CN111304159B - 辛酰化Ghrelin在体外抑制牛卵母细胞减数分裂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了辛酰化Ghrelin体外抑制牛卵母细胞减数分裂中的应用，本发明研究发现，辛酰化Ghrelin可体外抑制牛卵母细胞减数分裂。通过辛酰化Ghrelin体外培养抑制牛卵母细胞减数分裂的恢复，从而使得卵母细胞核和细胞质同步成熟，进而提高了牛卵母细胞的质量以及体外发育能力。能够成为新型的减数分裂制剂药物在畜牧业生产上推广应用，具有良好的市场效应和社会效应。
Description
本案为分案申请，其母案申请日为2016年8月1日，申请号为2016106215951，发明名称为“辛酰化Ghrelin在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用”。
技术领域
本发明涉及家畜配子胚胎工程技术领域，具体涉及辛酰化Ghrelin在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用。
背景技术
牛卵母细胞体外成熟(In Vitro Maturation，IVM)作为胚胎体外生产技术(InVitro Production，IVP)的三大技术环节之一，是一项重要的繁殖生物技术，也是决定体外胚胎生产的关键技术。其通过体外成熟培养屠宰场废弃卵巢有腔卵泡来源卵母细胞获得大量可用卵子，可以为育种、克隆、性别控制、细胞核移植、转基因动物生产等提供丰富的成熟卵源，变废为宝。
卵母细胞体外成熟是指卵母细胞离开卵泡环境后，在体外一定培养条件下能够自发恢复减数分裂进程，并获得能够正常受精以及进一步发育的能力。卵母细胞的体外成熟是一个复杂的生理过程，主要包括细胞核成熟和细胞质成熟。但在体外成熟过程中，虽然能够使卵母细胞在体外环境下完成减数分裂,但是由于离开了卵泡液，细胞质在未发育好的情况下细胞核恢复减数分裂，导致细胞核、细胞质成熟不同步，这样就会造成卵母细胞质量以及受精后胚胎发育能力较差，因此限制了此项技术的利用效率，细胞核、细胞质同步成熟成为亟待解决的问题。
鉴于以上原因，许多学者开发了卵母细胞体外两段成熟培养方法，即通过体外使用减数分裂抑制剂暂时可逆的阻止卵母细胞减数分裂恢复，同时促进胞质发育，然后移出减数分裂抑制环境，进行体外成熟。其中发明专利CN 102899286A公开了卵母细胞体外成熟的培养液以及分段培养方法。
Ghrelin(Ghre在印欧语系作词根，意为“grow”)。目前，我国学术界对Ghrelin尚没有统一的译名，所以有生长激素促释放剂、生长激素促分泌素、生长激素释放肽、生长素和脑肠肽等多种称谓。Ghrelin含28个氨基酸残基组成，其中经测定，发现在血液和组织中Ghrelin以两种主要形式存在：N端辛酰化和脱酰化修饰的Ghrelin。
Ghrelin的功能除了具有调节生长素的分泌、胃肠生理活动、能量代谢、心血管活动等功能外，还具有调节生殖的作用。越来越多的研究表明，Ghrelin在生殖轴的不同层次影响着动物的生殖。其中，对激素的分泌有着十分重要的调节作用。同时，Ghrelin还具有调节动物的发情，胚胎的发育等功能。
但是，辛酰化Ghrelin在牛卵母细胞体外分段成熟培养以及进一步用于体外受精、胚胎生产的作用尚不确定，目前尚无此方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛卵母细胞体外成熟前培养液。
本发明另一目的是提供一种促进牛卵母细胞体外成熟的培养液及方法。
本发明再一目的是提供辛酰化Ghrelin在促进牛卵母细胞成熟中的应用及辛酰化Ghrelin在制备用于促进牛卵母细胞体外成熟药物/减数分裂抑制剂药物中的应用。
所述牛卵母细胞体外前成熟培养液以牛卵母细胞体外培养液为基质，在所述基质中含有辛酰化Ghrelin。
优选地，所述辛酰化Ghrelin浓度为10-50ng/mL，更优选，所述辛酰化Ghrelin浓度为50ng/mL。
优选地，所述基质为不含hepes的TCM199培养液。
本发明还提供牛卵母细胞体外成熟方法，其是将牛卵母细胞在上述牛卵母细胞体外前成熟培养液中培养，然后进行体外成熟培养。牛卵母细胞采集后在添加辛酰化Ghrelin的细胞培养液内前成熟处理6h，然后在成熟液内成熟28h，成熟后的卵母细胞进行体外受精，然后进行体外胚胎培养。
优选地，所述牛卵母细胞为3-8mm的卵丘-卵母细胞复合体。
优选地，所述前成熟培养的培养时间为6h；所述辛酰化Ghrelin浓度为10-50ng/mL，更优选所述辛酰化Ghrelin浓度为50ng/mL，所述基质为不含hepes的TCM199培养液。
优选地，所述体外成熟培养的成熟培养液为含有FSH 10μg/ml，LH 10μg/ml，E2 1μg/ml，肝素钠10μg/ml，半胱氨酸10μg/ml，10％FBS的TCM199培养液；培养时间为28h。
成熟培养后的卵母细胞还用于体外受精或体外胚胎生产。
进一步，本发明提供辛酰化Ghrelin在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用。
进一步，本发明提供辛酰化Ghrelin在制备用于促进牛卵母细胞体外成熟药物/减数分裂抑制剂药物中的应用。
有益效果：
1)本发明应用辛酰化Ghrelin前成熟处理牛卵母细胞，促进细胞核和细胞质成熟同步，提高了卵母细胞的质量以及体外发育能力，促进了卵裂率以及囊胚率。辛酰化Ghrelin可以作为新型的卵母细胞减数分裂抑制剂药物在家畜胚胎工程上推广应用。
2)本发明所述的辛酰化Ghrelin为体内存在的生物活性肽类物质，对卵母细胞的毒害作用小。
具体实施方式：
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范围。实验用卵巢采自河北省大厂县屠宰场，牛辛酰化Ghrelin多肽由北京中科亚光生物科技有限公司合成。
实施例1卵母细胞成熟培养
(1)卵母细胞采集
使用含有2ml抽卵液(含25mM hepes M199+1％PVA+200uM IBMX+1％双抗)的10ml注射器从屠宰场获取的牛卵巢表面抽取直径3-8mm卵泡。将吸取卵母细胞后的吸卵液放入7cm3国产培养皿中，在体视显微镜下挑选出胞质均匀，且有3层及以上紧密卵丘颗粒细胞包裹的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte omplexes，COCs)用于体外前成熟培养。
(2)卵母细胞前成熟处理
将挑选出的COCs在洗卵液(含hepes M199+1％PVA+200uM IBMX+1％双抗)中清洗3次，在含有辛酰化Ghrelin的前成熟液(添加1-1000ng/ml浓度辛酰化Ghrelin的M199培养液)中清洗3次，然后放入预先在CO2培养箱中平衡2h的前成熟培养液的培养滴中(3.5cm3培养皿，60μl体积培养液/滴，20枚COCs)，培养条件为含5％CO2的空气，温度38.5℃，饱和湿度，培养时间为6h。前成熟后一部分COCs脱去颗粒细胞，4％多聚甲醛固定后DAPI染色在显微镜下观察辛酰化Ghrelin对牛卵母细胞减数分裂的抑制情况(未添加辛酰化Ghrelin的前成熟液培养的COCs为对照)，统计卵母细胞维持在生发泡(germinal vesicle,GV)阶段的数目。前成熟后的卵母细胞进行下一步成熟培养用于检测发育能力以及受精能力。同时，收集培养后的前成熟培养液,用于雌二醇、孕酮以及cAMP和MAPK的检测。结果见表1-3。
表1不同浓度辛酰化Ghrelin体外前成熟处理对牛卵母细胞减数分裂的影响
| 处理 | 卵母细胞数 | GV(％) | GVBD(％) |
| Control(0) | 246 | 95(38.62±0.86)<sup>e</sup> | 151(61.38±0.86)<sup>a</sup> |
| Ghrelin(1ng/ml) | 223 | 121(54.26±1.69)<sup>c</sup> | 102(45.74±1.69)<sup>c</sup> |
| Ghrelin(10ng/ml) | 227 | 134(59.03±1.60)<sup>b</sup> | 93(40.97±1.60)<sup>d</sup> |
| Ghrelin(50ng/ml) | 244 | 170(69.67±1.67)<sup>a</sup> | 74(30.33±1.67)<sup>e</sup> |
| Ghrelin(100ng/ml) | 249 | 115(46.18±2.22)<sup>d</sup> | 134(53.82±2.22)<sup>b</sup> |
| Ghrelin(500ng/ml) | 243 | 122(50.21±3.09)<sup>d</sup> | 121(49.79±3.09)<sup>b</sup> |
| Ghrelin(1000ng/ml) | 227 | 105(46.26±3.30)<sup>d</sup> | 122(53.74±3.30)<sup>b</sup> |
注：同列不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。
表1实验结果表明50ng/ml辛酰化Ghrelin处理6h后抑制了牛卵母细胞减数分裂，卵母细胞维持在GV阶段的比例显著高于与对照(P<0.05)。
表2不同浓度辛酰化Ghrelin前处理对牛卵母细胞卵丘细胞复合体雌二醇和孕酮分泌的影响
| 处理 | 处理次数(n) | 雌二醇(E<sub>2</sub>,ng/L) | 孕酮(P<sub>4</sub>,pg/ml) |
| Control(0) | 3 | 19.09±0.11<sup>d</sup> | 114.13±5.98<sup>e</sup> |
| Ghrelin(1ng/ml) | 3 | 19.28±0.06<sup>cd</sup> | 121.03±2.08<sup>d</sup> |
| Ghrelin(10ng/ml) | 3 | 19.55±0.09<sup>bc</sup> | 133.53±2.85<sup>c</sup> |
| Ghrelin(50ng/ml) | 3 | 21.11±0.15<sup>a</sup> | 164.27±4.72<sup>a</sup> |
| Ghrelin(100ng/ml) | 3 | 19.82±0.23<sup>b</sup> | 142.77±4.76<sup>b</sup> |
| Ghrelin(500ng/ml) | 3 | 17.75±0.33<sup>f</sup> | 132.40±7.86<sup>c</sup> |
| Ghrelin(1000ng/ml) | 3 | 18.28±0.28<sup>e</sup> | 133.73±3.13<sup>c</sup> |
表2结果显示：50ng/ml的Ghrelin能够促进颗粒细胞中雌二醇和孕酮的分泌。
表3不同浓度Ghrelin前处理对牛卵母细胞卵丘细胞复合体cAMP和MAPK分泌的影响
| 处理 | 6h-cAMP(pmol/ml) | 6h-MAPK(ng/ml) |
| Control(0) | 10.86±0.09<sup>d</sup> | 4.63±0.06<sup>a</sup> |
| Ghrelin(1ng/ml) | 10.50±0.05<sup>de</sup> | 4.38±0.04<sup>b</sup> |
| Ghrelin(10ng/ml) | 10.38±0.09<sup>e</sup> | 4.12±0.06<sup>c</sup> |
| Ghrelin(50ng/ml) | 9.41±0.09<sup>f</sup> | 3.57±0.08<sup>d</sup> |
| Ghrelin(100ng/ml) | 11.66±0.38<sup>c</sup> | 4.70±0.16<sup>a</sup> |
| Ghrelin(500ng/ml) | 13.13±0.19<sup>a</sup> | 4.05±0.09<sup>c</sup> |
| Ghrelin(1000ng/ml) | 12.24±0.42<sup>b</sup> | 4.42±0.06<sup>b</sup> |
表3结果显示，Ghrelin体外处理牛卵丘卵母细胞复合体6h对卵丘细胞内MAPK分泌有影响，50ng/ml处理浓度卵丘细胞内MAPK以及MPF水平最低。由此推测，Ghrelin在50ng/ml处理浓度抑制卵母细胞GVBD发生主要是通过抑制MAPK的活性来实现的。有研究表明，在正常情况下，MAPK在GVBD之前被激活，通过抑制myt1来活化MPF，从而刺激卵母细胞的GVBD。
(3)卵母细胞成熟培养
前成熟处理后的牛卵母细胞在成熟液中进行体外成熟培养28h。
在本发明中针对当前常用的体外成熟培养液进行了调整，本发明配置的成熟液A(FSH 10μg/ml，LH 10μg/ml，E 2 1μg/ml，肝素钠10μg/ml，半胱氨酸10μg/ml，10％FBS的TCM199培养液)以及常规成熟液B(添加FSH 10μg/ml，LH 1μg/ml，E21μg/ml，EGF 10ng/ml，10％FBS的TCM199培养液)，成熟培养时间为28h，同时没有经过前成熟处理的卵母细胞设定为对照。
实施例2体外受精与体外胚胎生产
用实施例1卵母细胞成熟培养的卵母细胞进行进一步实验。
(1)体外受精
采用培养皿微滴法，首先将成熟的卵母细胞在受精液(BO液+20mg/ml BSA+20mg/mL肝素钠+100mg/mL链霉素+100IU/mL青霉素)中清洗2-3次后放入平衡好的受精液中(放入量为每60μl受精液，20枚卵母细胞)，未添加辛酰化Ghrelin的前成熟液培养的卵母细胞为对照；然后采用上浮法处理冷冻精液，精子在2ml洗精液(BO液+3.38mg/mL咖啡因)上浮30min，之后取上清600-800μl放入1.5ml离心管离心(1800转，离心5min)2次，离心后除去上清加入受精液最终体积为200μl，取40μl处理后的精液加入已放入卵母细胞的受精液中，精子终浓度为1×106精子/ml，培养条件为5％CO2的空气，温度38.5℃，饱和湿度，受精时间为6h。
(2)体外胚胎生产
受精后的合子在前期发育液(CR1液+6mg/ml BSA，100ul/滴)洗涤3次后采用微滴两步法培养：首先在100μl前期发育液(20枚左右合子)培养2d，计数卵裂胚胎后移入100μl后期发育液(CR1液+10％FBS)培养5d，隔天半量换液，培养条件为5％CO2的空气，温度38.5℃，饱和湿度，胚胎发育第7天计数囊胚数。结果见表4、表5。
表4辛酰化Ghrelin前处理对体外牛卵母细胞受精后卵裂率的影响
| 处理 | 卵母细胞数 | 卵裂数(％) |
| Control(0) | 119 | 91(76.47±1.31<sup>a</sup>) |
| Ghrelin(50ng/ml)+A液 | 99 | 89(89.90±2.51<sup>b</sup>) |
| Ghrelin(50ng/ml)+B液 | 97 | 82(84.53±2.42<sup>c</sup>) |
注：同列不同字母表示差异显著(P<0.05)；卵裂率＝卵裂数/卵母细胞数
表5辛酰化Ghrelin前处理对体外牛卵母细胞受精后囊胚率的影响
注：同列不同字母表示差异显著(P<0.05)；囊胚率＝囊胚数/卵母细胞数
实验结果表明辛酰化Ghrelin前成熟处理8h后进行体外成熟培养，在成熟培养28h后卵裂率(表4)和囊胚率(表5)均显著高于对照(P<0.05)。成熟液A的效果要优于B，差异显著。
结论：由以上结果可知辛酰化Ghrelin能抑制牛卵母细胞减数分裂进程，促进牛卵母细胞体外发育能力，提高牛卵母细胞受精后卵裂率和囊胚发育率以及胚胎质量。因此，辛酰化Ghrelin可作为潜在的减数分裂抑制剂应用于牛的卵母细胞体外培养。
Claims (5)
1.辛酰化Ghrelin在体外抑制牛卵母细胞减数分裂中的应用，其中所述辛酰化Ghrelin的浓度为1-1000ng/mL。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述辛酰化Ghrelin的浓度为1-50ng/mL。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述辛酰化Ghrelin的浓度为50ng/mL。
4.辛酰化Ghrelin在制备体外抑制牛卵母细胞减数分裂药物中的应用，其中所述辛酰化Ghrelin的浓度为1-1000ng/mL。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，其中所述辛酰化Ghrelin的浓度为50ng/mL。
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