CN106561633A - 一种人类精子冷冻保存液及人类精子冷冻保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人类精子冷冻保存液及人类精子的冷冻保存方法，以及人类精子冷冻复苏方法，所述冷冻保存液包括卵黄液、甘油、抗生素、冷冻缓冲液，与槲皮素或其衍生物。人类精子的冷冻保存与复苏方法为，使用上述人类精子冷冻保存液中，4℃冷平衡，‑80℃冷冻之后，转入液氮罐中冷冻储存；使用前在37℃水浴箱中解冻复苏。本发明添加适当浓度的槲皮素的精子冷冻保存液，能够有效保护精子，并在后续的精子复苏过程中，能够显著提高复苏后的精子存活率及活动力，从而减少精子ROS的产生以及凋亡的发生，辅助生殖技术方面具有应用潜力。

Description

一种人类精子冷冻保存液及人类精子冷冻保存方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类精子冷冻保存液及人类精子冷冻保存方法。
背景技术
据2012年《中国不孕不育现状调研报告》显示，中国不孕不育的发病率从20年前的3％提高到15％，其中男性因素占30％～40％，并呈增加的趋势。从20世纪90年代到至今，辅助生殖技术(ART)成为解决人类生育问题的重要手段。其中，精子冷冻保存是ART的重要保障，其不仅为无精子症或男方有遗传疾病的不育夫妇提供了生育可能，而且还为将要接受放化疗的肿瘤患者或有生育力保存要求的夫妇提供了生育保险。
虽然精子冻存技术在医学生物学及畜牧业等领域已得到广泛的应用，但是精子冻存后精子膜的完整性降低、精子运动能力及生存能力下降，从而使授精潜力下降。冻存还可导致精子过早获能，表现为膜的通透性增加、活性氧产生增多、胆固醇与磷脂比例降低，从而引起精子寿命缩短、活率降低。
发明内容
槲皮素(Quereetin)，化学名为3,3',4',5,7-五羟基黄酮(3,3',4',5,7-Pentahydroxyflavone)；存在于许多植物的花、叶、果实中，多以甙的形式存在，如芦丁(芸香甙)，槲皮甙，金丝桃甙等植物中含量较高。
意外地，发明人发现通过在精子冷冻液中添加适当浓度的槲皮素，可以提高冻存后精子的运动和生存能力，并减少氧化损伤。
即本发明的第一目的在于一种人类精子冷冻保存液，包括以下组分：卵黄液、甘油、抗生素、冷冻缓冲液，与槲皮素或其衍生物。
优选地，本发明的人类精子冷冻保存液中，所述卵黄液为20％质量体积比SPF卵黄液。
更优选地，本发明的人类精子冷冻保存液中，所述甘油为12％质量体积比甘油。
更优选地，本发明的人类精子冷冻保存液中，所述冷冻缓冲液为柠檬酸缓冲液、TES缓冲液的一种。
在本发明中，术语“槲皮素”，包括化学名为3,3',4',5,7-五羟基黄酮的化合物，也包括含槲皮素的植物提取物，所述植物提取物包括但不限于壳斗科植物伊比利亚栎Quercus iberica、小檗科植物红八角莲Dysosma veitchii(Hemsl.et Wils.)Fu、金丝桃科植物红旱莲(湖南连翘)Hypericum ascyron L.、夹竹桃科植物红麻Apocynum lancifoliumRus的皮、叶、根或全草。
本发明中，术语“槲皮素的衍生物”包括但不限于二氢槲皮素、槲皮素-3-半乳糖甙、槲皮素二水合物、异槲皮苷、槲皮素-7-葡萄糖苷、槲皮素-3-葡萄糖甙、槲皮素-3-龙胆二糖苷、槲皮素-3-D-木糖甙、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、或对槲皮素进行结构修饰的其他槲皮素的衍生物。即包括槲皮素的五羟基黄酮的功能基团，或其分子中2、3位间有双键，37、47位处有2个羟基故具有能作为金属螯合作用或氧化过程中产生的游离基团接受体的功能的任何槲皮素衍生物。
更优选地，本发明的人类精子冷冻保存液中，所述槲皮素或槲皮素衍生物含量为50μM(μmol/L)，或者所述槲皮素或槲皮素衍生物的有效含量为50μM。
本发明的另一目的在于提供一种人类精子的冷冻保存方法，包括以下步骤：取精、液化后，加入到上述人类精子冷冻保存液中，4℃冷平衡，-80℃冷冻之后，转入液氮罐中冷冻储存。
优选地，本发明的人类精子的冷冻保存方法中，所述4℃冷平衡时间为10min。
优选地，本发明的人类精子的冷冻保存方法中，所述-80℃冷冻时间为20min。
本发明的再一目的在于提供一种人类精子冷冻保存液中精子的复苏方法，将上述人类精子的冷冻保存方法中获得的液氮保藏的人类精子在37℃水浴箱中解冻复苏。
槲皮素(Quercetin)又名栎精，槲皮黄素，是一种具有抗肿瘤、消炎功能的黄酮类化合物。可作为药品，具有较好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用。此外还有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉，增加冠脉血流量等作用。用于治疗慢性支气管炎。对冠心病及高血压患者也有辅助治疗作用。近期发现槲皮素能够槲皮素能减轻睾丸扭转复位后引起的损伤。
意外地，发明人发现添加了适当浓度的槲皮素的精子冷冻保存液，该精子冷冻保存液能够有效保护精子，并在后续的精子复苏过程中，能够显著提高复苏后的精子存活率及活动力，从而减少精子ROS的产生以及凋亡的发生，为辅助生殖技术(ART)提供了有力的支持，具有明显的工业应用价值。
附图说明
图1本发明的一个实施例中的人类精子的冷冻保存、复苏及检验流程示意图；
图2本发明实施例1人类精子不同冷冻保存方法处理的精液复苏后镜检分析结果图；
图3本发明实施例1不同冷冻保存方法处理的精液复苏后凋亡检测、活性氧检测图。
具体实施方式
在本发明的一个实施例中，提供了一种人类精子冷冻保存液，包括以下组分：卵黄液、甘油、抗生素、冷冻缓冲液，与槲皮素或其衍生物。
在本发明的另一个实施例中，所述卵黄液为20％质量体积比SPF卵黄液。
在本发明的另一个实施例中，所述甘油为12％质量体积比甘油。
在本发明的另一个实施例中，所述冷冻缓冲液为柠檬酸缓冲液、TES缓冲液的一种。
在本发明的另一个实施例中，所述槲皮素含量为50μM。
在本发明的又一个实施例中，提供了一种人类精子的冷冻保存方法，包括以下步骤：取精、液化后，加入到上述人类精子冷冻保存液中，4℃冷平衡，-80℃冷冻之后，转入液氮罐中冷冻储存。
在本发明的另一个实施例中，所述4℃冷平衡时间为10min。
在本发明的另一个实施例中，所述-80℃冷冻时间为20min。
在本发明的又一个实施例中，还提供了一种人类精子冷冻保存液中精子的复苏方法，即将上述人类精子的冷冻保存方法中获得的液氮保藏的人类精子在37℃水浴箱中解冻复苏。
以下通过具体实施例进一步对本发明的技术方案进行说明，应理解以下仅为本发明的示例性说明，并不用于限制本发明权利要求的保护范围。
实施例1人类精子的冷冻保存、复苏及检验
根据《WHO人类精液检查和处理实验室手册》(第5版)正常标准进行选取正常的取精者20例。精液30min液化混匀后，分为2份(对照组和实验组)，每份1mL，移入15mL离心管中。对照组添加冻存液(配方为20％m/v SPF级蛋黄液、12％m/v甘油、10μg/mL庆大霉素、TES缓冲液(1×，pH7.5)，一滴一滴加入1mL的冻存液，混匀，转移至2mL冻存管中，实验组添加等量含50μM槲皮素的冻存液，混匀并转移至冻存管。之后两组4℃冷平衡10min，-80℃冰箱冷冻20min，之后转入液氮罐中冷冻储存。冷冻于液氮罐中的精液标本，在冻存48h后，从液氮罐中取出，直接放于37℃水浴箱中解冻复苏，用于后续检测，流程图见图1。
1、镜检分析
对上述两组复苏人类精子，采用计算机辅助精液分析(CASA)系统分析精液常规参数，主要比较两组精子存活率(a级+b级+c级)及活动率(a级+b级)。结果显示(参见图2)，如图2所示，本发明方法处理的精子复苏后，存活率为(35.5±5.21)％，活动率为(20.4±4.23)％；而对照组的存活率为(27.1±4.75)％，活动率为(16.6±3.89)％(n＝20，*P<0.05)，因此，说明实验组的精子存活率及活动率都高于对照组(P<0.05)。
(精子活力是指精液中呈前进运动精子所占的百分率，一般分为4个等级，0级(d级)表示精子不能活动，不运动；1级(c级)表示精子非向前运动，原地运动；
2级(b级)表示精子缓慢或呆滞向前移动，缓慢运动；
3级(a级)表示精子快速直线前向运动，直线运动。
依据来自《WHO laboratory manual for the examination and processing ofhuman semen》。
2、活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测：采用GENMED细胞内氧化应激活性氧高级荧光测定试剂盒，参照试剂盒说明书步骤如下：将精子细胞浓度调至1×106ml-1，300g离心5min，去上清液，加1mL GENMED染色工作液，轻柔混匀，37℃避光孵育20min，300g离心5min，去上清液，加入预冷的0.4mLGENMED保存液轻柔混匀，流式细胞仪检测。
如图3所示，其中A为对照组ROS阳性，B为实验组ROS阳性；结果显示，实验组ROS阳性率为(11.83±1.04)％，对照组ROS阳性率为(17.63±2.91)％，两组相比有统计学意义(P<0.05)，其中M2为阳性细胞百分率。
3、凋亡检测：采用GENMED TUNEL流式细胞仪分析试剂盒，参照试剂盒说明书步骤如下：加GENMED固着液，混匀，滴加GENMED通透液，400g离心10min，加GENMED湿润液，800g离心5min，加GENMED反应液，37℃避光孵育60min，800g离心5min，加GENMED酶解液，室温避光孵育20min，800g离心5min，加GENMED终止液，室温避光孵育30min，800g离心5min，加GENMED缓冲液，800g离心5min，加GENMED染色液A，室温避光孵育30min，800g离心5min，加GENMED清理液，800g离心5min，重复2次，加GENMED染色液B，混匀，流式细胞仪检测。
如图3所示，其中C为对照组TUNEL阳性，D为实验组TUNEL阳性；结果显示：实验组TUNEL阳性率为(10.86±2.69)％，对照组TUNEL阳性率为(15.01±2.98)％，两组相比有统计学意义(P<0.05)。
综上，研究结果表明在冷冻保护剂中添加50μM槲皮素，能显著性提高冻存后复苏精子的存活率(a级+b级+c级)及活动率(a级+b级)，可以有效抑制精子冻融后ROS的产生，减少精子在冷冻过程中受到的氧化损伤，能够减少精子凋亡的发生。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种人类精子冷冻保存液，包括以下组分：
卵黄液、甘油、抗生素、冷冻缓冲液，与槲皮素或其衍生物。
2.根据权利要求1所述的人类精子冷冻保存液，其特征在于，所述卵黄液为20％质量体积比SPF卵黄液。
3.根据权利要求1所述的人类精子冷冻保存液，其特征在于，所述甘油为12％质量体积比的甘油。
4.根据权利要求1所述的人类精子冷冻保存液，其特征在于，所述冷冻缓冲液为柠檬酸缓冲液、TES缓冲液的一种。
5.根据权利要求1～4所述的人类精子冷冻保存液，其特征在于，所述槲皮素的衍生物包括二氢槲皮素、槲皮素-3-半乳糖甙、槲皮素二水合物、异槲皮苷、槲皮素-7-葡萄糖苷、槲皮素-3-葡萄糖甙、槲皮素-3-龙胆二糖苷、槲皮素-3-D-木糖甙、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷的一种或几种。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的人类精子冷冻保存液，其特征在于，所述槲皮素或其衍生物含量为50μM。
7.一种人类精子的冷冻保存方法，包括以下步骤：取精、液化后，加入到如权利要求1～6任意一项所述的人类精子冷冻保存液中，4℃冷平衡，-80℃冷冻之后，转入液氮罐中冷冻储存。
8.根据权利要求7所述的人类精子冷冻保存方法，其特征在于，所述4℃冷平衡时间为10min。
9.根据权利要求7所述的人类精子冷冻保存液方法，其特征在于，所述-80℃冷冻时间为20min。
10.一种人类精子冷冻保存液中精子的复苏方法，其特征在于，将权利要求7～9任意一项所述的方法获得的液氮保藏的人类精子在37℃水浴箱中解冻复苏。
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