CN110205284A

CN110205284A - L-脯氨酸在提高卵母细胞早期胚胎发育及抗氧化能力中的应用

Info

Publication number: CN110205284A
Application number: CN201910445362.4A
Authority: CN
Inventors: 武振龙; 刘宁; 杨鹰
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-05-27
Filing date: 2019-05-27
Publication date: 2019-09-06
Anticipated expiration: 2039-05-27
Also published as: CN110205284B

Abstract

本发明提出了L‑脯氨酸在促进卵母细胞早期胚胎发育中的用途，L‑脯氨酸能够提高卵母细胞孤雌激活率、2细胞胚率或4细胞胚率以及囊胚率，提高抗氧化基因的表达量，提高细胞内GSH浓度，降低细胞内ROS水平，对于体外胚胎培养具有重要意义，应用前景广泛。

Description

L-脯氨酸在提高卵母细胞早期胚胎发育及抗氧化能力中的应用

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及L-脯氨酸在提高卵母细胞早期胚胎发育及抗氧化能力中的应用。更具体地，本发明涉及L-脯氨酸在促进卵母细胞早期胚胎发育中的用途、促进卵母细胞早期胚胎发育的方法和用于促进卵母细胞早期胚胎发育的培养基或产品。

背景技术

卵母细胞的发育对女性生育能力的建立至关重要，卵母细胞的细胞核成熟和细胞质成熟在卵母细胞发育中起着关键作用。第一次减数分裂的恢复和第一极体的排出被视为细胞核成熟的标志。雄原核的形成、受精和早期胚胎发育的能力被认为是卵母细胞细胞质成熟的标志，细胞质成熟涉及mRNA和蛋白质积累、细胞骨架和细胞器重组以及细胞代谢变化的过程。研究发现体外成熟卵母细胞的发育能力不如体内成熟卵母细胞，造成这种差异的原因主要是由于细胞质成熟不足引起的。虽然体外完成核成熟，但细胞质的正常成熟显然不够完全。卵母细胞被卵丘细胞包围，形成一种紧密相连的复合体，称为卵丘卵母细胞复合体(COCs)。卵丘卵母细胞复合体通过卵丘细胞之间以及卵丘细胞和卵母细胞之间的缝隙连接而连接。卵丘细胞提供的营养物质、低分子(如谷胱甘肽、cAMP和cGMP)、信号分子可通过缝隙连接传递到卵母细胞，这将影响卵母细胞成熟。

活性氧可引起氧化应激，造成卵母细胞损伤和女性生殖并发症。在正常生理条件下，细胞内抗氧化防御系统通过清除过量的活性氧维持氧化还原稳态。谷胱甘肽(GSH)在保护体细胞以及哺乳动物配子免受氧化应激方面发挥着重要作用，谷胱甘肽(GSH)也是预测细胞质成熟的分子标记之一。

目前，适于提高卵母细胞抗氧化能力从而促进其早期胚胎发育的物质仍有待开发。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了L-脯氨酸在促进卵母细胞早期胚胎发育中的用途。发明人发现，L-脯氨酸可以有效地促进卵母细胞早期胚胎发育，提高体外卵母细胞的成熟度，对于卵母细胞体外培养具有重要意义，应用前景广泛。

根据本发明的实施例，上述L-脯氨酸在促进卵母细胞早期胚胎发育中的用途还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，L-脯氨酸可以提高所述卵母细胞的抗氧化能力。由此，以便促进卵母细胞早期胚胎发育。

根据本发明的实施例，L-脯氨酸可以提高卵母细胞的孤雌激活率、2细胞胚率或4细胞胚率以及囊胚率。由此，以便促进卵母细胞早期胚胎发育。

根据本发明的实施例，L-脯氨酸可以降低卵母细胞的ROS水平，提高谷胱甘肽含量。发明人发现，L-脯氨酸在体外具有很强的清除氧化剂的功效，可以通过降低ROS水平，提高卵母细胞内的谷胱甘肽含量，从而提高卵母细胞的抗氧化能力，利于卵母细胞存活，促进早期胚胎发育。

根据本发明的实施例，L-脯氨酸可以上调GCLC基因和GCLM基因的表达。

谷氨酸-半胱氨酸连接酶(GCL)是谷胱甘肽(GSH)合成过程中的限速酶，后者在调节细胞氧化还原状态、避免氧化损伤过程中发挥主要作用。GCL由催化亚基(GCLC)和修饰亚基(GCLM)组成，前者具有催化活性，后者具有重要调节功能。发明人发现，L-脯氨酸可以有效地上调GCLC基因和GCLM基因的表达，从而促使卵母细胞合成谷胱甘肽，以便抵御ROS水平所造成的损伤，促进卵母细胞早期胚胎发育。

根据本发明的实施例，L-脯氨酸是以试剂盒、培养基或者药物的形式提供的。

根据本发明的实施例，基于100微升的作用体系，所述卵母细胞的数量为20～30枚，所述L-脯氨酸的浓度为0.25～0.50mM。由此，以便有效地提高体外卵母细胞合成谷胱甘肽的能力，减少细胞内ROS水平，从而提高其抗氧化能力，减少细胞损伤，促进早期胚胎发育。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种促进卵母细胞早期胚胎发育的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将L-脯氨酸与卵母细胞接触。如前所述，L-脯氨酸能够促进卵母细胞早期胚胎发育，提高体外卵母细胞的成熟度，对于卵母细胞体外培养具有重要意义，应用前景广泛。

根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)使卵母细胞在含有L-脯氨酸的成熟培养液中培养，移除卵丘细胞，收集卵母细胞置于胚胎培养液中培养，然后将所获得的卵母细胞置于激活培养液中进行孤雌激活；(2)将步骤(1)所得到孤雌激活后的卵母细胞置于胚胎培养液中培养，然后将所获得的细胞转移至含有葡萄糖的胚胎培养液中培养。

步骤(1)的溶液中添加脯氨酸有利于提高卵母细胞内GSH水平，提高细胞质成熟度，再置于激活液中培养使卵母细胞形成雄原核与雌原核；步骤(2)中将孤雌激活后的卵母细胞进行胚胎发育，会形成2细胞胚或4细胞胚，转移到含葡萄糖的培养液中，有利于2细胞胚或4细胞胚发育为囊胚，由此，以便于实现卵母细胞早期胚胎发育。

根据本发明的实施例，所述成熟培养液含有：0.25～0.5mM的L-脯氨酸；1～2mM的氯化钙；0.5～1mM的硫酸镁；5～6mM的氯化钾；20～30mM的碳酸氢钠；100～130mM的氯化钠；0.5～1.5mM的磷酸二氢钠；1～4mM的L-谷氨酰胺；2～6g/L的牛血清白蛋白；80000～1200000IU/L的孕马血清促性腺激素10000；0.01～0.05mM的酚红；40000～80000IU/L的青霉素50000；以及20～80mg/L的链霉素，所述成熟培养液的pH值为7.2。由此，可以有效地促使卵母细胞成熟，促进其早期胚胎发育。

根据本发明的实施例，所述胚胎培养液为CZB培养液。由此，为早期胚胎发育提供营养物质。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种产品。根据本发明的实施例，所述产品含有L-脯氨酸，具有下列至少之一的用途：促进卵母细胞早期胚胎发育；提高所述卵母细胞的抗氧化能力；提高卵母细胞的孤雌激活率、2细胞胚率或4细胞胚率以及囊胚率；降低卵母细胞的ROS水平，提高谷胱甘肽含量；上调GCLC基因和GCLM基因的表达。由此，根据本发明实施例的产品具有广泛的应用前景。

需要说明的是，本发明所使用的术语“产品”应作广义理解，凡是具有实用性、可被使用和消费、能满足某种需求的物质均可视作产品，本发明对于产品的具体种类不作严格限定，例如可以为培养基、试剂、试剂盒等，具体可以根据实际情况灵活选择。

根据本发明的实施例，所述产品进一步含有成熟培养液，所述成熟培养液含有：0.25～0.5mM的L-脯氨酸；1～2mM的氯化钙；0.5～1mM的硫酸镁；5～6mM的氯化钾；20～30mM的碳酸氢钠；100～130mM的氯化钠；0.5～1.5mM的磷酸二氢钠；1～4mM的L-谷氨酰胺；2～6g/L的牛血清白蛋白；80000～1200000IU/L的孕马血清促性腺激素10000；0.01～0.05mM的酚红；40000～80000IU/L的青霉素50000；以及20～80mg/L的链霉素，所述成熟培养液的pH值为7.2。由此，以便促使卵母细胞成熟。

需要说明的是，本发明对于成熟培养液的提供形式不作严格限定，既可以与L-脯氨酸以混合物的形式提供，也可以单独提供，待使用时，再与L-脯氨酸配合。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的L-脯氨酸对卵母细胞成熟和早期胚胎发育的影响；其中，A：脯氨酸对卵母细胞MⅡ期的影响；B：脯氨酸对卵母细胞孤雌激活率的影响；C：脯氨酸对2细胞胚或4细胞胚的影响；D：脯氨酸对卵母细胞囊胚率的影响；数据表示为平均值±标准误；n＝3次独立的试验；不同的字母表示组间差异显著，P<0.05；

图2显示了根据本发明一个实施例的L-脯氨酸对细胞内ROS水平和GSH含量的影响；其中，A：脯氨酸对卵母细胞ROS水平的影响(放大×100)；B：脯氨酸对卵母细胞内GSH含量的影响；C：脯氨酸对卵丘细胞内GSH含量的影响；数据表示为平均值±标准误；n＝3次独立的试验；不同的字母表示组间差异显著，P<0.05；

图3显示了根据本发明一个实施例的L-脯氨酸对卵母细胞和卵丘细胞GCLC和GCLM基因表达的影响；其中，A：脯氨酸对卵母细胞GCLC基因表达的影响；B：脯氨酸对卵母细胞GCLM的影响；C：脯氨酸对卵丘细胞GCLC基因表达的影响；D：脯氨酸对卵丘细胞GCLM的影响；数据表示为平均值±标准误；n＝3次独立的试验；不同的字母表示组间差异显著，P<0.05；

图4显示了根据本发明一个实施例的CBX和L-脯氨酸对卵母细胞和卵丘细胞GSH含量的影响；其中，A：CBX和脯氨酸对卵母细胞内GSH含量的影响；B：CBX和脯氨酸对卵母细胞周围卵丘细胞GSH含量的影响；数据表示为平均值±标准误；n＝3次独立的试验；不同的字母表示组间差异显著，P<0.05；

图5显示了根据本发明一个实施例的CBX和L-脯氨酸对卵母细胞成熟和早期胚胎发育的影响；其中，A：CBX和脯氨酸对卵母细胞MⅡ的影响；B：CBX和脯氨酸对卵母细胞孤雌激活率的影响；C：CBX和脯氨酸对2细胞胚或4细胞胚的影响；D：CBX和脯氨酸对卵母细胞囊胚率的影响；数据表示为平均值±标准误；n＝3次独立的试验；不同的字母表示组间差异显著，P<0.05。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1、小鼠卵母细胞收集

8-10周龄雌性ICR小鼠，腹腔注射10IU的孕马血清促性腺激素，44-46小时后颈部脱臼处死小鼠。从小鼠卵巢中分离出生发泡期卵丘卵母细胞复合物(COCs)，收集具有三层以上未扩散卵丘，直径大于70μm，细胞质均匀的GV期卵母细胞。

2、卵母细胞体外成熟

COCs培养在α-MEM成熟培养液中，依据试验设置，配置不同脯氨酸浓度的成熟培养液。用M2洗涤三次，用成熟培养液洗涤一次，将25枚左右的COCs培养在100μL的成熟培养液中并覆盖矿物油，放置于37℃和含有5％CO₂的培养箱中培养。体外成熟16小时后，收集卵母细胞和卵丘细胞，统计成熟率(GVBD和第一极体)。测定细胞内谷胱甘肽(GSH)和活性氧(ROS)水平。

α-MEM成熟培养液的组成：氯化钙1.80mM、硫酸镁0.81mM、氯化钾5.30mM、碳酸氢钠26.20mM、氯化钠117.20mM、磷酸二氢钠1mM、L-谷氨酰胺2mM、牛血清白蛋白4g/L、孕马血清促性腺激素10000IU/L、酚红0.03mM、青霉素50000IU/L、链霉素50mg/L，pH 7.2。

3、体外老化

卵母细胞成熟后，将其在Chatot-Ziomek-Bavister(CZB)培养液中培养6小时，然后将卵母细胞转移到激活培养液中进行孤雌激活。

4、卵母细胞激活与胚胎培养

用移液管吸取含有0.1％透明质酸酶的M2培养液脱掉卵母细胞的卵丘细胞，用M2清洗两次卵母细胞，再用含有10mM SrCl₂和5μg/ml细胞松弛素B(一种激活介质)的无Ca²⁺-CZB培养液中清洗一次卵母细胞。然后将卵母细胞在激活培养液(含有10mM SrCl₂和5μg/ml细胞松弛素B的无Ca²⁺-CZB培养液)中培养6小时，置于37.5℃和5％二氧化碳的培养箱中。经激活处理后，用显微镜观察卵母细胞，含有一个或两个发育良好的原核的卵母细胞记为激活。培养48小时后，测定2细胞胚率或4细胞胚率[细胞胚率＝(胚胎数/正常受精卵裂胚胎数)×100％]，并将其置于含有5.56mM葡萄糖的CZB培养液中进行下一步培养，培养96小时后，用显微镜观察囊胚发育情况，并计算囊胚率。

5、细胞内GSH的测定

为了评价卵母细胞或卵丘中的谷胱甘肽的含量，根据试剂盒的说明，使用谷胱甘肽分析试剂盒测定样品。

6、细胞内活性氧(ROS)的测定

为了评价单个卵母细胞中的活性氧水平，用活性氧敏感探针2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCHFDA)测定活性氧的水平，使用荧光显微镜(Zeiss Axiovert)拍摄照片。

7、缝隙连接的抑制

通过在α-MEM培养基中添加150μmmol/L的CBX处理COCs以抑制缝隙连接通讯功能。

8、抗氧化基因mRNA表达的测定

用Trizol试剂(北京艾德莱生物科技有限公司)从100个卵母细胞或100个卵母细胞的卵丘中提取总RNA，并用cDNA反转录试剂盒(中国天根)进行反转录。根据试剂盒说明书，使用ABI 7500 Real Tine PCR系统对SYBR Green进行定量实时PCR。用于谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚单位(GCLC)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚单位(GCLM)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的引物序列(5’-3’)如下：GCLC：GGCCACTATCTGCCCAATTG(正向引物)，CTCCCCAGCGACAATCAATG(反向引物)；GCLM：ATCCCTGACATTGAAGCCCA(正向引物)，ATTCCCCTGCTCTTCACGAT(反向引物)；和GAPDH：ATGGGAAGCTTGTCATCAACG(正向引物)，AAGACACCAGTAGACTCCACG(反向引物)。

9、统计分析

数据以平均值±SEMs表示，并通过单因素方差分析进行分析。采用GraphPadPrism 7.0版(美国加利福尼亚州圣地亚哥市GraphPad软件公司)进行邓肯式多重比较以确定差异，P<0.05被认为差异显著。

10、结果

结果如图1的A所示，α-MEM成熟培养液中添加不同浓度脯氨酸对卵母细胞核成熟没有显著(P>0.05)影响。添加0.25和0.50mM的脯氨酸显著提高(P<0.05)卵母细胞的孤雌激活(图1的B)、2细胞胚或4细胞胚和囊胚的比例(图1的C和D)。2.0mM的脯氨酸对卵母细胞的细胞核成熟和早期胚胎发育无显著影响(P>0.05)。结果表明脯氨酸对体外卵母细胞核成熟无影响，但对小鼠卵母细胞的早期胚胎发育有促进作用。

GSH含量与卵母细胞胞质成熟和早期胚胎发育呈正相关，评估体外成熟培养后卵母细胞内的活性氧水平。添加0.25和0.50mM脯氨酸显著降低(P<0.05)卵母细胞中ROS水平(图2的A)，显著(P<0.05)增加卵母细胞和卵丘细胞中的GSH含量(图2的B)。添加2.0mM脯氨酸可提高卵母细胞ROS水平，降低GSH浓度。结果表明，脯氨酸引起的谷胱甘肽水平升高和活性氧水平降低有助于促进体外早期胚胎发育。但是，若添加2.0mM脯氨酸，会降低谷胱甘肽含量，主要原因可能是底物的增加代偿性地提高线粒体对脯氨酸的代谢，脯氨酸在线粒体中的大量代谢会产生过多的ROS，低剂量ROS会刺激细胞产生更多抗氧化物质，但如果ROS水平过高细胞产生的抗氧化物质无法满足，进而导致ROS水平升高。

在体外成熟过程中添加脯氨酸显著上调(P<0.05)卵丘细胞中GCLC和GCLM的mRNA表达水平(图3的A和B)，显著提高(P<0.05)卵母细胞中GCLC和GCLM的mRNA表达水平(图3的C和D)。添加2mM脯氨酸对卵母细胞中GCLC的mRNA表达无显著(P>0.05)影响(图3的C和D)。

用CBX处理对卵母细胞中的GSH含量的影响如图4的A所示。与对照相比成熟培养液中添加CBX显著降低(P<0.05)卵母细胞内谷胱甘肽的含量。添加0.5mM的脯氨酸部分恢复由CBX引起的GSH含量的降低。CBX处理引起卵丘细胞中谷胱甘肽含量轻微升高(P>0.05)。CBX对卵母细胞核成熟和细胞质成熟的影响如图5的A和B所示，CBX处理对卵母细胞细胞核成熟无显著影响，但显著降低2细胞胚或4细胞胚和囊胚的发育比例。脯氨酸恢复了由CBX引起的卵母细胞激活，2细胞胚或4细胞胚和囊胚的发育比率的降低(图5的C和D)。

综上所述，α-MEM成熟培养液中添加脯氨酸，可改善早期胚胎发育并通过缝隙连接通讯增加卵母细胞中谷胱甘肽的积累。本发明结果不仅揭示了脯氨酸代谢在卵母细胞成熟过程中的作用，而且可以在人类辅助生殖临床上推广应用。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> L-脯氨酸在提高卵母细胞早期胚胎发育及抗氧化能力中的应用

<130> PIDC3191854

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GCLC基因正向引物

<400> 1

ggccactatc tgcccaattg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GCLC基因反向引物

<400> 2

ctccccagcg acaatcaatg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GCLM基因正向引物

<400> 3

atccctgaca ttgaagccca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GCLM基因反向引物

<400> 4

attcccctgc tcttcacgat 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GAPDH基因正向引物

<400> 5

atgggaagct tgtcatcaac g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GAPDH基因反向引物

<400> 6

aagacaccag tagactccac g 21

Claims

1.L-脯氨酸在促进卵母细胞早期胚胎发育中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，L-脯氨酸可以提高所述卵母细胞的抗氧化能力。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，L-脯氨酸可以提高卵母细胞的孤雌激活率、2细胞胚率或4细胞胚率以及囊胚率。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，L-脯氨酸可以降低卵母细胞的ROS水平，提高谷胱甘肽含量；

任选地，L-脯氨酸可以上调GCLC基因和GCLM基因的表达。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，L-脯氨酸是以试剂盒、培养基或者药物的形式提供的。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，基于100微升的作用体系，所述卵母细胞的数量为20～30枚，所述L-脯氨酸的浓度为0.25～0.50mM。

7.一种促进卵母细胞早期胚胎发育的方法，其特征在于，包括：将L-脯氨酸与卵母细胞接触。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括：

(1)使卵母细胞在含有L-脯氨酸的成熟培养液中培养，移除卵丘细胞，收集卵母细胞置于胚胎培养液中培养，然后将所获得的卵母细胞置于激活培养液中进行孤雌激活；

(2)将步骤(1)所得到的孤雌激活后的卵母细胞置于胚胎培养液中培养，然后将所获得的细胞转移至含有葡萄糖的胚胎培养液中培养；

任选地，所述成熟培养液含有：

0.25～0.5mM的L-脯氨酸；

1～2mM的氯化钙；

0.5～1mM的硫酸镁；

5～6mM的氯化钾；

20～30mM的碳酸氢钠；

100～130mM的氯化钠；

0.5～1.5mM的磷酸二氢钠；

1～4mM的L-谷氨酰胺；

2～6g/L的牛血清白蛋白；

80000～1200000 IU/L的孕马血清促性腺激素10000；

0.01～0.05mM的酚红；

40000～80000 IU/L的青霉素50000；以及

20～80mg/L的链霉素，

所述成熟培养液的pH值为7.2；

任选地，所述胚胎培养液为CZB培养液。

9.一种产品，其特征在于，含有L-脯氨酸，具有下列至少之一的用途：

促进卵母细胞早期胚胎发育；

提高所述卵母细胞的抗氧化能力；

提高卵母细胞的孤雌激活率、2细胞胚率或4细胞胚率以及囊胚率；

降低卵母细胞的ROS水平，提高谷胱甘肽含量；

上调GCLC基因和GCLM基因的表达。

10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述产品进一步含有成熟培养液，所述成熟培养液含有：

0.25～0.5mM的L-脯氨酸；

1～2mM的氯化钙；

0.5～1mM的硫酸镁；

5～6mM的氯化钾；

20～30mM的碳酸氢钠；

100～130mM的氯化钠；

0.5～1.5mM的磷酸二氢钠；

1～4mM的L-谷氨酰胺；

2～6g/L的牛血清白蛋白；

80000～1200000 IU/L的孕马血清促性腺激素10000；

0.01～0.05mM的酚红；

40000～80000 IU/L的青霉素50000；以及

20～80mg/L的链霉素，

所述成熟培养液的pH值为7.2。