CN102578007B - 一种罗非鱼精子通用激活液及制备方法 - Google Patents

Abstract

一种罗非鱼精子通用激活液及制备，它由蔗糖、氯化钾、碳酸氢钠、氯化镁组成，其步骤：A、激活液母液的配制：(1)根据母液的浓度、体积和蔗糖分子量计算出配制母液需要的蔗糖重量，称取蔗糖，(2)根据母液的浓度、体积和氯化钾分子量计算出配制母液需要的氯化钾重量，称取氯化钾；(3)根据母液的浓度、体积和氯化镁分子量计算出配制母液需要的氯化镁重量；(4)根据母液的浓度、体积和碳酸氢钠分子量计算出配制母液的碳酸氢钠重量，将碳酸氢钠放入烧杯中，保存；B、精子稀释液的配制：从各组分母液中量取配制激活液所需体积的各组分、混合、放置冰箱、备用。配方合理，方法易行，操作简便，高于中华鲟精子激活液的渗透压，低于大口鲶精子激活液的渗透压。

Description

一种罗非鱼精子通用激活液及制备方法

技术领域

本发明涉及罗非鱼品种的精子技术领域，更具体涉及一种罗非鱼精子通用激活液，同时还涉及一种罗非鱼精子通用激活液的制备方法，适合所有罗非鱼品种的精子。

背景技术

罗非鱼（Tilapia）为一种中小型鱼，被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。原产于非洲，上世纪70年代被引进到我国，目前已成为我国一个重要的水产养殖品种。随着我国对罗非鱼品种的选育和改良，除最初引进的尼罗罗非鱼（O.niloticus）和奥尼亚罗非鱼（O.aureus）外，又培育了许多新的品种。如：尼罗罗非鱼和奥尼亚罗非鱼的杂交后代奥尼罗非鱼；通过3系杂交选育的后代尼罗超雄鱼；以及由8个品系的尼罗罗非鱼经杂交混合选育的吉富罗非鱼等。

为了能进一步开展罗非鱼的新品种选育以及罗非鱼的人工繁殖，为市场提供更优质的罗非鱼新品种和苗种，需要进行罗非鱼精子超低温保存，并将保存后的精液应用于罗非鱼的人工繁殖过程中。然而，当精子被超低温保存时，为了提高精子的抗冻能力，除了对精液进行稀释外，还需要在稀释的精液中添加一定量的抗冻剂，如二甲亚砜(DMSO)等。由于抗冻剂具有很强的吸水性，当被添加到精液中后，可以使精子细胞内的一部分水被吸出。精子细胞的水分流失导致精子细胞内的细胞液浓度升高，精子的冰点也随之升高，从而提升了精子的抗冻能力。也正是由于精子细胞内的细胞液浓度升高，精子的渗透压也会随之升高。这样，经超低温保存后的精子再解冻后，一般称为冻精，其渗透压与鲜精(未经超低温保存的，新挤出的精子)相比会高出30～40%。经超低温保存1年后的罗非鱼冻精渗透压可以达到388.4mOsM。含如此高内部渗透压的冻精，如果直接用淡水激活进行人工授精，在巨大的渗透压差作用下，其冻精一遇见水就可能破裂，从而使人工授精失败。解决这一问题的办法就是用具有一定渗透压的精子激活液来替代淡水对罗非鱼冻精进行激活，以减少这种渗透压差。因此，罗非鱼精子激活液的作用就是减少这种渗透压差，使罗非鱼冻精在激活时不会破裂，顺利实现用冻精进行罗非鱼人工授精。

另一方面，罗非鱼精子激活液除了减少冻精与激活液间的渗透压差，保护冻精在激活过程中不破裂的作用外，对一般罗非鱼鲜精也有使精子活力优化的作用。这是因为激活液是由不同离子或大分子物质组成的，这些离子和大分子物质对精子的运动可以起到一定的优化作用。如：Na离子主要是起调节激活液渗透压的作用；K离子起着改变精子膜表面通透性的作用；Ca、Mg离子则起着增加或降低精子运动速度的作用；而CO₃离子则起着调节激活液pH的作用等。除此之外，有报道显示葡萄糖和蔗糖等大分子类溶质除了起到调节渗透压的作用外，还具有提供精子能量的作用。罗非鱼精子激活液是由蔗糖、KCl、MgCl₂和NaHCO₃等4种物质组成。由于这些物质对罗非鱼精子的不同作用，使罗非鱼精子被激活后的生物学特性发生了很大变化。通过计算机辅助分析发现，采用罗非鱼精子激活液激活的精子与不采用激活液激活的精子比较，呈快速直线运动的精子比例由58%提高到72%；精子曲线运动的平均速度(VCL)由35.96±1.68μm/s提高到42.90±1.54μm/s；精子直线运动的平均速度(VSL)由20.62±1.21μm/s提高到25.86±1.35μm/s；精子路径运动的平均速度(VAP)由23.54±0.43μm/s提高到29.30±1.08μm/s；精子的平均寿命由4分30秒提高到5分45秒。由此可见，罗非鱼精子激活液对提高罗非鱼精子的活力起着十分重要的作用。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种罗非鱼精子通用激活液，适合各种罗非鱼品种精子的激活，是采用罗非鱼鲜精和冻精进行人工授精所必须的一种溶液。在用罗非鱼冻精授精时，它可减少冻精与授精环境间的渗透压差，使罗非鱼冻精在激活时不会破裂，顺利实现用冻精进行罗非鱼人工授精。在用鲜精进行人工授精时，它可有效提高鲜精的活力，从而提高受精率。

本发明的另一个目的是在于提供了一种罗非鱼精子通用激活液的制备方法，方法易行，操作简便，适合配制各种体积的激活液，可确保所配制激活液中个组分浓度的准确性。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种罗非鱼精子通用激活液，它由以下浓度份的原料制成：

激活液渗透压为87.4～134.2mOsM，pH为8.0～9.0。

一种罗非鱼精子通用激活液，它由以下浓度份的原料制成：

激活液渗透压为93.6～128.4mOsM，pH为8.1～8.9。

一种罗非鱼精子通用激活液，它由以下浓度份的原料制成：

激活液渗透压为99.4～122.6mOsM，pH为8.2～8.8。

一种罗非鱼精子通用激活液，它由以下浓度份的原料制成：

激活液渗透压为105.2～116.8mOsM，pH为8.3～8.7。

一种罗非鱼精子通用激活液，它由以下浓度份的原料制成：

本配方的激活液渗透压为111.0mOsM，pH为8.5。

一种罗非鱼精子通用激活液的制备方法，其步骤是：

1.激活液母液的配制：

(1)每毫升含蔗糖1mmol的母液：根据母液的浓度、体积和蔗糖分子量计算出配制母液需要的蔗糖重量，计算精确度为0.0g。用天平精确称取该重量分析纯的蔗糖，将蔗糖放入烧杯中，加入体积约为需要配制母液体积二分之一的蒸馏水，使蔗糖充分溶解，将溶解后的蔗糖溶液倒入需要配制母液同样体积的容量瓶中，用5～10ml蒸馏水洗涤3次烧杯，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处。蔗糖重量计算公式如下：

溶质重量＝(母液浓度×溶质分子量)×母液体积

以下溶质重量均按此公式计算。

(2)每毫升含氯化钾1mmol的母液：根据母液的浓度、体积和氯化钾分子量计算出配制母液需要的氯化钾重量，计算精确度为0.0g。用天平精确称取该重量分析纯的氯化钾（KCl），将氯化钾（KCl）放入烧杯中，加入体积约为需要配制母液体积二分之一的蒸馏水，使氯化钾充分溶解，将溶解后的氯化钾溶液倒入需要配制母液同样体积的容量瓶中，用5～10ml蒸馏水洗涤3次烧杯，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处。

(3)每毫升含氯化镁0.5mmol的母液：根据母液的浓度、体积和氯化镁分子量计算出配制母液需要的氯化镁重量，计算精确度为0.0g。用天平精确称取该重量分析纯的氯化镁（MgCl₂）将氯化镁放入烧杯中，加入体积约为需要配制母液体积二分之一的蒸馏水，使氯化镁充分溶解，将溶解后的氯化镁溶液倒入需要配制母液同样体积的容量瓶中，用5～10ml蒸馏水洗涤3次烧杯，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处。

(4)每毫升含碳酸氢钠0.5mmol的母液：根据母液的浓度、体积和碳酸氢钠分子量计算出配制母液需要的碳酸氢钠重量，计算精确度为0.0g。用天平精确称取该重量分析纯的碳酸氢钠（NaHCO₃），将碳酸氢钠放入烧杯中，加入体积约为需要配制母液体积二分之一的蒸馏水，使NaHCO₃充分溶解，将溶解后的NaHCO₃溶液倒入需要配制母液同样体积的容量瓶中，用5～10ml蒸馏水洗涤3次烧杯，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处。

(5)上述母液均放置4℃冰箱保存，备用。

2.精子激活液的配制：

(1)用微量取样器(规格：5μl～5ml)从各组分母液中精确量取配制激活液所需体积的各组分。量取各组分所需的体积根据激活液配方中各组分的浓度、各组分母液的浓度、以及所需配制的激活液体积，按如下公式计算：

量取体积＝(配方浓度×激活液体积)÷母液浓度

(2)将上述各组分混合均匀。如果需要配制的激活液体积大于100ml，则在相应体积的容量瓶中混匀，然后用蒸馏水定容至容量瓶刻度。如果需要配制的激活液体积小于100ml，则在玻璃瓶中混匀，然后根据需要配制的激活液体积减去已经量取的各组分体积总和，就是需要加入的蒸馏水体积(因为容量瓶最小为100ml)。

(3)配制好的激活液放置4℃冰箱保存，备用。

配制一款适合各种罗非鱼精子的精子激活液，以便使罗非鱼鲜精和经超低温冷冻保存的冻精获得良好的人工授精效果，从而为罗非鱼的选育种提供可靠的方法和技术保证。

本发明与其他鱼类精子激活液的比较：

下表为罗非鱼精子与其他几种鱼类精子激活液成分的比较

罗非鱼精子激活液与其他鱼类精子激活液比较，具有以下优点和效果：

1.罗非鱼精子激活液的成分和浓度与其它鱼类精子激活液存在较大差异。罗非鱼精子激活液属于大分子类组成的激活液，同属这一类的激活液只有中华鲟精子激活液。但与中华鲟精子激活液相比，配方合理，方法易行，操作简便，罗非鱼精子激活液的蔗糖浓度远高于中华鲟精子激活液。

2.罗非鱼精子激活液的渗透压虽然与鲤鱼和白鲢的激活液渗透压较接近，但与大口鲶和中华鲟的激活液渗透压存在较大差异，远高于中华鲟精子激活液的渗透压，而远低于大口鲶精子激活液的渗透压。

3.罗非鱼精子激活液的pH虽然与有些鱼类基本相同，如：大口鲶、鲤鱼。但与其它鱼类的pH仍存在一定的差异。

具体实施方式

实施例1：

一种罗非鱼精子通用激活液，它由以下浓度份的原料制成：

激活液渗透压为121.0mOsM，pH为8.6。

一种罗非鱼精子通用激活液的制备方法，其步骤是：

以下采用3ml超低温保存1年后的尼罗罗非鱼冻精进行人工授精为例，说明罗非鱼精子通用激活液的配制和使用方法。

A、精子激活液母液的配制：

(1)配制1000ml浓度为1M的蔗糖母液：根据方法中描述的计算公式，计算出需要称取的蔗糖重量。用天平精确称取343.2g分析纯的蔗糖，放置于1000ml烧杯中，加入约500ml蒸馏水，待蔗糖充分溶解后，将其倒入1000ml容量瓶中，每次用5～10ml蒸馏水洗涤烧杯3次，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶1000ml刻度处。

(2)配制500ml浓度为0.5M的KCl母液：根据方法中描述的计算公式，计算出需要称取的氯化钾重量。用天平精确称取18.7g分析纯的KCl，放置于500ml烧杯中，加入约250ml蒸馏水，待KCl充分溶解后，将其倒入500ml容量瓶中，每次用5～10ml蒸馏水洗涤烧杯3次，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处。

(3)配制500ml浓度为0.5M的MgCl₂母液：精确称取101.7g分析纯的MgCl₂，蒸馏水定容至500ml。

(4)配制500ml浓度为0.5M的NaHCO₃母液：精确称取42.0g分析纯的NaHCO₃，蒸馏水定容至500ml。

(5)上述母液均放置4℃冰箱保存，备用。

B、100ml精子激活液的配制：

(1)分别精确量取7.1ml1M的蔗糖母液；320μl0.5M的KCl母液；920μl0.5M的MgCl₂母液；560μl0.5M的NaHCO₃母液于100ml容量瓶中。

(2)将上述溶液混匀后，加蒸馏水定容至100ml。

(3)将上述配制好的100ml罗非鱼精子激活液常温保存，24小时内可用。

C、尼罗罗非鱼冻精的的解冻：

(1)从液氮罐中取出冻精：用长镊子从液氮罐中冷冻支架上取下保存1年以上的1支麦管套的冻精(1支麦管套内装6支麦管，每支麦管装有0.5ml冻精，共3ml冻精)。在液氮罐口放置30～60秒后，从麦管套中取出麦管，准备解冻。

(2)解冻：将麦管直接放入38℃水浴中，在水浴中不断晃动麦管，7～8秒后见麦管内气泡可上下移动时，即说明麦管内冻精已经解冻。

(3)冻精存放与备用：将解冻后的精液集中到一个干燥的5ml试管中，放入4℃冰箱备用。冰箱存放时间最多不超过30分钟就必须用于人工授精。

C、尼罗罗非鱼冻精人工授精

(1)尼罗罗非鱼人工采卵：选择2尾性腺发育成熟的尼罗罗非鱼雌鱼，用干毛巾揩干选择好的雌鱼生殖孔周围以及腹部，按照自头向尾方向轻轻挤压腹部，待有卵流出后用干燥的容器接卵，常温备用。

(2)尼罗罗非鱼冻精人工授精：将解冻备用的3ml尼罗罗非鱼冻精倒入挤出的卵中，用羽毛轻轻搅匀。1～2分钟后加入50ml预先配制好的罗非鱼精子通用激活液，轻轻搅拌3～5分钟，静置2分钟后，再加入500ml以上清水。再轻轻搅拌2～3分钟后，倒掉面上的污水，然后用此清水洗卵2～3次，即可将卵移入孵化器中孵化。

实施例2-6

其制备方法实施例1相同。

实施例7：

以下以人工授精20尾尼罗罗非鱼雌鱼的卵为例，说明罗非鱼激活液在人工授精过程中的使用方法。

1.精子激活液母液的配制：

精子激活液母液配制方法与案例一完全相同。

2.500ml精子激活液的配制：

(1)分别精确量取35ml1M的蔗糖母液母液；750μl0.5M的KCl母液；2.5ml0.5M的MgCl₂母液；1.5ml0.5M的NaHCO₃母液于500ml容量瓶中。

(2)将上述溶液混匀后，加蒸馏水定容至500ml。

(3)将上述配制好的500ml罗非鱼精子激活液常温保存，24小时内可用。

3.尼罗罗非鱼的人工授精

(1)尼罗罗非鱼精子的采集：选择性腺发育成熟的尼罗罗非鱼雄鱼1～2尾，用干毛巾擦干生殖孔周围及腹部的水。用手轻轻挤压雄鱼腹部，待能挤出精液后，前面几滴精液不要，然后将精液挤入干燥的容器中。将挤出的精液混匀后，放入4℃冰箱保存，备用。

(2)精液的稀释与平衡：用干燥的取样器取5ml精液，加入10ml预先配制好的罗非鱼精子激活液，稀释比为1:2。精液与激活液混匀后，放置4℃冰箱，平衡1小时以上。

注：研究证明尼罗罗非鱼精液被稀释后，在4℃冰箱里存放1小时以上的授精效果比不存放的效果要好很多。

(3)尼罗罗非鱼人工采卵：待稀释后的精液在冰箱平衡1小时左右后，选择20尾性腺发育成熟的雌性尼罗罗非鱼，分别用干毛巾揩干雌鱼生殖孔周围以及腹部，按照自头向尾方向轻轻挤压腹部，将这20尾雌鱼的卵全部挤入干燥的容器中，常温备用。

(4)尼罗罗非鱼人工授精：将平衡好的15ml精液倒入卵中，用羽毛轻轻搅匀。1～2分钟后加入250～300ml预先配制好的罗非鱼精子激活液(其配方另外发布)，轻轻搅拌3～5分钟，静置2分钟后，再加入1000ml以上清水。再轻轻搅拌2～3分钟后，倒掉面上的污水，然后用此清水洗卵2～3次，即可将卵移入孵化器中孵化。

Claims (6)

1.一种罗非鱼精子通用激活液，它由以下浓度份的原料制成：

激活液渗透压为87.4～134.2mOsM，pH为8.0～9.0；

所述罗非鱼精子通用激活液的制备方法，其步骤是：

A、激活液母液的配制：

(1)每毫升含蔗糖1mmol的母液：根据母液的浓度、体积和蔗糖分子量计算出配制母液的蔗糖重量，称取蔗糖，将蔗糖放入烧杯中，加入体积为配制母液体积二分之一的蒸馏水，使蔗糖溶解，将溶解后的蔗糖溶液倒入配制母液同样体积的容量瓶中，用蒸馏水洗涤3次，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处，蔗糖重量计算公式如下：

溶质重量＝母液浓度×溶质分子量÷母液体积；

(2)每毫升含氯化钾1mmol的母液：根据母液的浓度、体积和氯化钾分子量计算出配制母液需要的氯化钾重量，称取氯化钾，将氯化钾放入烧杯中，加入配制母液体积二分之一的蒸馏水，使氯化钾充分溶解，将溶解后的氯化钾溶液倒入配制母液同样体积的容量瓶中，用蒸馏水洗涤3次，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处；

(3)每毫升含氯化镁0.5mmol的母液：根据母液的浓度、体积和氯化镁分子量计算出配制母液的氯化镁重量，称取氯化镁，将氯化镁放入烧杯中，加入体积为配制母液体积二分之一的蒸馏水，使氯化镁溶解，将溶解后的氯化镁溶液倒入配制母液同样体积的容量瓶中，用蒸馏水洗涤3次，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处；

(4)每毫升含碳酸氢钠0.5mmol的母液：根据母液的浓度、体积和碳酸氢钠分子量计算出配制母液的碳酸氢钠重量，称取碳酸氢钠，将碳酸氢钠放入烧杯中，加入体积为配制母液体积二分之一的蒸馏水，使碳酸氢钠溶解，将溶解后的碳酸氢钠溶液倒入配制母液同样体积的容量瓶中，用蒸馏水洗涤3次，将洗涤后的蒸馏水也倒入容量瓶，最后用蒸馏水定容至容量瓶刻度处；

(5)上述母液均放置4℃冰箱保存，备用；

B、精子激活液液的配制：

(1)用取样器从各组分母液中量取配制激活液，根据激活液配方中各组分的浓度、各组分母液的浓度、以及所配制的激活液体积，按如下公式计算：

量取体积＝配方浓度×激活液体积÷母液浓度；

(2)将上述各组分混合均匀；配制的激活液体积大于100ml，在相应体积的容量瓶中混匀，然后用蒸馏水定容至容量瓶刻度，配制的激活液体积小于100ml，在玻璃瓶中混匀，根据配制的激活液体积减去已经量取的各组分体积总和，加入的蒸馏水体积；

(3)配制好的激活液放置4℃冰箱保存，备用。

2.根据权利要求1所述的一种罗非鱼精子通用激活液，其特征在于：

激活液渗透压为93.6～128.4mOsM，pH为8.1～8.9。

3.根据权利要求1所述的一种罗非鱼精子通用激活液，其特征在于：

激活液渗透压为99.4～122.6mOsM，pH为8.2～8.8。

4.根据权利要求1所述的一种罗非鱼精子通用激活液，其特征在于：

激活液渗透压为105.2～116.8mOsM，pH为8.3～8.7。

5.根据权利要求1所述的一种罗非鱼精子通用激活液，其特征在于：

激活液渗透压为111.0mOsM，pH为8.5。

6.根据权利要求1所述的一种罗非鱼精子通用激活液，其特征在于：

激活液渗透压为121.0mOsM，pH为8.6。