JPH08289779A - 無血清培地及び体外受精卵の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 受精卵の体外培養に好適に使用される無血清
培地及び体外受精卵の生産方法を目的とする。 【構成】 本発明の無血清培地は、乳酸類、ピルビン酸
類、塩基性線維芽細胞成長因子及び腫瘍成長因子−β１
を含有する低グルコース濃度ＴＣＭ１９９培地からな
り、本発明の体外受精卵の生産方法は、上記の無血清培
地を用いた受精卵の生産方法である。本発明の無血清培
地は、受精卵の発生率が高く、また血清成分を含有して
いないので安定した培養成績が得られる。また、本発明
の生産方法によれば、受精卵移植に用いられる胚盤胞期
胚を受精卵から高率で発生させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、無血清培地及び体外受
精卵の生産方法に関する。より詳細には、受精卵の体外
培養に好適に使用される無血清培地、ウシから採取され
た卵子の体外成熟、体外受精、体外受精卵培養システム
に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、優良種家畜の大量生産、人為
的操作を加えた受精卵からの産仔を目的として、受精卵
（胚）移植法が利用されている。受精卵移植法として
は、体内受精卵移植、即ち、ドナー（受精卵の供給動
物）から受精卵を採取し、その受精卵を同期化処置（受
精卵を子宮に着床させる目的で、レシピエントをホルモ
ンなどで処理し、擬妊娠状態にする処置）をしたレシピ
エント（受精卵の受容動物）に移植して妊娠させ、産仔
を得ることが行われている。このような体内受精卵移植
方法は、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジなどの動物（家畜）
では技術的に確立されており、一般に、ドナーにＦＳＨ
（卵胞刺激ホルモン）などのホルモン剤の投与を行って
過排卵を誘起した後、交配又は人工授精により受精させ
る。次いで、受精卵を採取した後、受精した正常分割卵
であることの確認を行い、必要に応じて所定期間の体外
培養を行った後、黄体ホルモンなどの投与により同期化
処置を施したレシピエントの子宮（又は卵管）に移植
し、レシピエントを妊娠・分娩させて仔を産生すること
が行われている。

【０００３】このような体内受精卵移植法においては、
受精卵を低コストで且つ安定的に供給することが困難で
あるため、体外受精卵移植法が研究されている。即ち、
体外受精卵移植法（一般に、屠殺された雌家畜から卵子
を採取し、体外成熟、体外受精、受精卵の発生を行った
後にレシピエント家畜に移植する方法）によれば、体内
受精卵のコスト高要因であるドナー家畜の導入、飼育、
過排卵処理等の操作を行う必要がないので、低コストで
受精卵を生産することができる。また、体外受精卵の生
産では、屠殺された家畜から卵子を採取するので、肉質
等の特性が判明した家畜の卵子を利用することができる
利点がある。更に、体外受精卵生産技術は、核移植、受
精卵の性判別、遺伝子導入等の新しい家畜バイオテクノ
ロジーの基幹技術であり、また発生学や家畜繁殖学の基
礎研究の重要な手段であることからも、当該技術の確立
が要望されている。しかし、体外受精卵の生産には卵子
の体外成熟、体外受精及び受精卵（胚）の体外培養技術
が不可欠であるが、卵子の体外成熟、体外受精、受精卵
の発生は複雑で効率が悪いという問題があり、また体外
受精卵移植による受胎率は、体内受精卵移植に比べて低
いことが知られている。上記の卵子の体外成熟及び受精
卵の体外培養には、通常、血清培地が用いられている
が、血清培地は使用する血清のロットにより成分が異な
るので、培地組成が変動し、安定的な体外成熟及び受精
卵培養を行うことが困難である。また、受精卵の培養に
は、発生効率を高めるために、体細胞と受精卵との共培
養が広く行われているが、受精卵を培養するたびに体細
胞を準備しなければならず、操作が煩雑になる問題があ
る。このような問題から、血清成分を含まない培地（無
血清培地）を用いた体外成熟及び受精卵培養並びに体細
胞を用いない受精卵培養が種々研究されている。この分
野における最近の研究成果の概要を以下に示す。

【０００４】これまで哺乳類の卵子の成熟に必要と考え
られている卵丘膨潤には、ゴナドトロピンが深く関与し
ていることが知られている(Linderら, Recent Prog. in
Hormone Res., 30, 79-138, 1974; Eppig, Biol. Repr
od., 23, 545-552, 1980; EppigとDowns, Biol. Repro
d., 30, 1-11, 1984)。一方、卵胞を構成する体細胞か
ら種々の細胞成長因子が合成・分泌され、これらの因子
が卵胞液中に発見されている。そして、細胞成長因子が
卵子の成熟に重要な役割を果たしていると考えられるよ
うになってきた。Dekelと Sherizly (Endocrinology.,
116, 406-409, 1985)は、上皮成長因子(EGF)が卵胞由来
細胞の存在下で培養ラット卵子の成熟を促進することを
報告している。同様に、卵丘細胞付着のマウス卵子にEG
Fを処理すると、卵子成熟の指標である卵核胞崩壊(germ
inal vesicle breakdown)が誘導されることが報告され
ている(Downsら, J. Exp. Zool., 245, 86-96, 1988; D
owns, Biol. Reprod., 41, 371-379, 1989)。また、EGF
と物質構造や生物学的機能の類似している腫瘍成長因子
-α(TGF-α)に卵丘細胞付着したマウス卵子の成熟促進
活性を見い出した(Bruckerら, Mol. Reprod. Dev., 28,
94-98, 1991)。最近、本研究において、EGFやTGF-αを
成分既知の基礎培地に添加しただけで、著しいウシ卵丘
膨潤と卵子の体外成熟が誘導されることがわかった(Kob
ayashiら, J. Reprod. Fertil.,100, 439-446, 1994)。
結果として、この細胞成長因子添加成分既知無血清培地
で体外成熟した卵子の体外受精率は有意に高く、通常体
外成熟用培地として用いられている血清培地に比べても
遜色のないことがわかった。

【０００５】ウシ受精卵を体外培養すると、８細胞期か
ら16細胞期で発生が停止することが一般的に知られてい
る(WrightとBondioli, J. Anim. Sci., 53, 702-729, 1
981)。この受精卵の発生阻害を克服するためにいくつか
の工夫がなされてきた。ひとつは、受精卵と体細胞を共
培養する方法である。ウシ受精卵と卵管上皮細胞(Eyest
oneとFirst, J. Reprod.Fertil.,85, 715-720, 1989)、
卵丘／顆粒膜細胞（FukuiとOno, J. Reprod. Fertil.,
86, 501-506, 1989; Kobayashiら, In Vitro Cell. De
v. Biol., 28A, 255-259, 1992)、子宮由来細胞(Voekle
ら, Theriogenology., 24, 271-281, 1985)など種々の
体細胞との共培養により、受精卵（胚）の発生効率が増
加することがわかった。しかし、この方法では、胚を培
養する毎に体細胞を培養し準備しなければならず、大変
煩雑であるとの問題がある。

【０００６】また、通常、受精卵の培養は５％炭酸ガス
／95％空気（酸素分圧は約20％）／加湿状態にある培養
用インキュベータで行なわれるが、培養酸素濃度を５〜
10％程度に減少させると発生率が上昇することが報告さ
れている（Tervitら, J. Reprod. Fertil., 30, 493-49
7, 1972; Thompsonら, J. Reprod. Fertil., 89,573-57
8,1990)。低酸素培養による効果としては、５〜10％酸
素分圧は生体内の酸素分圧とほぼ同程度であること、高
酸素状態では酸化作用が活発に起こり、生成されたラジ
カルにより受精卵が損傷を受けることが一因と考えられ
ている。

【０００７】更に、本来、細胞のエネルギー代謝にはグ
ルコースが用いられる。それ故に市販されている動物細
胞培養用基礎培地には通常グルコースが添加されている
が、体外受精後８細胞期までの初期発生では、グルコー
スが発生阻害の原因となっていることが、マウス（Chat
otら, J.Reprod. Fertil., 86, 679-688, 1989)、ハム
スター(SheshagiriとBavister, Biol. Reprod., 40, 59
9-606, 1989)、ウシ(PinyopummintrとBavister, Biol.
Reprod., 45, 736-742, 1991)などについて報告されて
いる。他方、８細胞期から胚盤胞期にかけては、逆に受
精卵の発生にグルコースを有効に利用できることが、マ
ウス（Brinster, J.Anim. Sci., 27, (suppl. 1) : 1-1
4, 1968)、ウシ(Riegerら, J. Reprod. Fertil., 95, 5
85-595,1992)、ヒツジ(Thompsonら, Mol. Reprod. De
v., 31, 253-257, 1992)などについて報告されている。

【０００８】また、ウシ体外受精卵の生産は、複数の雌
牛卵巣より採取した卵子をプールして体外成熟培養、体
外受精、体外受精卵培養による方法がほとんどである。
この理由として、各個体の卵巣から回収できる卵子の数
が大きく変動すること、通常の培養方法では、１ドロッ
プあたりの培養される卵子の数の違いにより、受精卵の
生産効率が著しく変化することが知られている。これま
でに個体別雌牛卵巣から回収した卵子を分別して、体外
成熟、体外受精、体外受精卵の作出する試みとして、Me
rmillodら(J. Reprod. Fertil. 96, 717-723, 1992)の
報告がわずかにあるだけである。そして、血清培地によ
って培養されたウシ卵管上皮細胞の培養上清をウシ体外
受精卵の発生培養に用いることにより、個体毎に選別さ
れた卵子から得られた体外受精卵と複数の雌牛卵子をプ
ールして得られた体外受精卵の胚盤胞期胚への発生率
は、ほぼ同等であると報告してある。しかし、この方法
では、胚盤胞期胚の発生率がどちらも低く、１頭あたり
供卵牛から得られる胚盤胞期胚の数は1.3個という数字
であった。そのため、個体別卵巣から採取した卵子を分
離培養して、効率的に体外受精卵を生産することが困難
である。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】前述のように、受精卵
培養における至適な酸素濃度の選定や培地中にグルコー
スを添加するか否かは、受精卵だけを独自に培養するの
か、体細胞との共存下（共培養）で行うのかによって大
きく変化するものと考えられる。ごく最近、本発明者等
は、体細胞の共培養を必要としない系でウシ受精卵の無
血清培養を行った(K. Kobayashiら, In Vitro Cell De
v. Biol., 30A, 556-558,1994)。培養中の酸素分圧を５
％に減少させ、市販のTCM199培地（一般的にウシ受精卵
培養の基礎培地として使用されている）のグルコース濃
度を5.6mM(1mg/ml)から2.2mM(0.4mg/ml)に60％減少さ
せ、かわりにエネルギー源として乳酸ナトリウム（4.13
mM)、ピルビン酸ナトリウム(0.27mM)を添加した成分既
知無血清培地による胚盤胞期胚の発生率は、グルコース
濃度が5.6mMでは8.6％に対して、2.2mMグルコースでは2
3.7％と非常に高い値が得られた。この結果より、低酸
素培養と培地中のグルコース濃度を減少させることによ
り、これまでウシ受精卵培養に一般的に用いられている
体細胞との共培養、また血清培地を必要としない無血清
培養法が確立された。従来の体細胞との共培養による胚
発生効率の改善は、体細胞による基礎培地に含まれる高
濃度のグルコースを消費し、一部乳酸やピルビン酸に変
換すること、また酸素消費により受精卵に対する至適な
酸素分圧に低下させていたことがひとつの要因と考えら
れる。

【００１０】このように、低グルコースTCM199培地に乳
酸ナトリウム及びピルビン酸ナトリウムを添加した無血
清培地による受精卵の体外培養が可能になったが、本発
明者等は、この培地について更に検討を重ねた結果、当
該培地に成長因子を添加すると、受精卵の胚盤胞期胚へ
の発生率を高めることができ、発生率のバラツキが少な
く且つ安定性が高いことを見出した。更に、本発明者等
は、上記の無血清培地を用いると、個体別卵巣から採取
された卵子より作出される体外受精卵の生産効率が、従
来の血清培地を用いた場合よりはるかに優れていること
を見出した。本発明は係る知見に基づいてなされたもの
で、本発明は、体外受精卵の培養に好適に使用される無
血清培地及び無血清培地を使用した体外受精卵の生産方
法を提供することを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明は、 乳酸又はその可溶性塩、ピルビン酸又はその可溶性
塩、塩基性線維芽細胞成長因子（以下、ｂＦＧＦとい
う）及び腫瘍成長因子−β１（以下、ＴＧＦ−β１とい
う）を含有する低グルコース濃度ＴＣＭ１９９培地から
なる無血清培地； ウシ受精卵の体外培養用培地である上記記載の無血
清培地； ウシから卵子を採取し、体外成熟した後、体外受精さ
せ、当該受精卵を上記記載の無血清培地中で体外培養
することからなるウシ体外受精卵の生産方法；である。

【００１２】以下、本発明をより詳細に説明する。本発
明の無血清培地で使用される低グルコース濃度ＴＣＭ１
９９培地は、従来から用いられているＴＣＭ１９９培地
のグルコース濃度を低減した培地を意味する。ＴＣＭ１
９９培地は、一般にウシ受精卵培養の基礎培地として広
く使用されており、日本においては極東製薬（株）など
から販売されている。ＴＣＭ１９９培地はグルコース濃
度が５．６ｍＭ（１ｍｇ／ｍｌ）であるが、本発明で使
用される低グルコース濃度ＴＣＭ１９９培地において
は、グルコース濃度を０．５６ｍＭ（０．１ｍｇ／ｍ
ｌ）〜３．４ｍＭ（０．６ｍｇ／ｍｌ）程度、好ましく
は１．１２ｍＭ（０．２ｍｇ／ｍｌ）〜２．８ｍＭ
（０．５ｍｇ／ｍｌ）程度、より好ましくは１．６８ｍ
Ｍ（０．３ｍｇ／ｍｌ）〜２．２ｍＭ（０．４ｍｇ／ｍ
ｌ）程度に調整した培地が用いられる。かかる低グルコ
ース濃度ＴＣＭ１９９培地は、ＴＣＭ１９９培地を調製
する際にグルコース濃度を調整することにより得ること
ができる。

【００１３】本発明の無血清培地においては、添加成分
として、乳酸又はその可溶性塩、ピルビン酸又はその可
溶性塩、ｂＦＧＦ及びＴＧＦ−β１を含有する。上記の
乳酸は、細胞培養の添加剤として使用できる程度に精製
されたものであれば何れのものも使用することができ
る。乳酸の可溶性塩としては、例えば、ナトリウム塩、
カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウ
ム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモ
ニウム塩などが例示される。乳酸とその可溶性塩を併用
してもよい。本発明の培地における乳酸及び／又はその
可溶性塩の含量は特に限定されないが、通常、２〜６ｍ
Ｍ程度、好ましくは３〜５ｍＭ程度、より好ましくは４
ｍＭ程度に調整される。

【００１４】ピルビン酸としては、細胞培養の添加剤と
して使用できる程度に精製されたものであれば何れのも
のも使用することができる。ピルビン酸の可溶性塩とし
ては、上記の乳酸の可溶性塩として例示されたような塩
が挙げられる。ピルビン酸とその可溶性塩とを併用して
もよい。本発明の培地におけるピルビン酸及び／又はそ
の可溶性塩の含量は特に限定されないが、通常、０．１
〜０．５ｍＭ程度、好ましくは０．１５〜０．３５ｍＭ
程度、より好ましくは０．２〜０．３ｍＭ程度に調整さ
れる。

【００１５】ｂＦＧＦは公知の成長因子であり、基本的
にはアミノ酸１４６個からなる分子量１６ｋＤａの蛋白
質性成長因子である（書籍「細胞成長因子partI及びII、
日本組織培養学会編、朝倉書店発行」参照）。なお、ｂ
ＦＧＦには末端のアミノ酸が欠落したものなどが知られ
ているが、ｂＦＧＦと同様な作用を示すものであれば、
全て本発明のｂＦＧＦに包含され、それを使用すること
ができる。ｂＦＧＦは、動物（例えば、ヒト、ウシ、マ
ウス、ラット等）の組織・器官（例えば、脳下垂体、
脳、網膜、黄体、副腎、胎盤、前立腺等）から慣用の蛋
白質精製法に準じて精製することにより得ることができ
る。本発明においては、上記の方法で精製されたｂＦＧ
Ｆを使用してもよく、また遺伝子工学的方法で得られた
ものを使用してもよく、更に既に市販されているものを
使用してもよい。本発明の培地におけるｂＦＧＦの含量
は特に限定されないが、通常、１〜３０ｎｇ／ｍｌ程
度、好ましくは５〜２０ｎｇ／ｍｌ程度、より好ましく
は８〜１５ｎｇ／ｍｌ程度に調整される。

【００１６】ＴＧＦ−β１も公知の成長因子であり、一
般的に１１〜１２．５ｋＤａのポリペプチドがＳ−Ｓ結
合して２３〜２５ｋＤａのホモダイマーを形成している
蛋白質性成長因子である（前掲の書籍参照）。なお、Ｔ
ＧＦ−β１には分子量の異なる前駆体ポリペプチドなど
が知られているが、ＴＧＦ−β１と同様な作用を有する
ものであれば、全て本発明のＴＧＦ−β１に包含され、
またそれを使用することができる。ＴＧＦ−β１は、動
物（例えば、ヒト、ウシ、ラット等）の組織・器官（例
えば、胎盤、腎臓、血小板等）から慣用の蛋白質精製法
に準じて精製することにより得ることができる。本発明
においては、上記の方法で精製されたＴＧＦ−β１を使
用してもよく、また遺伝子工学的方法で得られたものを
使用してもよく、更に既に市販されているものを使用し
てもよい。本発明の培地におけるＴＧＦ−β１の含量は
特に限定されないが、０．１〜３ｎｇ／ｍｌ程度、好ま
しくは０．５〜２ｎｇ／ｍｌ程度、より好ましくは０．
８〜１．５ｎｇ／ｍｌ程度に調整される。

【００１７】本発明の無血清培地は上記の成分より構成
されるが、必要に応じて慣用の添加剤を添加してもよ
く、係る添加剤としては、例えば、ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）などが例示される。本発明の無血清培地は、
動物の受精卵、特にウシの受精卵の体外培養に好適に使
用される。本発明の培地においては、血清を含有してい
ないので、ロット間の成分のバラツキが少なく、安定し
た培養成績が得られる。また、体細胞の共培養を必要と
することなく、受精卵の体外培養を行うことができるの
で、操作の著しい簡便化を図ることができる。

【００１８】本発明のウシ体外受精卵の生産方法は、ウ
シから卵子を採取し、体外成熟、体外受精を行った後、
得られた受精卵を請求項１記載の無血清培地中で体外培
養することからなる。上記のウシ卵子の採取は、通常、
屠殺されたウシの卵巣から行われる。卵子の体外成熟は
無血清培地中で行われ、卵子成熟に使用される無血清培
地としては、TCM199培地に腫瘍成長因子−α(TGF-α, 1
0ng/ml程度)、インシュリン(5μg/ml程度)及びBSA(1mg/
ml程度)を添加した培地等が好適に利用されるが、この
培地に限定されるものではなく、適当な基礎培地にＥＧ
Ｆ、ＴＧＦ−α等の成長因子、インシュリン、ＢＳＡな
どを添加した培地も使用できる。体外成熟は、採取した
卵子を、一般に、5%炭酸ガス/95%空気、飽和湿度の条件
で20-22時間程度培養することにより行われる。

【００１９】卵子の体外受精は常法に準じて行うことが
でき、例えば、精子を適当な希釈液にて希釈し、精子数
の計測及び精子濃度の調整を行った後、カフェイン、ヘ
パリン、脂肪酸フリーBSAなどを含む希釈液に加えて精
子浮遊液を調製する。次いで、この浮遊液に卵子を加
え、38.5℃、5%炭酸ガス/95%空気、飽和湿度の条件で6
時間程度培養することにより行われる。

【００２０】かくして得られた受精卵の体外培養は、本
発明の無血清培地を用いて行われる。培養は、通常、本
発明の無血清培地中、38.5℃程度の温度で、5%酸素/5%
炭酸ガス/90%窒素、飽和湿度の低酸素培養条件で7-8日
程度培養することにより行われる。低酸素培養条件下に
培養を行うことにより、受精卵の損傷を抑制することが
できる。なお、培養中、必要に応じて培地交換を行って
もよいが、通常、培地交換を行うことなく培養すること
ができる。この培養により、受精卵は胚盤胞期胚に発生
し、受精卵移植に用いられる。なお、受精卵は、必要に
応じて人為的処置を受けた受精卵を培養してもよく、人
為的処置としては、例えば、遺伝子導入、核移植、受精
卵分割、キメラ体を得るためのＥＳ細胞の導入等の処置
が例示され、これらの処置により改良種家畜、クローン
家畜、一卵性双仔、キメラ家畜などの産生を行うことが
できる。また、受精卵として、凍結保存等の胚保存法に
より保存されたものを用いてもよい。

【００２１】本発明の体外受精卵の生産方法は、上記の
例に限定されるものではなく、適宜変更して実施するこ
とができる。本発明の体外受精卵の生産方法は、従来の
血清培地を用いた体外受精卵の生産方法より、体外受精
卵の生産効率がはるかに高い。それ故、従来法のように
採取した卵子をプールする必要がなく、個体卵巣から採
取した卵子を分離培養し、効率的に体外受精卵を生産す
ることができることから、将来、血統登録可能な受精卵
の生産を行うことができる。

【００２２】

【実施例】以下、実施例に基づいて、本発明をより詳細
に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではな
い。 実施例１ａ）ウシ卵胞卵子の採取 屠殺後、採取された成牛卵巣は、プラスチックバックに
入れ、30〜35℃の温水でまわりを温めて１〜２時間以内
に実験室に運び実験に用いた。38.5℃に保温しておいた
滅菌済カルシウム、マグネシウム不含リン酸緩衡液(PBS
-)で卵巣をよく洗った後、眼科用ハサミで卵巣を二分割
した。卵巣は、TCM199培地に25mM HEPES、ヘパリン(15
μg/ml)、ピルビン酸ナトリウム(1.25mM)、及び抗生物
質としてゲンタマイシン(10μg/ml)を含む培地の入った
90mmシャーレの中に移した。３枚組み合わた外科用メス
で細切し、卵胞を切開した。卵子を含む液をメッシュで
ろ過し、卵丘／顆粒膜細胞が多層に付着している卵子を
回収し、実験に用いた。卵丘／顆粒膜細胞付着卵子は、
TCM199培地で数回洗った後、１ドロップあたり約30個ず
つ成熟培地に移した。なお、体外成熟培養には、無血清
培地、血清培地ともに60mmシャーレにミネラルオイルで
覆ったそれぞれの培地を１ドロップあたり350μlの培地
量とした。無血清培地による体外成熟では、TCM199培地
にTGF-α(10ng/ml)、インシュリン(5μg/ml)及びBSA(1m
g/ml)を添加したものを用いた。BSAは、調製された液体
培地に含まれるTGF-αやインシュリンが保存容器に吸着
されるのを防止するために添加した。血清培地は、TCM1
99培地にそれぞれロットの異なる牛胎児血清(FCS)を10
％になるように添加した。体外成熟は、5%炭酸ガス／95
%空気、飽和湿度の条件で20〜22時間培養した。

【００２３】ｂ）体外受精 黒毛和種１個体の凍結精液（0.5ml ストロー)を35℃の
温水中で融解し、ヘパリン(15μg/ml)及びカフェイン(5
mM)を含むBO液(BrakettとOliphant, Biol. Reprod., 1
2, 260-274, 1975)を6ml加えて、２回遠心操作を繰り返
し精子を洗浄した。精子をヘパリン、カフェイン添加の
BO液に再懸濁して、血球計算盤で精子を計測し、精子濃
度を1×10⁷/mlに調整した。この精子液50μlをカフェイ
ン(5mM)、脂肪酸フリーの牛血清アルブミン(BSA 10mg/m
l)を含むBO液50μlに加えた。成熟培養を終了した卵子
をカフェイン(5mM)、BSA(10mg/ml)を含むBO液で３回洗
浄後、精子浮遊液に加えた。38.5℃で5%炭酸ガス／95%
空気、飽和湿度の条件で６時間培養することにより受精
させた。受精時の培養では、精子数5×10⁶個/ml、カフ
ェイン(5mM)、ヘパリン(7.5μg/ml)、BSA(5mg/ml)の条
件である。

【００２４】ｃ）体外発生培養 体外受精後の卵子は、TCM199培地にインシュリン(5μg/
ml)を添加した培地の350μlドロップに移した。60mm培
養用シャーレは、あらかじめ100μg/mlのＩ型コラーゲ
ンで前処理したものを用いた。培養条件は、38.5℃、5%
炭酸ガス／95%空気、飽和湿度とした。無血清培地によ
る培養では、24〜30時間後にキャピラリーピペットで卵
丘／顆粒膜細胞を受精卵から除去し、38.5℃、5%酸素／
5%炭酸ガス／90%窒素、飽和湿度の低酸素培養条件で受
精後8日まで培地交換をせずに培養を行い、受精卵
（胚）の発生状況を調べた。無血清培地（本願培地）と
しては、低グルコース濃度199培地(LG199; この培地は
オリジナルのTCM199培地のグルコース濃度5.6mMを60％
減少させ、2.2mMとしたものである)に、乳酸ナトリウム
(4.13mM)、ピルビン酸(0.27mM)、bFGF(10ng/ml)及びTGF
-β1(1ng/ml)を添加した培地を用いた。本願培地の対照
培地として、LG199培地に、乳酸ナトリウム(4.13mM)及
びピルビン酸(0.27mM)を添加したものを用いた。本願培
地及び対照培地には、BSA(1mg/ml)を添加した。血清培
地の培養は、受精後卵丘／顆粒膜細胞の共培養下で38.5
℃、5%炭酸ガス／95%空気、飽和湿度の条件で培養を行
った。血清培地はTCM199培地に10％FCSを添加したもの
を用い、２日毎に半量づつの培地交換を行い、受精後8
日まで胚の発生状況を調べた。

【００２５】実験結果１ 無血清培地（本願培地と対照培地)と血清培地（４種類
のそれぞれロットの異なる血清）について胚の発生率を
比較した。その結果を表１に示す。表１に示されるよう
に、２細胞期胚の発生比率に両者の違いはみられなかっ
た。しかし、さらに発生の進んだ胚盤胞期胚の発生率を
みると、無血清培地である本願培地(39%)及び対照培地
(27%)に対して血清培地（３〜15％）となり、無血清培
地の方が有意に発生率が高いことがわかった。また、血
清培地はロットにより胚盤胞期胚の発生率が著しく異な
ることもわかった。無血清培地に関し、本願培地と対照
培地における胚盤胞への発生率をみると、対照培地の27
％に対して本願培地では39％となり、本願培地の方が発
生率が高いことが明らかとなった。

【００２６】

【表１】

【００２７】実験結果２ 本願培地と対照培地における胚盤胞への発生率のバラツ
キを比較するために、それぞれの培地で上記の実験を４
回行った。その結果を表２に示す。表２に示されるよう
に、本願培地では、胚盤胞期胚への発生率は41.9%〜35.
5%で平均38.7%となり、対照培地では40.0％〜20.7%で平
均27.1%となった。この結果から、対照培地に比べて本
願培地では胚盤胞期胚への発生率が高く、かつ実験毎の
発生率のバラツキが少なく安定していることがわかっ
た。

【００２８】

【表２】

【００２９】実施例２ａ）個体別の雌牛卵巣より採取した卵子の無血清培地に
よる体外受精卵の生産（本願方法） 35頭の雌牛卵巣を個体別に採取し、実験室に持ち帰っ
た。卵巣から卵子の採取は、実施例１のａ）に従った。
体外成熟培養の培地は１ドロップあたり100μlとした。
実際に採取された卵子は、一頭あたり２〜34個であっ
た。無血清培地は、TCM199培地に、インシュリン(5μg/
ml)、TGF-α(10ng/ml)、BSA(1mg/ml)を添加したものを
用いた。BSAは、調製された液体培地に含まれるTGF-α
やインシュリンが保存容器に吸着を防ぐ目的で添加し
た。5%炭酸ガス／95%空気、飽和湿度の条件で20〜22時
間培養を行った。体外受精は、実施例１のｂ）方法によ
り行った。

【００３０】体外発生培養は、まず、コラーゲン前処理
したシャーレに、卵丘／顆粒膜細胞の付着している受精
卵を移し、体外成熟用無血清培地を用いて、24時間培養
を行った。この時、１ドロップの培地量を100μlとし、
38.5℃、5%炭酸ガス／95%空気、飽和湿度の条件とし
た。次に、キャピラリーピペットで卵丘／顆粒膜細胞を
受精卵から除去し、38.5℃、5%酸素／5%炭酸ガス／90%
窒素、飽和湿度の低酸素培養条件で受精後８日まで培地
交換をせずに培養を行い、胚の発生状況を調べた。この
時の無血清培地は、低グルコース濃度のLG199培地に乳
酸ナトリウム(4.13mM)、ピルビン酸(0.27mM)、bFGF(10n
g/ml)、TGF-β1(1ng/ml)及びBSA(1mg/ml)を添加したも
のを用いた。BSAは、調製された液体培地に含まれるbFG
FやTGF-β1が保存容器の吸着を防ぐ目的で添加した。

【００３１】ｂ）個体別の雌牛卵巣より採取した卵子の
血清培地による体外受精卵の生産（比較例） 血清培地によるデータは、Mermillodら(J. Reprod. Fer
til. 96, 717-723, 1992)の結果を引用する。この文献
における手順の概要は以下のとおりである。35頭の雌牛
卵巣より個体別に卵子を採取して、１ドロップあたりの
培地量を100μlとし、１〜20個の卵子を各ドロップに移
した。体外成熟用培地は、TCM199培地にエストラジオー
ル(1μg/ml)、LH（黄体ホルモン、5μg/ml)、FSH(卵胞
刺激ホルモン、0.5μg/ml)、10％FCSを添加したものを
用いて、24時間培養した。体外受精は、50μlのドロッ
プに１〜10個の卵子を個体別に分けて移し、TALP液にヘ
パリン(10μg/ml)を添加し、精子濃度2×10⁶/mlとなる
ように調整し、18時間培養した。体外胚発生培養には、
ウシ卵管上皮細胞の培養上清を用いた。ウシ卵管上皮細
胞は、EyestoneとFirst(J. Reprod. Fertil. 85, 715-7
20,1989)の方法で単離・培養された。TCM199培地に10％
FCSを添加し、４日間卵管上皮細胞を培養し、培地交換
を行い、さらに２日間培養し、培養上清を回収した。受
精卵に付着している卵丘／顆粒膜細胞を除去し、１ドロ
ップに10μlの卵管上皮細胞培養上清を作り、２〜38個
の受精卵を培養し、７日後まで発生状況を調べた。

【００３２】実験結果３ 上記の実験結果を表３に示す。表３に示されるように、
35頭の雌牛卵巣より採取された未成熟卵子の数は、本実
験(494個)と比較例(493個)とほぼ同数で、一頭あたりの
平均卵子数は14.1個であった。個体別の卵子回収数の分
布をみると、本実験（２〜34個)と比較例(0〜38個）は
ほぼ同様の結果であった。受精卵移植に用いられる胚盤
胞期胚の発生率は、無血清培地を用いた本願方法（24.7
%)が、血清培地を用いた比較例(9.5%)に比べて有意に高
いことがわかった。一頭当りの胚盤胞期胚生産個数をみ
ると、無血清培地を用いた本願方法(3.5個)は、血清培
地を用いた比較例(1.3個）より高いことが明らかになっ
た。このことから、本願方法は、個体別に採取された卵
子の数の影響を受けずに、体外受精卵を効率よくかつ安
定して生産できることが判明した。

【００３３】

【表３】

【００３４】

【発明の効果】本発明の無血清培地においては、受精卵
の発生率が高く、また血清成分を含有していないので成
分のバラツキが少なく、安定した培養成績が得られる。
更に、体細胞の共培養を必要とすることなく、受精卵の
体外培養を行うことができるので、操作の著しい簡便化
を図ることができる。従って、本発明の無血清培地は、
動物の受精卵、特にウシの受精卵の体外培養に好適に使
用される。また、本発明の体外受精卵の生産方法によれ
ば、受精卵移植に用いられる胚盤胞期胚を受精卵から高
率で発生させることができ、特に従来の血清培地を用い
た体外受精卵の生産方法より、体外受精卵の生産効率が
はるかに高い。従って、個体卵巣から採取した卵子を分
離培養し、効率的に体外受精卵を生産することが可能と
なり、将来、血統登録可能な受精卵の生産を行うことが
できる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 乳酸又はその可溶性塩、ピルビン酸
   又はその可溶性塩、塩基性線維芽細胞成長因子及び腫瘍
   成長因子−β１を含有する低グルコース濃度ＴＣＭ１９
   ９培地からなることを特徴とする無血清培地。
2. 【請求項２】 ウシ受精卵の体外培養用培地である
   請求項１記載の無血清培地。
3. 【請求項３】 ウシから卵子を採取し、体外成熟を
   行った後、体外受精させ、当該受精卵を請求項１記載の
   無血清培地中で体外培養することを特徴とするウシ体外
   受精卵の生産方法。