CN109997844A - 灵芝多糖在家畜精液冷冻长期保存中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在家畜精液冷冻保存中应用的保护剂，该保护剂能显著提高家畜精子的存活率，其主要物质是灵芝多糖。本发明主要创新是在国内外首次将灵芝多糖作为保护剂，用于猪、羊和牛细管冷冻精液长期保存、人工授精及精液超低温冷冻后的长途运输后输精，可显著提高冷冻‑解冻后猪、羊和牛精子活率、顶体完整率和质膜完整率。
Description
技术领域
本发明属于哺乳动物精液的超低温冷冻保存技术领域，具体涉及灵芝多糖作为抗冻保护剂在家畜精液冷冻保存中的应用。
背景技术
精子冷冻技术是人工授精的重要革新，不仅解决了雄性动物精液的长期保存问题，便于保存遗传资源，而且应用方便，不受时间及空间的限制，在开展省际、国际之间畜牧业的协作，在建立全球优良物种基因库等方面起到重要作用。精子冷冻技术的广泛应用，有利于提高优秀种公畜的利用率，减少公畜的饲养量，减少经济成本，提高了畜牧业效益，尤其在人工授精领域方面起到重要的作用。精液冷冻技术对我国及国际的畜牧业可持续发展和畜产品的满足供应具有重要现实意义。
精子对温度变化比较敏感，在冷冻降温的过程中，精子容易遭受冷冻损伤，主要包括物理性损伤、化学性损伤和氧化性损伤。跟新鲜精液相比，冷冻-解冻后的精子，其活率、顶体完整率、线粒体活性、DNA完整率和膜完整率显著下降。而精子质量的好坏，与妊娠率、分娩率和窝产仔数密切相关。目前为止，冷冻精液人工授精技术已经应用于养牛生产，在奶牛繁殖和改良方面应用最为普及。但冷冻解冻后，依然有40％-50％精子失去活性，严重降低了良种公牛的利用率。而猪精子和羊精子对于冷冻刺激更为敏感，解冻后精子复苏率低，异常精子多，受胎率低于正常受胎率，故猪精子和羊精子冷冻还处于试验阶段。
灵芝是一种重要的中药材，属多孔菌科类真菌，灵芝多糖中除含有葡萄糖外，大多还含有阿拉伯糖、木糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖、鼠李糖等单糖多糖的药理活性与单糖间糖苷键的结合形式有关。单糖间以β-1,3、1,6或β-1,4、1,6-糖苷键连接是有效的即具有药理活性，而纯β-1,4-糖背键连接的则没有药理活性。灵芝多糖是灵芝中的一种重要的活性物质，前人研究表明，具有免疫调节、抗肿瘤和抗衰老等生物活性。
由于灵芝多糖具有特有的生理活性和临床作用，且安全无毒，可广泛应用于医药、食品和化妆品行业。基于灵芝多糖可提高机体免疫力，在癌症病人经放疗、化疗机体免疫力受损的情况下，与放疗、化疗配合可达到治愈疾病的目的。另外，灵芝多糖还可抑制过敏反应介质的释放，从而阻断非特异性反应的发生，因此又可抑制手术后癌细胞复发和转移。已投入使用的灵芝制剂有片剂、针剂、冲剂、口服液、糖浆剂和酒剂等，均取得了一定的临床疗效。灵芝多糖作为功能因子可制成保健食品，也可作为食品添加剂加入饮料、糕点、口服液中，这些都极大地丰富了食品市场。
关于灵芝多糖作为家畜精液冷冻保护剂用于猪、羊和牛等家畜精子冷冻长期保存，甚至任何哺乳类精液冷冻保存的研究，直到目前为止，国内外未查阅到相关报道。所以，本研究通过大量反复试验和剂量冷冻筛选，发现了灵芝多糖在家畜精液冷冻保护中，特别在猪、羊和牛等家畜精子冷冻保存后，可明显提高了冷冻后精子活率和膜完整性等。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种家畜精液冷冻保护剂、以及其在猪、羊和牛精液冷冻保存中的应用，解决了现有技术家畜精子冷冻-解冻后活率较低的问题。
为解决上述不足，本发明采用的技术方案如下：
灵芝多糖在家畜精液冷冻保存中的应用。所述家畜精液冷冻保护剂主要是灵芝多糖。
其次冷冻过程中，需要的常规冷冻基础液、鸡蛋黄和甘油等。特别要强调的是上述的家畜精液冷冻保存剂中添加甘油的量体积比为6％-12％。
以灵芝多糖作为主要冷冻保护剂，冷冻过程中，需要完全溶解于常规冷冻基础液的配方中(葡萄糖1.1g，柠檬酸1.48g，Tris2.42g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，双蒸水100mL)。
所述家畜精液冷冻保存剂用于保存猪精液，100mL所述家畜精液冷冻保存剂中灵芝多糖添加量为0.010mgl-0.090mg。
本发明所述家畜精液冷冻保存剂还可以用于保存羊精液，100mL所述家畜精液冷冻保存剂中灵芝多糖添加量为0.020mg-0.085mg。
本发明所述家畜精液冷冻保存剂也可以用于保存牛精液，100mL所述家畜精液冷冻保存剂中灵芝多糖添加量为0.040mg-0.100mg。
本发明的主要优点：
本发明在国际上首次将灵芝多糖用于猪、羊和牛精液冷冻保存，效果可靠，易于推广，适用于猪、羊和牛细管冷冻精液人工授精及精液超低温冷冻后的长期保存和长途运输后输精，可显著提高冷冻-解冻后猪、羊和牛精子活率、顶体完整率和质膜完整率，保持精子的受精能力。
具体实施方式
在以下的实施例中，所涉及的常温稀释液(Betsville Thawing Solution，BTS)配方为：葡萄糖3.7g，二水柠檬酸三钠0.6g，EDTA0.125g，碳酸氢钠0.125g，氯化钾0.075g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，双蒸水混匀，定容至100mL，调整PH至7.2，渗透压为310mosm/L。
本发明所述家畜精液冷冻保存剂主要是灵芝多糖。其次在冷冻过程中，像其他常规冷冻途径一样，也需要常规冷冻基础液、鸡蛋黄和甘油等。上述的家畜精液冷冻保存剂中添加甘油的量的体积比为6％-12％，例如，上述的94mL家畜精液冷冻保存剂中添加甘油的量为6mL。
所述冷冻基础液的配方为葡萄糖1.1g，柠檬酸1.48g，Tris2.42g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，双蒸水100mL。
实施例1：
本发明猪精液冷冻保护剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，配制冷冻基础液：准确量取葡萄糖1.1g，柠檬酸1.48g，Tris2.42g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，溶于100mL双蒸水中，调节pH至6.21，渗透压286mosm/L，配制成冷冻基础液；
步骤二，准确量取冷冻基础液80mL，加入新鲜鸡蛋黄20mL，灵芝多糖0.030mgl-0.060mg，混匀即得到本发明的一种家畜精液冷冻保存剂(I液)。
取94mL的上述家畜精液冷冻保护剂添加6mL甘油，过滤灭菌，冷却至室温，即可以得到本发明的另一种家畜精液冷冻保存剂(II液)用于保存猪精液，放入4℃冰箱中备用留做以下试验测试。
发明人对该实施例的猪精液冷冻保存稀释液使用效果进行了如下试验：
(一)精液采集
用手握法采精，经4层消毒纱布过滤除去胶状物，用光学显微镜34-37℃下进行常规品质检查。选择无异味、色泽为乳白色、精子形态正常、活率在0.75以上、密度为“密”的精液，30℃保温用于试验。
(二)精液处理与冷冻
将新鲜精液加入等温的常温稀释液(30℃，1：1稀释)，经多层纱布包裹后，在17℃恒温箱中平衡0.5h-1h。将平衡处理过的精液在17℃离心(1200rpm，10min)，弃上清，加入等温的两倍体积的I液，用多层纱布包裹后置于4℃冰箱中平衡1h-1.5h。之后将平衡处理过的精液加入4℃的等体积Ⅱ液，用纱布包裹后置于4℃冰箱中再平衡1.5-2.5h。用专用注射器将精液吸入0.25mL细管内，快速封管，置于程序冷冻仪中以1℃/min的速率从4℃降至–5℃，移至液氮上方2.5-3.5cm熏蒸10-15min，将细管投入液氮中保存。
(三)细管冻精的解冻和精子质量评定
1、精子活率
将细管冻精取出后迅速放入37℃的水浴中解冻45s，收集于小试管内，然后加入等体积的、37℃预热过的常温稀释液稀释，孵育10min，取10μL精液于载玻片上，盖上盖玻片，在400×倒置显微镜下评价精子活率(直线运动精子百分率)。每次检查200-300个精子，重复5次。
2、精子顶体完整率
利用FITC-PNA染液染色后，荧光显微镜观察精子顶体形态。
冻精细管解冻后，将精液加到2mL 3％聚乙烯吡咯烷酮液面上，1500rpm离心6min，弃上清；用磷酸缓冲盐溶液洗2次，1500rpm离心6min，弃上清；用磷酸缓冲盐溶液(37℃)重悬精子，调整密度至1-2×106spe/mL；吸取30μl精子悬液，涂片，空气干燥，用甲醇固定10min；再加入30μl FITC-PNA染液，37℃黑暗潮湿环境孵育30min；磷酸缓冲盐溶液冲洗，空气干燥，滴少量封片剂，盖片，用无色指甲油封片，尽快在400×荧光显微镜下观察。每次检查200-300个精子，重复5次。
3、精子质膜完整率
采用果糖-柠檬酸钠低渗液进行低渗肿胀检测(HOST)。将解冻的精液用低渗液稀释，调整精子密度为1×l06spe/mL，37℃孵育30min，取20μl精液于悬液滴于血细胞计数板上，400×显微镜下观察，计算弯尾精子百分率，每次检查200-300个精子，重复5次。
(四)精子质量评定结果
应用本发明的猪精液冷冻保存抗冻剂以及精液冷冻-解冻方法，评定结果如下：
当在猪用冷冻Ⅰ液中添加0.010mgl-0.090mg灵芝多糖时，冷冻-解冻后精子活率达61％，顶体完整率达68％，质膜完整率达65％。
试验例结果如下表1所示：
表1
| 处理 | 精子活率 | 顶体完整率 | 质膜完整率 |
| 对照组 | 26％ | 40％ | 34％ |
| 实施例1 | 61％ | 68％ | 65％ |
实施例2：
本发明羊精液冷冻保存剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，配制冷冻基础液，方法同实施例1。
步骤二，准确量取冷冻基础液85mL，加入新鲜鸡蛋黄15mL和灵芝多糖0.020mg-0.085mg，混匀即配制成本发明的一种家畜精液冷冻保存剂(I液)。
取88mL的上述家畜精液冷冻保存剂添加12mL甘油配制成100mL的混合液，过滤灭菌，冷却至室温，即得到本发明的另一种家畜精液冷冻保存剂(II液)用于保存羊精液，放入4℃冰箱中备用做以下试验。
(一)精液采集
用假阴道法采精，用显微镜在34-37℃下进行常规品质检查。选择无异味、色泽为乳白色、精子形态正常、活率在0.7以上、密度为“密”的精液，30℃保温用于试验。
(二)精液处理与冷冻
将新鲜精液中加入等温等体积的的Ⅰ液，经多层纱布包裹后，在4℃冰箱中平衡2h。再在平衡处理过的精液中加入等温等体积的Ⅱ液，用多层纱布包裹后置于4℃冰箱中平衡1-1.5h。用专用注射器将精液吸入0.25mL细管内，快速封管，置于程序冷冻仪中以1℃/min的速率从4℃降至–5℃，移至液氮上方2.5-3.5cm熏蒸6-8min，将细管投入液氮中保存。
(三)细管冻精的解冻和精子质量评定
1、精子活率
将细管冻精取出后迅速放入37℃的水浴中解冻25s，收集于小试管内，然后用等体积的、37℃预热过的常温稀释液稀释，孵育10min，取10μL精液于载玻片上，盖上盖玻片，在400×倒置显微镜下评价精子活率(直线运动精子百分率)。每次检查200-300个精子，重复5次。
2、精子顶体完整率
利用FITC-PNA染液染色后，荧光显微镜观察精子顶体形态。
冻精细管解冻后，将精液加到2mL 3％聚乙烯吡咯烷酮液面上，1500rpm离心6min，弃上清；用磷酸缓冲盐溶液洗2次，1500rpm离心6min，弃上清；用磷酸缓冲盐溶液(37℃)重悬精子，调整密度至1-2×106spe/mL；吸取30μl精子悬液，涂片，空气干燥，用甲醇固定10min；再加入30μl FITC-PNA染液，37℃黑暗潮湿环境孵育30min；磷酸缓冲盐溶液冲洗，空气干燥，滴少量封片剂，盖片，用无色指甲油封片，尽快在400×荧光显微镜下观察。每次检查200-300个精子，重复5次。
3、精子质膜完整率
采用果糖-柠檬酸钠低渗液进行低渗肿胀检测(HOST)。将解冻的精液用常规稀释液稀释，调整精子密度为1×l06spe/mL，37℃孵育30min，取20μl精液于悬液滴于血细胞计数板上，400×显微镜下观察，计算弯尾精子百分率，每次检查200-300个精子，重复5次。
(四)精子质量评定结果
应用本发明的羊用精液冷冻保护剂以及精液冷冻-解冻方法，评定结果如下：
当在羊用冷冻Ⅰ液中添加0.020mg-0.085mg的灵芝多糖时，冷冻-解冻后精子活率达68％，顶体完整率达70％，质膜完整率达60％。结果如下表2所示：
表2
| 处理 | 精子活率 | 顶体完整率 | 质膜完整率 |
| 对照组 | 43％ | 51％ | 40％ |
| 实施例2 | 68％ | 70％ | 60％ |
实施例3：
本发明牛精液冷冻保存剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，配制冷冻基础液，方法同实施例1；
步骤二，准确量取冷冻基础液80mL，加入新鲜鸡蛋黄20mL和灵芝多糖0.040mg-0.100mg，即得到本发明的一种家畜精液冷冻保存剂(I液)。
上述的家畜精液冷冻保存剂中加甘油6mL，混匀，过滤灭菌，冷却至室温，即得到本发明的另一种家畜精液冷冻保存剂(II液)用于保存牛精液，放入4℃冰箱中备用做以下试验。
(一)精液采集
用假阴道法采精，用显微镜在37℃下进行常规品质检查。选择无异味、色泽为乳白色、精子形态正常、活率在0.7以上、密度为“密”的精液，37℃保温用于试验。
(二)精液处理与冷冻
将新鲜精液加入等温的II液，调整精子密度为1.5×106个/mL,经纱布包裹后，在4℃冰箱中平衡4h。
将平衡处理过的精液，用专用注射器将精液吸入0.25mL细管内，快速封管，置于程序冷冻仪中以1℃/min的速率从4℃降至–5℃，移至液氮上方2-3cm熏蒸5-10min，将细管投入液氮中保存。
(三)细管冻精的解冻和精子质量评定
1、精子活率
将细管冻精取出后迅速放入37℃的水浴中解冻45s，收集于小试管内，然后加入等体积的常温稀释液稀释，孵育10min，取10μL精液于载玻片上，盖上盖玻片，在400×倒置显微镜下评价精子活率(直线运动精子百分率)。每次检查200-300个精子，重复5次。
2、精子顶体完整率
利用FITC-PNA染液染色后，荧光显微镜观察精子顶体形态。
冻精细管解冻后，将精液加到2mL 3％聚乙烯吡咯烷酮液面上，1500rpm离心6min，弃上清；用磷酸缓冲盐溶液洗2次，1500rpm离心6min，弃上清；用磷酸缓冲盐溶液(37℃)重悬精子，调整密度至1-2×106spe/mL；吸取30μl精子悬液，涂片，空气干燥，用甲醇固定10min；再加入30μl FITC-PNA染液，37℃黑暗潮湿环境孵育30min；磷酸缓冲盐溶液冲洗，空气干燥，滴少量封片剂，盖片，用无色指甲油封片，在400×荧光显微镜下观察。每次检查200-300个精子，重复5次。
3、精子质膜完整率
采用果糖-柠檬酸钠低渗液进行低渗肿胀检测(HOST)。将解冻的精液用常规稀释液稀释，调整精子密度为1×l06个/mL，37℃孵育30min，取20μl精液于悬液滴于血细胞计数板上，400×显微镜下观察，计算弯尾精子百分率，每次检查200-300个精子，重复5次。
(四)精子质量评定结果
应用本发明的牛精液冷冻保存抗冻剂以及精液冷冻-解冻方法，评定结果如下：
当添加灵芝多糖0.040mg-0.100mgl时，冷冻-解冻后精子活率达70％，顶体完整率达78％，质膜完整率达65％。结果如表3所示：
表3
| 处理 | 精子活率 | 顶体完整率 | 质膜完整率 |
| 对照组 | 46％ | 63％ | 54％ |
| 实施例3 | 70％ | 78％ | 65％ |
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (7)
1.灵芝多糖作为保护剂在猪、羊、牛精液冷冻保存中的应用。
2.权利要求1所述家畜精液冷冻保护剂，主要物质是灵芝多糖。
3.如权利要求2所述家畜精液冷冻保护剂灵芝多糖，其特征在于其完全溶解于常规的冷冻基础液的配方中(葡萄糖1.1g，柠檬酸1.48g，Tris2.42g，青霉素钠0.06g，硫酸链霉素0.1g，双蒸水100mL)。
4.如权利要求2所述家畜精液冷冻保护剂灵芝多糖，其特征在于，其冷冻过程中和另一种保护剂甘油能协同作用,甘油的添加量为家畜精液冷冻保护剂体积的6％-12％。
5.权利要求2所述家畜精液冷冻保护剂灵芝多糖用于保存猪精液，其特征在于，100mL所述家畜精液冷冻保存剂中灵芝多糖添加量为0.010mg-0.090mg。
6.权利要求2所述家畜精液冷冻保护剂灵芝多糖用于保存羊精液，其特征在于，100mL所述家畜精液冷冻保存剂中灵芝多糖添加量为0.020mg-0.085mg。
7.权利要求2所述家畜精液冷冻保护剂灵芝多糖用于保存牛精液，其特征在于，100mL所述家畜精液冷冻保存剂中灵芝多糖添加量为0.040mg-0.100mg。
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