数分别提高了20.5％和52.1％，滋养外胚层细胞数分别提高了18.2％和25.0％，总细胞数分别提高了18.8％和32.9％。0ng(对照；白色)，2ng/ml GM-CSF(灰色)和10ng/ml GM-CSF(黑色)。数值是重复六次的平均值+SEM。

图3-示出了向卵母细胞成熟培养基中添加GM-CSF对鼠DNA胚泡损伤的影响的图表。与对照相比，向成熟培养基中添加GM-CSF使2ng/ml GM-CSF和10ng/ml GM-CSF组中DNA双链断裂的发生率分别降低了8.4％和29.1％。数值以百分比表示，并且是重复五次的平均值+SEM。

图4-示出了用GM-CSF使鼠卵母细胞成熟对着床率的影响的图表。数值以着床点/移植的胚胎的数量的百分比表示，并且是移植11次的平均值±SEM。

图5-示出了用GM-CSF使鼠卵母细胞成熟对于在性交后第17.5天存在的胎儿数量的影响的图表。数值以胎儿存在/移植的胚胎的百分比表示，并且是移植11次的平均值±SEM。

具体实施方式

核苷酸和多肽序列在本文中由序列标识符号(SEQ ID NO:)表示。表1中提供了序列标识符的摘要。在提交本申请时还提供了序列表。

表1

序列标识符摘要

在整个说明书中使用的以下缩写在本文中定义如下：

IVF(In vitro Fertilization)体外受精

OHSS(Ovarian Hyperstimulation Syndrome)卵巢过度刺激综合征

IVM(In vitro Maturation)体外成熟

IVP(In vitro Production)体外生产

MOET(Multiple Ovulation and Embryo Transfer)多排卵和胚胎移植

GM-CSF(Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子

HSA(Human Serum Albumin)人血清白蛋白

ITS(Insulin-Transferrin-Selenium)胰岛素-转铁蛋白-硒

IGF-1(Insulin-Like Growth Factor-1)胰岛素样生长因子-1

EGF(Epidermal Growth Factor)表皮生长因子

FSH(Follicle Stimulating Hormone)卵泡刺激素

HCG(Human Chorionic Gonadotropin)人绒毛膜促性腺激素

LH(Luteinizing Hormone)促黄体激素

PMSG(Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin)孕妇的血清促性腺激素

ART(Assisted Reproductive Technology)辅助生殖技术

ICSI(Intracytoplasmic Sperm Injection)卵胞浆内单精子注射

PVA(Polyvinyl Alcohol)聚乙烯醇

如本文所示，在培养基中包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(本文称为“GM-CSF”)提高了体外培养基中培养的卵母细胞的成熟和发育能力。关于辅助生殖技术，这允许在所述卵母细胞体外受精之前，从卵巢收获的卵母细胞成熟到接近于生殖周期期间体内自然产生的卵母细胞(与在当前已知的培养基中收集和培养的卵母细胞的成熟相比)。

某些公开的实施方式具有一个或多个优点的组合。例如，本文公开的实施方式的一些优点包括以下的一个或多个：用于提高卵母细胞成熟的培养基和方法；用于提高卵母细胞发育能力的培养基和方法；用于源自培养基中培养的卵母细胞的胚胎提高胚泡内细胞团数、提高胚泡率、提高胚泡滋养细胞数、提高胚泡总细胞数和/或提高生存力的培养基和方法；用于减少源自培养基中培养的卵母细胞的胚泡中DNA损伤的培养基和方法；用于将源自培养基中培养的卵母细胞的胚胎移植至代孕者后提高妊娠率的培养基和方法；用于提高源自培养基中培养的卵母细胞的胚泡着床的培养基和方法；用于提高源自培养基中培养的卵母细胞的胚胎发育至足月的培养基和方法；提供一个或多个优点，或提供商业替代方案。本文提供了本公开的一些实施方式的其他优点。

因此，在各个方面，本发明提供了卵母细胞体外成熟培养基，用于提高卵母细胞体外成熟的培养基，和/或当用于提高卵母细胞成熟的体外培养基，该培养基包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

术语“成熟培养基”、“用于提高成熟的培养基”和“体外培养基”不旨在限定不同的培养基。事实上，这些术语可以有效地互换使用，并且确实涉及相同的培养基，即包含GM-CSF的用于卵母细胞成熟的培养基。

添加GM-CSF的基础培养基可以是支持和维持体外培养基中培养的卵母细胞的生存力的任何培养基。合适的基础培养基例如可以包括但不限于组织培养基199(也称为培养基199，TCM199和M199)(ThermoFisher Scientific)，极限必需培养基Eagle(也称为Eagles’极限必需培养基，EMEM和MEM)(Sigma-Aldrich)，极限必需培养基Eagleα改良(也称为α-MEM)(Sigma-Aldrich)，Dulbecco's改良的Eagle培养基(也称为DMEM或D-MEM)(ThermoFisher Scientific)，Ham's F12(也称为F-12Ham，Ham's F12培养基，和F12营养混合物)(ThermoFisher Scientific)，RPMI培养基1640(ThermoFisher Scientific)，Isocove's改良的Dulbecco's培养基(也称为IMDM)(ThermoFisher Scientific)，Waymouth's MB 752/1培养基(也称为Waymouth或Waymouth培养基)(Sigma-Aldrich)，Chang's培养基(Irvine Scientific)，HTF培养基(Irvine Scientific)，Dulbecco's改良的Eagle's培养基/营养物F-12Ham(也称为DMEM/F-12和DME F12)(ThermoFisherScientific)，Vitromat(IVF Vet Solutions,Robinson Research Institute,Universityof Adelaide,SA,Australia)和ART-1600-B(Origio,Denmark)。

关于人卵母细胞的体外成熟，公司如Origio(Denmark)提供合适的基础培养基。例如，可以将GM-CSF添加到Origio提供的ART-1600-B培养基中。

尽管包括上述列表，但如本领域技术人员所理解的，还考虑其他基础培养基，条件是基础培养基支持并维持体外培养基中培养的卵母细胞的生存力。

添加GM-CSF的基础培养基还可以补充附加组分。例如，参见Culture Media,Solutions,and Systems in Human ART(2014),Editor Patrick Quinn,CambridgeUniversity Press,ISBN978-1-107-61953-1。附加组分的例子包括但不限于无机离子(如阳离子和阴离子-Na⁺,K⁺,Mg²⁺,Ca²⁺,Cl^-,SO₄ ^2-,PO₄ ^2-,HCO₃ ^-)、能量底物(如葡萄糖、乳酸盐、丙酮酸、氨基酸)、氮源(如必需和非必需氨基酸)、维生素、脂肪酸或前体、核酸前体、螯合剂(如EDTA)、抗氧化剂、蛋白质或大分子(如HSA和透明质酸盐)、其他生长因子或激素(如胰岛素-转铁蛋白-硒、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、卵泡刺激素和人绒毛膜促性腺激素)、缓冲液以维持生理pH、抗生素、pH指示剂，和以上任何一个或多个的组合。应该清楚的是，某些基础培养基可能已经包含以上列出的附加组分中的一种或多种。

这些附加组分的优选量和范围可以在本领域已知的标准教科书中找到。例如，参见Culture Media,Solutions,and Systems in Human ART(2014,同上),和Textbook ofAssisted Reproduction:Laboratory and Clinical Perspectives(2003)EditorsGardner,D.K.,Weissman,A.,Howles,C.M.,Shoham,Z.Martin Dunits Ltd,London,UK；andGordon,I.(2003)Laboratory Production of Cattle Embryos 2nd Edition CABIPublishing,Oxon,UK。

例如，本发明的成熟培养基可包含一种或多种以下所示浓度范围的组分：

关于人卵母细胞的成熟，根据本发明的一个实施方式的合适的成熟培养基可以包括指定量的下列组分：

在一些实施方式中，前述关于人卵母细胞的成熟培养基还可包括一种或多种抗生素，例如庆大霉素、青霉素和链霉素。

在一些实施方式中，基础培养基是M199。在一些实施方式中，基础培养基补充有丙酮酸盐，青霉素，硫酸链霉素，L-谷氨酰胺，半胱胺，胰岛素，妊娠母马血清促性腺激素(pregnant mare’s serum gonadotropin,PMSG)，人绒毛膜促性腺激素(human chorionicgonadotropin,HCG)，表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和卵泡液。例如，鉴于大多数猪IVM培养基包含10至20％的卵泡液，这种培养基可用于猪卵母细胞的体外成熟。因此，当从除猪以外的物种培养卵母细胞时，卵泡液可以是成熟培养基的可选成分。

GM-CSF是小分泌糖蛋白，其折叠成四个反平行α-螺旋的束状结构。GM-CSF由许多细胞类型产生，包括骨髓细胞，树突细胞(DC)，T细胞，B细胞和非造血细胞(例如内皮细胞，成纤维细胞样滑膜细胞，软骨细胞，肺上皮细胞)。GM-CSF也由生殖道的细胞(即输卵管和子宫内膜的细胞)产生。

GM-CSF蛋白具有许多功能，主要作为刺激干细胞的细胞因子起作用以产生粒细胞和单核细胞。GM-CSF在胚胎发育过程中发挥作用，它已在蛋白质和mRNA水平处的粒层细胞中发现，其浓度在卵泡液中比在血清中高。GM-CSF似乎是与胚胎着床过程有关的重要局部调节剂，考虑到中和GM-CSF会增加自然流产。

首先在小鼠中描述了GM-CSF在胚胎发育和胎儿存活中的意义。在胚胎水平，通过GM-CSF增强了鼠卵裂球生存力。它还促进猪、绵羊和牛的胚胎发育，特别是通过增加后两者的IFNτ分泌。GM-CSF也被证明对人类胚胎具有积极的营养作用。在这方面，通过用人重组GM-CSF补充胚胎培养基的与这种胚胎效应有关的细胞机制是抗细胞凋亡的卵裂球保护，对胚胎染色体构成没有明显影响。然而，以前没有报道过GM-CSF对卵母细胞生存力，成熟和发育能力的积极影响。

迄今为止，在93种不同的哺乳动物中发现了GM-CSF，包括人，小鼠，大鼠，牛，狗，猪，恒河猴，绵羊，黑猩猩，马，猫，山羊，狐狸，雪貂，牦牛，猕猴，猎豹，狐猴，骆驼，野牛，熊，负鼠，海豚，鲸鱼，虎，海豹，大猩猩，大象，熊猫，猩猩，兔子，狒狒和犀牛等等。GM-CSF在本领域中也称为集落刺激因子2，CSF2，molgramostin和沙格司亭(sargramostim)。

用于本发明的GM-CSF可以以多种方式获得。例如，GM-CSF可以从可用的供应商处购买，包括Sigma-Aldrich,ThermoFisher Scientific,Peprotech,Miltenyi Biotech,Kingfisher,Biotech,Inc.,Bio-Rad等。在这方面，这些供应商提供纯化形式的GM-CSF。

通常，GM-CSF在非人或非动物宿主(例如大肠杆菌)中重组产生。用于蛋白质(包括GM-CSF)的重组生产及其纯化的技术是本领域标准的。参见，例如，Green MR and SambrookJ,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(4th edition),Cold Spring HarborLaboratory Press,2012。

为了GM-CSF的重组生产，需要了解所需物种和编码的蛋白质中GM-CSF基因的序列。在这方面，可以从国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)(www.ncbi.nlm.nih.gov)的GenBank数据库访问基因信息。例如，人GM-CSF的基因ID编号是1437。人GM-CSF基因由GenBank登记号NM_000758.3(由SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列)和NP_000749.2(由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列)表示。其他物种中的GM-CSF基因的更多细节可以从NCBI获得。例如，牛GM-CSF的基因ID编号为281095，对于猪为397208，对于马为100033981，对于狗为403923，对于猫为101094153，对于小鼠为12981，对于绵羊为443400。这些物种的核苷酸和氨基酸序列分别由SEQ ID NO：3至16表示。

关于人和其他物种中的GM-CSF基因的细节也可以在NCBI的UniGene门户中找到(UniGene Hs.1349-https://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/clust.cgi？UGID＝130983&TAXID＝9606&SEARCH＝)。或者，对于GM-CSF的核苷酸和氨基酸序列的细节可以从UniProt数据库(www.uniprot.org)获得，其中人GM-CSF的UniProt ID是P04141。

应该清楚，本文对GM-CSF的引用包括对其变体的引用。在这方面，GM-CSF的“变体”可以表现出与天然GM-CSF至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.9％相同的核酸或氨基酸序列，条件是所述变体保留天然GM-CSF的生物活性或其实质等同物。GM-CSF的这种变体可以称为“功能活性变体”。还考虑了其他水平的同一性，包括具有小于80％同一性的变体。

GM-CSF的功能活性变体可包含相对于天然GM-CSF序列(例如关于人GM-CSF的SEQID NO：2)的单个氨基酸取代、缺失或插入。例如，本领域技术人员将认识到任何氨基酸可以被化学(功能上)相似的氨基酸取代并保留多肽的功能。这种保守氨基酸取代是本领域熟知的。表2中的下列各组含有彼此保守取代的氨基酸。

表2

示例性的氨基酸保守取代

此外，如果需要，可以引入非天然氨基酸或化学氨基酸类似物作为到本文所包括的多肽中的取代或添加。这些氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体，2,4-二氨基丁酸，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，2-氨基丁酸，6-氨基己酸，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，半胱氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，氟氨基酸，设计者氨基酸如β-甲基氨基酸，Cα-甲基氨基酸，Nα-甲基氨基酸和一般的氨基酸类似物。

当比较氨基酸序列以定义GM-CSF的变体时，应在比较窗口上比较天然和变体序列，所述比较窗口由多肽的长度确定。例如，设计了天然GM-CSF的至少20个氨基酸残基，至少50个氨基酸残基，至少75个氨基酸残基，至少100个氨基酸残基或整个全长的比较窗口。对于两个序列的最佳比对，比较窗口可以包括与参考序列(其不包括添加或缺失)相比约20％或更少的添加或缺失(即缺口)。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法的计算机化实现(诸如由例如Altschul等,1997,Nucl.Acids Res.25:3389-3402公开的BLAST系列程序)来进行。全局比对程序也可用于比对大致相等大小的相似序列。全局比对程序的例子包括NEEDLE(可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/获得)，其是EMBOSS包的一部分(Rice P等,2000,Trends Genet.,16:276-277)，和GGSEARCH程序(可在fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi？rm＝compare&pgm＝gnw获得)，其是FASTA包的一部分(Pearson W和Lipman D,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444-2448)。这两个程序都基于Needleman-Wunsch算法，该算法用于寻找两个序列沿其整个长度的最佳比对(包括间隙)。序列分析的详细讨论也可以在Ausubel等人的单元19.3("CurrentProtocols in Molecular Biology"John Wiley&Sons Inc,1994-1998,Chapter 15,1998)中找到。

存在于培养基中的GM-CSF的量的范围通常为约0.1ng/ml至约100ng/ml。例如，GM-CSF可以以下量存在：约0.1至约90ng/ml、约0.1至约80ng/ml、约0.1至约70ng/ml、约0.1至约60ng/ml、约0.1至约50ng/ml、约0.1至约40ng/ml、约0.1至约30ng/ml、约0.1至约20ng/ml、约0.1至约10ng/ml、约0.1至约5.0ng/ml、约0.1至约4.0ng/ml、约0.1至约3.0ng/ml、约0.1至约2.0ng/ml、约0.1至约1.0ng/ml、约0.1至约0.5ng/ml、约0.5至约100ng/ml、约0.5至约90ng/ml、约0.5至约80ng/ml、约0.5至约70ng/ml、约0.5至约60ng/ml、约0.5至约50ng/ml、约0.5至约40ng/ml、约0.5至约30ng/ml、约0.5至约20ng/ml、约0.5至约10ng/ml、约0.5至约5.0ng/ml、约0.5至约4.0ng/ml、约0.5至约3.0ng/ml、约0.5至约2.0ng/ml、约0.5至约1.0ng/ml、约1.0至约100ng/ml、约1.0至约90ng/ml、约1.0至约80ng/ml、约1.0至约70ng/ml、约1.0至约60ng/ml、约1.0至约50ng/ml、约1.0至约40ng/ml、约1.0至约30ng/ml、约1.0至约20ng/ml、约1.0至约10ng/ml、约1.0至约9.0ng/ml、约1.0至约8.0ng/ml、约1.0至约7.0ng/ml、约1.0至约6.0ng/ml、约1.0至约5.0ng/ml、约1.0至约4.0ng/ml、约1.0至约3.0ng/ml和约1.0至约2.0ng/ml。

在一些实施方式中，GM-CSF可以以约2.0ng/ml至约10ng/ml的范围存在于培养基中。例如，GM-CSF可以以下量存在：约2.0ng/ml至约9.0ng/ml、约2.0ng/ml至约8.0ng/ml、约2.0ng/ml至约7.0ng/ml、约2.0ng/ml至约6.0ng/ml、约2.0ng/ml至约5.0ng/ml、约2.0ng/ml至约4.0ng/ml、约2.0ng/ml至约3.0ng/ml、约3.0ng/ml至约10ng/ml、约3.0ng/ml至约9.0ng/ml、约3.0ng/ml至约8.0ng/ml、约3.0ng/ml至约7.0ng/ml、约3.0ng/ml至约6.0ng/ml、约3.0ng/ml至约5.0ng/ml、约3.0ng/ml至约4.0ng/ml、约4.0ng/ml至约10ng/ml、约4.0ng/ml至约9.0ng/ml、约4.0ng/ml至约8.0ng/ml、约4.0ng/ml至约7.0ng/ml、约4.0ng/ml至约6.0ng/ml、约4.0ng/ml至约5.0ng/ml、约5.0ng/ml至约10ng/ml、约5.0ng/ml至约9.0ng/ml、约5.0ng/ml至约8.0ng/ml、约5.0ng/ml至约7.0ng/ml、约5.0ng/ml至约6.0ng/ml、约6.0ng/ml至约10ng/ml、约6.0ng/ml至约9.0ng/ml、约6.0ng/ml至约8.0ng/ml、约6.0ng/ml至约7.0ng/ml、约7.0ng/ml至约10ng/ml、约7.0ng/ml至约9.0ng/ml、约7.0ng/ml至约8.0ng/ml、约8.0ng/ml至约10ng/ml、约8.0ng/ml至约9.0ng/ml和约9.0ng/ml至约10ng/ml。

在一些实施方式中，培养基中存在的GM-CSF的量可以是约2ng/ml。

在一些实施方式中，培养基中存在的GM-CSF的量可以是约10ng/ml。

本发明的培养基可用于使从任何哺乳动物来源获得的卵母细胞成熟。在一些实施方式中，卵母细胞选自人卵母细胞、牛卵母细胞、猪卵母细胞、马卵母细胞、犬卵母细胞、猫卵母细胞、鼠卵母细胞(例如小鼠和大鼠)、羊卵母细胞和非人灵长类动物卵母细胞。

获得卵母细胞的受试者可以是另外健康的受试者，但受试者生育能力低或不能怀孕和/或不能怀孕到足月。或者，受试者可以是老年的和/或肥胖的，由于年龄和/或肥胖对卵母细胞发育能力的影响，从而也具有低生育能力或不能怀孕和/或不能怀孕到足月。老年受试者将被视为比特定物种的生育高峰年龄范围更老的受试者。对于年龄在23岁至35岁之间的其他健康人类受试者。因此，老年人类受试者可被视为年龄超过35岁的受试者。当然，人类的生育高峰年龄范围可能因许多因素(包括种族，民族和遗传背景)而异。

在一些实施方式中，包含在培养基中的GM-CSF是物种特异性的。也就是说，GM-CSF的来源与卵母细胞的来源相同。例如，GM-CSF可以是重组或天然人GM-CSF，卵母细胞是人卵母细胞。或者，GM-CSF可以是重组或天然猪GM-CSF，卵母细胞是猪卵母细胞。

因此，在一些实施方式中，卵母细胞是猪卵母细胞，GM-CSF是猪GM-CSF，并且培养基中存在的猪GM-CSF的量可以是约2ng/ml。

在一些实施方式中，卵母细胞是猪卵母细胞，GM-CSF是猪GM-CSF，培养基中存在的猪GM-CSF的量可以是约10ng/ml。

在一些实施方式中，卵母细胞是牛卵母细胞，GM-CSF是牛GM-CSF，培养基中存在的牛GM-CSF的量可以是约2ng/ml。

在一些实施方式中，卵母细胞是牛卵母细胞，GM-CSF是牛GM-CSF，培养基中存在的牛GM-CSF的量可以是约10ng/ml。

在一些实施方式中，卵母细胞是鼠卵母细胞，GM-CSF是鼠GM-CSF，培养基中存在的鼠GM-CSF的量可以是约2ng/ml。

在一些实施方式中，卵母细胞是鼠卵母细胞，GM-CSF是鼠GM-CSF，培养基中存在的鼠GM-CSF的量可以是约10ng/ml。

在一些实施方式中，卵母细胞是人卵母细胞，GM-CSF是人GM-CSF，并且培养基中存在的人GM-CSF的量可以是约2ng/ml。

在一些实施方式中，卵母细胞是人卵母细胞，GM-CSF是人GM-CSF，并且培养基中存在的人GM-CSF的量可以是约10ng/ml。

在整个说明书中，对卵母细胞的引用包括缺乏伴随细胞的卵母细胞，或包括伴随细胞的卵母细胞。例如，卵母细胞可以是裸露的卵母细胞，其中围绕卵母细胞的体细胞层(例如卵丘细胞)已被除去。卵母细胞也可以是卵泡的一部分，或者可以是卵丘卵母细胞复合体(cumulus oocyte complex,COC)的一部分，其中卵丘外衣保持完整。

如上所述，已经确定当收获的卵母细胞在包含GM-CSF的培养基中培养时，从卵巢收获的卵母细胞的成熟提高。在这方面，辅助生殖技术的成功在很大程度上取决于受精前卵母细胞的成熟度。从卵巢收获的卵母细胞通常经历减数分裂的自发恢复，即当置于培养物中时进行它们的核成熟。这种核成熟可能经常发生在卵母细胞经历其他方面成熟(例如细胞质成熟)之前。未成熟的卵母细胞可能最终影响受精的成功以及可能的后续胚胎着床和发育。

实际上，发明人已经发现，在培养基中包含GM-CSF用于卵母细胞，同时提高卵母细胞的成熟度，也提高了卵母细胞的发育能力。在这方面，术语“发育能力”应理解为意指卵母细胞发育成能够着床、发育至足月和生产健康后代的胚胎的能力。

成熟的“提高”和发育能力的“提高”意指卵母细胞的成熟度和发育能力水平大于在不含GM-CSF的基础培养基中培养时的相同物种的卵母细胞或来自相同动物的卵母细胞的成熟度和发育能力水平。例如，相对于对照“未处理的”的卵母细胞，在包含GM-CSF的培养基中培养的卵母细胞的成熟和发育能力可以提高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高，2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更高。

可以通过多种方式测定成熟和发育能力的提高。最终，最合适的分析将评估“成熟”卵母细胞受精后对胚胎生存力和质量指标的积极影响。例如，合适的分析可以检查提高的胚泡内细胞团数，提高的胚泡率/胚泡数(例如通过受精后发育至胚泡期的卵母细胞数，和/或达到胚泡阶段的时间/速率与正常/自然受精后体内发生的时间/速率相同的卵母细胞数测量)，提高的滋养外胚层细胞数，提高的胚泡总细胞数(内细胞团细胞数加上滋养外胚层细胞数)，提高的分裂(例如通过卵母细胞受精和分裂成双细胞阶段的能力来测量)，胚胎形态，孵化的胚泡数量，妊娠率(例如通过将源自包含GM-CSF的培养基中培养的卵母细胞的胚胎移植后的代孕者的妊娠成功进行测量，和/或通过已着床/胎儿存在的角的数量进行测量)，和在胚泡或基因表达模式中检测DNA损伤。或者，与已知的工业标准相比，适当的分析将简单地评估“成熟的”卵母细胞受精后胚胎生存力的改善，或者测试经处理的卵母细胞发育成能够着床或发育至足月(即出生)的胚胎的能力，如上所述。其他分析对于本领域技术人员来说是已知的。

关于“提高的胚泡内细胞团数”，“提高的胚泡率”，“提高的胚泡滋养细胞数量”，“提高的胚泡总细胞数”，“提高的卵裂”和“提高的生存力”，与相关对照(例如，源自未暴露于GM-CSF的相同物种的卵母细胞或来自相同动物的卵母细胞的胚胎/胚泡，例如在不含GM-CSF的基础培养基中培养的卵母细胞)相比的每个参数的提高水平包括提高至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％，50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、70％、80％、90％、100％、105％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％或更高，2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更高。

同样，与相关对照(例如，源自未暴露于GM-CSF的相同物种的卵母细胞或来自相同动物的卵母细胞的胚胎/胚泡，例如在不含GM-CSF的基础培养基中培养的卵母细胞)相比，“提高的妊娠率”，“提高的着床”和“提高的发育至足月”意味着相关参数的提高。这种提高与对照相比可能至少为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或更高，2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更高。

最后，胚泡中的DNA损伤的“减少”意味着损伤水平小于源自在不包含GM-CSF的基础培养基中培养时的相同物种的卵母细胞或来自相同动物的卵母细胞的胚泡的损伤水平。DNA损伤的减少反映了卵母细胞成熟培养基具有减少与卵母细胞体外培养相关的环境胁迫的能力。与对照相比，减少量可以至少为5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、105％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或更低，2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更低。

如本文所用，术语“衍生自”包括已通过卵母细胞的体外受精产生的胚胎。

可以根据本领域长期已知的标准技术从卵巢收获或收集卵母细胞。例如，参见Textbook of Assisted Reproduction:Laboratory and Clinical Perspectives(2003,同上)。大多数卵母细胞收集技术涉及使用经阴道的超声将吸液针插入卵巢滤泡中。吸液针通过装管到材料收集阱连接，收集阱又连接到抽吸源(例如手动操作的注射器或机电真空源)。通常从多个卵泡中分离卵母细胞。因此，收获的卵母细胞在其成熟度和因此的发育潜力方面代表异源群体。

应当理解，本发明的培养基中卵母细胞成熟的时间可以在物种之间不同。通常，成熟的时间将是在这些系统中达到中期II的减数分裂阶段的时间，并且因此卵母细胞到达减数分裂的中期II阶段的成熟时间通常为6小时至44小时。例如，在牛背景下，在培养基中不存在GM-CSF时，IVM时间通常在18-24小时的范围内。在人背景下，在培养基中不存在GM-CSF时，IVM时间通常为约28至约52小时，并且最通常为约30至约36小时。

在一个实施方式中，卵母细胞是猪卵母细胞，并且猪卵母细胞在受精前用合适的气体混合物在35-39℃下的本发明的培养基中培养约40至42小时。合适的气体混合物的实例包括但不限于包含CO₂(按体积计1-10％)，剩余为空气或维持生物活性成比例的O₂和N₂的混合物的气体混合物。例如，对于人类卵母细胞，培养通常在37℃的培养箱中进行，气氛为5％CO₂和95％空气，高湿度(或三重气体混合物(90％N₂,5％CO₂和5％O₂)和100％湿度)。

另一方面，通过建立在培养基中包含GM-CSF提高了培养基中体外培养的卵母细胞的成熟，本发明提供了卵母细胞体外成熟的方法，该方法包括在如上所述的成熟培养基中培养卵母细胞。

在另一方面，本发明还提供了一种提高卵母细胞体外成熟的方法，该方法包括在含有GM-CSF的培养基中培养卵母细胞。

鉴于培养基中GM-CSF的存在也提高了卵母细胞的发育能力，在另一方面，本发明提供了一种提高卵母细胞体外发育能力的方法，该方法包括在包含GM-CSF的培养基中培养卵母细胞。

在这方面，在另一方面，还提供了通过上述方法产生的具有成熟提高和发育能力提高的分离的卵母细胞，以及由所述卵母细胞产生的胚胎或非人动物。

通过上述体外方法产生的具有成熟提高和发育能力提高的卵母细胞可以形成辅助生殖技术的一部分。在整个说明书中使用的术语“辅助生殖技术”应理解为意指用于繁殖目的的分离的配子(卵母细胞或精子)和/或胚胎的任何实验室或临床技术。这些技术包括体外受精(in vitro fertilization,IVF；卵母细胞抽吸，实验室受精和胚胎移植到受体)，配子输卵管内移植(gamete intrafallopian transfer,GIFT；将卵母细胞和精子置于输卵管中)，受精卵输卵管移植(zygote intrafallopian transfer,ZIFT；将受精的卵母细胞置于输卵管中)，输卵管胚胎移植(tubal embryo transfer,TET；将分裂的胚胎置于输卵管中)，腹膜卵母细胞和精子转移(peritoneal oocyte and sperm transfer,POST；将卵母细胞和精子置于盆腔中)，卵胞浆内精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)，睾丸精子提取(testicular sperm extraction,TESE)和显微外科附睾精子抽吸术(microsurgical epididymal sperm aspiration,MESA)；或用于在人和/或动物中产生胚胎的任何其他体外技术，例如核移植，孤雌激活，胚胎干细胞产生和全能细胞的使用。

在一个实施方式中，辅助生殖技术包括体外受精(in vitro fertilization,IVF)。IVF涉及卵母细胞体外的受精，其中从受试者中分离卵母细胞并在培养基中培养以允许卵母细胞受精。如上所述，本领域熟知用于从合适的雌性收集卵母细胞并在体外使卵母细胞受精的方法。预期卵母细胞的受精理想地发生在收集卵母细胞和在本发明的培养基中培养后不少于24小时，但不迟于60小时，使得卵母细胞的成熟处于足够阶段以最大限度地提高IVF程序后续步骤的成功率。对于体外受精，可以将精子与成熟的卵母细胞一起培养1至60小时。

因此，在另一方面，本发明提供了一种通过辅助生殖技术从卵母细胞产生胚胎的方法，该方法包括：

(a)从受试者的卵巢收集卵母细胞；

(b)在含有GM-CSF的培养基中体外培养卵母细胞；和

(c)通过使所述卵母细胞体外受精从所述卵母细胞产生胚胎。

在另一方面，本发明提供了涉及卵母细胞的辅助生殖方法，该方法包括在体外将卵母细胞暴露于GM-CSF的步骤。在另一个方面，提供了一种涉及卵母细胞的辅助生殖方法，该方法包括通过在体外将卵母细胞暴露于GM-CSF使卵母细胞体外成熟的步骤。在一些实施方式中，所述方法包括在体外将源自卵母细胞的胚胎暴露于GM-CSF的后续步骤。

在一些实施方式中，辅助生殖技术或辅助生殖方法是体外受精。

在期望通过除了精子和卵母细胞的自然相互作用完成受精的情况下，例如由于卵母细胞周围增厚的透明带，精子不能使卵子受精，或者精子来自男性因素患者，精子可通过称为卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)的技术转运到卵母细胞中。因此，在一些实施方式中，辅助生殖技术或辅助生殖方法是ICSI。当使用ICSI技术时，从卵母细胞中除去卵丘细胞，并使用玻璃移液管将精子注射到卵母细胞的内部。

关于任何上述辅助生殖技术，收集的精子可以在受精前保持在培养基中。合适的培养基是本领域已知的，并且在标准教科书中列出，例如Textbook of AssistedReproduction:Laboratory and Clinical Perspectives(2003,同上)。含有精子的培养基可以具有这样的组成，以便当卵母细胞从本发明的成熟培养基转移到含有精子的培养基时，卵母细胞上的任何应力最小化。因此，在一些实施方式中，容纳精子的培养基可具有与成熟培养基相似或相同的离子和非必需氨基酸组成。

在一些实施方式中，含有精子的培养基可包含GM-CSF。

关于受精过程，进行该过程的合适培养基(即受精培养基)在本领域中是已知的，并且在标准教科书中列出，例如Textbook of Assisted Reproduction:Laboratory andClinical Perspectives(2003,同上)。受精培养基可以具有促进精子功能和受精的组成。例如，与本发明的成熟培养基相比，受精培养基可包含提高浓度的钠和/或磷酸盐。受精培养基还可以补充碳水化合物葡萄糖、乳酸盐和丙酮酸盐。具体制剂可包括用碳酸氢盐、促进精子头部解凝的谷胱甘肽，非必需氨基酸、HAS、透明质酸盐和抗生素(如青霉素和链霉素)中的一种或多种补充所述培养基。

在一些实施方式中，受精培养基可包含GM-CSF。

或者，收集的精子可以直接转移到含有成熟卵母细胞的本发明成熟培养基中(用于体外受精)或者可以直接注射到成熟培养基中存在的成熟卵母细胞中(用于ICSI)。

关于ICSI技术，另一种安排是使用单一培养基(ICSI培养基)，其可用于培养成熟卵母细胞，并且当精子通过注射进入卵母细胞来运输时，其也可用作精子的载体。ICSI培养基应优选与成熟卵母细胞的内部和外部高度相容。ICSI培养基可以是如上所述的基础培养基，并且可以包含与在本发明的卵母细胞成熟培养基中发现的那些类似的离子成分。在一个实施方式中，可以省略磷酸盐以避免成熟卵母细胞上的新陈代谢和稳态应激。因为ICSI是在培养箱外进行的临床程序，所以通常使用在正常气氛中有效的缓冲系统。因此MOPS和HEPES是ICSI培养基的优选缓冲液。因为卵丘细胞已经从卵母细胞中移除，并且精子处于其独立生命的结束，所以可以从ICSI培养基中省略葡萄糖(卵丘细胞和精子的主要能量来源，而不是卵母细胞)。为了滋养成熟的卵母细胞，可以在ICSI培养基中包括卵母细胞中最丰富的非必需氨基酸(例如甘氨酸，脯氨酸，丝氨酸和牛磺酸)和谷氨酰胺，以避免渗透和pH胁迫。ICSI培养基还可以包括透明质酸盐或聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrollidone,PVP)以使精子固定或迟钝，使得它们可以被捕获在ICSI移液管中。

在一些实施方式中，ICSI培养基可包含GM-CSF。

受精后，胚胎可以在支持胚胎发育的培养基(胚胎培养基)中培养。胚胎培养基可以是如上所述的基础培养基，并且可以包含与在本发明的卵母细胞成熟培养基中发现的那些类似的离子成分。在一个实施方式中，胚胎培养基可以包含EDTA，其被认为与可能对早期胚胎有害的毒素结合并使之丧失能力。胚胎培养基还可包含HSA和透明质酸盐。此外，丙氨酰-谷氨酰胺可以取代谷氨酰胺以减少培养基中的铵积累。

在一些实施方式中，胚胎培养基可包含GM-CSF。

在一些实施方式中，所有培养基(其中收获的卵母细胞开始接触，包括从卵母细胞的收集，到卵母细胞的受精，和到随后的胚胎培养和发育)可以包括GM-CSF。例如，预计卵母细胞成熟培养基中GM-CSF的存在，含有精子的培养基中GM-CSF的存在，受精培养基中GM-CSF的存在，以及受精后含有卵母细胞的培养基中GM-CSF的存在，对胚泡发育、妊娠率和最终发育至足月具有加成效应。

在前述方法的一些实施方式中，相应培养基中存在的GM-CSF的量可以是如上所述的量。在一些实施方式中，培养基中存在的GM-CSF的量通常为约0.1ng/ml至约100ng/ml。例如，GM-CSF可以以约2.0ng/ml至约10ng/ml的范围存在于培养基中。

在另外的方面，本发明提供粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage-colony stimulating factor GM-CSF)，在培养基中使用或当在培养基中使用时，用于提高卵母细胞的体外成熟或用于提高卵母细胞的体外发育能力。另一方面，本发明提供了粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在制备培养基中的用途，所述培养基用于提高卵母细胞的体外成熟或用于提高卵母细胞的体外发育能力。

在另一方面，本发明还允许制备组合产品，其用于或当使用时用于提高卵母细胞的体外成熟或提高卵母细胞的体外发育能力。在一个方面，组合产品可包含：

(i)培养基；

(ii)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；并且可选地

(iii)用于在包含所述GM-CSF的所述培养基中培养卵母细胞的说明书。

在另一方面，组合产品可包括：

(i)包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的培养基；和

(ii)用于在所述培养基中培养卵母细胞的说明书。

以上参考基础培养基描述了用于组合产品的合适培养基。上文也描述了GM-CSF的来源，并且在一些实施方式中GM-CSF的来源是物种特异性的。说明书可以指导使用者添加到培养基中的GM-CSF的量，并且可以提供可以用于在培养基中培养卵母细胞的条件。说明书可以是合适标签的形式，或者可以是单独的插入物。

在一些实施方式中，组合产品用作辅助生殖技术的一部分。辅助生殖技术的实例如上所述。

作为冷冻/解冻的结果，个体卵母细胞(包括卵丘卵母细胞复合物)，整个卵泡，卵巢组织或整个卵巢在冷冻时通常会死亡。设想本发明还适用于减少由于冻融引起的对这些细胞/组织的损害。

因此，在另一方面，本发明提供了一种减少由于冻融对卵母细胞、卵泡、卵巢组织或卵巢的损伤的方法，该方法包括将卵母细胞、卵泡、卵巢组织或卵巢暴露于包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor,GM-CSF)的培养基中。设想暴露于GM-CSF将导致卵母细胞成熟到能够最好地应对冻融循环的程度。

应注意，在表达一系列数值的情况下，将清楚地理解该范围包括该范围的上限和下限，以及这些限制之间的所有值。

本说明书中使用的术语“约”意指近似地或近似地并且在本文所述的数值或范围的上下文中意指包含所述的或要求保护的数值或范围的+/-10％或更少，+/-5％或更少，或+/-1％或更少，或+/-0.1％或更少的变化，和来自所述的或要求保护的数值或范围的+/-10％或更少，+/-5％或更少，或+/-1％或更少，或+/-0.1％或更少的变化。

贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包含”或诸如“包括”或“含有”的变体将被理解为暗示包含所述元素或整数或元素或整数的组，但不排除任何其他元素或整数或元素或整数的组。

如本文所用，除非另外特别说明，否则单数形式“一”，“一个”和“所述”可以指多个物品。

除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明示例实施方式，并且不对所要求保护的发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求保护的元素是必要的。

对于本领域技术人员显而易见的是，尽管出于清楚和理解的目的已经相当详细地描述了本发明，但是可以在不脱离本说明书中公开的发明构思的范围的情况下对本文描述的实施方式和方法进行各种修改和改变。

此外，本文提供的描述涉及可能分享共同特性和特征的若干实施方式。应理解，一个实施方式的一个或多个特征可与其他实施方式的一个或多个特征组合。另外，实施方式的单个特征或特征的组合可以构成另外的实施方式。

本文使用的主题标题被包括仅仅是为了便于读者参考，并且不应用于限制在整个本公开或权利要求中找到的主题。主题标题不应用于构造权利要求的范围或权利要求限制。

在以下实施例中进一步说明本发明。这些实施例仅用于描述特定实施方式的目的，并不意图限制于以上描述。本领域技术人员将理解，本公开可以以多种其他形式体现。

实施例1

GM-CSF对猪卵母细胞体外成熟的影响

在使用重组GM-CSF的剂量反应实验中，在猪中检查了将粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor,GM-CSF)添加到各种卵母细胞成熟培养基中的效果。使用体外胚胎生产系统生产胚胎。实验检查了分裂和发育至胚泡期的胚胎数，和胚泡内细胞团、滋养外胚层和总细胞数，作为卵母细胞发育能力的量度。除非另有说明，否则所有化学品均购自Sigma-Aldrich。

方法

1.卵母细胞成熟和体外胚胎生产-方法1

1.1卵母细胞收集和体外成熟

从当地屠宰场收集猪卵巢，并在33℃至37℃之间在0.9％氯化钠溶液中运输至实验室。使用连接到恒定真空源的21量孔的针吸出直径在3至6mm之间的小窦卵泡。将卵泡内容物合并在收集管中，以使用解剖显微镜进行搜索。

从收集的液体中回收具有至少三个紧密卵丘层和均匀颗粒状细胞质的卵丘-卵母细胞复合物(Cumulus-oocyte complexes,COC)，并合并在1ml培养基199Hepes(M199HEPES；Life Technologies,Vic,AUS–现在的ThermoFisher Scientific)液滴中，在油下有10％的母猪卵泡液。一旦处理了所有收集管，将合并的COC通过基础成熟培养基洗涤三次。在最后一次洗涤期间，COC经过最终的筛选过程，去除任何不合适的COC。将剩余的COC随机分配到50-60个COC的组中，然后在补充有0ng/ml，2ng/ml或10ng/ml猪GM-CSF的基础成熟培养基中培养。每个处理组在38.5℃，5％CO₂空气气氛下，在600μl的成熟培养基中培养40-42小时，所述成熟培养基在4孔培养皿IVF多盘的孔中覆盖矿物油。

基础成熟培养基由50ml培养基199(M199；Life Technologies,Vic,AUS-现在的ThermoFisher Scientific)和含有9ml基本培养基的成熟工作溶液组成，其中所述50ml培养基199补充有5.0mg丙酮酸钠，3.8mg青霉素-G，2.5mg硫酸链霉素，5mg L-谷氨酰胺，5μL半胱胺(5M原液)，并且所述9ml基本培养基补充有10μl胰岛素(5mg/ml原液)，100μlPMSG(1000iu/ml原液)，100μlHCG(1000uu/ml原液)，5μlEGF(10μg/ml原液)和1ml过滤的灭菌母猪卵泡液。将卵泡液解冻并在使用前立即过滤灭菌(Millipore,USA；滤器孔径0.22μm)。1.2体外受精(In vitro Fertilization,IVF)和体外培养(in vitro Culture,IVC)

成熟后，将COC与混合的公猪精液(长白猪/大白猪)在38.5℃5％CO₂空气气氛下于共培养6小时。在矿物油下的100μl TALP-PVA受精培养基液滴中进行受精(Bavister BD,1989,A consistently successful procedure for in vitro fertilization of goldenhamster eggs,Gamete Research,23(2):139-158)。TALP-PVA原液培养基含有114.0mMNaCl，3.16mM KCl，4.72mM CaCl₂·2H₂O，0.5mM MgCl₂·6H₂O，25mM NaHCO₃，5mM D-葡萄糖，0.075mg/ml青霉素-G，0.05mg/ml硫酸链霉素和1.0mg/ml PVA，并且工作溶液补充有10mM乳酸钠，0.1mM丙酮酸钠，2mM咖啡因-苯甲酸钠，3mM乳酸钙二水合物和3mg/ml BSA(级分V)。在用TALP-PVA培养基稀释使最终精子浓度为5x10⁶精子/ml之前，通过将精液以1300RPM离心5分钟两次并用精子预培养培养基洗涤来制备精子，所述精子预培养培养基由补充有5mg丙酮酸钠，0.9mg/ml乳酸钙，0.075mg/ml青霉素，0.05mg/ml的硫酸链霉素，6ml热灭活的FBS和0.1mg/ml的L-谷氨酰胺的M199组成。将10μl制备的精子加入到含有成熟COC的90μl TALP-PVA培养基的液滴中，以使最终精子浓度为5x10⁵sp/ml。

受精后，通过反复吹打去除卵丘细胞，并通过改良的NCSU-23(NCSU-PLG)洗涤受精卵两次，其中所述改良NCSU-23(NCSU-PLG)补充有0.2mM丙酮酸，5.7mM乳酸钠，0.6mM葡萄糖和MEM-非必需氨基酸(Invitrogen,USA)，然后在矿物油下的50μlNUSU-PLG液滴中培养第1至3天。在第3天检查胚胎的分裂并转移到改良NCSU-23(NCSU-G)的新液滴中培养第3至6天，所述改良NCSU-23(NCSU-G)补充有5.5mM葡萄糖和MEM非必需和必需氨基酸(Invitrogen,USA)。在受精后第5天，将10％胎牛血清加入到培养液滴中并评估形态。

将胚胎在38.5℃，5％CO₂、5％O₂，余量为氮气的湿润气氛中培养6天。在第5天和第6天测定胚泡发育。第6天胚泡差异染色以确定总细胞数，内细胞团数和滋养外胚层细胞数。

在胚胎发育的第6天，基于形态学外观对胚泡进行评分。基于胚泡直径和腔体大小将胚泡评分为：小型的、中型的、扩张的，或孵化的/孵化中。

2.卵母细胞成熟和体外胚胎生产-方法2

2.1卵母细胞收集和体外成熟

从当地屠宰场收集卵巢，并在37℃下在0.9％氯化钠盐水溶液中运输2小时至实验室。在实验室中，使用18-20量孔的注射器吸出小的窦卵泡(直径3-6mm)。

去除卵丘-卵母细胞复合物(Cumulus-oocyte complexes,COC)并基于形态学外观进行选择。排除了具有少于三层卵丘细胞，具有过度膨胀和不均匀或暗的卵丘层，或具有异常核的COC。COC通过培养基199HEPES(M199HEPES；Life Technologies,Vic,AUS–现在的ThermoFisher Scientific)洗涤一次，然后通过BOMED成熟培养基洗涤两次(Kühholzer Bet al.,2001,Clonal lines of transgenic fibroblast cells derived from the samefetus result in different development when used for nuclear transfer in pigs,Biology of Reproduction,64(6):1695–1698)，所述BOMED成熟培养基补充有3mg/ml聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)。基础成熟培养基由补充有5.0mg丙酮酸钠，3.8mg青霉素-G，2.5mg硫酸链霉素和5μl半胱胺(5M原液)的50ml培养基199(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)组成。最终或工作BOMED成熟培养基含有10ml基础成熟培养基，补充有10μl胰岛素(5mg/ml原液)，100μlPMSG(1000iu/ml原液，Folligon,Intervet,Castle Hill,Australia)，100μl HCG(1000uu/ml原液，Chorulon,Intervet,Castle Hill,Australia)，5μlEGF(10μg/ml原液)和3mg/ml PVA(Beebe LFS et al.,2007,The effect of energysubstrate concentration and amino acids on the in vitro development ofpreimplantation porcine embryos,Cloning and Stem Cells,9(2):206-215)。对于每个处理组(0ng/ml，2ng/ml或10ng/ml的猪GM-CSF)，在38.5℃，5％CO₂空气气氛下，在600μl的成熟培养基中培养40-42小时，所述成熟培养基在4孔培养皿IVF多盘的孔中覆盖矿物油。

2.2体外受精(In vitro Fertilization,IVF)和体外培养(in vitro Culture,IVC)

成熟后，将COC与混合的公猪精液(长白猪/大白猪；SABOR Pty Ltd Clare SA)在38.5℃，5％CO₂空气气氛下于共培养6小时。在矿物油下100μlTALP-受精培养基(BavisterBD,1989同上)液滴中进行受精。TALP-受精培养基含有25ml TALP-PVA原液(114.0mM NaCl，3.16mM KCl，4.72mM CaCl₂·2H₂O，0.5mM MgCl₂·6H₂O，25mM NaHCO₃，5mM D-葡萄糖，0.0188g/250ml青霉素-G，0.0125g/250ml硫酸链霉素，0.0005g/250ml酚红和0.25g/250mlPVA)，补充有10mM乳酸钠，0.1mM丙酮酸钠，2mM咖啡因-苯甲酸钠，3mM乳酸钙二水合物和75mg BSA(级分V)。通过将精液以1400RPM离心5分钟两次来制备精子，然后用TALP-受精培养基和精子洗涤液(由补充有5mg丙酮酸钠，45mg乳酸钙，3.75mg青霉素-G，2.5mg硫酸链霉素和6ml热灭活的FBS的50ml M199组成)稀释精子，使最终精子浓度为5x10⁶精子/ml。将10μl制备的精子加入到含有成熟COC的90μlTALP-受精培养基液滴中，使最终精子浓度为5x10⁵精子/ml。

受精后，通过反复吹打移除卵丘细胞，并通过改良的PZM-5(mPZM-5；Yoshioka K等,2008,Defined system for in vitro production of porcine embryos using asingle basic medium,Journal Reproduction and Development,54(3):208-213)洗涤受精卵两次，然后在100μl mPZM-5IVC液滴中培养。改良的PZM-5培养基补充有3mg/ml的BSA代替PVA(Yoshioka K等,2012,Production of piglets from in vitro-produced embryosfollowing non-surgical transfer,Animal Reproduction Science,131(1-2):23-29)。将胚胎在38.3℃，5.5％CO₂和7％O₂湿润空气中培养6天。在第3天测定分裂，并在第5天和第6天测定胚泡发育率。基于形态学外观(包括胚泡直径和腔体大小)对胚泡发育率进行评分。将胚泡评分为：中小型的，扩张的，或孵化的/孵化中。

差异染色

对于上述两种胚胎生产方法，在培养的第6天用Hoechst 33358和碘化丙锭对评分为中型的，扩张的，或孵化的/孵化中的胚泡进行差异染色(Handyside A and Hunter S.,1984,Rapid procedure for visualising the inner cell mass and trophectodermnuclei of mouse blastocysts in situ using polynucleotide-specificfluorochromes,J.Exp.Zool.,231:429-434)。在矿物油下在200μl链霉蛋白酶溶液滴中去除每个胚胎的透明带，并且在含有1mg/ml PVA的无蛋白M199Hepes中洗涤无带胚泡两次。然后将胚泡在黑暗中pH8.5下具有740μl M199Hepes-PVA的60μl 10mM三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulphonic acid,TNBS)中培养20分钟。然后将胚泡通过M199Hepes-PVA洗涤三次，然后在37℃下具有40μlM199Hepes-PVA的10μl 0.2mg/ml抗DNP BSA中培养20分钟。然后将胚泡通过M199Hepes-PVA洗涤三次，然后在37℃下5μl豚鼠补体中培养20分钟，所述豚鼠补体具有10μg/ml Hoechst 33342(1mg/ml原液)，10μg/ml碘化丙啶(0.1mg/ml原液)和40μl M199Hepes-PVA。然后通过M199Hepes-PVA进行最后洗涤，将胚泡固定在99％乙醇中，然后将其安装在甘油下的载玻片上并用盖玻片覆盖。然后用指甲油密封盖玻片。使用UV光源显微镜观察染色的胚胎。内细胞团染成蓝色，并且滋养外胚层细胞染成粉红色。

猪GM-CSF

猪重组GM-CSF购自R&D systems(Minneapolis,Minnesota)。将冻干的10μgGM-CSF(产品711-PG-010)在含有0.1％BSA的无菌D-PBS中重构成10μg/ml。将该溶液在含有0.1％BSA的无菌D-PBS中进一步1:10稀释，得到1μg/ml(1000x)原液，并储存在-20℃直至使用。然后将该原液以1：500或1：100稀释，得到2ng/ml或10ng/ml的工作浓度。

结果

向卵母细胞成熟培养基中添加GM-CSF提高了猪胚泡内细胞团细胞数

在第一个卵母细胞成熟和胚胎生产方法中，来自屠宰场的猪卵母细胞在补充或不补充GM-CSF的含有10％猪卵泡液的卵母细胞成熟培养基中成熟。GM-CSF对胚泡内细胞团数，滋养外胚层细胞数和总细胞数的影响如表3所示。与对照组相比，用2ng/ml GM-CSF处理使胚泡内细胞团、滋养外胚层和总细胞数分别显著提高了60.8％,8.6％和12.7％。

表3

GM-CSF对胚泡ICM、滋养外胚层和总细胞数的影响

GM-CSF(ng/ml)	n	ICM	滋养外胚层	总数
					0	64	3.39+0.62	39.91+3.24	43.30+3.64
2	70	5.45+0.52	43.33+2.31	48.78+2.65
					10	76	5.35+0.43	43.73+2.54	48.76+3.01

值是重复5次的平均值±标准误差(SEM)。

向卵母细胞成熟培养基中添加GM-CSF提高了猪的按时胚泡发育和胚泡率

在第二个卵母细胞成熟和胚胎生产方法中，源自屠宰场的猪卵母细胞在补充或不补充GM-CSF并且缺乏猪卵泡液的卵母细胞成熟培养基中成熟。GM-CSF对随后胚胎发育的影响如表4所示。用2ng/ml和10ng/ml GM-CSF处理分别使培养第5天的胚泡数量显著提高了41％和78％。这是胚泡通常在体内形成的阶段，表明向成熟培养基中添加GM-CSF可以克服胚胎在体外产生和/或培养时所见的发育延迟，从而提高了按时胚泡发育。向卵母细胞成熟培养基中添加GM-CSF也使第6天培养结束时存在的胚泡数量分别提高了28％和22％。

表4

GM-CSF对猪胚胎发育的影响

数值是总(n)的百分比，并且是6次重复的平均值±标准误差(SEM)

对上述胚泡进行差异染色以确定内细胞团、滋养外胚层和总细胞数。结果显示在表5中。向ooycte成熟培养基中添加2ng/ml的GM-CSF分别使胚泡内细胞团、滋养外胚层和总细胞数提高了25％，11％和13％。与对照组相比，向卵母细胞成熟培养基中添加10ng/mlGM-CSF使胚泡内细胞团、滋养外胚层和总细胞数分别提高了29％，16％和19％。

表5

GM-CSF对胚泡ICM、滋养外胚层和总细胞数的影响

GM-CSF(ng/ml)	n	ICM	滋养外胚层	总数
					0	81	7.38(0.9)	38.3(2.3)	45.7(2.5)
2	101	9.25(1.0)	42.5(3.0)	51.6(4.0)
					10	98	9.55(1.5)	44.3(2.9)	54.5(4.6)

值是6次重复的平均值±标准误差(SEM)。

实施例2

GM-CSF对牛卵母细胞体外成熟的影响

在使用重组GM-CSF的剂量反应实验中，在奶牛中检查了将粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor,GM-CSF)添加到卵母细胞成熟培养基中的效果。使用体外胚胎生产系统生产胚胎。实验检查了分裂和发育至胚泡期的胚胎数，和胚泡内细胞团、滋养外胚层和总细胞数，作为卵母细胞发育能力的量度。除非另有说明，否则所有化学品均购自Sigma-Aldrich。

方法

牛GM-CSF

牛重组GM-CSF购自Kingfisher Biotech,Inc.(St Paul,Minnesota)。将冻干的25μg GM-CSF(产品RP0871B-025)在含有0.1％BSA的无菌D-PBS中重构成25μg/ml。将该溶液在含有0.1％BSA的无菌D-PBS中进一步1:10稀释，得到1μg/ml(1000x)原液，并储存在-20℃直至使用。然后将该原液以1：500或1：100稀释，得到2ng/ml或10ng/ml的工作浓度。

卵母细胞成熟和体外胚胎生产

卵母细胞收集和体外成熟

从当地屠宰场收集卵巢并在30-35℃下盐水中运输。使用18量孔的针和10ml注射器吸出直径为2至8mm的卵泡。然后在清洁的卵泡液中选择具有紧密卵丘和未分化卵母细胞的COC，通过洗涤用培养基(Vitrowash，IVF Vet Solutions)，所述洗涤用培养基添加了4.0mg/ml BSA和补充4.0mg/ml BSA和0.1IU/ml FSH(Ovagen)的体外成熟(in vitromaturation,IVM)培养基(Vitromat,IVF Vet Solutions,Robinson Research Institute,University of Adelaide,SA,Australia)洗涤两次。然后将COC转移到覆盖石蜡油(Merck)的平衡IVM培养基培养液滴(500μl液滴)中。成熟处理组为：(1)对照(IVM培养基)，(2)2ng/ml GM-CSF(IVM培养基+2ng/ml GM-CSF)，和(3)10ng/ml GM-CSF(IVM培养基+10ng/ml GM-CSF)。将50个COC的组在6％CO₂的湿润空气中38.5℃下500μl培养基中培养23小时。

体外受精(In vitro Fertilization,IVF)和体外培养(in vitro Culture,IVC)

成熟后，COC通过添加了4.0mg/ml BSA的洗涤用培养基(Vitrowash，IVF VetSolutions)洗涤，并转移到覆盖石蜡油的500μl的IVF培养基(Vitrofert,IVF VetSolutions)的培养液滴中，所述IVF培养基添加了4.0mg/ml BSA，10IU肝素，25μM青霉胺，12.5μM亚牛磺酸，1.25μM肾上腺素。精子由Semex Australia Pty Ltd的生育能力已证明的公牛中提供。将两管精子在30-35℃下解冻，并使用Bovipure不连续梯度(40％：80％)制备，并以1X 10⁶精子/ml的终浓度加入。将COC与精子在6％CO₂空气中培养23小时，然后通过反复吹打机械裸露，并通过添加了4.0mg/ml BSA的洗涤用培养基(Vitrowash，IVF VetSolutions)洗涤，并将5个胚胎的组转移至覆盖石蜡油的添加了4.0mg/ml BSA的20μl液滴的预平衡分裂培养基(Vitrocleave，IVF Vet Solutions)中，并在38.5℃，7％O₂，6％CO₂和余量N₂下培养5天。在第5天，在38.5℃，7％O₂，6％CO₂和余量N₂下，将胚胎转移到覆盖石蜡油的添加了4.0mg/ml BSA的20μl的预平衡胚泡培养基(Vitroblast，IVF Vet Solutions)的培养液滴中直到第8天。

结果

向卵母细胞成熟培养基中添加GM-CSF可提高了牛的胚泡发育

来自屠宰场的牛卵母细胞在补充或未补充GM-CSF的卵母细胞成熟培养基中成熟。GM-CSF对随后的胚胎发育的影响如表6所示。与对照组相比，加入2ng/ml和10ng/ml的GM-CSF分别使培养第8天的胚泡数量提高了20％和44％。

表6

GM-CSF对牛胚胎发育的影响

值是总(n)的百分比，并且是重复4次的平均值±标准误差(SEM)

向卵母细胞成熟培养基中添加GMCSF提高了胚胎培养第8天孵化的胚泡的牛胚泡的比例

如图1所示，用2ng/ml和10ng/ml GM-CSF处理分别使胚胎培养第8天达到孵化胚泡阶段的总牛胚泡比例显著提高了45.4％和149.0％。这是胚泡通常在体内形成的阶段，表明向成熟培养基中添加GM-CSF可以克服牛胚胎在体外产生和/或培养时所见的发育延迟，以提高了按时胚泡发育。

鉴于牛和奶牛行业已经常规地使用IVM用于育种目的，并且牛胚胎经常被用作对人类胚胎影响的模型，证明使牛卵母细胞体外成熟中使用GM-CSF的功效是重要的。

例3

GM-CSF对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

在使用重组GM-CSF的剂量反应实验中，在小鼠中检查了将粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor,GM-CSF)添加到卵母细胞成熟培养基中的效果。使用体外胚胎生产系统生产胚胎。实验检查了分裂和发育至胚泡期的胚胎数，和胚泡内细胞团、滋养外胚层和总细胞数，作为卵母细胞发育能力的量度。除非另有说明，否则所有化学品均购自Sigma-Aldrich。

小鼠

将CBAFI雄性(6-8周)和雌性(21-23天)圈养在12小时光照和12小时黑暗循环中，随意获取水和食物。所有实验均根据为科学目的照顾和使用动物的澳大利亚实践守则进行，该研究得到阿德莱德大学动物伦理委员会的批准(M/2015/072和M/2017/081)。

鼠GM-CSF

鼠重组GM-CSF购自R&D systems(Minneapolis，Minnesota)。将冻干的10μgGM-CSF(产品415-ML-010)在含有0.1％BSA的无菌D-PBS中重构成10μg/ml。将该溶液在含有0.1％BSA的无菌D-PBS中进一步1:10稀释，得到1μg/ml(1000x)原液，并储存在-20℃直至使用。然后将该原液以1：500或1：100稀释，得到2ng/ml或10ng/ml的工作浓度。

卵母细胞成熟和体外胚胎生产

卵母细胞收集和体外成熟

通过腹腔注射(intraperitoneal injection,i.p)给C57B16x CBA F1雌性小鼠施用马绒毛膜促性腺激素(eCG；Folligon,Intervert,Boxmeer,The Netherlands)以刺激卵泡生长。注射后46-48小时，从大的窦卵泡中吸出卵丘卵母细胞复合物(cumulus oocytecomplexes,COCs)，并收集在HEPES缓冲的极限必需培养基(α-MEM)处理培养基中，所述处理培养基补充有4.0mg/ml牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和1mg/ml胎球蛋白(Wong SL等,2015,Hyperglycaemia and lipid differentially impair mouse oocytedevelopmental competence,Reproduction,Fertility and Development,27:583-592)。在进行IVM之前，将IVM培养基在培养箱(37℃，6％O₂)中预平衡4小时。每50μl液滴IVM培养基在20％O₂，6％CO₂和余量N₂中培养10个COC共16小时。IVM培养基是碳酸氢盐缓冲的α-MEM，其含有3mg/ml BSA和1mg/ml胎球蛋白和5mIU/ml FSH(Puregon-Organon,Oss,TheNetherlands；Wong SL et al.,2015,同上)，16h后成熟，使用如Vanderhyden BC等，1990中描述的量表评估卵丘扩张(Developmental pattern of the secretion of cumulusexpansion-enabling factor by mouse oocytes and the role of oocytes inpromoting granulosa cell differentiation,Developmental Biology,140:307-317)。COC分级为0：无扩张，1+：卵丘细胞外层扩张，2：卵丘外半部扩张，3：所有层均远离冠状放射线扩张，4+：所有卵丘细胞层最大扩张。

体外受精(In vitro Fertilization,IVF)和体外培养(in vitro Culture,IVC)

使用颈椎脱位处死C57B16x CBA F1雄性小鼠，并将输精管连同附睾解剖出来并置于37℃的洗涤用培养基(Cook Medical Pty.Ltd,QLD,Australia)中，并在显微镜下去除多余的组织和脂肪。然后将输精管和附睾转移到含有预平衡的1000μl Fert培养基(CookMedical Pty.Ltd,QLD,Australia)的培养皿中，提取精子并在37℃，6％CO₂，5％O₂和89％N₂中培养45-60分钟，以使精子获得能量(Wong SL等,2015,同上)精子，然后将其加入含有扩张COC的受精液滴中并培养4小时。受精后，假定的受精卵在分裂培养基(Cook Medical PtyLtd,QLD,Australia)中培养至第5天。通过在第4天和第5天检查卵裂率作为受精和胚泡率的量度来确定着床前胚胎的发育。

差异染色

使用如所述(Handyside A和Hunter S.,1984，同上)的差异染色测定ICM和滋养外胚层(trophectoderm,TE)细胞数。将胚泡置于20μl 0.5％链霉蛋白酶中约2-3分钟直至透明带溶解，然后置于无蛋白质的3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)培养基中。然后将它们转移到10μl2,4,6-三硝基苯磺酸和90μl的聚乙烯吡咯烷酮(plolyvinylpyrrolidone,PVP)中，并在4℃下培养10分钟。然后将胚泡在37℃下20μl抗二硝基苯中培养10分钟，然后在37℃下补体(50μl碘化丙啶(propidium iodide,PI)和50μl豚鼠血清中培养5分钟。然后将胚泡转移到500μl双苯甲酰亚胺中并在4℃培养过夜。第二天将胚胎置于500μl 100％乙醇中，并置于3μl甘油中的硅化载玻片上。将盖玻片轻轻放置在液滴顶部，并在UV和红色滤光器下计数ICM细胞(蓝色)和TE(粉红色)的数量。使用装有紫外灯的Olympus BX 51(Olympus,Victoria,Australia)对胚泡进行成像。激发双苯酰亚胺并在338nm和505nm处发射以在537nm和619nm处显现ICM细胞和PI，以显现TE细胞。

胚泡DNA损伤

使用组蛋白修饰抗体γH2AX(Cell Signalling Technology)测量DNA双链断裂的发生率作为胚泡DNA损伤的评估(Sharma A et al.,2012,Histone H2AXphosphorylation:A marker for DNA damage,Methods in Molecular Biology,920:613-626)。将胚胎固定在4％多聚甲醛中，然后在具有0.3mg/ml聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)的磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline,PBS)中洗涤30分钟，并在0.25％Triton-X(USB Corporation,OH)中透化。为了防止非特异性结合，加入在PBS-PVA(JacksonImmunoResearch,PA)中的山羊血清的10％封闭溶液1小时。然后将胚泡在室温(roomtemperature,RT)下与10％山羊血清中的一级抗体γH2AX(在PBS-PVA中)培养过夜。在阴性对照中没有使用一级抗体。在第2天，将处理中的胚泡在PBS-PVA溶液中洗涤3次，每次2分钟。然后用稀释系数1：500的二级抗体Alexa-594(Life Technologies)标记胚泡，并在室温下培养2小时。与二级抗体一起，加入4'6二咪啶-2-苯基吲哚(DAPI)作为核染色剂。将培养后的胚胎在PBS中洗涤3次并装入共聚焦培养皿中进行成像。通过Fluoview FV10i共聚焦显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)检测荧光。对于每次重复，仪器设置保持不变。将该实验重复5次，每次处理至少评估10个胚泡。

玻璃化/加温

在第5天收集小鼠胚泡并在胚胎转移至假妊娠受体小鼠之前玻璃化。在进行玻璃化的当天制备玻璃化培养基。对于玻璃化，处理培养基(handling media,HM)含有BSA，平衡溶液由8ml处理培养基，1ml乙二醇(EG)，1ml二甲基亚砜(DMSO)组成，并且玻璃化溶液由10.8ml蔗糖培养基(SM)，1.2ml处理培养基，3ml DMSO和3ml乙二醇组成。从每个培养基中取出600μl并置于4孔培养皿中，在进行玻璃化之前，所述4孔培养皿在37℃下平衡15分钟。将6-7个胚泡转移到含有处理培养基的每个孔中，然后立即置于含有处理培养基的另一个孔中，然后在37℃下置于具有平衡溶液的第3孔中3分钟，然后在37℃下进入玻璃化溶液20-30秒，然后将其放在吸管的钩子上，然后将吸管插入预冷的纤维塞中并储存在液氮中。在胚胎移植的早晨做加温培养基，并在使用前在37℃平衡15分钟。加温溶液(Warming solution,WS)1由7ml HM和3ml SM组成，WS2由7.5ml HM和2.5ml SM组成，WS3具有8.5ml HM和1.5mlSM，而WS4由10ml HM组成。从WS1和WS2中取500μl，同时从WS3和WS4中取600μl，置于4孔培养皿中，在加温前所述4孔培养皿于37℃校准15分钟。通过去除纤维塞并将含有胚泡的吸管置于具有WS1的孔中来加温胚泡。然后将胚泡立即放入WS2中5分钟，然后放入WS3中5分钟，然后放入WS4中5分钟，之后将它们放入预平衡的分裂培养基中。在移植前，将胚泡在分裂培养基(Cook Medical Pty Ltd,QLD,Australia)中培养3-4小时以允许它们再扩张以确定移植前的存活率。

假妊娠和胚胎移植

将年龄在8-12周之间的瑞士雌性小鼠用作胚胎移植的受体母亲。将这些放置在输精管切除的成年C57B16×CBA FI雄性中以诱导假妊娠。在第2.5天，来自对照和10ng/mlGM-CSF组的dpc胚泡外科手术地移植到对侧子宫角(Zander-Fox DL等,2015,Reduction ofmitochondrial function by FCCP during mouse cleavage stage embryo culturereduces birth weight and impairs the metabolic health of offspring,Biology ofReproduction,92:124)。将来自每组的六个再扩张(re-expanded)的胚泡移植到随机选择的一个角上。每个治疗组共进行了11次移植。在怀孕第17.5天宰杀小鼠并确定着床和胎儿的数量。还测定了胎儿体重、顶臀长和直径以及胎盘重量。

结果

向限定的卵母细胞成熟培养基中添加GM-CSF提高了小鼠按时胚泡发育和胚泡率

源自激素刺激的青春期前小鼠的小鼠卵母细胞在补充或不补充GM-CSF的卵母细胞成熟培养基中成熟。GM-CSF对随后的胚胎发育的影响如表7所示。

表7

GM-CSF对小鼠胚胎发育的影响

值是总(n)的百分比，并且是重复6次的平均值±标准误差(SEM)

添加2ng/ml和10ng/ml的GM-CSF分别使胚胎培养第4天的胚泡数量显著提高了41％和78％。这是胚泡通常在体内形成的阶段，表明向成熟培养基中添加GM-CSF可以克服胚胎在体外产生和/或培养时所见的发育延迟，从而提高了按时胚泡发育。向卵母细胞成熟培养基中添加2ng/ml和10ng/ml GM-CSF也使第6天培养结束时存在的胚泡总数分别提高了28％和22％。

向成熟培养基中添加GM-CSF提高了小鼠胚泡细胞数量

对上述胚泡进行差异染色以确定内细胞团、滋养外胚层和总细胞数。结果显示在图2中。向卵母细胞成熟培养基中加入2ng/ml和10ng/ml鼠GM-CSF分别使胚泡内细胞团提高了20.5％和52.1％，滋养外胚层细胞数提高了18.2％和25.0％，总细胞数提高了18.8％和32.9％。

向卵母细胞成熟培养基中添加GM-CSF降低了小鼠胚泡中DNA损伤的发生率

通过使用免疫组织化学检测对照中和使用含有2ng/ml和10ng/ml GM-CSF的成熟培养基成熟的卵母细胞产生的胚泡中的γH2AX染色的发生率，来测定小鼠体外产生的胚泡中DNA损伤的发生率。结果显示在图3中。与对照相比，添加GM-CSF使2ng/ml和10ng/ml组中阳性细胞的比例分别降低8.4％和29.1％。

向卵母细胞成熟培养基中添加GM-CSF提高了小鼠的妊娠和着床率

玻璃化并加温对照和使用在含有10ng/ml GM-CSF的成熟培养基中成熟的卵母细胞产生的胚泡。将加温后扩张的玻璃化胚泡移植到受体小鼠随机选择的对侧(相对)子宫角。在交配后第17.5天处死小鼠并测定着床和胎儿的数量。

在GM-CSF组中，如通过具有着床/胎儿的角的数量确定的妊娠率提高了50％。如图4所示，GM-CSF组的着床率提高了64.7％。

向卵母细胞成熟培养基中添加GM-CSF提高了小鼠的出生率

玻璃化并加温对照和使用在含有10ng/ml GM-CSF的成熟培养基中成熟的卵母细胞产生的胚泡。将加温后扩张的玻璃化胚泡移植到受体小鼠的对侧或相对角上，并且使用在第17.5天存在的胎儿数来测量出生率。如图5所示，与对照组相比，GM-CSF组的出生率提高了25％。

总结

实施例1至3的结果显示了向卵母细胞成熟培养基中添加GM-CSF可以提高卵母细胞的发育能力。这导致胚胎数量和质量的显著改善，其反过来又提高了着床和出生率。具体地，本发明证明了向卵母细胞成熟培养基中添加GM-CSF的令人惊讶和意外的发现：

·提高了受精后发育到胚泡期的卵母细胞的数量；

·提高了在与受精后体内正常发生(按时胚泡率)的相同时间达到胚泡期的卵母细胞的数量。与其体内对应物相比，产生和/或培养的胚胎在其发育中延迟，突出了当前体外成熟受精和培养系统的缺陷；

·提高了孵化的胚泡数量。而且测量按时胚胎发育，胚泡从透明带孵化的能力被用作胚胎生存力的量度；

·提高了胚泡内细胞团细胞的数量。内细胞团包括产生胎儿的细胞，并且先前已显示与着床率相关。

·提高了胚泡含有的滋养外胚层细胞数量。这些是有助于胎盘的细胞，其本身影响胎盘的生长和发育，进而影响胎儿的生长和发育；

·提高了胚泡含有的细胞总数；

·降低了胚泡中DNA损伤的发生率，证明向成熟培养基中添加GM-CSF可减少与体外培养相关的环境压力；

·提高了胚胎移植后变为怀孕/妊娠的接受者或代孕者的人数；

·提高了着床的冷冻保存胚泡的数量；和

·提高了发育至足月的冷冻保存胚泡的数量。

实施例4

GM-CSF对卵母细胞和胚胎体外成熟的影响

检查了当在培养基中培养卵母细胞和培养源自卵母细胞的胚胎时，培养基中的GM-CSF的存在对胚泡发育的影响。实际上，当GM-CSF用于从卵母细胞到胚胎阶段的成熟培养基中时，可以确定GM-CSF是否具有加成或甚至协同效应。

根据上文实施例1至3中所述的方法，在含有GM-CSF的培养基中体外成熟卵母细胞。然后根据实施例1至3中所述的方法使成熟的卵母细胞受精，并在培养基中培养，所述培养基中有或没有GM-CSF存在于培养基中。

根据每个实施例1至3检查受精率和胚泡期胚胎存在数量，以及ICM，滋养外胚层和总细胞数，以确定GM-CSF添加到成熟和培养型培养基中是否具有对胚泡发育的加成或甚至协同作用。实验重复多次，以证实在IVF过程的卵母细胞成熟、受精和胚胎阶段培养中使用GM-CSF培养基的额外益处。

对于猪，如表8所示，发明人已经证明，单独向卵母细胞成熟培养基中加入2ng/ml和10ng/ml的GM-CSF分别使卵裂率提高了15.7％和14.4％。然而，向成熟、受精和培养型培养基(culture media)中加入10ng/ml的GM-CSF使卵裂率提高了25.2％，表明当在整个培养过程中(即从卵母细胞到胚胎阶段)加入GM-CSF时具有加成效应。

表8

GM-CSF对猪胚胎发育的影响

值是总(n)的百分比，并且是重复2次的平均值±标准误差(SEM)

此外，如表8中所示，单独向成熟培养基中添加2ng/ml和10ng/ml的GM-CSF分别使第6天的胚泡率提高了7.6％和20.1％。然而，向成熟、受精和培养型培养基中添加10ng/ml的GM-CSF使第6天的胚泡率提高了28.5％，表明当在整个培养过程中添加GM-CSF时具有加成效应。

序列表

<110> 阿德莱德大学

<120> 用于卵母细胞体外成熟的组合物和方法

<130> 1105149

<150> AU2016905096

<151> 2016-12-09

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 800

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

acacagagag aaaggctaaa gttctctgga ggatgtggct gcagagcctg ctgctcttgg 60

gcactgtggc ctgcagcatc tctgcacccg cccgctcgcc cagccccagc acgcagccct 120

gggagcatgt gaatgccatc caggaggccc ggcgtctcct gaacctgagt agagacactg 180

ctgctgagat gaatgaaaca gtagaagtca tctcagaaat gtttgacctc caggagccga 240

cctgcctaca gacccgcctg gagctgtaca agcagggcct gcggggcagc ctcaccaagc 300

tcaagggccc cttgaccatg atggccagcc actacaagca gcactgccct ccaaccccgg 360

aaacttcctg tgcaacccag attatcacct ttgaaagttt caaagagaac ctgaaggact 420

ttctgcttgt catccccttt gactgctggg agccagtcca ggagtgagac cggccagatg 480

aggctggcca agccggggag ctgctctctc atgaaacaag agctagaaac tcaggatggt 540

catcttggag ggaccaaggg gtgggccaca gccatggtgg gagtggcctg gacctgccct 600

gggccacact gaccctgata caggcatggc agaagaatgg gaatatttta tactgacaga 660

aatcagtaat atttatatat ttatattttt aaaatattta tttatttatt tatttaagtt 720

catattccat atttattcaa gatgttttac cgtaataatt attattaaaa atatgcttct 780

acttgaaaaa aaaaaaaaaa 800

<210> 2

<211> 144

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile

1 5 10 15

Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His

20 25 30

Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp

35 40 45

Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe

50 55 60

Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys

65 70 75 80

Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met

85 90 95

Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser

100 105 110

Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys

115 120 125

Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu

130 135 140

<210> 3

<211> 768

<212> DNA

<213> 牛(Bos taurus)

<400> 3

agtcctcaag aggatgtggc tgcagaacct gcttctcctg ggcactgtgg tctgcagctt 60

ctccgcacct actcgcccac ccaacactgc cacccggccc tggcagcatg tggatgccat 120

caaggaggcc ctgagccttc tgaaccacag cagtgacact gatgctgtga tgaatgacac 180

agaagtcgtc tctgaaaagt ttgactccca ggaaccaacg tgcctgcaga ctcgcctgaa 240

gctgtacaag aacggcctgc agggcagcct cactagtctc atgggctcct tgaccatgat 300

ggccacccac tacgagaaac actgcccacc caccccggaa acttcctgtg gaacccagtt 360

tatcagcttc aaaaatttca aagaggacct gaaggagttc ctttttatca ttccctttga 420

ctgctgggaa ccagcccaga agtgaagcag gccaaaccag ccagaagtgg aagcttacct 480

cacagatcgc tgccctccta cccacaaaga gccaaacaaa actcaggatc ttcacactgg 540

agggaccaca gggagggcca gagctgtagg gggccgctgg cttgttcagg gccatgttga 600

ccctgataca ggtgtggcag gggaaacggg aaatgtttta cactggcagg gatcagcaat 660

atttatttat atatttatgt attttaatat ttatttattt atttatttaa actcataccc 720

catatttatt caagatgttt ttctataata ataaattatt caaagtca 768

<210> 4

<211> 143

<212> PRT

<213> 牛(Bos taurus)

<400> 4

Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Val Cys Ser Phe

1 5 10 15

Ser Ala Pro Thr Arg Pro Pro Asn Thr Ala Thr Arg Pro Trp Gln His

20 25 30

Val Asp Ala Ile Lys Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn His Ser Ser Asp

35 40 45

Thr Asp Ala Val Met Asn Asp Thr Glu Val Val Ser Glu Lys Phe Asp

50 55 60

Ser Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Lys Leu Tyr Lys Asn

65 70 75 80

Gly Leu Gln Gly Ser Leu Thr Ser Leu Met Gly Ser Leu Thr Met Met

85 90 95

Ala Thr His Tyr Glu Lys His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys

100 105 110

Gly Thr Gln Phe Ile Ser Phe Lys Asn Phe Lys Glu Asp Leu Lys Glu

115 120 125

Phe Leu Phe Ile Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Ala Gln Lys

130 135 140

<210> 5

<211> 829

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 5

agtgctcaga gagaaaggct aaagtcctca gaaggatgtg gctgcagaac ctgcttctcc 60

tgggcactgt ggtctgcagc atctccgctc ccacccgccc acccagccct gtcacccggc 120

cctggcagca tgtggatgcc atcaaagaag ccctgagcct tctaaacaac agtaatgaca 180

cagcggctgt gatgaatgaa accgtagacg tcgtctgtga aatgtttgac ccccaggagc 240

cgacatgcgt gcagactcgc ctgaacctgt acaagcaggg cctgcggggc agcctcacta 300

ggctcaagag ccccttgact ctgttggcca agcactatga gcagcactgc cccctcaccg 360

aggaaacttc ctgtgaaacc cagtctatca ccttcaaaag tttcaaagac agtctgaaca 420

aatttctttt taccatcccc tttgactgct gggggccagt caaaaagtaa agcagcctgc 480

agcagccaga agccagcctt gccgcacgga ttgctcccac tgacagagcc aaaccaaact 540

caggatcttc accgtggagg gaccactggc tggccaaggc tgtaatgggg cacagacttg 600

ccctgggcca tgttgaccct gatacaggcc tggcagggga aatggcagat gttttatacc 660

ggcagggatt agcaatattt attaacctat ttatgtattt taatatttat ttatttattt 720

atctatttat ttatttaagc ttgaacttca tatttattca agatgtttta ccataataat 780

aaattattta aaatctgtaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 829

<210> 6

<211> 144

<212> PRT

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 6

Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Val Cys Ser Ile

1 5 10 15

Ser Ala Pro Thr Arg Pro Pro Ser Pro Val Thr Arg Pro Trp Gln His

20 25 30

Val Asp Ala Ile Lys Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn Asn Ser Asn Asp

35 40 45

Thr Ala Ala Val Met Asn Glu Thr Val Asp Val Val Cys Glu Met Phe

50 55 60

Asp Pro Gln Glu Pro Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Asn Leu Tyr Lys

65 70 75 80

Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Arg Leu Lys Ser Pro Leu Thr Leu

85 90 95

Leu Ala Lys His Tyr Glu Gln His Cys Pro Leu Thr Glu Glu Thr Ser

100 105 110

Cys Glu Thr Gln Ser Ile Thr Phe Lys Ser Phe Lys Asp Ser Leu Asn

115 120 125

Lys Phe Leu Phe Thr Ile Pro Phe Asp Cys Trp Gly Pro Val Lys Lys

130 135 140

<210> 7

<211> 779

<212> DNA

<213> 马(Equus caballus)

<400> 7

atgtggcttc agaacctgct tcttctgggc actgtggttt acagcatgcc cgcacccacc 60

cgccaaccca gccctgtcac tcggccctgg cagcatgtgg atgccatcaa ggaggccctg 120

agccttctga acaacagtag tgacactgct gctatcatga atgaaacagt agaagtcgtc 180

tctgaaacgt ttgacgccga ggagctgaca tgcctgcaga ctcgcctgaa gctgtacaaa 240

cagggcttgc ggggcagcct catcaagctc gaaggcccct taaccatgat ggccagccac 300

tacaagcagc actgcccccc caccctggaa acttcctgtg caacccagat gatcaccttc 360

aaaagtttca aaaagaacct gaaggatttt ctgtttgaga tcccgtttga ctgctggaac 420

cagcccagaa gtaaggcagg ccttccagct aggagctagc cctgggagct cacctcacag 480

attgctgctg tcccactcac aaagaaccga aactcaggat cttcagcttg gagggaccaa 540

agggtgggcc atggctgttg agaacatgga cttgctctgg gccgtactga ccacgatatg 600

ggtgtggtag gggagtaggg gatattttac actggcgggg atcagtaata tttatttata 660

tatttatgta ttttaatatt tatttattta tttatttaag ctcatactcc atatttattc 720

aagatgtttt accattagaa taaattatta aaacccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 779

<210> 8

<211> 152

<212> PRT

<213> 马(Equus caballus)

<400> 8

Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Val Tyr Ser Met

1 5 10 15

Pro Ala Pro Thr Arg Gln Pro Ser Pro Val Thr Arg Pro Trp Gln His

20 25 30

Val Asp Ala Ile Lys Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn Asn Ser Ser Asp

35 40 45

Thr Ala Ala Ile Met Asn Glu Thr Val Glu Val Val Ser Glu Thr Phe

50 55 60

Asp Ala Glu Glu Leu Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Lys Leu Tyr Lys

65 70 75 80

Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Ile Lys Leu Glu Gly Pro Leu Thr Met

85 90 95

Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Leu Glu Thr Ser

100 105 110

Cys Ala Thr Gln Met Ile Thr Phe Lys Ser Phe Lys Lys Asn Leu Lys

115 120 125

Asp Phe Leu Phe Glu Ile Pro Phe Asp Cys Trp Asn Gln Pro Arg Ser

130 135 140

Lys Ala Gly Leu Pro Ala Arg Ser

145 150

<210> 9

<211> 809

<212> DNA

<213> 犬(Canis lupus)

<400> 9

aggaggatgt ggctgcagaa cctgcttttc ttgggcactg tggtctgcag catctctgca 60

cccacccgct cacccaccct tgtcactcgg ccctctcagc acgtggatgc catccaggaa 120

gccctgagcc ttttgaacaa cagtaatgac gtgactgctg tgatgaataa agcagtaaaa 180

gtggtctctg aagtgtttga ccctgagggg ccaacatgcc tggagacccg cctacagctg 240

tacaaggagg gcctgcaggg cagcctcacc agcctcaaga atcccttaac catgatggcc 300

aatcactata agcagcactg tccccctacc ccggaatctc cctgtgcaac ccagaatatt 360

aacttcaaaa gtttcaaaga gaacctgaag gattttctgt ttaacatccc ctttgactgc 420

tggaaaccag tcaagaagtg aggcagacca gtccagccag gagccagccc agtccagcca 480

gaagccagcc ctgagagcat acctcatacc tcacaagtca ctgcctttct acccatggat 540

tgctgaaact caggatcttc acctttgagg gacaccgggt ggaccagggc agtagagggg 600

gcatggactt gctctggcca tgctgcccgg ataccagctt ggtatgggga gcggggaatg 660

ttttatactg gcagggatca gtaatattta tttatatatt tatgtatttt aatatttatt 720

tatttattta tttaagatca tactctgtat ttattcaaga cattttacta ttataataaa 780

ttattaaaag cctgttaaaa aaaaaaaaa 809

<210> 10

<211> 144

<212> PRT

<213> 犬(Canis lupus)

<400> 10

Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Phe Leu Gly Thr Val Val Cys Ser Ile

1 5 10 15

Ser Ala Pro Thr Arg Ser Pro Thr Leu Val Thr Arg Pro Ser Gln His

20 25 30

Val Asp Ala Ile Gln Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn Asn Ser Asn Asp

35 40 45

Val Thr Ala Val Met Asn Lys Ala Val Lys Val Val Ser Glu Val Phe

50 55 60

Asp Pro Glu Gly Pro Thr Cys Leu Glu Thr Arg Leu Gln Leu Tyr Lys

65 70 75 80

Glu Gly Leu Gln Gly Ser Leu Thr Ser Leu Lys Asn Pro Leu Thr Met

85 90 95

Met Ala Asn His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Ser Pro

100 105 110

Cys Ala Thr Gln Asn Ile Asn Phe Lys Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys

115 120 125

Asp Phe Leu Phe Asn Ile Pro Phe Asp Cys Trp Lys Pro Val Lys Lys

130 135 140

<210> 11

<211> 435

<212> DNA

<213> 猫(Felis catus)

<400> 11

atgtggctgc agaacctgct tttcctgggc actgtggtct gcagcatctc tgcacccacc 60

agttcaccca gctctgtcac tcggccctgg caacacgtgg atgccatcaa ggaggctctg 120

agccttctga acaacagtag tgaaataact gctgtgatga atgaagcagt agaagtcgtc 180

tctgaaatgt ttgaccctga ggagccgaaa tgcatgcaga ctcacctaaa gctgtacgag 240

cagggcctac ggggcagcct catcagcctc aaggagcctc tgagaatgat ggccaaccat 300

tacaagcagc actgccccct tactccggaa acgccctgtg aaacccagac tatcaccttc 360

aaaaatttca aagagaatct gaaggatttt ctgtttaaca tcccctttga ctgctgggag 420

ccagaccaga agtaa 435

<210> 12

<211> 144

<212> PRT

<213> 猫(Felis catus)

<400> 12

Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Phe Leu Gly Thr Val Val Cys Ser Ile

1 5 10 15

Ser Ala Pro Thr Ser Ser Pro Ser Ser Val Thr Arg Pro Trp Gln His

20 25 30

Val Asp Ala Ile Lys Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn Asn Ser Ser Glu

35 40 45

Ile Thr Ala Val Met Asn Glu Ala Val Glu Val Val Ser Glu Met Phe

50 55 60

Asp Pro Glu Glu Pro Lys Cys Met Gln Thr His Leu Lys Leu Tyr Glu

65 70 75 80

Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Ile Ser Leu Lys Glu Pro Leu Arg Met

85 90 95

Met Ala Asn His Tyr Lys Gln His Cys Pro Leu Thr Pro Glu Thr Pro

100 105 110

Cys Glu Thr Gln Thr Ile Thr Phe Lys Asn Phe Lys Glu Asn Leu Lys

115 120 125

Asp Phe Leu Phe Asn Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Asp Gln Lys

130 135 140

<210> 13

<211> 1033

<212> DNA

<213> 鼠(Mus musculus)

<400> 13

ggtcagactg cccaggcagg gtgggaaagg cctttaaagc agcccgcagg tgggctgcca 60

gttcttggaa gggcttatta atgaaaaccc cccaagcctg acaacctggg ggaaggctca 120

ctggccccat gtatagctga taagggccag gagattccac aactcaggta gttcccccgc 180

ccccctggag ttctgtggtc accattaatc atttcctcta actgtgtata taagagctct 240

tttgcagtga gcccagtact cagagagaaa ggctaaggtc ctgaggagga tgtggctgca 300

gaatttactt ttcctgggca ttgtggtcta cagcctctca gcacccaccc gctcacccat 360

cactgtcacc cggccttgga agcatgtaga ggccatcaaa gaagccctga acctcctgga 420

tgacatgcct gtcacgttga atgaagaggt agaagtcgtc tctaacgagt tctccttcaa 480

gaagctaaca tgtgtgcaga cccgcctgaa gatattcgag cagggtctac ggggcaattt 540

caccaaactc aagggcgcct tgaacatgac agccagctac taccagacat actgcccccc 600

aactccggaa acggactgtg aaacacaagt taccacctat gcggatttca tagacagcct 660

taaaaccttt ctgactgata tcccctttga atgcaaaaaa ccaggccaaa aatgaggaag 720

cccaggccag ctctgaatcc agcttctcag actgctgctt ttgtgcctgc gtaatgagcc 780

aggaacttgg aatttctgcc ttaaagggac caagagatgt ggcacagcca cagttggaag 840

gcagtatagc cctctgaaaa cgctgactca gcttggacag cggaagacaa acgagagata 900

ttttctactg atagggacca ttatatttat ttatatattt atatttttta aatatttatt 960

tatttattta tttatttttg caactctatt tattgagaat gtcttaccag aataataaat 1020

tattaaaact ttt 1033

<210> 14

<211> 141

<212> PRT

<213> 鼠(Mus musculus)

<400> 14

Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Phe Leu Gly Ile Val Val Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg Pro Trp Lys His

20 25 30

Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp Asp Met Pro Val

35 40 45

Thr Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val Ser Asn Glu Phe Ser Phe Lys

50 55 60

Lys Leu Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Lys Ile Phe Glu Gln Gly Leu

65 70 75 80

Arg Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn Met Thr Ala Ser

85 90 95

Tyr Tyr Gln Thr Tyr Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Asp Cys Glu Thr

100 105 110

Gln Val Thr Thr Tyr Ala Asp Phe Ile Asp Ser Leu Lys Thr Phe Leu

115 120 125

Thr Asp Ile Pro Phe Glu Cys Lys Lys Pro Gly Gln Lys

130 135 140

<210> 15

<211> 495

<212> DNA

<213> 绵羊(Ovis aries)

<400> 15

agtcctcaag aggatgtggc tgcagaacct gcttctcctg ggcactgtgg tctgcagctt 60

ctccgcaccc actcgccaac ccagccctgt cacccggccc tggcagcatg tggatgccat 120

caaggaggcc ctgagccttc tgaacgacag cactgacact gctgctgtga tggatgaaac 180

agtagaagtc gtctctgaaa tgtttgactc ccaggagccg acatgcctgc agactcgcct 240

ggagctgtac aagcagggcc tgcggggcag cctcaccagt ctcacgggct ccttgaccat 300

gatggccagc cactacaaga aacactgccc ccccacccag gaaacttcct gtgaaaccca 360

gattatcacc ttcaaaagtt tcaaagagaa cctgaaggat ttccttttta tcattccctt 420

tgactgctgg gaaccagtcc agaagtgaag caggccagac cagccagaag ccagcccaga 480

agcttacctc acaga 495

<210> 16

<211> 144

<212> PRT

<213> 绵羊(Ovis aries)

<400> 16

Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Val Cys Ser Phe

1 5 10 15

Ser Ala Pro Thr Arg Gln Pro Ser Pro Val Thr Arg Pro Trp Gln His

20 25 30

Val Asp Ala Ile Lys Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn Asp Ser Thr Asp

35 40 45

Thr Ala Ala Val Met Asp Glu Thr Val Glu Val Val Ser Glu Met Phe

50 55 60

Asp Ser Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys

65 70 75 80

Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Ser Leu Thr Gly Ser Leu Thr Met

85 90 95

Met Ala Ser His Tyr Lys Lys His Cys Pro Pro Thr Gln Glu Thr Ser

100 105 110

Cys Glu Thr Gln Ile Ile Thr Phe Lys Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys

115 120 125

Asp Phe Leu Phe Ile Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Lys

130 135 140

Claims (100)

1.一种卵母细胞体外成熟培养基，所述培养基包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

2.根据权利要求1所述的卵母细胞体外成熟培养基，其中所述GM-CSF提高了所述培养基中培养的卵母细胞的成熟。

3.根据权利要求1或2所述的卵母细胞体外成熟培养基，其中所述GM-CSF提高了所述培养基中培养的卵母细胞的发育能力。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的卵母细胞体外成熟培养基，其中源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚胎具有提高的胚泡内细胞团数、提高的胚泡率、提高的滋养外胚层细胞数、提高的胚泡总细胞数和提高的生存力中的一个或多个。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的卵母细胞体外成熟培养基，其中源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚泡具有减少的DNA损伤。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的卵母细胞体外成熟培养基，其中在将源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚胎移植至代孕者后，提高了在代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的卵母细胞体外成熟培养基，其中所述卵母细胞选自人卵母细胞、牛卵母细胞、猪卵母细胞、马卵母细胞、犬卵母细胞、猫卵母细胞、鼠卵母细胞、羊卵母细胞和非人灵长类动物卵母细胞。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的卵母细胞体外成熟培养基，其中所述卵母细胞来自老年和/或肥胖受试者。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的卵母细胞体外成熟培养基，其中所述GM-CSF是物种特异性的。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的卵母细胞体外成熟培养基，其中所述培养基中存在的GM-CSF的量为约0.1ng/ml至约100ng/ml。

11.一种用于提高卵母细胞的体外成熟的培养基，所述培养基包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

12.根据权利要求11的培养基，其中所述GM-CSF提高了所述卵母细胞的发育能力。

13.根据权利要求11或权利要求12的培养基，其中源自所述卵母细胞的胚胎具有提高的胚泡内细胞团数、提高的胚泡率、提高的滋养外胚层细胞数、提高的胚泡总细胞数和提高的生存力中的一个或多个。

14.根据权利要求11-13中任一项所述的培养基，其中源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚泡具有减少的DNA损伤。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的培养基，其中在将源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚胎移植至代孕者后，提高了在所述代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

16.根据权利要求11-15中任一项所述的培养基，其中所述卵母细胞选自人卵母细胞、牛卵母细胞、猪卵母细胞、马卵母细胞、犬卵母细胞、猫卵母细胞、鼠卵母细胞、羊卵母细胞。

17.根据权利要求11-16中任一项所述的培养基，其中所述卵母细胞来自老年和/或肥胖受试者。

18.根据权利要求11-17中任一项所述的培养基，其中所述GM-CSF是物种特异性的。

19.根据权利要求11-18中任一项所述的培养基，其中所述培养基中存在的GM-CSF的量为约0.1ng/ml至约100ng/ml。

20.一种体外培养基，当用于提高卵母细胞的成熟时，所述培养基包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

21.根据权利要求20的体外培养基，其中所述GM-CSF提高卵母细胞的发育能力。

22.根据权利要求20或权利要求21所述的体外培养基，其中源自所述卵母细胞的胚胎具有提高的胚泡内细胞团数、提高的胚泡率、提高的滋养外胚层细胞数、提高的胚泡总细胞数和提高的生存力中的一个或多个。

23.根据权利要求20-22中任一项所述的体外培养基，其中源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚泡具有减少的DNA损伤。

24.根据权利要求20至23中任一项所述的体外培养基，其中在将源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚胎移植至代孕者后，提高了在所述代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

25.根据权利要求20-24中任一项所述的体外培养基，其中所述卵母细胞选自人卵母细胞、牛卵母细胞、猪卵母细胞、马卵母细胞、犬卵母细胞、猫卵母细胞、鼠卵母细胞、羊卵母细胞和非人灵长类动物卵母细胞。

26.根据权利要求20-25中任一项所述的体外培养成熟培养基，其中所述卵母细胞来自老年和/或肥胖受试者。

27.根据权利要求20-26中任一项所述的体外培养基，其中所述GM-CSF是物种特异性的。

28.根据权利要求20-27中任一项所述的体外培养基，其中所述培养基中存在的GM-CSF的量为约0.1ng/ml至约100ng/ml。

29.一种卵母细胞体外成熟的方法，所述方法包括在权利要求1至28中任一项所述的培养基中培养所述卵母细胞。

30.一种通过权利要求29的方法成熟的卵母细胞。

31.一种由权利要求30的卵母细胞产生的胚胎或非人动物。

32.一种提高卵母细胞体外成熟的方法，所述方法包括在包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的培养基中培养所述卵母细胞。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述GM-CSF提高了所述卵母细胞的发育能力。

34.根据权利要求32或权利要求33所述的方法，其中源自所述卵母细胞的胚胎具有提高的胚泡内细胞团数、提高的胚泡率、提高的滋养外胚层细胞数、提高的胚泡总细胞数和提高的生存力中的一个或多个。

35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚泡具有减少的DNA损伤。

36.根据权利要求32至35中任一项所述的方法，其中在将源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚胎移植至代孕者后，提高了在所述代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

37.根据权利要求32至36中任一项所述的方法，其中所述方法用作辅助生殖技术的一部分。

38.根据权利要求32-37中任一项所述的方法，其中所述卵母细胞选自人卵母细胞、牛卵母细胞、猪卵母细胞、马卵母细胞、犬卵母细胞、猫卵母细胞、鼠卵母细胞、羊卵母细胞和非人灵长类动物卵母细胞。

39.根据权利要求32至38中任一项所述的方法，其中所述卵母细胞来自老年和/或肥胖受试者。

40.根据权利要求32至39中任一项所述的方法，其中所述GM-CSF是物种特异性的。

41.根据权利要求32-40中任一项所述的方法，其中所述培养基中存在的GM-CSF的量为约0.1ng/ml至约100ng/ml。

42.一种提高卵母细胞的体外发育能力的方法，所述方法包括在包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的培养基中培养所述卵母细胞。

43.根据权利要求42所述的方法，其中源自所述卵母细胞的胚胎具有提高的胚泡内细胞团数、提高的胚泡率、提高的滋养外胚层细胞数、提高的胚泡总细胞数和提高的生存力中的一个或多个。

44.根据权利要求42或43的方法，其中源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚泡具有减少的DNA损伤。

45.根据权利要求42至44中任一项所述的方法，其中在将源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚胎移植至代孕者后，提高了在所述代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

46.根据权利要求42至45中任一项所述的方法，其中所述方法用作辅助生殖技术的一部分。

47.根据权利要求42-46中任一项所述的方法，其中所述卵母细胞选自人卵母细胞、牛卵母细胞、猪卵母细胞、马卵母细胞、犬卵母细胞、猫卵母细胞、鼠卵母细胞、羊卵母细胞和非人灵长类动物卵母细胞。

48.根据权利要求42-47中任一项所述的方法，其中所述卵母细胞来自老年和/或肥胖受试者。

49.根据权利要求42-48中任一项所述的方法，其中所述GM-CSF是物种特异性的。

50.根据权利要求42-49中任一项所述的方法，其中所述培养基中存在的GM-CSF的量为约0.1ng/ml至约100ng/ml。

51.一种通过辅助生殖技术从卵母细胞产生胚胎的方法，所述方法包括：

(a)从受试者的卵巢收集卵母细胞；

(b)在包含GM-CSF的培养基中体外培养所述卵母细胞；和

(c)通过使所述卵母细胞体外受精从所述卵母细胞产生胚胎。

52.根据权利要求51所述的方法，其中在所述胚胎移植至代孕者后，提高了在所述代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

53.根据权利要求51或权利要求52的方法，其中所述卵母细胞从老年和/或肥胖受试者中收集。

54.根据权利要求51-53中任一项所述的方法，其中在使所述卵母细胞受精之前，在包含GM-CSF的培养基中培养用于辅助生殖技术的精子。

55.根据权利要求51-54中任一项所述的方法，其中卵母细胞的受精在包含GM-CSF的培养基中进行。

56.根据权利要求51-55中任一项所述的方法，还包括一旦在包含GM-CSF的培养基中产生所述胚胎就培养的步骤。

57.一种涉及卵母细胞的辅助生殖方法，所述方法包括在包含GM-CSF的培养基中体外培养所述卵母细胞的步骤。

58.根据权利要求57所述的方法，还包括用已经在包含GM-CSF的培养基中培养的精子使所述卵母细胞体外受精的步骤。

59.根据权利要求57或权利要求58所述的方法，还包括在包含GM-CSF的培养基中体外培养源自所述卵母细胞的胚胎的步骤。

60.根据权利要求59所述的方法，其中在所述胚胎移植至代孕者后，提高了在所述代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

61.根据权利要求57-60中任一项所述的方法，其中所述卵母细胞从老年和/或肥胖受试者中收集。

62.一种涉及卵母细胞的辅助生殖方法，所述方法包括通过在包含GM-CSF的培养基中体外培养卵母细胞使所述卵母细胞体外成熟的步骤。

63.根据权利要求62所述的方法，还包括用已经在包含GM-CSF的培养基中培养的精子使所述卵母细胞体外受精的步骤。

64.根据权利要求62或权利要求63所述的方法，还包括在包含GM-CSF的培养基中体外培养源自所述卵母细胞的胚胎的步骤。

65.根据权利要求64所述的方法，其中在所述胚胎移植至代孕者后，提高了在所述代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

66.根据权利要求62-65中任一项所述的方法，其中所述卵母细胞从老年和/或肥胖受试者中收集。

67.一种粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，用于在培养基中使用或在培养基中使用时，用于提高卵母细胞的体外成熟或用于提高卵母细胞的体外发育能力。

68.根据权利要求67所述的GM-CSF，其中源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚胎具有提高的胚泡内细胞团数、提高的胚泡率、提高的滋养外胚层细胞数、提高的胚泡总细胞数和提高的生存力中的一个或多个。

69.根据权利要求67或权利要求68所述的GM-CSF，其中源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚泡具有减少的DNA损伤。

70.根据权利要求67至69中任一项所述的GM-CSF，其中所述GM-CSF在培养基中用作辅助生殖技术的一部分。

71.根据权利要求70所述的GM-CSF，其中在将源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚胎移植至代孕者后，提高了在所述代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

72.根据权利要求67-71中任一项所述的GM-CSF，其中所述卵母细胞选自人卵母细胞、牛卵母细胞、猪卵母细胞、马卵母细胞、犬卵母细胞、猫卵母细胞、鼠卵母细胞、羊卵母细胞和非人灵长类动物卵母细胞。

73.根据权利要求67至72中任一项所述的GM-CSF，其中所述卵母细胞来自老年和/或肥胖受试者。

74.根据权利要求67至73中任一项所述的GM-CSF，其中所述GM-CSF是物种特异性的。

75.根据权利要求67至74中任一项所述的GM-CSF，其中所述培养基中存在的GM-CSF的量为约0.1ng/ml至约100ng/ml。

76.一种粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在制备培养基中的用途，所述培养基用于提高卵母细胞的体外成熟或用于提高卵母细胞的体外发育能力。

77.根据权利要求76所述的用途，其中源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚胎具有提高的胚泡内细胞团数、提高的胚泡率、提高的滋养外胚层细胞数、提高的胚泡总细胞数和提高的生存力中的一个或多个。

78.根据权利要求76或权利要求77所述的用途，其中源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚泡具有减少的DNA损伤。

79.根据权利要求76至78中任一项所述的用途，其中所述培养基用作辅助生殖技术的一部分。

80.根据权利要求79所述的用途，其中在将源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚胎移植至代孕者后，提高了在所述代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

81.根据权利要求76至80中任一项所述的用途，其中所述卵母细胞选自人卵母细胞、牛卵母细胞、猪卵母细胞、马卵母细胞、犬卵母细胞、猫卵母细胞、鼠卵母细胞、羊卵母细胞和非人灵长类动物卵母细胞。

82.根据权利要求76至81中任一项所述的用途，其中所述卵母细胞来自老年和/或肥胖受试者。

83.根据权利要求76至82中任一项所述的用途，其中GM-CSF是物种特异性的。

84.根据权利要求76-83中任一项所述的用途，其中所述培养基中存在的GM-CSF的量为约0.1ng/ml至约100ng/ml。

85.一种组合产品，用于或当使用时用于提高卵母细胞的体外成熟或提高卵母细胞的体外发育能力，所述组合产品包含：

(i)培养基；

(ii)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；并且可选地

(iii)用于在包含所述GM-CSF的所述培养基中培养卵母细胞的说明书。

86.根据权利要求85所述的组合产品，其中源自包含GM-CSF的所述培养基中培养的卵母细胞的胚胎具有提高的胚泡内细胞团数、提高的胚泡率、提高的滋养外胚层细胞数、提高的胚泡总细胞数和提高的生存力中的一个或多个。

87.根据权利要求85或86所述的组合产品，其中源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚泡具有减少的DNA损伤。

88.根据权利要求85-87中任一项所述的组合产品，其中所述组合产品用作辅助生殖技术的一部分。

89.根据权利要求88所述的组合产品，其中在将源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚胎移植至代孕者后，提高了在所述代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

90.根据权利要求85-89中任一项所述的组合产品，其中所述卵母细胞选自人卵母细胞、牛卵母细胞、猪卵母细胞、马卵母细胞、犬卵母细胞、猫卵母细胞、鼠卵母细胞、羊卵母细胞和非人灵长类动物卵母细胞。

91.根据权利要求85至90中任一项所述的组合产品，其中所述卵母细胞来自老年和/或肥胖受试者。

92.根据权利要求85至91中任一项所述的组合产品，其中所述GM-CSF是物种特异性的。

93.一种组合产品，用于或当使用时用于提高卵母细胞的体外成熟或提高卵母细胞的体外发育能力，所述组合产品包含：

(i)包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的培养基；和

(ii)用于在所述培养基中培养卵母细胞的说明书。

94.根据权利要求93所述的组合产品，其中源自包含GM-CSF的所述培养基中培养的卵母细胞的胚胎具有提高的胚泡内细胞团数、提高的胚泡率、提高的滋养外胚层细胞数、提高的胚泡总细胞数和提高的生存力中的一个或多个。

95.根据权利要求93或权利要求94所述的组合产品，其中源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚泡具有减少的DNA损伤。

96.根据权利要求69或权利要求70所述的组合产品，其中所述组合产品用作辅助生殖技术的一部分。

97.根据权利要求96所述的组合产品，其中在将源自所述培养基中培养的卵母细胞的胚胎移植至代孕者后，提高了在所述代孕者体内的着床、妊娠率和发育至足月中的一个或多个。

98.根据权利要求93-97中任一项所述的组合产品，其中所述卵母细胞选自人卵母细胞、牛卵母细胞、猪卵母细胞、马卵母细胞、犬卵母细胞、猫卵母细胞、鼠卵母细胞、羊卵母细胞和非人灵长类动物卵母细胞。

99.根据权利要求93至98中任一项所述的组合产品，其中所述卵母细胞来自老年和/或肥胖受试者。

100.根据权利要求93至99中任一项所述的组合产品，其中所述GM-CSF是物种特异性的。