CN108244095B - 一种猪冻精解冻稀释液及其配制方法 - Google Patents

一种猪冻精解冻稀释液及其配制方法 Download PDF

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Abstract

一种猪冻精解冻稀释液及其配制方法，本发明属于猪冻精解冻技术领域。本发明要解决的技术问题是猪冷冻精液在解冻稀释过程中极易发生精子的氧化损伤。本发明的组分：D‑葡萄糖、果糖、氯化钾、乙二胺四乙酸二钠、碳酸氢钠，柠檬酸三钠、聚乙烯醇、庆大霉素、黄芪多糖和白藜芦醇。方法：一、将D‑葡萄糖、果糖、氯化钾、乙二胺四乙酸二钠、碳酸氢钠，柠檬酸三钠、聚乙烯醇，用双蒸水配制成水溶液；二、置于26℃水浴锅中平衡至充分溶解并且pH值稳定；三、除菌滤器过滤；四、使用前30分钟加入庆大霉素、黄芪多糖和白藜芦醇。本发明有效地产生抗氧化作用，降低了冻精解冻稀释过程剧烈稳定变化对精子的氧化损伤。

Description

一种猪冻精解冻稀释液及其配制方法
技术领域
本发明属于猪冻精解冻技术领域，具体涉及一种猪冻精解冻稀释液及其配制方法。
背景技术
超低温冷冻保存技术打破了鲜精对于时间和空间的限制。猪精液超低温冷冻保存可以充分发挥优质种公猪的种群繁殖的遗传潜能，可加快家畜品种改良、建立动物种质资源库，也可给养猪业带来快速的发展，是一种高效低成本的猪精液保存途径。另一方面，作为国家战略，地方猪资源的种群恢复、选育已刻不容缓，而保存冷冻精液是一种重要手段。我国拥有丰富的地方特有品种，但是现在这些地方品种存在基因资源不断退化和保有的种群规模逐渐减小的严峻问题，而精液的超低温冷冻保存技术将极大的有利于珍贵地方品种的保护。猪精液的超低温冷冻保存技术研究始于20世纪50年代，20世纪70年代后猪精液的冷冻保存技术有了较快的发展。1971年，Crab和Einarsso成功的进行了第一例利用冷冻猪精子的人工授精。从那时起不断改进的冷冻程序被陆续报道。目前为止，发达国家已经建立起来了较为成熟的猪精液超低温冷冻保存技术体系，而且主要应用于优质种公猪上。相比之下，我国猪精液的超低温冷冻保存效果仍不理想，尚未大规模应用于商业领域，主要原因是超低温冷冻对技术水平要求较高，另外该技术还存在不稳地的情况。
公猪精液冷冻解冻稀释后受精能力下降得到了公认。有一些假设被提出来解释这个现象的原因。其中氧化损伤被认为是主要因素。氧化损伤主要是由精子活性氧(如过氧化氢，超氧化物阴离子，羟自由基)水平的升高引起，活性氧能够破坏精子的蛋白、DNA和质膜中脂质。公猪精液对活性氧敏感性的原因是因为膜脂质中不饱和脂肪酸的浓度相对较高，而精浆的天然抗氧化能力相对较低。特别是，在冷冻保存和解冻稀释过程中产生的超氧自由基将导致精子膜的脂质过氧化，膜的完整性降低和精子凋亡的增加，从而影响精子活力。
目前的猪冻精解冻稀释液主要使用的鲜精稀释液的配方，或者基于鲜精稀释液的配方进行了微调。主要由以下成分组成：营养物质，主要是为猪精子提供外源性的营养和能量，以延长精子的寿命。由于猪精子的代谢过程不能利用复杂的合成作用将复杂能量物质转变为可利用成分，所以稀释液中的营养成分一般是最简单的能源物质。
目前的猪冻精解冻稀释液主要的问题是抗氧化能力不足，由于冻精的解冻过程温度由零下196摄氏度在20秒内迅速升为25摄氏度左右，这是一个非常剧烈的温度变化，在此过程中会产生大量的活性氧，而目前使用的冻精解冻稀释液是按照鲜精稀释液的配方进行抗氧化成分的添加，因此存在不能有效抵抗精子在复苏过程中受到的氧化损伤。
发明内容
本发明要解决的技术问题是猪冷冻精液在解冻稀释过程中极易发生精子的氧化损伤，从而造成受精率的降低、窝产仔数减少，严重制约着猪冷冻精液的应用；本发明提供了一种猪冻精解冻稀释液及其配制方法。本发明可有效保护冻精解冻稀释过程中的精子，从而提高冻精解冻稀释后精子活力与受精能力，扩大优良种公猪的利用效率，减少公猪的饲养量，降低猪场生产成本，显著增加经济效益。
为解决上述技术问题，本发明的一种猪冻精解冻稀释液由以下组分组成：D-葡萄糖、果糖、氯化钾、乙二胺四乙酸二钠、碳酸氢钠，柠檬酸三钠、聚乙烯醇、庆大霉素、黄芪多糖和白藜芦醇。
1000mL解冻稀释液中各组分的配比是：D-葡萄糖15g～25g、果糖5～10g、氯化钾0.1g～1.0g、乙二胺四乙酸二钠1g～3g、碳酸氢钠1g～3g，柠檬酸三钠2g～10g、聚乙烯醇0.5g～2g、庆大霉素(30～50)万IU、黄芪多糖2g～10g、白藜芦醇0.2g～0.5g。
上述猪冻精解冻稀释液的配制方法是按下述步骤进行的：
步骤一、将D-葡萄糖、果糖、氯化钾、乙二胺四乙酸二钠、碳酸氢钠，柠檬酸三钠、聚乙烯醇，用双蒸水配制成水溶液；
步骤二、置于26℃水浴锅中平衡至充分溶解并且pH值稳定；
步骤三、用0.22μm除菌滤器进行过滤；
步骤四、使用前30分钟加入庆大霉素、黄芪多糖和白藜芦醇，得到用于冻精解冻稀释液。
本发明冻精解冻稀释液的pH值为6.8-7.0，渗透压为300-320mOsmo。
本发明的猪精液稀释液添加D-葡萄糖、果糖单糖作为精液主要能量来源；
本发明使用碳酸氢钠，柠檬酸三钠来维持维持稳定的pH值与渗透压；
精液如果被微生物污染会导致精子活力降低，存活时间缩短，另外也会对人工授精后的母畜造成疾病威胁，本发明使用庆大霉素抗菌成分，
本发明使用了黄芪多糖和白藜芦醇，协同作用下有效地产生抗氧化作用，降低了冻精解冻稀释过程剧烈稳定变化对精子的氧化损伤，解冻后精子的活率在70％左右，活力在50％以上，顶体完整性在60％左右，质膜完整性在50％左右，人工授精后不返情率达到70％以上。使用黄芪多糖、白藜芦醇作为冻精解冻稀释液的抗氧化剂，具有高效抗氧化、稳定性好等优点。
具体实施方式
具体实施方式一、本实施方式中1000mL解冻稀释液中各组分的配比是：
D-葡萄糖15g、果糖10g、氯化钾0.2g、乙二胺四乙酸二钠1g、碳酸氢钠3g，柠檬酸三钠8g、聚乙烯醇0.5g、庆大霉素50万IU、黄芪多糖4g、白藜芦醇0.4g；上述猪冻精解冻稀释液的配制方法是按下述步骤进行的：
步骤一、将D-葡萄糖、果糖、氯化钾、乙二胺四乙酸二钠、碳酸氢钠，柠檬酸三钠、聚乙烯醇，用双蒸水配制成水溶液；
步骤二、置于26℃水浴锅中平衡至充分溶解并且pH值稳定；
步骤三、用0.22μm除菌滤器进行过滤；
步骤四、使用前30分钟加入庆大霉素、黄芪多糖和白藜芦醇，得到用于冻精解冻稀释液。
经检测，本实施方式冻精解冻稀释液的pH值在7.2～7.5范围内，渗透压在240mosM～380mosM范围内。
具体实施方式二、本实施方式中1000mL解冻稀释液中各组分的配比是：
D-葡萄糖20g、果糖8g、氯化钾0.5g、乙二胺四乙酸二钠2g、碳酸氢钠2.5g，柠檬酸三钠5.6g、聚乙烯醇1g、庆大霉素40万IU、黄芪多糖4g、白藜芦醇0.46g。
本实施方式解冻稀释液的配制方法按具体实施方式一方法进行。
经检测，本实施方式冻精解冻稀释液的pH值在7.2～7.5范围内，渗透压在240mosM～380mosM范围内。
采用下述试验验证发明效果
从液氮中取出1支0.5mL冷冻精液，于38摄氏度水浴锅中摇动20s，然后迅速擦干，将其分为2份，各0.25mL，分别稀释于26摄氏度的对照组解冻稀释液(将D-葡萄糖20g、果糖8g、氯化钾0.5g、乙二胺四乙酸二钠2g、碳酸氢钠2.5g，柠檬酸三钠5.6g、聚乙烯醇1g、庆大霉素40万IU)以及26摄氏度的本发明解冻稀释液(将D-葡萄糖20g、果糖8g、氯化钾0.5g、乙二胺四乙酸二钠2g、碳酸氢钠2.5g，柠檬酸三钠5.6g、聚乙烯醇1g、庆大霉素40万IU、黄芪多糖4g和白藜芦醇0.46g)中。孵育1小时。记录孵育后精子活力，见表1。
表1
分组 活率(％) 活力(％)
对照组 65.5±6.8 45.3±5.6
发明组 67.5±7.0 45.3±4.9
分别利用基于对照组与发明组解冻稀释液解冻稀释的精子进行体外受精操作，评价受精率和胚胎发育囊胚率。结果见表2。
表2
分组 单精受精率(％) 囊胚率(％)
对照组 48.53±8.03a 20.59±4.18a
发明组 60.62±9.92b 33.25±5.23b
分别评价基于对照组与发明组解冻稀释液解冻稀释的精子的抗氧化指标，结果见表3。
表3
分组 过氧化氢 羟自由基 过氧化氢酶
对照组 8.23±1.14a 339.48±42.35a 3.21±1.10a
发明组 3.97±1.21b 255.02±33.71b 6.08±1.02b
从上述表格可知，本发明组配方的解冻稀释液进行冻精解冻后稀释时单精受精率(发明组60.62±9.92％vs对照组48.53±8.033％)和囊胚率都显著高于对照组(发明组33.25±5.23％vs对照组20.59±4.18％)，但是该浓度下精子活力未受影响。抗氧化指标中，发明组精子中过氧化氢与羟自由基浓度显著低于对照组(发明组3.89±1.32vs对照组8.23±1.14；发明组255.02±33.71vs对照组339.48±42.35)。与之对应的是，发明组精子中过氧化氢酶的含量显著高于对照组(发明组6.08±1.02vs对照组3.21±1.10)。
综上所述，本实施方式的猪冻精解冻稀释液能够提高复苏后精子的抗氧化能力，并最终提高体外受精能力。
具体实施方式三、本实施方式中1000mL解冻稀释液中各组分的配比是：
D-葡萄糖25g、果糖5g、氯化钾1.0g、乙二胺四乙酸二钠3g、碳酸氢钠2g，柠檬酸三钠5g、聚乙烯醇2g、庆大霉素35万IU、黄芪多糖4g、白藜芦醇0.5g。
本实施方式解冻稀释液的配制方法按具体实施方式一方法进行。
经检测，本实施方式冻精解冻稀释液的pH值在7.2～7.5范围内，渗透压在240mosM～380mosM范围内。

Claims (5)

1.一种猪冻精解冻稀释液，其特征在于所述解冻稀释液由以下组分组成：D-葡萄糖、果糖、氯化钾、乙二胺四乙酸二钠、碳酸氢钠，柠檬酸三钠、聚乙烯醇、庆大霉素、黄芪多糖和白藜芦醇，用双蒸水配制成水溶液；
其中，1000mL解冻稀释液中各组分的配比是：
D-葡萄糖15g～25g、果糖5～10g、氯化钾0.1g～1.0g、乙二胺四乙酸二钠1g～3g、碳酸氢钠1g～3g，柠檬酸三钠2g～10g、聚乙烯醇0.5g～2g、庆大霉素(30～50)万IU、黄芪多糖2g～10g、白藜芦醇0.2g～0.5g。
2.根据权利要求1所述的一种猪冻精解冻稀释液，其特征在于1000mL解冻稀释液中各组分的配比是：
D-葡萄糖15g、果糖10g、氯化钾0.2g、乙二胺四乙酸二钠1g、碳酸氢钠3g，柠檬酸三钠8g、聚乙烯醇0.5g、庆大霉素50万IU、黄芪多糖4g、白藜芦醇0.4g。
3.根据权利要求1所述的一种猪冻精解冻稀释液，其特征在于1000mL解冻稀释液中各组分的配比是：
D-葡萄糖20g、果糖8g、氯化钾0.5g、乙二胺四乙酸二钠2g、碳酸氢钠2.5g，柠檬酸三钠5.6g、聚乙烯醇1g、庆大霉素40万IU、黄芪多糖4g、白藜芦醇0.46g。
4.根据权利要求1所述的一种猪冻精解冻稀释液，其特征在于1000mL解冻稀释液中各组分的配比是：
D-葡萄糖25g、果糖5g、氯化钾1.0g、乙二胺四乙酸二钠3g、碳酸氢钠2g，柠檬酸三钠5g、聚乙烯醇2g、庆大霉素35万IU、黄芪多糖4g、白藜芦醇0.5g。
5.如权利要求1-4任意一项权利要求所述一种猪冻精解冻稀释液的配制方法，其特征在于猪冻精解冻稀释液的配制方法是按下述步骤进行的：
步骤一、将D-葡萄糖、果糖、氯化钾、乙二胺四乙酸二钠、碳酸氢钠、柠檬酸三钠和聚乙烯醇用双蒸水配制成水溶液；
步骤二、置于26℃水浴锅中平衡至充分溶解并且pH值稳定；
步骤三、用0.22μm除菌滤器进行过滤；
步骤四、使用前30分钟加入庆大霉素、黄芪多糖和白藜芦醇，得到用于冻精解冻稀释液。
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