CN110432258B - 虫草素用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法 - Google Patents
虫草素用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种虫草素用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法，本发明同时还提供了一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括虫草素、营养物质、缓冲物质、冷冻保护剂以及抗菌物质。本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液，在精液降温、冷冻保存和解冻过程中对精子起到保护作用，减少损伤，明显提高了山羊冷冻精液的精子活力和顶体的完整率。
Description
技术领域
本发明属于动物生物技术领域，涉及动物繁殖技术，尤其涉及虫草素用 于制备山羊精液保存用稀释液的应用及制备方法。
背景技术
精液冷冻保存是动物生物技术体系中的关键环节之一，主要解决精液长 期稳定保存的问题。通过精液的人工采集和长期保存，实现动物生产的精液 能够跨时间、跨地域、多种方式的被利用，从而极大提高了雄性动物在实际 生产和科学研究领域中的使用价值。例如在动物育种领域，对于育种值估计、 种质资源保护、品种改良、新品种育成、实现工厂化规模化养殖等方面，以 及降低生产成本和提高经济效益具有重要意义。
研究表明，精子在降温和冷冻保存的过程中，很容易产生各种损伤，包 括物理性的、化学性的和生物性的损伤。与新鲜精液相比较，经冷冻/解冻 处理的精液，其精子的成活率、精子活力、顶体完整率、线粒体活性和受胎 率显著下降，而山羊的精液更是如此，这对于生产实践和科学研究来说是极 其不利的因素。尽管山羊精液的冷冻保存技术已经有了长足的发展，但目前 仍然存在精液经冷冻-解冻处理后精子活力不高的问题。
虫草素学名为3-脱氧腺苷，是从蛹虫草中提取出来的一种天然生物活性 物质，是一种核甙类新药，目前虫草素在美国作为抗癌、抗病毒新药已经进 人三期临床末，但是并没有虫草素应用于动物精液冷冻保存用稀释液的应 用。
发明内容
针对现有技术的缺陷或者不足，本发明提供了一种虫草素用于制备山羊 精液保存用稀释液的应用及制备方法。
本发明同时还提供了一种山羊精液冷冻保存用稀释液，所提供的山羊精 液冷冻保存用稀释液用于保存山羊精液，包括虫草素。
优选的，一种山羊精子冷冻保存用稀释液，所述的山羊精子冷冻保存用 稀释液包括虫草素、营养物质以及抗菌物质。
更优选的，一种山羊精子冷冻保存用稀释液，所述的山羊精子冷冻保存 用稀释液包括虫草素、营养物质、缓冲物质、冷冻保护剂以及抗菌物质。
更具体的，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括虫草素、果糖、柠檬 酸钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
优选的，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的pH值为7。
本发明山羊精子冷冻保存用稀释液的制备方法，包括如下步骤：
(1)将柠檬酸钠0.25-1.25g，柠檬酸0.75-6g，碳酸氢钠0.062-0.5 g，加50mL无菌水溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到A液；
(2)将果糖0.5-4g，卵磷脂0.125-1g，二甲基亚砜6-30mL，乙二 醇6-30mL，加A液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到B液；
(3)将青霉素0.07-0.56g，链霉素0.06-0.48g，加B液50mL溶解， 调节pH至7后定容至100mL，得到C液；
(4)取虫草素0.001-0.007g，加入C液50mL溶解后定容至100mL， 即得到山羊精子冷冻保存用稀释液。
上述步骤的优选方案如下，包括如下步骤：
(1)将柠檬酸钠1.25g，柠檬酸3.35g，碳酸氢钠0.28g，加50mL 无菌水溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到A液；
(2)将果糖2.25g，卵磷脂0.53g，二甲基亚砜18mL，乙二醇18mL， 加A液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到B液；
(3)将青霉素0.25g，链霉素0.25g，加B液50mL溶解，调节pH 至7后定容至100mL，得到C液；
(4)取虫草素0.005g，加入C液50mL溶解后定容至100mL，即得 到山羊精子冷冻保存用稀释液
本发明的有益效果是：
本发明的山羊精液冷冻保存用稀释液，添加了虫草素，精液经冷冻-解 冻处理后，精液的精子活率、顶体和质膜完整率分别可以达到44.24±1.73％， 52.13±1.50％和42.34±2.64％，与对比例不添加虫草素的山羊精液冷冻保存用 稀释液相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
虫草素为白色晶体，相对分子质量为251.25，能溶于水，乙醇，为含氮 配糖体的核酸衔生物,属嘌呤类生物碱，是一种核甙类新药。20世纪70年代 被发现有抑制肿瘤、抗疟原虫和抑制mRNA翻译的作用，20世纪90年代研 究发现，添加腺甙脱氨酶(adenosinedeaminase,ADA)抑制剂对其抗肿瘤活 性的表达起着重要作用。目前,虫草素在美国作为抗癌新药已经进人三期临 床末。
经发明人的偶然发现，山羊精液冷冻保存用稀释液中偶然加入虫草素 后，在精液降温、冷冻保存和解冻过程中对精子会起到一定的保护作用，经 不断的实验研究，得到了目前的配方，包括配方中的组分以及组分的含量范 围，其结果显示，能到有效减少损伤，明显提高了山羊冷冻精液的精子活力 和顶体的完整率，具体的保护机理还处在进一步探究中。
另外，为保证效果，本发明的用于山羊精液冷冻保存的稀释液，应现用 现配。本发明的山羊精液保存用稀释液，包括柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢 钠(三者共同起到维持渗透压以及酸碱调节作用)、果糖(作为能源，主要 作用是补充精子能量，也是一种简单的稀释剂)、卵磷脂(具有类似卵黄中 具有抗低温打击保护能力的主要功能性成份)、二甲基亚砜、乙二醇(均作 为冷冻保护剂)、青霉素、链霉素(均作为抑菌物质)和虫草素。
为了说明上述各实施例中山羊精子冷冻保存用稀释液对山羊精液的保存 效果，发明人对精子的活率、顶体完整率和质膜完整率进行了观测。随机抽 取10支细管冻精，37℃水浴20s解冻。取10μL精液，置于全自动精子质 量分析仪的样品池中，观测精子的活率、顶体完整率和质膜完整率。同时， 为了确定虫草素以及与虫草素配比的其他成分在山羊精子冷冻保存用稀释 液中的最适添加浓度，实施例共设置5组，每组中虫草素以及与虫草素配比 的其他成分在山羊精子冷冻保存用稀释液中的添加浓度均不同。同时，为进 一步说明虫草素的在山羊精子冷冻保存用稀释液所起到的有益效果，特与各 对比例的效果加以对比。
实施例1：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括虫草素、果糖、柠 檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链 霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75 g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者 1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖0.50g，卵磷脂0.125g， 准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L 氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：用分析天平精确称取虫草素0.007g，加入C液50mL 充分溶解，定容至100mL，得到所谓D液，D液即是添加虫草素的山羊精子 冷冻保存精液稀释液。
山羊精液的制备：
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精 液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精 液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀， 1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入D液，混匀，使精子密度为 900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包 裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精:
将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25mL的细管中，用聚乙烯醇粉封 口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速置 于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中长 期保存。
对比例1：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、 柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75 g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者 1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖0.50g，卵磷脂0.125g， 准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L 氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精 液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精 液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀， 1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入C液，混匀，使精子密度为 900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包 裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25 mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率 从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min， 再将细管投入到液氮中保存。
实施例2：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括虫草素、果糖、柠 檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链 霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75 g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者 1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖4g，卵磷脂1g，准确量 取二甲基亚砜30mL，乙二醇30mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化 钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：精确量取虫草素0.002g，加入C液50mL充分溶解， 定容至100mL，得到所谓D液，即添加虫草素的山羊精子冷冻保存精液稀释 液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精 液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精 液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀， 1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入D液，混匀，使精子密度为 900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包 裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25 mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率 从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min， 再将细管投入到液氮中长期保存。
对比例2：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、 柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75 g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌的超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或 者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平准确称取果糖4g，卵磷脂1g，准确量 取二甲基亚砜30mL，乙二醇30mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化 钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平准确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精 液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精 液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀， 1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入C液，混匀，使精子密度为 900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包 裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25 mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率 从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min， 再将细管投入到液氮中保存。
实施例3：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括虫草素、果糖、柠 檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链 霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠2g，柠檬酸6g，碳 酸氢钠0.5g，加50mL无菌的超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L 盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平准确称取果糖4g，卵磷脂1g，准确量 取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化 钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.07g，链霉素0.06g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：用分析天平精确称取虫草素0.002g，加入C液50mL 充分溶解，定容至100mL，得到所谓D液，即添加虫草素的山羊精子冷冻保 存精液稀释液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精 液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精 液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀， 1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入D液，混匀，使精子密度为 900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包 裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：
将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25mL的细管中，用聚乙烯醇粉封 口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速置 于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中长 期保存。
对比例3：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、 柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠2g，柠檬酸6g，碳 酸氢钠0.5g，加50mL无菌的超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L 盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平准确称取果糖4g，卵磷脂1g，准确量 取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化 钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.07g，链霉素0.06g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
(4)将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下 检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8 的精液定为合格精液。
取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000转/min 离心5min，弃上清液，缓慢加入C液，混匀，使精子密度为900万/mL左 右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包裹在17℃平 衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25 mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率 从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min， 再将细管投入到液氮中保存。
实施例4：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括虫草素、果糖、柠 檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链 霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠2g，柠檬酸6g，碳 酸氢钠0.5g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L 盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖0.5g，卵磷脂0.125g， 准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液5 0mL溶解，用1mol/L 氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.07g，链霉素0.06g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：用分析天平精确称取虫草素0.005g，加入C液50mL 充分溶解，定容至100mL，得到所谓D液，即添加虫草素的山羊精子冷冻保 存精液稀释液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精 液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精 液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀， 1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入D液，混匀，使精子密度为 900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包 裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25 mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率 从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min， 再将细管投入到液氮中长期保存。
对比例4：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、 柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠2g，柠檬酸6g，碳 酸氢钠0.5g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L 盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖0.5g，卵磷脂0.125g， 准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢 氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.07g，链霉素0.06g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
(4)将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下 检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8 的精液定为合格精液。
取(4)检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000 转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入C液，混匀，使精子密度为900万 /mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包裹在 17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25 mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率 从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min， 再将细管投入到液氮中保存。
实施例5：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括虫草素、果糖、柠 檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链 霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠1.25g，柠檬酸3.35 g，碳酸氢钠0.28g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖2.25g，卵磷脂0.53g， 准确量取二甲基亚砜18mL，乙二醇18mL，加A液50mL溶解，用1mol/L 氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.25g，链霉素0.25g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：精确量取虫草素0.001g，加入C液50mL充分溶解， 定容至100mL，得到所谓D液，即添加虫草素的山羊精子冷冻保存精液稀释 液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精 液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精 液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀， 1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入D液，混匀，使精子密度为 900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包 裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25 mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率 从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min， 再将细管投入到液氮中长期保存。
对比例5：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、 柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠1.25g，柠檬酸3.35 g，碳酸氢钠0.28g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者 1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖2.25g，卵磷脂0.53g， 准确量取二甲基亚砜18mL，乙二醇18mL，加A液50mL溶解，用1mol/L 氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.25g，链霉素0.25g， 加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容 至100mL，得到所谓C液，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
(4)将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下 检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8 的精液定为合格精液。
取(4)检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000 转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入C液，混匀，使精子密度为900万 /mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包裹在 17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25 mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率 从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min， 再将细管投入到液氮中保存。
对比例6：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、 柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇和虫草素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠1.25g，柠檬酸3.35 g，碳酸氢钠0.28g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者 1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖2.25g，卵磷脂0.53g， 准确量取二甲基亚砜18mL，乙二醇18mL，加A液50mL溶解，用1mol/L 氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)制备C液：精确量取虫草素0.001g，加入B液50mL充分溶解， 定容至100mL，得到所谓C液，即添加虫草素的山羊精子冷冻保存精液稀释 液。
其余操作同对比例5。
实施例与对比例的试验效果如下：
实施例1效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精 子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是42.13±1.65％，49.65±1.43％和 40.32±2.51％，统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活率、 顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比 对比例组提高了26.67±1.14％，顶体完整率提高了11.37±0.80％，质膜完整率 提高了8.30±1.00％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊精子的冷冻 保存，具有良好的效果。
实施例2效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精 子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是37.92±1.49％，44.69±1.29％和 36.29±2.26％，统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活率、 顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比 对比例组提高了28.25±1.03％，顶体完整率提高了12.76±0.73％，质膜完整率 提高了9.65±0.89％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊精子的冷冻 保存，具有良好的效果。
实施例3效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精 子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是34.13±1.33％，40.22±1.16％和 32.66±2.03％，统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活率、 顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比 对比例组提高了25.92±0.93％，顶体完整率提高了10.71±0.65％，质膜完整率 提高了7.66±0.81％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊精子的冷冻 保存，具有良好的效果。
实施例4效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精 子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是44.24±1.73％，52.13±1.50％和 42.34±2.64％，统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活率、 顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比 对比例组提高了27.94±1.21％，顶体完整率提高了11.91±0.85％，质膜完整率 提高了8.70±1.04％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊精子的冷冻 保存，具有良好的效果。
实施例5效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精 子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是38.13±1.49％，44.93±1.29％和 36.49±2.27％，统计分析结果表明，实施例组与对比例5相比，精子的活率、 顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比 对比例5提高了26.33±1.04％，顶体完整率提高了11.08±0.73％，质膜完整率 提高了8.012±0.90％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊精子的冷 冻保存，具有良好的效果。同时，实施例5的精子活率比对比例6提高了17.33±1.04％，说明稀释液中不添加抑菌物质青霉素和链霉素时会影响精子 活力，但是影响程度小于虫草素对精子活力的影响。同时，对比例6精子中 检测到与繁殖障碍疾病有关的病毒总阳性率达14.53％，说明本发明的山羊精 子的冷冻保存用稀释液中起到抗菌作用的主要成分是青霉素和链霉素。
另外，如各实施例和不添加虫草素的各对比例所示，实施例组与对比例 组相比精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，由此表 明，本发明添加虫草素的的稀释液对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效 果。
如实施例1至实施例5所示，具有同样含量虫草素的山羊精子冷冻保存 用稀释液，均能显著提高精子的活率、顶体完整率和质膜完整率，但是实施 例4的效果优于其他实施例，说明虫草素的添加量并不是越多越好，其与山 羊精子冷冻保存用稀释液中的其他成分有一个最佳的适配范围，只有配方中 各组分处在适配范围，才能起到最大效果。
通过以上结果可以得出，本发明稀释粉配方中添加0.001-0.007g的虫 草素能显著延长精子有效保存时间，提高精子的活率、顶体完整率和质膜完 整率，其中添加0.005g的虫草素效果更好，精液经冷冻-解冻处理后，精液 的精子活率、顶体和质膜完整率分别可以达到44.24±1.73％，52.13±1.50％和 42.34±2.64％，与对比例不添加虫草素的山羊精液冷冻保存用稀释液相比， 精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)。
进一步，为了说明本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液对多个品种的山 羊的各个年龄阶段精液冷冻保存均具有良好的效果，特设置了实施例6：
实施例6：
本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液对多个品种的山羊的各个年龄阶段 精液冷冻保存均具有良好的效果，试验已经对不同年龄段的陕西关中奶山 羊、不同年龄段的黑山羊以及黄羊的精液冷冻保存效果均进行了验证，试验 方法同上(不做详述)，结果表明：本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液， 能有效提高解冻后精液的精子活率、顶体完整率，降低精子畸形率，提高奶 山羊冻精生产效率冻精品质。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发 明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要 求所涵盖。
Claims (4)
1.一种山羊精子冷冻保存用稀释液，其特征在于，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括虫草素、果糖、柠檬酸钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素；
每100 mL山羊精子冷冻保存用稀释液中加入虫草素0.001-0.007g。
2.如权利要求1所述的山羊精子冷冻保存用稀释液，其特征在于，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的pH值为7。
3.权利要求2所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将柠檬酸钠0.25-1.25 g，柠檬酸0.75-6 g，碳酸氢钠0.062-0.5 g，加50 mL无菌水溶解，调节pH至7后定容至100 mL，得到A液；
（2）将果糖0.5-4 g，卵磷脂0.125-1 g，二甲基亚砜6-30 mL，乙二醇6-30 mL，加A液50mL溶解，调节pH至7后定容至100 mL，得到B液；
（3）将青霉素0.07-0.56 g，链霉素0.06-0.48 g，加B液50 mL溶解，调节pH至7后定容至100 mL，得到C液；
（4）取虫草素0.001-0.007 g，加入C液50 mL溶解后定容至100 mL，即得到山羊精子冷冻保存用稀释液。
4.权利要求3所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将柠檬酸钠1.25 g，柠檬酸3.35 g，碳酸氢钠0.28 g，加50 mL无菌水溶解，调节pH至7后定容至100 mL，得到A液；
（2）将果糖2.25 g，卵磷脂0.53 g，二甲基亚砜18 mL，乙二醇18mL，加A液50 mL溶解，调节pH至7后定容至100 mL，得到B液；
（3）将青霉素0.25 g，链霉素0.25 g，加B液50 mL溶解，调节pH至7后定容至100 mL，得到C液；
（4）取虫草素0.005 g，加入C液50 mL溶解后定容至100 mL，即得到山羊精子冷冻保存用稀释液。
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