CN112304731A - 一种猪卵母细胞膜蛋白nhe1荧光染色的方法 - Google Patents
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Abstract
一种猪卵母细胞膜蛋白NHE1荧光染色的方法，涉及细胞生物学技术领域。为了更直观的观察细胞所处时期及膜蛋白NHE1和微丝的共定位情况，本发明提供了一种猪卵母细胞膜蛋白NHE1荧光染色的方法，包括如下步骤：从性成熟的猪卵泡内抽取的卵丘‑卵母细胞复合体，经培养后，获得生发泡期GV、第一次成熟分裂前期GVBD、第一次成熟分裂中期MI、第二次成熟分裂中期MII卵母细胞，然后依次经透明质酸酶去除卵丘细胞、链霉蛋白酶去除透明带后，将各时期的猪卵母细胞经透膜、封闭后，经抗体孵育后染核制备封片，在多通道共聚焦显微镜下进行观察。本发明为研究猪卵母细胞膜蛋白NHE1及其他膜蛋白的分子机制提供新的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种猪卵母细胞膜蛋白NHE1荧光染色的方法。
背景技术
猪卵母细胞成熟过程中涉及很多不同的发育阶段，其荧光染色能直观地显示出猪卵母细胞发育的不同阶段。由于膜蛋白NHE1(钠/氢交换因子1)的位置靠近透明带，而使其在进行荧光染色实验时经常由于透明带的存在而使细胞膜蛋白无法与特异性抗体特异结合或者非特异性的结合在透明带上影响观察。
发明内容
为了更直观的观察细胞所处时期及膜蛋白NHE1和微丝的共定位情况，本发明提供了一种猪卵母细胞膜蛋白NHE1荧光染色的方法，包括如下步骤：
1)猪卵母细胞培养：在性成熟的猪卵泡内抽取卵丘-卵母细胞复合体，经成熟培养液漂洗后转入成熟培养液于培养箱中进行培养，分别在0、24、30和44h收集生发泡期GV、第一次成熟分裂前期GVBD、第一次成熟分裂中期MI、第二次成熟分裂中期MII卵母细胞；
2)固定：将步骤1)中收集的各时期的猪卵母细胞分别用含透明质酸酶的Medium199培养液反复吹打去除颗粒细胞，洗净颗粒细胞的猪卵母细胞，在含链霉蛋白酶和血清的Medium 199培养液中去除透明带，在添加了BSA的4％(质量分数)多聚甲醛中清洗后，再置于4％(质量分数)多聚甲醛中室温固定30min；
3)透膜：将固定好的各猪卵母细胞分别经透膜液中清洗后，再置于透膜液中于37℃透膜8-48h；
4)封闭：将透膜后的各猪卵母细胞分别经封闭液清洗后，置于封闭液中封闭至少1h；
5)孵育第一抗体：将上述各猪卵母细胞分别放入到2％(体积分数)的兔抗NHE1的IgG中，4℃孵育第一抗体12-24h；
6)孵育第二抗体：将步骤5)中的各猪卵母细胞表面没有与NHE1结合的第一抗体洗掉后，将各猪卵母细胞分别加入到0.2％(体积分数)的FITC标记的羊抗兔二抗中，室温孵育第二抗体1-2h；
7)孵育鬼笔环肽：然后，将步骤6)中猪卵母细胞表面没有与第一抗体结合的第二抗体洗掉后，将各猪卵母细胞分别加入到2.5％(体积分数)的鬼笔环肽中，室温孵育鬼笔环肽0.5-1h；
8)染核：将上述猪卵母细胞表面的鬼笔环肽洗掉后，在载玻片上室温孵育DAPI，10min后封片；
9)检测：选用多通道共聚焦显微镜观察封片后的猪卵母细胞。
进一步地限定，步骤1)中所述的猪卵泡取自性成熟的青年母猪。
进一步地限定，步骤1)中所述的猪卵泡直径为2-6mm。
进一步地限定，步骤1)中所述培养箱培养条件为38.5℃、5％CO2，湿度100％。
进一步地限定，步骤1)中所述成熟培养液为Medium 199添加了10％(体积分数)猪卵泡液,10ng/mL表皮生长因子,10IU/mL孕马血清促性腺激素和10IU/mL人绒毛膜促性腺激素。
进一步地限定，步骤2)中所述透明质酸酶在Medium 199培养液中的质量分数为2％。
进一步地限定，步骤2)中所述链霉蛋白酶在Medium 199培养液中的质量分数为0.5％；所述血清在Medium 199培养液中的质量分数为5％。
进一步地限定，步骤2)中所述BSA在4％(质量分数)多聚甲醛中的质量含量为0.03％。
进一步地限定，步骤3)中所述透膜液为质量分数为1％的TritonX-100溶液。
进一步地限定，步骤3)中所述封闭液质量分数为3％的BSA溶液。
有益效果
本发明能直观的观察到细胞所处时期及膜蛋白NHE1和微丝的共定位情况。避免透明带对荧光染色实验结果的干扰。为研究猪卵母细胞膜蛋白NHE1及其他膜蛋白的分子机制提供新的技术支持。
附图说明
图1猪卵母细胞在生发泡期(GV)染色结果示意图，其中a为合并图，b为DAPI染色的DNA显示猪卵母细胞处于生发泡期，c为NHE1蛋白染色图，d为微丝染色图；
图2猪卵母细胞在第一次成熟分裂前期(GVBD)染色结果示意图，其中a为合并图，b为DAPI染色的DNA显示猪卵母细胞处于第一次成熟分裂前期，c为NHE1蛋白染色图，d为微丝染色图；
图3猪卵母细胞在第一次成熟分裂中期(MI)染色结果示意图，其中a为合并图，b为DAPI染色的DNA显示猪卵母细胞处于第一次成熟分裂中期，c为NHE1蛋白染色图，d为微丝染色图；
图4猪卵母细胞在第二次成熟分裂中期(MII)染色结果示意图，其中a为合并图，b为DAPI染色的DNA显示猪卵母细胞处于第二次成熟分裂中期，c为NHE1蛋白染色图，d为微丝染色图。
具体实施方式
链霉蛋白酶购买自sigma，产品型号11459643001，其他试剂或仪器、设备均可通过商业化途径购买获得。
DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料。
兔抗NHE1的IgG，抗体名称Anti-Na+/H+Exchanger 1(NHE-1)Antibody，购买自Alomone Labs，型号ANX-010。
其他试剂或仪器设备如无特殊说明，也均可通过商业化途径购买获得，所述的实验方法如无特殊说明，为常规方法或参照产品说明书进行。
下述实施例中所使用的成熟培养液为Medium 199添加了10％(体积分数)猪卵泡液,10ng/mL表皮生长因子(EGF),10IU/mL孕马血清促性腺激素(PMSG)和10IU/mL人绒毛膜促性腺激素(hCG)，各成分含量为在培养液中的终含量。
实施例1.猪卵母细胞膜蛋白NHE1荧光染色的方法，包括如下步骤：
1)猪卵母细胞培养：猪卵巢取自当地屠宰场性成熟的青年母猪，卵巢盛于含有青霉素、链霉素的25-30℃的生理盐水中尽快送回实验室。利用固定有粉色针头的10mL一次性注射器，从中等直径(2-6mm)的卵泡内抽取卵丘-卵母细胞复合体(COCs)。在体视镜下选择卵丘细胞包裹紧密、胞质颗粒分布均匀的卵母细胞，将其在成熟培养液中漂洗多次后转移入成熟培养液中，在38.5℃、5％CO2和100％湿度的培养箱中培养于体外成熟培养0、24、30和44h收集生发泡期(GV)、第一次成熟分裂前期(GVBD)、第一次成熟分裂中期(MI)、第二次成熟分裂中期(MII)卵母细胞。
2)固定：将步骤1)中收集的各时期的猪卵母细胞分别用已经预热到37℃含(质量分数)2％透明质酸酶的Medium 199培养液反复吹打60次左右，去除颗粒细胞，洗净颗粒细胞的猪卵母细胞在含链霉蛋白酶0.5％(质量分数)和5％(质量分数)血清的Medium 199培养液中去除透明带，在添加了约0.03％BSA的4％(质量分数)多聚甲醛中清洗后在4％(质量分数)多聚甲醛中室温固定30min。
3)透膜：将固定好的各猪卵母细胞分别经透膜液中清洗后，再置于新的透膜液1％TritonX-100中于37℃透膜24h。
4)封闭：将透膜后的猪卵母细胞经封闭液(为质量分数为3％的BSA溶液)中清洗后再置于封闭液中封闭中至少1h。
5)孵育第一抗体(兔抗NHE1的IgG)：将上述各猪卵母细胞放入到2％(体积分数)的兔抗NHE1的IgG中，4℃孵育第一抗体12h(每50个猪卵母细胞可使用上述浓度的一抗100μL)。
6)孵育第二抗体(羊抗兔-FITC)：将步骤5)中的各猪卵母细胞置于洗液(0.01％Triton X-100,0.1％Tween 20溶解在PBS中)中五分钟每次洗3-5次，清洗掉表面没有与NHE1结合的第一抗体，然后将各猪卵母细胞加入到0.2％体积浓度的FITC标记的羊抗兔二抗中(每50个猪卵母细胞可使用上述浓度的二抗100μL)，室温孵育第二抗体1h。
7)孵育鬼笔环肽(TRITC)：将步骤6)中二抗孵育后的各猪卵母细胞置于洗液(0.01％Triton X-100,0.1％Tween 20溶解在PBS中)中五分钟每次洗3-5次，清洗掉表面没有与第一抗体结合的第二抗体，然后将各猪卵母细胞加入到2.5％体积浓度的鬼笔环肽中(每50个猪卵母细胞可使用上述浓度的鬼笔环肽100μL)，室温孵育鬼笔环肽0.5h。
8)染核：将上述猪卵母细胞表面的鬼笔环肽洗掉后，每50个卵母细胞加10μL商品化DAPI，在载玻片上室温孵育DAPI 10min后，用四角加了羊毛脂的盖玻片在镜下压片或者直接镜下压片后用透明指甲油在边缘涂抹进行封片(防止在倒置显微镜观察时盖玻片脱落)。
9)检测：选用多通道共聚焦显微镜观察封片后的猪卵母细胞并拍照保存,分析猪卵母细胞核形态及NHE1蛋白和微丝表达。
实施例2.重复实施例1，与实施例1的不同在于，本实施例中步骤3)中37℃透膜时间为48h。
实施例3.重复实施例1，与实施例1的不同在于，本实施例中步骤3)中37℃透膜时间为8h。
实施例4.重复实施例1，与实施例1的不同在于，本实施例中步骤5)4℃孵育第一抗体24h。
实施例5.重复实施例1，与实施例1的不同在于，本实施例中步骤6)室温孵育第二抗体2h。
实施例6.重复实施例1，与实施例1的不同在于，本实施例中步骤7)室温孵育鬼笔环肽1h。
下面结合图1-4说明本发明实施例1的染色的结果：图1为生发泡期卵母细胞的染色结果，图1中b所示为染DNA的结果，可以看出染色体含有一个环状结构，说明猪卵母细胞处于生发泡期，图1中c为NHE1染色结果，显示了NHE1蛋白定位于细胞膜上，图1中d为微丝染色结果，其定位于细胞膜上，将前述三图合并后得到a图，显示出了NHE1和微丝的共定位结果；图2为到第一次成熟分裂前期卵母细胞的染色结果，图2中b所示为染DNA的结果，可以看出染色体中含有一个破裂的环状结构，说明猪卵母细胞处于第一次成熟分裂前期，图2中c为NHE1染色结果，显示了NHE1蛋白定位于细胞膜上，图2中d为微丝染色结果，其定位于细胞膜上，将前述三图合并后得到a图，显示出了NHE1和微丝的共定位结果；图3为第一次成熟分裂中期卵母细胞的染色结果，图3中b为染DNA的结果，说明猪卵母细胞处于第一次成熟分裂中期，图3中c为NHE1染色结果，显示了NHE1蛋白定位于细胞膜上，图3中d为微丝染色结果，其定位于细胞膜上，将前述三图合并后得到a图，显示出了NHE1和微丝的共定位结果；图4为第二次成熟分裂中期卵母细胞的染色结果，如图4中b为染DNA的结果，可以看出猪卵母细胞处于第二次成熟分裂中期，图4中c为NHE1染色结果，显示其定位于细胞膜上，图4中d为微丝染色结果，其定位于细胞膜上，将前述三图合并后得到a图，其中右上角的小圈代表第一极体，该图显示出了NHE1和微丝的共定位结果，综上，本发明能直观的观察到细胞所处时期及膜蛋白NHE1和微丝的共定位情况，避免了透明带对荧光染色实验结果的干扰。
Claims (10)
1.一种猪卵母细胞膜蛋白NHE1荧光染色的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)猪卵母细胞培养：在性成熟的猪卵泡内抽取卵丘-卵母细胞复合体，经成熟培养液漂洗后转入成熟培养液于培养箱中进行培养，分别在0、24、30和44h收集生发泡期GV、第一次成熟分裂前期GVBD、第一次成熟分裂中期MI、第二次成熟分裂中期MII卵母细胞；
2)固定：将步骤1)中收集的各时期的猪卵母细胞分别用含透明质酸酶的Medium 199培养液反复吹打去除颗粒细胞，洗净颗粒细胞的猪卵母细胞，在含链霉蛋白酶和血清的Medium 199培养液中去除透明带，在添加了BSA的4％(质量分数)多聚甲醛中清洗后，再置于4％(质量分数)多聚甲醛中室温固定30min；
3)透膜：将固定好的各猪卵母细胞分别经透膜液中清洗后，再置于透膜液中于37℃透膜8-48h；
4)封闭：将透膜后的各猪卵母细胞分别经封闭液清洗后，置于封闭液中封闭至少1h；
5)孵育第一抗体：将上述各猪卵母细胞分别放入到2％(体积分数)的兔抗NHE1的IgG中，4℃孵育第一抗体12-24h；
6)孵育第二抗体：然后，将步骤5)中的各猪卵母细胞表面没有与NHE1结合的第一抗体洗掉后，将各猪卵母细胞分别加入到0.2％(体积分数)的FITC标记的羊抗兔二抗中，室温孵育第二抗体1-2h；
7)孵育鬼笔环肽：然后，将步骤6)中猪卵母细胞表面没有与第一抗体结合的第二抗体洗掉后，将各猪卵母细胞分别加入到2.5％(体积分数)的鬼笔环肽中，室温孵育鬼笔环肽0.5-1h；
8)染核：将上述猪卵母细胞表面的鬼笔环肽洗掉后，在载玻片上室温孵育DAPI，10min后封片；
9)检测：选用多通道共聚焦显微镜观察封片后的猪卵母细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的猪卵泡取自性成熟的青年母猪。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的猪卵泡直径为2-6mm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述培养箱培养条件为38.5℃、5％CO2，湿度100％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述成熟培养液为Medium 199添加了10％(体积分数)猪卵泡液，10ng/mL表皮生长因子，10IU/mL孕马血清促性腺激素和10IU/mL人绒毛膜促性腺激素。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述透明质酸酶在Medium 199培养液中的质量分数为2％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述链霉蛋白酶在Medium 199培养液中的质量分数为0.5％；所述血清在Medium 199培养液中的质量分数为5％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述BSA在4％(质量分数)多聚甲醛中的质量含量为0.03％。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述透膜液为质量分数为1％的TritonX-100溶液。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述封闭液质量分数为3％的BSA溶液。
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