CN106538510A - 番茄红素和芝麻酚配伍在家畜精液冷冻保存剂中的应用 - Google Patents

番茄红素和芝麻酚配伍在家畜精液冷冻保存剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了番茄红素和芝麻酚配伍在家畜精液冷冻保存剂中的应用，本发明提供了一种家畜精液冷冻保存剂，能显著提高家畜精子的存活率，包括冷冻基础液、鸡蛋黄、番茄红素和芝麻酚，本发明还提供另一种家畜精液冷冻保存剂，包括冷冻基础液、鸡蛋黄、番茄红素、芝麻酚和甘油，本发明首次将番茄红素和芝麻酚配伍作为抗冻剂用于猪、羊和牛精液冷冻保存，适用于猪、羊和牛细管冷冻精液人工授精及精液超低温冷冻后的长期保存和长途运输后输精，可显著提高冷冻‑解冻后猪、羊和牛精子活率、顶体完整率、质膜完整率。

Description

番茄红素和芝麻酚配伍在家畜精液冷冻保存剂中的应用
技术领域
本发明属于哺乳动物精液的超低温冷冻保存技术领域，具体涉及番茄红素和芝麻酚配伍作为抗冻剂在家畜精液冷冻保存中的应用
背景技术
精液冷冻保存技术的发展解决了精液无法长期保存的问题，使采精和受精在时间和空间上得以分离，很大程度上延长了精子的体外储存时间，提高优良种畜的利用率，便于珍贵遗传物质的保存。
精子对温度变化比较敏感，在冷冻降温的过程中，精子容易遭受冷冻损伤，主要包括物理性损伤、化学性损伤和氧化性损伤。但跟鲜精液相比较，冷冻解冻后的精子，其活率、顶体完整率、线粒体活性、DNA完整率和膜完整率依然显著下降。而精子质量的好坏，与妊娠率、分娩率和窝产仔数密切相关。目前为止，冷冻精液人工授精技术已经应用于养牛生产，在奶牛繁殖和改良方面应用最为普及。但冷冻解冻后，依然有40％-50％精子失去活性，严重降低了良种公牛的利用率。而猪精子和羊精子对于冷冻刺激更为敏感，解冻后精子复苏率低，异常精子多，受胎率低于正常受胎率，故猪精子和羊精子冷冻还处于试验阶段。
试验证明，在精液冷冻过程中，添加抗氧化成份可以起到一定的保护作用。有关番茄红素和芝麻酚配比作为冷冻保护剂用于猪、羊和牛等家畜精液冷冻保存的研究国内外尚未见相关报道。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种家畜精液冷冻保存剂、以及其在猪、羊和牛精液冷冻保存剂中的应用，解决现有技术家畜精子活率低的问题。
未解决上述不足，本发明采用的技术方案如下：
番茄红素和芝麻酚配伍在家畜精液冷冻保存剂中的应用。
所述家畜精液冷冻保存剂，包括冷冻基础液、鸡蛋黄、番茄红素和芝麻酚。
上述的家畜精液冷冻保存剂中添加甘油的量体积比为6％～10％，即得到本发明的另外一种家畜精液冷冻保存剂。
以上所述冷冻基础液的配方为葡萄糖1.1g，柠檬酸1.48g，Tris2.42g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，双蒸水100ml。
所述家畜精液冷冻保存剂用于保存猪精液，100ml所述家畜精液冷冻保存剂中番茄红素添加量为0.15μmol-0.35μmol，芝麻酚添加量为15mg-30mg。
本发明所述家畜精液冷冻保存剂还可以用于保存羊精液，100ml所述家畜精液冷冻保存剂中番茄红素添加量为0.2μmol-0.4μmol，芝麻酚添加量为10mg-25mg。
本发明家畜精液冷冻保存剂也可以用于保存牛精液，94ml所述家畜精液冷冻保存剂中番茄红素添加量为0.2μmol-0.4μmol，芝麻酚添加量为15mg-30mg。
本发明的有益效果是：
本发明首次将番茄红素和芝麻酚配伍用于猪、羊和牛精液冷冻保存，效果可靠，易于推广，适用于猪、羊和牛细管冷冻精液人工授精及精液超低温冷冻后的长期保存和长途运输后输精，可显著提高冷冻-解冻后猪、羊和牛精子活率、顶体完整率和质膜完整率，保持精子的受精活力。
具体实施方式
活性氧(ROS)是机体在氧化代谢过程中所产生的正常副产物，在细胞代谢和维持体内平衡过程中发挥重要作用。通常情况下，精子细胞含有复杂的氧化还原系统，其抗氧化系统包含超氧化歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)，能将过量的ROS转化为安全的副产物以降低氧自由基对机体的损害。
精子在冷冻解冻过程中会产生大量的ROS，不仅能够引起精子的脂质过氧化，破坏精子膜结构和功能的完整性，还能够破坏精子DNA结构的完整性，造成DNA损伤。因此通过在冷冻稀释液中添加有效的外源抗氧化物质来帮助精子清除多余的ROS。
番茄红素是广泛存在于番茄类以及其他可食用果蔬和植物中的一种重要类胡萝卜素，不仅可以降低癌症发生率，而且可以预防一些心血管疾病，作为强抗氧化剂，能清除ROS，其清除氧自由基的速率是VE的100倍，防止脂蛋白和DNA受到氧化破坏。已有文献证明，在冷冻保护液中添加适当浓度的番茄红素，可以改善冷冻解冻后的人精液质量。
芝麻酚是存在于芝麻油中的一种木质素，具有良好的药理活性和潜在的抗氧化活性。到目前为止还没有相关文献报道关于芝麻酚对精液冷冻保存效果的影响，本申请发明人研究发现作为强抗氧化剂的番茄红素和弱抗氧化剂的芝麻酚，两者配伍能够有效提高精子内抗氧化酶活性。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施。需要说明的是，本发明不限于所举实施例，本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均应属于本发明的保护范围。
在以下的实施例中，所涉及的常温稀释液(Betsville Thawing Solution，BTS)配方为：葡萄糖3.7g，二水柠檬酸三钠0.6g，EDTA0.125g，碳酸氢钠0.125g，氯化钾0.075g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，双蒸水混匀，定容至100ml，调整PH至7.2，渗透压为310mosm/L。
本发明的一种家畜精液冷冻保存剂，包括冷冻基础液、鸡蛋黄、番茄红素和芝麻酚。
上述的家畜精液冷冻保存剂中添加甘油的量为6％～10％，即得到本发明的另外一种家畜精液冷冻保存剂，例如，上述的94ml家畜精液冷冻保存剂中添加甘油的量为6ml,即得到本发明的另外一种家畜精液冷冻保存剂。
所述冷冻基础液的配方为葡萄糖1.1g，柠檬酸1.48g，Tris2.42g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，双蒸水100ml。
实施例1：
本发明猪精液冷冻保存剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，配制冷冻基础液：准确量取葡萄糖1.1g，柠檬酸1.48g，Tris2.42g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，溶于100ml双蒸水中，调节pH至6.21，渗透压286mosm/L，配制成冷冻基础液；
步骤二，准确量取冷冻基础液80ml，加入新鲜鸡蛋黄20ml，0.15μmol-0.35μmol番茄红素和15mg-30mg芝麻酚，混匀即得到本发明的一种家畜精液冷冻保存剂。
取94ml的上述家畜精液冷冻保存剂添加6ml甘油，调节混合液的pH值为6.0～7.5，渗透压286mosm/L，过滤灭菌，冷却至室温，即可以得到本发明的另一种家畜精液冷冻保存剂用于保存猪精液，放入4℃冰箱中备用留做以下实验测试。
(一)精液采集
用手握法采精，经4层消毒纱布过滤除去胶状物，用显微镜在37℃下进行常规品质检查。选择无异味、色泽为乳白色、精子形态正常、活率在0.7以上的精液用于试验。
(二)精液处理与冷冻
将新鲜精液加入等温的常温稀释液(30℃，1：1稀释)，经纱布包裹后，在17℃恒温箱中平衡0.5h-1h。将平衡处理过的精液在17℃离心(1600×g，5min)，弃上清，加入等温两倍体积的I液，用纱布包裹后置于4℃冰箱中平衡1h-2h。调整精子密度为1.0×109个/ml，用专用注射器将精液吸入0.25ml细管内，快速封管，置于程序冷冻仪中以1℃/min的速率从4℃缓慢降至–5℃，迅速移至液氮上方2-3cm熏蒸5min-10min，将细管投入液氮中保存。
(三)细管冻精的解冻和精子质量评定
1、精子活率
将细管冻精取出后迅速放入37℃的水浴中解冻45s，收集于小试管内，然后加入四倍体积的常温稀释液稀释，孵育5min，取10μL精液于载玻片上，盖上盖玻片，在400×倒置显微镜下评价精子活率(直线运动精子百分率)。每次至少检查200个精子，重复5次。
2、精子顶体完整率
利用FITC-PNA染液染色后，荧光显微镜观察精子顶体形态。冻精细管解冻后，将精液加到2ml 3％PVP液面上，1500×g，6min离心洗2次，弃上清；用PBS(37℃)重悬调整密度至1～2×106个精子/ml；吸取30μl精子悬液，涂片，空气干燥，用纯甲醇固定10min；再加入30μl FITC-PNA染液，37℃黑暗潮湿环境孵育30min；PBS冲洗，空气干燥，滴少量甘油：PBS(9：1)，盖片，用无色指甲油封片，尽快在400×荧光显微镜下观察。每次至少检查200个精子，重复5次。
3、精子质膜完整率
采用果糖-柠檬酸钠低渗液进行低渗肿胀检测(HOST)。将解冻的精液用常规稀释液稀释，调整精子密度为1×l06个/ml，37℃孵育3O min，取20μl精液于悬液滴于血细胞计数板上，400×显微镜下观察，计算弯尾精子百分率，每次至少检查200个精子，重复5次。
(四)精子质量评定结果
应用本发明的猪精液冷冻保存抗冻剂以及精液冷冻-解冻方法，评定结果如下：
当在猪用冷冻Ⅰ液中添加0.15μmol-0.35μmol番茄红素和15mg-30mg芝麻酚时，冷冻-解冻后精子活率达68％，顶体完整率达72％，质膜完整率达78％。
试验例结果如下表1所示：
表1
处理 精子活率 顶体完整率 质膜完整率
对照组(未添加抗冻剂) 35％ 45％ 48％
实施例1 68％ 72％ 78％
对比例1：
本对比例用于猪精液的冷冻剂配制方法及对猪精子的质量检测同实施例1相同，不同的是，番茄红素的添加量为0.2μmol，并且冷冻剂中不含芝麻酚。
实验结果显示猪精子活率为53％，顶体完整率为57％，质膜完整率为58％。
对比例2：
本对比例用于猪精液的冷冻剂配制方法及对猪精子的质量检测同实施例1相同，不同的是，芝麻酚的添加量为20mg，并且冷冻剂中不含番茄红素。
实验结果显示猪精子活率为47％，顶体完整率为51％，质膜完整率为53％。
对比例1和对比例2均是发明人在抗冻剂中仅添加芝麻酚或者番茄红素所做的实验，但是实验效果均不理想，猪精子活率、顶体完整率和质膜完整率均比较低。
当芝麻酚和番茄红素配伍作为抗冻剂时，其活率、顶体完整率和质膜完整率均明显好于单独使用芝麻酚或者番茄红素，推测其原因，可能是由于作为强抗氧化剂的番茄红素和弱抗氧化剂的芝麻酚，两者合理配伍相互作用能够有效提高精子内抗氧化酶活性，从而提高精子活率。
实施例2：
本发明羊精液冷冻保存剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，配制冷冻基础液，方法同实施例1；
步骤二，准确量取冷冻基础液85ml，加入新鲜鸡蛋黄15ml，0.20μmol-0.40μmol番茄红素和10mg-25mg芝麻酚，混匀即配制成本发明的一种家畜精液冷冻保存剂。
取90ml的上述家畜精液冷冻保存剂添加10ml甘油配制成100ml的混合液，调节混合液的pH值为6.0～7.5，渗透压286mosm/L，过滤灭菌，冷却至室温，即得到本发明的另一种家畜精液冷冻保存剂用于保存羊精液，放入4℃冰箱中备用做以下实验。
(一)精液采集
用假阴道法采精，用显微镜在37℃下进行常规品质检查。选择无异味、色泽为乳白色、精子形态正常、活率在0.7以上、密度为“密”的精液用于试验。
(二)精液处理与冷冻
将新鲜精液用纱布包裹后，放入17℃恒温培养箱中平衡0.5h。
在平衡处理过的精液中加入等温两倍体积的的Ⅰ液，经纱布包裹后，在4℃冰箱中平衡2h。再在平衡处理过的精液中加入等温两倍体积的Ⅱ液，用纱布包裹后置于4℃冰箱中平衡1.5h-2h。调整精子密度为1.0×109个/ml，用专用注射器将精液吸入0.25ml细管内，快速封管，置于程序冷冻仪中以1℃/min的速率从4℃缓慢降至–5℃，迅速移至液氮上方2-3cm熏蒸6-8min，将细管投入液氮中保存。
(三)细管冻精的解冻和精子质量评定
1、精子活率
将细管冻精取出后迅速放入37℃的水浴中解冻45s，收集于小试管内，然后用常温稀释液等量稀释，孵育5min，取10μL精液于载玻片上，盖上盖玻片，在400×倒置显微镜下评价精子活率(直线运动精子百分率)。每次至少检查200个精子，重复5次。
2、精子顶体完整率
利用FITC-PNA染液染色后，荧光显微镜观察精子顶体形态，细管解冻后，将精液加到2ml 3％PVP液面上，1500×g，6min离心洗2次，弃上清；用PBS(37℃)重悬调整密度至1～2×106个精子/ml；吸取30μl精子悬液，涂片，空气干燥，用纯甲醇固定10min；再加入30μlFITC-PNA染液，37℃黑暗潮湿环境孵育30min；PBS冲洗，空气干燥，滴少量甘油：PBS(9：1)，盖片，用无色指甲油封片，尽快在400×荧光显微镜下观察。每次至少检查200个精子，重复5次。
3、精子质膜完整率
采用果糖-柠檬酸钠低渗液进行低渗肿胀检测(HOST)。将解冻的精液用常规稀释液稀释，调整精子密度为1×lO6个/ml，37℃孵育3O min，取20μl精液于悬液滴于血细胞计数板上，400×显微镜下观察，计算弯尾精子百分率，每次至少检查200个精子，重复5次。
(四)精子质量评定结果
应用本发明的羊用精液冷冻保护剂以及精液冷冻-解冻方法，评定结果如下：
当在羊用冷冻Ⅰ液中添加0.20μmol-0.40μmol番茄红素和10mg-25mg芝麻酚时，冷冻-解冻后精子活率达72％，顶体完整率达76％，质膜完整率达77％。结果如下表2所示：
表2
处理 精子活率 顶体完整率 质膜完整率
对照组(未添加抗冻剂) 52％ 51％ 55％
实施例2 72％ 76％ 77％
实施例3：
本发明牛精液冷冻保存剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，配制冷冻基础液，方法同实施例1；
步骤二，准确量取冷冻基础液74ml，加入新鲜鸡蛋黄20ml，0.2μmol-0.4μmol番茄红素、15mg-30mg芝麻酚，即得到本发明的一种家畜精液冷冻保存剂。
上述的家畜精液冷冻保存剂中加甘油6ml，混匀，调节pH值为6.0～7.5，渗透压286mosm/L，过滤灭菌，冷却至室温，即得到本发明的另一种家畜精液冷冻保存剂用于保存牛精液，放入4℃冰箱中备用做以下实验。
(一)精液采集
用假阴道法采精，用显微镜在37℃下进行常规品质检查。选择无异味、色泽为乳白色、精子形态正常、活率在0.7以上、密度为“密”的精液用于试验。
(二)精液处理与冷冻
将新鲜精液加入等温的冷冻保护剂，调整精子密度为1.5×106个/ml,经纱布包裹后，在4℃冰箱中平衡4h。
将平衡处理过的精液，用专用注射器将精液吸入0.25ml细管内，快速封管，置于程序冷冻仪中以1℃/min的速率从4℃缓慢降至–5℃，迅速移至液氮上方2-3cm熏蒸5-10min，将细管投入液氮中保存。
(三)细管冻精的解冻和精子质量评定
1、精子活率
将细管冻精取出后迅速放入37℃的水浴中解冻45s，收集于小试管内，然后用常温稀释液稀释，孵育5min，取10μL精液于载玻片上，盖上盖玻片，在400×倒置显微镜下评价精子活率(直线运动精子百分率)。每次至少检查200个精子，重复5次。
2、精子顶体完整率
利用FITC-PNA染液染色后，荧光显微镜观察精子顶体形态。冻精细管解冻后，将精液加到2ml 3％PVP液面上，1500×g，6min离心洗2次，弃上清；用PBS(37℃)重悬调整密度至1～2×106个精子/ml；吸取30μl精子悬液，涂片，空气干燥，用纯甲醇固定10min；再加入30μl FITC-PNA染液，37℃黑暗潮湿环境孵育30min；PBS冲洗，空气干燥，滴少量甘油：PBS(9：1)，盖片，用无色指甲油封片，尽快在400×荧光显微镜下观察。每次至少检查200个精子，重复5次。
3、精子质膜完整率
采用果糖-柠檬酸钠低渗液进行低渗肿胀检测(HOST)。将解冻的精液用常规稀释液稀释，调整精子密度为1×l06个/ml，37℃孵育3O min，取20μl精液于悬液滴于血细胞计数板上，400×显微镜下观察，计算弯尾精子百分率，每次至少检查200个精子，重复5次。
(四)精子质量评定结果
应用本发明的牛精液冷冻保存抗冻剂以及精液冷冻-解冻方法，评定结果如下：
表3
处理 精子活率 顶体完整率 质膜完整率
对照组(未添加抗冻剂) 44％ 70％ 65％
实施例3 69％ 78％ 74％
当添加0.2μmol-0.4μmol番茄红素和15mg-30mg芝麻酚时，冷冻-解冻后精子活率达69％，顶体完整率达78％，质膜完整率达74％。

Claims (8)

1.番茄红素和芝麻酚配伍在家畜精液冷冻保存剂中的应用。
2.权利要求1所述家畜精液冷冻保存剂，包括冷冻基础液、鸡蛋黄，其特征在于，所述家畜精液冷冻保存剂还包括番茄红素和芝麻酚。
3.如权利要求2所述家畜精液冷冻保存剂，其特征在于，所述冷冻基础液的配方为葡萄糖1.1g，柠檬酸1.48g，Tris2.42g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，双蒸水100ml。
4.如权利要求2所述家畜精液冷冻保存剂，其特征在于，所述家畜精液冷冻保存剂还包括甘油。
5.如权利要求3所述家畜精液冷冻保存剂，其特征在于，所述甘油的添加量为家畜精液冷冻保存剂体积的6％～10％。
6.权利要求2所述家畜精液冷冻保存剂用于保存猪精液，其特征在于，100ml所述家畜精液冷冻保存剂中番茄红素添加量为0.15μmol-0.35μmol，芝麻酚添加量为15mg-30mg。
7.权利要求2所述家畜精液冷冻保存剂用于保存羊精液，其特征在于，100ml所述家畜精液冷冻保存剂中番茄红素添加量为0.2μmol-0.4μmol，芝麻酚添加量为10mg-25mg。
8.权利要求2所述家畜精液冷冻保存剂用于保存牛精液，其特征在于，94ml所述家畜精液冷冻保存剂中番茄红素添加量为0.2μmol-0.4μmol，芝麻酚添加量为15mg-30mg。
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