CN111657265A - 花旗松素和山奈酚配伍用于制备家畜冷冻保存剂的应用 - Google Patents

花旗松素和山奈酚配伍用于制备家畜冷冻保存剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了花旗松素和山奈酚配伍用于制备家畜冷冻保存剂的应用。同时公开了包括花旗松素、山奈酚和冷冻基础液的家畜冷冻保存剂。本发明首次将花旗松素和山奈酚配伍用于猪、羊和牛精液冷冻保存，效果可靠，易于推广，适用于猪、羊和牛细管冷冻精液人工授精及精液超低温冷冻后的长期保存和长途运输后输精，可显著提高冷冻‑解冻后猪、羊和牛精子活率、顶体完整率和质膜完整率，保持精子的受精能力。

Description

花旗松素和山奈酚配伍用于制备家畜冷冻保存剂的应用
技术领域
本发明属于哺乳动物精液的超低温冷冻保存技术领域，具体涉及花旗松素和山奈酚配伍作为抗冻保护剂在家畜精液冷冻保存中的应用。
背景技术
精子冷冻技术具有重大的意义，理论上能将精液进行永久保存，可以实现精液基因库的建立，全球化种质资源的交流，提高优良种猪的利用率，还能有效的防止疾病的传播，对我国及国际的畜牧业可持续发展和畜产品的满足供应具有重要现实意义。
精子对温度变化比较敏感，在冷冻降温的过程中，精子容易遭受冷冻损伤，主要包括物理性损伤、化学性损伤和氧化性损伤。跟新鲜精液相比，冷冻-解冻后的精子，其活率、顶体完整率、线粒体活性、DNA完整率和膜完整率显著下降。而精子质量的好坏，与妊娠率、分娩率和窝产仔数密切相关。目前为止，冷冻精液人工授精技术已经应用于养牛生产，在奶牛繁殖和改良方面应用最为普及。但冷冻解冻后，依然有40％-50％精子失去活性，严重降低了良种公牛的利用率。而猪精子和羊精子对于冷冻刺激更为敏感，解冻后精子复苏率低，异常精子多，受胎率低于正常受胎率，故猪精子和羊精子冷冻还处于试验阶段。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了花旗松素和山奈酚配伍用于制备家畜冷冻保存剂的应用。
同时，本发明提供了一种家畜精液冷冻保存剂。所提供的家畜冷冻保存剂包括花旗松素、山奈酚和冷冻基础液。
可选的，所述冷冻基础液的配方为：葡萄糖1.1g，柠檬酸1.48g，Tris2.42g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，双蒸水100ml。
可选的，100ml所述家畜精液冷冻保存剂中花旗松素添加量为0.08mmol-0.16mmol，山奈酚添加量为10mg-30mg。
可选的，100ml所述家畜精液冷冻保存剂中花旗松素添加量为0.12mmol-0.16mmol，山奈酚添加量为10mg-25mg。
进一步可选的，100ml所述家畜精液冷冻保存剂中花旗松素添加量为0.08mmol-0.14mmol，山奈酚添加量为15mg-30mg。
进一步可选的，100ml所述家畜精液冷冻保存剂中花旗松素添加量为0.08mmol-0.14mmol，山奈酚添加量为10mg-25mg。
进一步，所述家畜精液冷冻保存剂还包括鸡蛋黄或/和甘油。
可选的，所述鸡蛋黄的体积占家畜冷冻保护剂体积的18％-22％。所述甘油的体积占家畜冷冻保护剂体积的3％-6％。
本发明的优点：
本发明首次将花旗松素和山奈酚配伍用于猪、羊和牛精液冷冻保存，效果可靠，易于推广，适用于猪、羊和牛细管冷冻精液人工授精及精液超低温冷冻后的长期保存和长途运输后输精，可显著提高冷冻-解冻后猪、羊和牛精子活率、顶体完整率和质膜完整率，保持精子的受精能力。
具体实施方式
本发明是基于花旗松素和山奈酚配伍或联合应用于家畜精液冷冻保存的发明思路，所提供的家畜精液冷冻保存剂主要是由花旗松素和山奈酚及冷冻基础液。本发明所述的冷冻基础液可采用现有技术已有冷冻基础液或不改变本发明构思并可实现本发明目的的冷冻基础液。示例，冷冻基础液配方为：葡萄糖1.1g，柠檬酸1.48g，Tris2.42g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，双蒸水100ml。
花旗松素具有广泛的生化和药理学效应，包括抗肿瘤作用、肝保护作用和抗炎作用，并有助于预防阿尔茨海默病等，更重要的是，它具有很强的抗氧化作用，能有效清除细胞内产生的ROS，防止脂蛋白和DNA受到氧化破坏；山奈酚对多种疾病都有较好的药理学效应，具有较高的清除自由基活性、抗炎和抗菌能力，本发明研究证明在精液冷冻过程中，两种物质联合使用可以对家畜精液冷冻保存起到有效的作用。
进一步，在冷冻程序各阶段，需要在冷冻保存剂中添加鸡蛋黄、甘油或者鸡蛋黄和甘油等。
本发明所述冷冻保存是指将采集后的家畜精液直接或经预处理后置于冷冻保存剂中，之后进行逐级降温平衡处理，最后一次平衡处理温度接近液氮保存温度，置于程序冷冻仪中以1℃/min的速率从4℃缓慢降至–5℃，后迅速移至液氮上方2.5-3.5cm熏蒸10-15min，将细管投入液氮中保存。如–5℃～0℃，然后在液氮中进行冷冻保存，液氮保存温度范围低至-196℃，对于不同家畜，其精液采集方式不同，并且根据各家畜精液的精子膜结构和对温度敏感度不同特点，有些家畜精液需要进行预处理，有些可以直接进行冷冻保存；对于需要进行预处理的精液，根据精液的对温度敏感性不同的特点，其预处理方法不同。对于预处理过程需要使用的常温稀释液可采用现有技术已有常温稀释液或不改变本发明构思并可实现本发明目的的常温稀释液。示例，常温稀释液(Betsville Thawing Solution，BTS)配方为：葡萄糖3.7g，二水柠檬酸三钠0.6g，EDTA0.125g，碳酸氢钠0.125g，氯化钾0.075g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，双蒸水混匀，定容至100ml，调整PH至7.2，渗透压为310mosm/L。
以下实施例中所用花旗松素和山奈酚均购自索莱宝公司，花旗松素货号为ST8050，山奈酚货号为IK0020。冷冻基础液配方为：葡萄糖1.1g，柠檬酸1.48g，Tris2.42g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，双蒸水100ml。常温稀释液(Betsville ThawingSolution，BTS)配方为：葡萄糖3.7g，二水柠檬酸三钠0.6g，EDTA0.125g，碳酸氢钠0.125g，氯化钾0.075g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，双蒸水混匀，定容至100ml，调整PH至7.2，渗透压为310mosm/L。
实施例1：
本发明猪精液冷冻保护剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，配制冷冻基础液：准确量取葡萄糖1.1g，柠檬酸1.48g，Tris2.42g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，溶于100ml双蒸水中，调节pH至6.21，渗透压286mosm/L，配制成冷冻基础液；
步骤二，准确量取冷冻基础液80ml，加入新鲜鸡蛋黄20ml，花旗松素0.16mmol，山奈酚10mg，混匀即得到本发明的一种家畜精液冷冻保存剂(I液)；
取94ml的上述家畜精液冷冻保护剂(I液)添加6ml甘油，过滤灭菌，冷却至室温，即可以得到本发明的另一种家畜精液冷冻保存剂(II液)用于保存猪精液，放入4℃冰箱中备用留做以下试验测试。
对照组11-13：
与实施例1不同的是，对照组11不添加花旗松素和山奈酚；对照组12不添加花旗松素；对照组13不添加山奈酚。
发明人对实施例1及对照组11-13的猪精液冷冻保存稀释液使用效果进行了如下试验：
(一)精液采集
用手握法采精，经4层消毒纱布过滤除去胶状物，用光学显微镜34-37℃下进行常规品质检查。选择无异味、色泽为乳白色、精子形态正常、活率在0.75以上、密度为“密”的精液，30℃保温用于试验。
(二)精液处理与冷冻
将新鲜精液加入等温的常温稀释液(30℃，1：1稀释)，经多层纱布包裹后，在17℃恒温箱中平衡0.5h-1h；将平衡处理过的精液在17℃离心(1200rpm，10min)，弃上清，加入等温的两倍体积的I液，用多层纱布包裹后置于4℃冰箱中平衡1h-1.5h；之后将平衡处理过的精液加入4℃的等体积Ⅱ液，用纱布包裹后置于4℃冰箱中再平衡1.5-2.5h；用专用注射器将精液吸入0.25ml细管内，快速封管，置于程序冷冻仪中以1℃/min的速率从4℃缓慢降至–5℃，后迅速移至液氮上方2.5-3.5cm熏蒸10-15min，将细管投入液氮中保存。
(三)细管冻精的解冻和精子质量评定
1、精子活率
将细管冻精取出后迅速放入37℃的水浴中解冻45s，收集于小试管内，然后加入等体积的、37℃预热过的常温稀释液稀释，孵育10min，取10μL精液于载玻片上，盖上盖玻片，在400×倒置显微镜下评价精子活率(直线运动精子百分率)。每次至少检查200个精子，重复5次。
2、精子顶体完整率
利用FITC-PNA染液染色后，荧光显微镜观察精子顶体形态。
冻精细管解冻后，将精液加到2ml 3％PVP液面上，1500rpm离心6min，弃上清；用PBS洗2次，1500rpm离心6min，弃上清；用PBS(37℃)重悬精子，调整密度至1-2×106spe/ml；吸取30μl精子悬液，涂片，空气干燥，用甲醇固定10min；再加入30μl FITC-PNA染液，37℃黑暗潮湿环境孵育30min；PBS冲洗，空气干燥，滴少量封片剂，盖片，用无色指甲油封片，尽快在400×荧光显微镜下观察。每次至少检查200个精子，重复5次。
3、精子质膜完整率
采用果糖-柠檬酸钠低渗液进行低渗肿胀检测(HOST)。将解冻的精液用低渗液稀释，调整精子密度为1×l06 spe/ml，37℃孵育30min，取20μl精液于悬液滴于血细胞计数板上，400×显微镜下观察，计算弯尾精子百分率，每次至少检查200个精子，重复5次。
(四)精子质量评定结果
应用本发明的猪精液冷冻保存抗冻剂以及精液冷冻-解冻方法，评定结果如下表1所示：
表1
处理 精子活率 顶体完整率 质膜完整率
对照组11 33％ 41％ 45％
对照组12 55％ 60％ 66％
对照组13 54％ 58％ 61％
实施例1 67％ 71％ 75％
实施例2：
本发明羊精液冷冻保存剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，配制冷冻基础液，方法同实施例1；
步骤二，准确量取冷冻基础液80ml，加入新鲜鸡蛋黄20ml，花旗松素0.08mmol，山奈酚30mg，混匀即配制成本发明的一种家畜精液冷冻保存剂(I液)；
取97ml的上述家畜精液冷冻保存剂(I液)添加3ml甘油配制成100ml的混合液，过滤灭菌，冷却至室温，即得到本发明的另一种家畜精液冷冻保存剂(II液)用于保存羊精液，放入4℃冰箱中备用做以下试验。
对照组21-23：
与实施例2不同的是，对照组21不添加花旗松素和山奈酚；对照组22不添加花旗松素；对照组13不添加山奈酚。
发明人对实施例2及对照组21-23的猪精液冷冻保存稀释液使用效果进行了如下试验：
(一)精液采集
用假阴道法采精，用显微镜在34-37℃下进行常规品质检查。选择无异味、色泽为乳白色、精子形态正常、活率在0.7以上、密度为“密”的精液，30℃保温用于试验。
(二)精液处理与冷冻
将新鲜精液中加入等温等体积的的Ⅰ液，经多层纱布包裹后，在4℃冰箱中平衡2h。再在平衡处理过的精液中加入等温等体积的Ⅱ液，用多层纱布包裹后置于4℃冰箱中平衡1-1.5h。用专用注射器将精液吸入0.25ml细管内，快速封管，置于程序冷冻仪中以1℃/min的速率从4℃缓慢降至–5℃，迅速移至液氮上方2.5-3.5cm熏蒸6-8min，将细管投入液氮中保存。
(三)细管冻精的解冻和精子质量评定
1、精子活率
将细管冻精取出后迅速放入37℃的水浴中解冻25s，收集于小试管内，然后用等体积的、37℃预热过的常温稀释液稀释，孵育10min，取10μL精液于载玻片上，盖上盖玻片，在400×倒置显微镜下评价精子活率(直线运动精子百分率)。每次至少检查200个精子，重复5次。
2、精子顶体完整率
利用FITC-PNA染液染色后，荧光显微镜观察精子顶体形态。
冻精细管解冻后，将精液加到2ml 3％PVP液面上，1500rpm离心6min，弃上清；用PBS洗2次，1500rpm离心6min，弃上清；用PBS(37℃)重悬精子，调整密度至1-2×106spe/ml；吸取30μl精子悬液，涂片，空气干燥，用甲醇固定10min；再加入30μl FITC-PNA染液，37℃黑暗潮湿环境孵育30min；PBS冲洗，空气干燥，滴少量封片剂，盖片，用无色指甲油封片，尽快在400×荧光显微镜下观察。每次至少检查200个精子，重复5次。
3、精子质膜完整率
采用果糖-柠檬酸钠低渗液进行低渗肿胀检测(HOST)。将解冻的精液用常规稀释液稀释，调整精子密度为1×l06 spe/ml，37℃孵育30min，取20μl精液于悬液滴于血细胞计数板上，400×显微镜下观察，计算弯尾精子百分率，每次至少检查200个精子，重复5次。
(四)精子质量评定结果
应用本发明的羊用精液冷冻保护剂以及精液冷冻-解冻方法，评定结果如下表2所示：
表2
Figure BDA0002541753970000111
Figure BDA0002541753970000121
实施例3：
本发明牛精液冷冻保存剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，配制冷冻基础液，方法同实施例1；
步骤二，准确量取冷冻基础液80ml，加入新鲜鸡蛋黄20ml，花旗松素0.14mmol，山奈酚25mg，即得到本发明的一种家畜精液冷冻保存剂(I液)。
取96ml的上述家畜精液冷冻保存剂添加4ml甘油配制成100ml的混合液，混匀，过滤灭菌，冷却至室温，即得到本发明的另一种家畜精液冷冻保存剂(II液)用于保存牛精液，放入4℃冰箱中备用做以下试验。
对照组31-33：
与实施例3不同的是，对照组31不添加花旗松素和山奈酚；对照组32不添加花旗松素；对照组33不添加山奈酚。
发明人对实施例3及对照组31-33的猪精液冷冻保存稀释液使用效果进行了如下试验：
(一)精液采集
用假阴道法采精，用显微镜在37℃下进行常规品质检查。选择无异味、色泽为乳白色、精子形态正常、活率在0.7以上、密度为“密”的精液，37℃保温用于试验。
(二)精液处理与冷冻
将新鲜精液加入等温的II液，调整精子密度为1.5×106个/ml,经纱布包裹后，在4℃冰箱中平衡4h。
将平衡处理过的精液，用专用注射器将精液吸入0.25ml细管内，快速封管，置于程序冷冻仪中以1℃/min的速率从4℃缓慢降至–5℃，迅速移至液氮上方2-3cm熏蒸5-10min，将细管投入液氮中保存。
(三)细管冻精的解冻和精子质量评定
1、精子活率
将细管冻精取出后迅速放入37℃的水浴中解冻45s，收集于小试管内，然后加入等体积的常温稀释液稀释，孵育10min，取10μL精液于载玻片上，盖上盖玻片，在400×倒置显微镜下评价精子活率(直线运动精子百分率)。每次至少检查200个精子，重复5次。
2、精子顶体完整率
利用FITC-PNA染液染色后，荧光显微镜观察精子顶体形态。
冻精细管解冻后，将精液加到2ml 3％PVP液面上，1500rpm离心6min，弃上清；用PBS洗2次，1500rpm离心6min，弃上清；用PBS(37℃)重悬精子，调整密度至1-2×106spe/ml；吸取30μl精子悬液，涂片，空气干燥，用甲醇固定10min；再加入30μl FITC-PNA染液，37℃黑暗潮湿环境孵育30min；PBS冲洗，空气干燥，滴少量封片剂，盖片，用无色指甲油封片，尽快在400×荧光显微镜下观察。每次至少检查200个精子，重复5次。
3、精子质膜完整率
采用果糖-柠檬酸钠低渗液进行低渗肿胀检测(HOST)。将解冻的精液用常规稀释液稀释，调整精子密度为1×l06个/ml，37℃孵育30min，取20μl精液于悬液滴于血细胞计数板上，400×显微镜下观察，计算弯尾精子百分率，每次至少检查200个精子，重复5次。
(四)精子质量评定结果
应用本发明的牛精液冷冻保存抗冻剂以及精液冷冻-解冻方法，评定结果如下表3所示：
当0.08mmol-0.14mmol花旗松素和10mg-25mg山奈酚时，冷冻-解冻后精子活率达70％，顶体完整率达79％，质膜完整率达71％。
表3
Figure BDA0002541753970000141
Figure BDA0002541753970000151
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.花旗松素和山奈酚配伍用于制备家畜冷冻保存剂的应用。
2.一种家畜精液冷冻保存剂，其特征在于，所述家畜冷冻保存剂包括花旗松素、山奈酚和冷冻基础液。
3.如权利要求2所述的家畜精液冷冻保存剂，其特征在于，所述冷冻基础液的配方为：葡萄糖1.1g，柠檬酸1.48g，Tris2.42g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，双蒸水100ml。
4.如权利要求3所述的家畜精液冷冻保存剂，其特征在于，100ml所述家畜精液冷冻保存剂中花旗松素添加量为0.08mmol-0.16mmol，山奈酚添加量为10mg-30mg。
5.如权利要求4所述的家畜精液冷冻保存剂，其特征在于，100ml所述家畜精液冷冻保存剂中花旗松素添加量为0.12mmol-0.16mmol，山奈酚添加量为10mg-25mg。
6.如权利要求4所述的家畜精液冷冻保存剂，其特征在于，100ml所述家畜精液冷冻保存剂中花旗松素添加量为0.08mmol-0.14mmol，山奈酚添加量为15mg-30mg。
7.如权利要求4所述的家畜精液冷冻保存剂，其特征在于，100ml所述家畜精液冷冻保存剂中花旗松素添加量为0.08mmol-0.14mmol，山奈酚添加量为10mg-25mg。
8.如权利要求2、3或4所述的家畜精液冷冻保存剂，其特征在于，所述家畜精液冷冻保存剂还包括鸡蛋黄或/和甘油。
9.如权利要求5所述的家畜精液冷冻保存剂，其特征在于，所述鸡蛋黄的体积占家畜冷冻保护剂体积的18％-22％。
10.如权利要求5所述的家畜精液冷冻保存剂，其特征在于，所述甘油的体积占家畜冷冻保护剂体积的3％-6％。
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