CN110042078A - 卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和应用 - Google Patents

卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和应用，卵母细胞体外成熟培养液包括发情母犬血清、发情母犬卵泡液和基础培养液。该卵母细胞体外成熟培养液可使犬COCs体外核成熟至MI‑MII阶段的比例稳定在45％左右，显著提高了犬COCs体外核成熟率，为犬卵母细胞体外成熟培养提供了新的思路。

Description

卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及卵母细胞体外培养技术领域，特别是涉及一种卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和应用。
背景技术
犬科动物如比格犬(Beagle)，品种固定且优良，遗传性能稳定、重复性好，对环境的适应力、抗病力较强，性格温顺，被公认为理想的实验动物，广泛应用于医药研究等生物学领域，尤其在新药安全评价与研发领域是世界公认的首选用犬。但由于犬科动物生殖生理的特殊性，其卵母细胞的体外培养成熟率低，辅助生殖研究进展缓慢，严重制约了该类动物在生物科学研究中的运用。犬科动物为非季节性单次发情动物，一年发情1～2次，犬发情间期平均180天，母犬排卵虽然主要集中在发情期前1～3日内，但在发情期的7日内随时都可发生排卵，发情排卵鉴定是仍是技术瓶颈之一。且与牛、羊等直接排出成熟的卵母细胞不同，犬排出的卵母细胞处于生发泡期(Germinal vesicle,GV)，需进一步在输卵管内完成成熟过程(48h～72h)才具备受精能力，因此犬卵母细胞体外成熟所需的条件不同于其他哺乳动物。尤其目前犬促排卵技术效果不明显，如果通过手术从自然发情排卵的母犬上获取成熟卵母细胞，需要耗费大量的人力物力，因此大多数科研工作者希望从犬卵巢收集卵丘卵母细胞复合体(COCs)再进行体外成熟来获得成熟犬卵母细胞，以进行后续研究，例如种子体外冷冻保存及基因编辑疾病模型犬的制备等。
自1976年第一次报道犬科动物卵母细胞体外成熟培养至今，犬卵母细胞体外成熟率仍远远滞后于鼠、牛、猪、羊等其它哺乳动物，目前国内外在犬卵母细胞体外成熟培养上仍处于探索阶段，进展缓慢。国内外报道的犬COCs体外培养，大概60％的COCs取出后就停止发育，大概25％的卵母细胞退化，只有20％左右能成功发育至MII阶段。近年来基因编辑技术进展很快，我国也已成功实现世界首例基因敲除犬，但该技术及体外保种要求有充足的实验材料即受精卵，因此急切需要解决犬COCs体外核成熟的技术壁垒，使成熟卵母细胞的获得变得更加简单、方便，以尽快应用于保种及基因编辑疾病模型犬研究。
发明内容
基于此，有必要提供一种用于犬卵丘卵母细胞复合体体外培养的能够提高成熟率的卵母细胞体外成熟培养液。
一种卵母细胞体外成熟培养液，包括发情母犬血清、发情母犬卵泡液和基础培养液。
由于在犬科动物体内，排卵前卵母细胞处于卵泡环境中，生发泡期卵母细胞排到输卵管内，并在此恢复和完成减数分裂，因此，四十多年来科研人员一直致力于在体外模拟输卵管内环境对COCs进行培养，例如往培养液添加促性腺激素(FSH、LH、PMSG、HCG)、甾类(E2、P4)、生长因子(IGF-1、EGF)、各种蛋白源、透明质酸酶、抗氧化剂和细胞周期抑制剂等，以及与犬输卵管上皮细胞共培养，或者将卵母细胞注入体外培养的输卵管内，但效果均不是太理想。而本发明的发明人针对目前犬COCs体外培养核成熟率低且培养液配方较复杂的问题，对犬COCs体外成熟培养液配方进行了大量尝试，建立了一种新的用于犬COCs体外核成熟的卵母细胞体外成熟培养液，首次在培养液中添加发情母犬卵泡液及血清，且无须额外添加激素、生长因子等，培养液配方简单易行。本发明的卵母细胞体外成熟培养液可使犬COCs体外核成熟率(MI-MII期)稳定在45％左右，显著提高了犬COCs体外核成熟率，达到世界先进水平，为犬卵母细胞体外成熟培养提供了新的思路。
在其中一个实施例中，在所述卵母细胞体外成熟培养液中，所述发情母犬血清的体积百分比为20％～55％，所述发情母犬卵泡液的体积百分比为8％～40％。
在其中一个实施例中，在所述卵母细胞体外成熟培养液中，所述发情母犬血清的体积百分比为48％～52％，所述发情母犬卵泡液的体积百分比为8％～12％。
本发明还提供了一种所述卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，包括以下步骤：将基础培养液、发情母犬血清和发情母犬卵泡液混合，得到所述卵母细胞体外成熟培养液。
在其中一个实施例中，还包括所述发情母犬血清的制备步骤：将凝固的发情母犬血液于2800r/min～3200r/min离心5min～15min，取上清于50℃～60℃灭活20min～40min。
在其中一个实施例中，还包括所述发情母犬卵泡液的制备步骤：从离体的发情母犬的卵巢中抽取卵泡液。
本发明还提供了一种所述卵母细胞体外成熟培养液在制备犬成熟卵母细胞中的应用。
在其中一个实施例中，将犬的卵丘卵母细胞复合体于所述卵母细胞体外成熟培养液中培养70小时～74小时。
在其中一个实施例中，所述卵丘卵母细胞复合体的培养密度为：每100μL所述卵母细胞体外成熟培养液培养所述卵丘卵母细胞复合体15枚～20枚。
在其中一个实施例中，所述卵丘卵母细胞复合体为发情母犬的卵丘卵母细胞复合体。
附图说明
图1为犬卵母细胞体外核成熟的四个时期的示意图；
图2为排出第一极体的犬成熟卵母细胞的显微照片；
图3为从犬卵巢获得的卵丘卵母细胞复合体的显微照片。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例的卵母细胞体外成熟培养液，包括发情母犬血清、发情母犬卵泡液和基础培养液。
由于在犬科动物体内，排卵前卵母细胞处于卵泡环境中，生发泡期卵母细胞排到输卵管内，并在此恢复和完成减数分裂，因此，四十多年来科研人员一直致力于在体外模拟输卵管内环境对COCs进行培养，例如往培养液添加促性腺激素(FSH、LH、PMSG、HCG)、甾类(E2、P4)、生长因子(IGF-1、EGF)、各种蛋白源、透明质酸酶、抗氧化剂和细胞周期抑制剂等，以及与犬输卵管上皮细胞共培养，或者将卵母细胞注入体外培养的输卵管内，但效果均不是太理想。而本发明的发明人针对目前犬COCs体外培养核成熟率低且培养液配方较复杂的问题，对犬COCs体外成熟培养液配方进行了大量尝试，建立了一种新的用于犬COCs体外核成熟的卵母细胞体外成熟培养液，首次在培养液中添加发情母犬卵泡液及血清，且无须额外添加激素、生长因子等，培养液配方简单易行。本发明的卵母细胞体外成熟培养液可使犬COCs体外核成熟率(MI-MII期)稳定在45％左右，显著提高了犬COCs体外核成熟率，达到世界先进水平，为犬卵母细胞体外成熟培养提供了新的思路。
在一个具体示例中，在卵母细胞体外成熟培养液中，发情母犬血清的体积百分比为20％～55％，发情母犬卵泡液的体积百分比为8％～40％。
在一个具体示例中，在卵母细胞体外成熟培养液中，发情母犬血清的体积百分比为48％～52％，发情母犬卵泡液的体积百分比为8％～12％，通过优化配比可获得更高的成熟率。优选地，基础培养液为M199培养液。
本发明一实施例的上述卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，包括以下步骤：将基础培养液、发情母犬血清和发情母犬卵泡液混合，得到上述卵母细胞体外成熟培养液。
在一个具体示例中，还包括发情母犬血清的制备步骤：将凝固的发情母犬血液于2800r/min～3200r/min离心5min～15min，取上清于50℃～60℃灭活20min～40min。可以理解，发情母犬血清也可以直接购买获得。
在一个具体示例中，还包括发情母犬卵泡液的制备步骤：从离体的发情母犬的卵巢中抽取卵泡液。
本发明一实施例的上述卵母细胞体外成熟培养液在制备犬成熟卵母细胞中的应用，即将犬的卵丘卵母细胞复合体于上述卵母细胞体外成熟培养液中培养70小时～74小时。
在一个具体示例中，卵丘卵母细胞复合体的培养密度为：每100μL卵母细胞体外成熟培养液培养卵丘卵母细胞复合体15枚～20枚。
以下为具体实施例，其中M199培养液购自Gibco公司，货号12340-030，500mL/瓶。如图1所示，卵母细胞核成熟阶段判定标准为：GV期：染色质疏松，有清晰核膜；GVBD期：核膜破裂消失，染色质散开；MI期：染色质凝集，通过染色可见高度浓缩荧光信号，没有核膜；MII期：染色质凝集，通过染色可见极体及细胞核两个荧光信号，或立体显微镜下卵母细胞胞质完整、胞质膜光滑，卵周隙明显，排出第一极体，如图2所示。
实施例1
选取外阴红肿、潮红、有血和粘液排出的发情母犬，麻醉后手术法摘除卵巢，置于含1％双抗的38.5℃生理盐水中，在超净工作台分离出卵巢后，用添加1％双抗的生理盐水清洗三次，后用无菌1mL注射针抽取卵巢表面卵泡中的卵泡液，分装并置于-20℃储存，作为COCs体外成熟培养添加剂待用。
犬卵巢采集自购买的母犬，共采集了9只发情母犬卵巢18个。取出的卵巢放入装有含1％双抗的38.5℃生理盐水中，在超净工作台去除卵巢囊，用含1％双抗的生理盐水清洗三次，然后放入含10％FBS的M199冲卵液中，用无菌1mL注射针反复穿刺卵巢表面卵泡，尽量穿刺所有卵泡，再用消毒手术剪刀充分剪碎卵巢，让所有COCs释出，在莱卡立体显微镜(S8APO)下挑选形态规则、包裹有三层以上卵丘细胞、卵胞质暗灰色、完整的COCs，见图3所示，共采集了204枚。
然后用卵母细胞体外成熟培养液(M199 40％、发情母犬血清50％、发情母犬卵泡液10％)清洗三次后，将15～20枚COCs放入100μL/滴的上述卵母细胞体外成熟培养液中，置于38.5℃、5％CO2二氧化碳培养箱中培养72h。然后将卵母细胞转移至预热的0.3％透明质酸酶液滴中，置于培养箱作用15min，后用口径小于卵母细胞直径的巴氏德吸管轻轻吹吸，机械剥离卵丘细胞，获得裸卵。首先在立体显微镜下观察裸卵第一极体排出情况，成熟卵母细胞胞质完整、胞质膜光滑，卵周隙明显，排出第一极体。然后将裸卵置于含4％低聚甲醛的D-PBS室温下固定20min以上，再用PBS洗3遍，移到含有1.9μM Hoechst 33342的液滴中避光染色5min以上，然后将卵母细胞转移到载玻片上，盖玻片覆盖，注意轻轻按压以防压破卵母细胞，荧光显微镜判定卵母细胞核成熟阶段。经过72h体外成熟，最终有92枚卵母细胞核发育至MI-MII阶段，占卵母细胞总数45.1％。
实施例2
实施例2与实施例1的方法基本相同，区别仅在于卵母细胞体外成熟培养液中，M199的体积百分比为30％，发情母犬血清的体积百分比为50％、发情母犬卵泡液的体积百分比为20％。经过72h体外成熟，最终核发育至MI-MII阶段的卵母细胞占卵母细胞总数的32.9％。
实施例3
实施例3与实施例1的方法基本相同，区别仅在于卵母细胞体外成熟培养液的配方不同，具体为：发情母犬血清的体积百分比为50％、发情母犬卵泡液的体积百分比为10％，FSH、P4、E2各添加1IU/mL，其余为M199基础培养液。经过72h体外成熟，最终核发育至MI-MII阶段的卵母细胞占卵母细胞总数的25.6％。
对比例1
将发情母犬卵巢分离，去除脂肪血管等组织，用含双抗的生理盐水洗净血液后放于含10％FBS的M199冲卵液中，用1mL注射针反复穿刺卵巢后用手术剪刀剪碎，选择有三层以上卵丘细胞包裹、胞质暗灰色、完整的COCs进行体外成熟培养。犬COCs体外成熟基础培养液为M199，添加10％FBS(胎牛血清)、10IU/mL PMSG(孕马血清促性腺激素)、10IU/mL HCG(绒毛膜促性腺激素)、0.1mg/mL Cys(半胱氨酸)、0.01μg/mL EGF(表皮细胞生长因子)、1IU/mL FSH(卵泡刺激素)、5μg/mL P4(孕酮)和5μg/mL E2(雌二醇)，制成100μL/滴培养液，将15～20枚COCs放入培养液滴里后置于38.5℃、5％CO2二氧化碳培养箱中培养72h。体外成熟培养完成后，用透明质酸酶结合机械法去除卵丘细胞，然后在立体显微镜下观察第一极体排出情况。再把裸卵用4％低聚甲醛固定、1.9μM Hoechst33342染色判定卵母细胞核成熟阶段。采用该对比例的方案进行犬COCs体外成熟，共采集犬卵巢12个，采集COCs 154枚，经过72h的体外成熟，共计获得29枚卵母细胞核发育至MI-MII期，占卵母细胞总数18.8％。
将实施例1和对比例1相比较可以得出，采用本发明的添加发情母犬血清、发情母犬卵泡液的卵母细胞体外成熟培养液，共计获得92枚卵母细胞核发育至MI-MII阶段，占卵母细胞总数45.1％，显著高于目前常规培养方法获得的18.8％核成熟率。该卵母细胞体外成熟培养液的配制无须额外添加激素、生长因子等，简便易行，核成熟率高而稳定，为后续犬COCs体外成熟培养提供了新的思路。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，包括发情母犬血清、发情母犬卵泡液和基础培养液。
2.根据权利要求1所述的卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，在所述卵母细胞体外成熟培养液中，所述发情母犬血清的体积百分比为20％～55％，所述发情母犬卵泡液的体积百分比为8％～40％。
3.根据权利要求2所述的卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，在所述卵母细胞体外成熟培养液中，所述发情母犬血清的体积百分比为48％～52％，所述发情母犬卵泡液的体积百分比为8％～12％。
4.一种权利要求1～3任一项所述的卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将基础培养液、发情母犬血清和发情母犬卵泡液混合，得到所述卵母细胞体外成熟培养液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括所述发情母犬血清的制备步骤：将凝固的发情母犬血液于2800r/min～3200r/min离心5min～15min，取上清于50℃～60℃灭活20min～40min。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括所述发情母犬卵泡液的制备步骤：从离体的发情母犬的卵巢中抽取卵泡液。
7.一种权利要求1～3任一项所述的卵母细胞体外成熟培养液在制备犬成熟卵母细胞中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将犬的卵丘卵母细胞复合体于所述卵母细胞体外成熟培养液中培养70小时～74小时。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述卵丘卵母细胞复合体的培养密度为：每100μL所述卵母细胞体外成熟培养液培养所述卵丘卵母细胞复合体15枚～20枚。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述卵丘卵母细胞复合体为发情母犬的卵丘卵母细胞复合体。
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