CN102174467A

CN102174467A - 一种小鼠卵巢组织液的提取方法及其应用

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Publication number: CN102174467A
Application number: CN2011100096617A
Authority: CN
Inventors: 周冬梅; 刘丽均; 徐平; 芮荣; 郁丽丽; 朱权凤
Original assignee: SHANGHAI SLAC LABORATORY ANIMAL Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI SLAC LABORATORY ANIMAL Co Ltd
Priority date: 2011-01-14
Filing date: 2011-01-14
Publication date: 2011-09-07

Abstract

本发明提供一种小鼠卵巢组织液的提取方法，将小鼠的卵巢置于基础培养液中捣碎，使卵巢组织液溶于基础培养液中形成预培养液。本发明还提供一种小鼠卵母细胞体外成熟的培养方法，包括将小鼠的未成熟卵母细胞移入成熟培养液中进行体外培养，所述成熟培养液由所述预培养液添加到卵母细胞基础培养液中形成。此外，本发明还提供一种胚胎移植获得试管小鼠的方法，包括将根据上述体外成熟的培养方法培养成熟的卵母细胞进行体外受精和胚胎移植。通过本发明所提供的卵巢组织液在小鼠卵母细胞体外成熟中的应用，有效提高了体外成熟卵子受精后的卵裂率，使其与体内成熟卵子的卵裂率无显著差异，最终通过胚胎移植获得试管小鼠。

Description

一种小鼠卵巢组织液的提取方法及其应用

技术领域

本发明涉及小鼠卵母细胞的体外培养，特别涉及一种小鼠卵巢组织液的提取方法及其应用。

背景技术

在生命科学研究蓬勃发展的今天，实验动物在科学研究中的作用日益突出。小鼠是应用最为广泛的实验动物之一，C57BL/6J品系小鼠作为一种近交小鼠，因其遗传背景稳定，成为生殖生物学、肿瘤学、生理学、免疫学和遗传学研究中常用的品系，大多数转基因小鼠均以C57BL/6J小鼠为遗传背景制作出来。如何对这些基因工程小鼠进行科学保种，建立一套有效的小鼠种质资源保存方案显得尤为重要。目前，体外受精技术和胚胎冷冻技术相结合，已经成熟地应用于了小鼠资源保存工作中，而小鼠卵母细胞体外成熟属于体外胚胎生产的基础环节之一，不仅可以辅助完成小鼠保种工作，而且在研究不孕症治疗模型方面也有着广阔的应用前景，同时它还可以对突发情况死亡的小鼠进行再生。因此，研究小鼠卵母细胞体外成熟具有重要的实际意义。

但小鼠卵母细胞体外成熟是一个复杂的过程。目前的研究报道中，虽然大多数小鼠卵母体外成熟后能进行体外受精并能获得胚胎，但是体外受精后的卵裂率低，高敏芝等的研究中的体外成熟卵子体外受精后的卵裂率为55.16％，胚胎的质量较低，胚胎的继续发育能力差，长期以来人们更多注重直接采取小鼠体内成熟卵子或胚胎进行相关实验；通过体外成熟，结合体外受精和胚胎移植得到试管小鼠并未受到足够的重视。随着转基因小鼠的生产与繁育保种的需求不断增加，小鼠卵母细胞体外成熟、体外受精技术研究显得愈益迫切，具有广阔的应用前景。

因此，本发明以C57BL/6J小鼠为研究对象，任务是建立较完善的小鼠卵母细胞体外成熟体系、提高体外成熟卵子的卵裂率、提高体外胚胎的发育能力、并通过胚胎移植获得试管小鼠。最终为重要优良小鼠品系的辅助保种，重要遗传工程小鼠品系的扩群和保种，自然生育困难的小鼠品系的扩群和保种，和濒危和突发情况死亡小鼠的再生，提供技术支持，为其它物种的资源保存和繁育提供技术参考。

发明内容

为了克服体外成熟卵子受精率低，受精后胚胎发育能力差的问题，本发明提供一种小鼠卵巢组织液的提取方法及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下方案：

一种小鼠卵巢组织液的提取方法，将小鼠的卵巢置于基础培养液中轻轻捣碎并离心，使卵巢组织液溶于所述基础培养液中形成预培养液。

所述基础培养液为M16溶液。

一种小鼠卵母细胞体外成熟的培养方法，包括将小鼠的未成熟卵母细胞移入成熟培养液中进行体外培养，其特征在于，将根据权利要求1或2所述的小鼠卵巢组织液的提取方法得到的所述预培养液添加到卵母细胞基础培养液中形成所述成熟培养液。

所述卵母细胞基础培养液为M16溶液。

所述预培养液中的每400μL M16溶液中含有20枚卵巢捣碎提取的卵巢组织液。

所述成熟培养液中含有胎牛血清。

所述成熟培养液中的M16溶液、胎牛血清和预培养液的体积比为8∶1∶1。

所述成熟培养液在进行体外培养之前需要在37℃，湿度100％，5％CO₂培养箱中进行平衡。

每滴所述平衡过的成熟培养液中培养20～50枚所述未成熟卵母细胞。

所述体外培养的培养条件为37℃，湿度100％，5％CO₂。

一种胚胎移植获得试管小鼠的方法，包括将成熟卵母细胞进行体外受精和胚胎移植，其特征在于，根据权利要求3所述的小鼠卵母细胞体外成熟的培养方法获得所述成熟卵母细胞。

所述体外受精包括制作精子获能皿和体外受精皿。

通过本发明所提供的卵巢组织液在小鼠卵母细胞体外成熟中的应用，有效提高了体外成熟卵子受精后的卵裂率，使其与体内成熟卵子的卵裂率无显著差异，最终通过胚胎移植还获得了试管小鼠。

附图说明

图1是显微镜下分离到的未成熟卵母细胞，周围有卵丘细胞包裹(×200)；

图2是未成熟卵母细胞经过本发明的培养液培养成熟后的显微形态，周围卵丘细胞扩散开来(×200)；

图3是成熟后进行体外受精所得到的2-细胞胚胎(×200)；

图4是胚胎移植后所得到的子代，出生当天；

图5是子代出生后第9天(黑色)及其代孕母鼠(白色)；

图6是子代出生后健康成长到第60天。

具体实施方式以下详述本发明的具体实施例。

本发明的具体实施例中所涉及的实验动物：

SPF级C57BL/6J小鼠，雌性，4周龄；C57BL/6J小鼠，雄性，10周龄以上，均由中科院上海实验动物中心提供，许可证号为沪SCXK(沪)2007-0005。按SPF级标准分群饲养，自由采食、饮水。

本发明的具体实施例中所涉及的主要仪器设备与器械：

CO₂培养箱(Hera，cell，Kandro)；实体显微镜(Nikon，SMZ645)；倒置显微镜(Leica，521665)；冷冻离心机(eppendorf 5415R)；移液枪(Gilson)；手术器械；35mm培养皿(Coming)。

本发明的具体实施例中所涉及的主要试剂：

M16培养液(Sigma公司，M7292)；本领域技术人员公知的HTF溶液和KSOM培养液。

实施例1

1、激素配制及贮存

孕马血清(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)用灭菌生理盐水配制成浓度为50IU/mL的溶液，-20℃保存备用。

2、预培养液的制备

小鼠卵巢体积小，成年小鼠的卵巢直径约3～4mm，组织液含量更是少，要提取纯卵巢组织液可行性差且耗费颇大，本发明采用以基础培养液为溶剂，将卵巢置于基础培养液中进行捣碎并离心，使卵巢组织液溶于基础培养液中，这种提取方法步骤简单、操作方便。

具体方法是用本实验室超数排卵用于保种的4周龄雌性小鼠，腹腔注射PMSG 10IU/只，48h后再腹腔注射hCG10IU/只，15h左右后分离小鼠卵巢，在经预平衡过的M16溶液中洗2～3遍，转入1.5mL离心管中，按每管中20枚卵巢和400μL的M16溶液分装，用自制的尖头玻璃棒在离心管内，轻轻将卵巢组织捣碎，3000r/min离心5min，取上清再5000r/min离心5min，将上清转入高压灭菌过的1.5mL离心管中，封口胶封口，-20℃保存备用。

3、成熟培养液的配制

本发明采用的基础培养液是通过试验研究筛选出来的M16溶液，而在培养液中添加胎牛血清(FBS)已经是相关研究中常用的方法。本发明中，在进行体外成熟的前晚，按M16∶FBS∶mOTF为8∶1∶1的比例配制，混均后作成100μL微滴于35mm培养皿中，每皿4个微滴，覆盖石蜡油，于37℃，湿度100％，5％CO₂培养箱中隔夜平衡，备用。

4、雌鼠的激素处理与卵母细胞分离培养

PMSG处理：腹腔注射PMSG溶液，10IU/只，48h后用于实验。

小鼠的处死及其卵母细胞的分离培养：颈椎脱臼处死小鼠，干净分离出卵巢，在M16培养液中清洗2～3遍，然后用显微镊在实体显微镜下反复轻轻夹镊卵巢，使未成熟卵母细胞从卵巢上卵泡内游离出来，用移卵针选择卵丘卵母细胞复合体(Cumulus Oocytes Complexes，COC)(如图1)，移入平衡过的成熟培养液M16中清洗2～3次，再放到35mm培养皿中的成熟培养液中培养，每滴中培养20～50枚未成熟卵母细胞。然后将培养皿放在37℃，湿度100％，5％CO₂的培养箱中培养。

5、精子获能皿与受精皿的准备

体外受精前一晚，准备精子获能皿和体外受精皿。获能皿的制作方法是用HTF作200μl微滴于35mm培养皿中，每皿2个微滴，覆盖石蜡油；体外受精皿的方法是用HTF作160μl和100μl各两个微滴于35mm培养皿中，呈十字轴对称排列，覆盖石蜡油；做好的获能皿、体外受精皿和2支HTF溶液都于37℃、湿度100％、5％CO₂培养箱中平衡过液，备用。

6、卵母细胞的准备

未成熟的COC培养18h后，将卵丘细胞扩散了的COC判定为成熟(如图2所示)，将选取的COC转入平衡过的HTF中洗涤2～3次，再分别转入平衡过的受精皿中的大滴中，每滴约20～50个卵子，等待受精。

7、体外受精

采集新鲜精子放入获能皿里微滴获能，每只小鼠的精子用1个微滴；获能时间到时，用移液枪吸取10μl获能好的精液轻轻吹入受精滴中与成熟的卵子共孵育24h后洗胚，统计2-细胞胚胎数量及卵裂率。图3示出了成熟后进行体外受精所得到的2-细胞胚胎(×200)。

8、假孕鼠的准备

做体外受精的当天，选择成年的阴门红肿的ICR/JCL雌鼠与结扎过的ICR/JCL雄鼠进行1∶1合笼，次日早晨对雌鼠进行阴栓检查，见栓者判定为假孕小鼠，用作胚胎移植的受体。

9、胚胎移植

小鼠用0.5％戊巴比妥钠按麻醉剂量表(表1)进行麻醉，小鼠进入麻醉状态后，背部腰侧切开1cm左右切口，然后切开腹肌，打开腹腔后用镊子轻轻引出卵巢及子宫，在卵巢与子宫之间的位置可见到弯曲的输卵管及膨大部，用夹子固定卵巢的脂肪垫，将动物移入体视显微镜下，用显微镊子夹住脂肪垫，找到膨大部，并调整好位置便于操作，用直头维纳斯剪在膨大部靠卵巢端剪一微口。

表1小鼠0.5％戊巴比妥钠麻醉剂量表

显微镜下选择10～12枚胚胎，用KSOM洗涤2～3遍，按照Andras Nagy在小鼠胚胎操作实验手册中的方法进行移植。移植后用镊子将牵引脂肪垫将卵巢子宫等轻轻带回腹腔，肌肉皮肤分层结节缝合。同样方法操作另一侧。手术后将小鼠放置在37℃的恒温台上保温，直到苏醒活动。送至动物房，饲养在独立通风笼具(IVC)中，1周后进行剖检胚胎是否着床，或饲养至妊娠足月，待其产仔。图4是胚胎移植后所得到的子代，出生当天。图5是子代出生后第9天。图6是子代出生后健康成长到第60天。

根据上述实验方法可知，本发明的卵巢组织液在小鼠卵母细胞体外成熟中的应用中可以有效提高体外成熟卵子受精后的卵裂率，如表2所示。

表2卵巢组织液对小鼠卵母细胞体外成熟效果的影响

Table 1 Effect of mOTF on IVF rate of mouse on the in vit ro maturation of mouse oocytes

^a，b同一列不同字母表示差异显著(P＜0.05)

^a，b Different alphabets in the same column indicate significant difference (P＜0.05)

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims

1.一种小鼠卵巢组织液的提取方法，其特征在于，将小鼠的卵巢置于基础培养液中轻轻捣碎并离心，使卵巢组织液溶于所述基础培养液中形成预培养液。

2.根据权利要求1所述的小鼠卵巢组织液的提取方法，其特征在于，所述基础培养液为M16溶液。

3.一种小鼠卵母细胞体外成熟的培养方法，包括将小鼠的未成熟卵母细胞移入成熟培养液中进行体外培养，其特征在于，将根据权利要求1或2所述的小鼠卵巢组织液的提取方法得到的所述预培养液添加到卵母细胞基础培养液中形成所述成熟培养液。

4.根据权利要求3所述的小鼠卵母细胞体外成熟的培养方法，其特征在于，所述卵母细胞基础培养液为M16溶液。

5.根据权利要求3所述的小鼠卵母细胞体外成熟的培养方法，其特征在于，所述预培养液中的每400μL M16溶液中含有20枚卵巢捣碎提取的卵巢组织液。

6.根据权利要求4所述的小鼠卵母细胞体外成熟的培养方法，其特征在于，所述成熟培养液中含有胎牛血清。

7.根据权利要求6所述的小鼠卵母细胞体外成熟的培养方法，其特征在于，所述成熟培养液中的M16溶液、胎牛血清和预培养液的体积比为8∶1∶1。

8.根据权利要求3所述的小鼠卵母细胞体外成熟的培养方法，其特征在于，所述成熟培养液在进行体外培养之前需要在37℃，湿度100％，5％CO₂培养箱中进行平衡。

9.根据权利要求8所述的小鼠卵母细胞体外成熟的培养方法，其特征在于，每滴所述平衡过的成熟培养液中培养20～50枚所述未成熟卵母细胞。

10.根据权利要求3所述的小鼠卵母细胞体外成熟的培养方法，其特征在于，所述体外培养的培养条件为37℃，湿度100％，5％CO₂。

11.一种胚胎移植获得试管小鼠的方法，包括将成熟卵母细胞进行体外受精和胚胎移植，其特征在于，根据权利要求3所述的小鼠卵母细胞体外成熟的培养方法获得所述成熟卵母细胞。

12.如权利要求11所述的胚胎移植获得试管小鼠的方法，其特征在于，所述体外受精包括制作精子获能皿和体外受精皿。