CN112772630A - 一种施氏鲟精子低温保存稀释液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种施氏鲟精子低温保存稀释液及其制备方法，该低温保存稀释液由包括如下重量份的组分制得：氯化钠1‑5份，氯化钾1‑5份，EDTA 3‑10份，柠檬酸钠5‑10份，磷酸氢钠1‑5份，人参皂苷0.1‑1份，白藜芦醇1‑5份，大豆卵磷脂1‑5份，左旋肉碱0.01‑5份，青霉素0.01‑1份，头孢噻呋0.01‑1份，山梨醇0.5‑2份，甜菜碱0.5‑2份，海藻糖3‑10份，乳糖3‑10份，蔗糖3‑10份，GSH 1‑5份，VE 0.5‑2份。

Description

一种施氏鲟精子低温保存稀释液及其制备方法
技术领域
本发明属于施氏鲟繁育领域，尤其是涉及一种施氏鲟精子低温保存稀释液及其制备方法。
背景技术
施氏鲟属硬骨鱼纲、幅鳍亚纲、硬鳞总目、鲟形目，主要分布于阿穆尔河(中国黑龙江)流域，因具有生长速度快、抗病力强、经济价值高等优点，已成为中国备受欢迎的养殖品种，占中国鲟鱼总产量的50％，而且仍有增加的趋势。但由于养殖技术粗放、养殖密度过高，导致疾病暴发频率升高，给鲟养殖业的健康可持续性发展造成了极大阻碍。近年来，科研工作者在施氏鲟资源保护、人工蓄养、人工繁殖、胚胎发育、性腺发育等方面做了大量工作,为保护施氏鲟种质资源提供了理论依据。但对于施氏鲟的精子保存以及精子质量还有待进行深入研究。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种施氏鲟精子低温保存稀释液及其制备方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种施氏鲟精子低温保存稀释液，该低温保存稀释液由包括如下重量份的组分制得：
氯化钠1-5份，氯化钾1-5份，EDTA 3-10份，柠檬酸钠5-10份，磷酸氢钠1-5份，人参皂苷0.1-1份，白藜芦醇1-5份，大豆卵磷脂1-5份，左旋肉碱0.01-5份，青霉素0.01-1份，头孢噻呋0.01-1份，山梨醇0.5-2份，甜菜碱0.5-2份，海藻糖3-10份，乳糖3-10份，蔗糖3-10份，GSH 1-5份，VE 0.5-2份。
进一步，所述的低温保存稀释液由包括如下重量份的组分制得：
氯化钠1.5份，氯化钾1.2份，EDTA 4份，柠檬酸钠6.5份，磷酸氢钠1.2份，人参皂苷0.1份，白藜芦醇3份，大豆卵磷脂3份，左旋肉碱0.2份，青霉素0.15份，头孢噻呋0.15份，山梨醇1.5份，甜菜碱0.65份，海藻糖5.5份，乳糖6.2份，蔗糖4.5份，GSH 1.2份，VE 0.8份。
所述的施氏鲟精子低温保存稀释液的制备方法，包括如下步骤：将各组分溶于蒸馏水中，混合均匀后即成。
进一步，所述的各组分的质量之和与所述的蒸馏水的质量之比为10-20:100。
利用所述的施氏鲟精子低温保存稀释液保存精子的方法，包括如下步骤：将所述的低温保存稀释液的温度降至10-15℃，然后将施氏鲟的精液与所述的低温保存稀释液混合、摇匀，然后将混合液进行分装，将小包装混合液在1-5℃环境下预冷，然后将预冷后的小包装混合液置于液氮面5-10cm处进行速冻，速冻完成后放入液氮中保存即成。
进一步，所述的预冷步骤的时间为20-60min。
进一步，所述的速冻步骤的时间为30-120min。
进一步，所述的施氏鲟的精液与所述的低温保存稀释液的体积比为1:5-10。
施氏鲟的鲜精乳白略带黄色，呈牛奶状；精浆与精液体积比为60-87：100。施氏鲟精子呈短棒状，分为头部、中段和尾部；头部前端窄、后端宽，且具有伞状顶体，中段呈漏斗状，尾部扁平细长，侧鳍。施氏鲟的精液相对较稀，浓度为13-40％，精子密度在不同个体之间差异很大，从每毫升10亿个到50亿个不等。
大多数硬骨鱼类精浆渗透压为250-300mOsmol/kg，鳃类的偏低，一般不超过100mOsmol/kg。而且施氏鲟的精浆组成的和浓度也比其它硬骨鱼低的多，因此，施氏鲟精子对外源的Na+和K+很敏感，浓度稍高就会抑制其活力。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的施氏鲟精子低温保存稀释液加入了氯化钠、氯化钾、EDTA、柠檬酸钠、磷酸氢钠、人参皂苷、白藜芦醇、大豆卵磷脂、左旋肉碱、青霉素、头孢噻呋、山梨醇、甜菜碱、海藻糖、乳糖、蔗糖、GSH、VE，人参皂苷与白藜芦醇配伍有效的起到了抗氧化的作用，在精子的保存过程中可以保护精子的生理活性，配合抗生素与糖类的使用，不但能够有效的提高精子活力，防止细菌的产生，同时还在很大程度上使卵裂率得到有效的提升，柠檬酸钠、磷酸氢钠用于调节低温保存稀释液的pH，同时与氯化钠、氯化钾、EDTA协同调节冷冻保护剂的渗透压，在解冻后能够激活精子活力，保持精子质膜的稳定。
本发明所述的保存方法通过分装与渐冻的方法对施氏鲟精子进行保存，分装的方式提高了渐冻的效率，同时提高了冷冻精子的成活率和受精率，渐冻的方式是精子对温度进行逐渐的适应，保证精子的活性，防止精子的损失，精子在进入液氮之前在液氮表面一定高度进行冷冻，使精子不会快速冷冻，提高了冷冻精子的成活率和受精率，通过使用低温保存稀释液同时配合渐冻的方法，大幅提升了保存效果与精子质量。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
按照本发明的技术方案，本实施例给出六组用于施氏鲟精子低温保存的人参皂苷与白藜芦醇配伍的稀释液配方，具体数值如表1所示。
表1人参皂苷与白藜芦醇配伍方案
Figure BDA0002872680660000041
Figure BDA0002872680660000051
所述的施氏鲟精子低温保存稀释液中其他组分的重量份如下：氯化钠1.5份，氯化钾1.2份，EDTA 4份，柠檬酸钠6.5份，磷酸氢钠1.2份，大豆卵磷脂3份，左旋肉碱0.2份，青霉素0.15份，头孢噻呋0.15份，山梨醇1.5份，甜菜碱0.65份，海藻糖5.5份，乳糖6.2份，蔗糖4.5份，GSH 1.2份，VE 0.8份。
所述的施氏鲟精子低温保存稀释液的制备方法，包括如下步骤：将各组分溶于蒸馏水中，混合均匀后即成(青霉素与头孢噻呋在保存之前单独添加)。所述的各组分的质量之和与所述的蒸馏水的质量之比为10:100。
利用所述的施氏鲟精子低温保存稀释液保存精子的方法，包括如下步骤：将所述的低温保存稀释液的温度降至12℃，然后将施氏鲟的精液与所述的低温保存稀释液混合、摇匀，然后将混合液进行分装，将小包装混合液在3℃环境下预冷，然后将预冷后的小包装混合液置于液氮面5cm处进行速冻，速冻完成后放入液氮中保存即成。
对人参皂苷与白藜芦醇配伍后各组稀释液的检测数据如表2所示。
表2人参皂苷与白藜芦醇配伍后各组稀释液的检测数据
组别 精子成活率(％) 精子成活时间(s) 受精率(％) SOD(U/ml)
1 63.18 92.4 84.45 251.08
2 43.84 83.7 73.26 245.78
3 75.12 107.9 88.41 276.15
4 82.56 116.2 96.34 292.17
5 60.72 94.1 83.14 264.12
6 67.48 96.4 73.86 259.74
对比例1
一种施氏鲟精子低温保存稀释液采用购买的低温保存稀释液。
利用所述的施氏鲟精子低温保存稀释液保存精子的方法，包括如下步骤：将施氏鲟的精液与10倍量的低温保存稀释液混合、摇匀，然后将混合液放入液氮中保存即成。
将实施例1与对比例1得到的冷冻保存的施氏鲟精子解冻，然后对解冻后的精子进行检测，检测结果见表3。
表3低温保存稀释液稀释施氏鲟精子后对精子存活时间和生存指数的影响
精子活力(％) 孵化率(％) 精子膜完整率(％)
实施例1 95.46 91.75 80.41
对比例1 69.41 72.48 62.41
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种施氏鲟精子低温保存稀释液，其特征在于：该低温保存稀释液由包括如下重量份的组分制得：
氯化钠1-5份，氯化钾1-5份，EDTA 3-10份，柠檬酸钠5-10份，磷酸氢钠1-5份，人参皂苷0.1-1份，白藜芦醇1-5份，大豆卵磷脂1-5份，左旋肉碱0.01-5份，青霉素0.01-1份，头孢噻呋0.01-1份，山梨醇0.5-2份，甜菜碱0.5-2份，海藻糖3-10份，乳糖3-10份，蔗糖3-10份，GSH1-5份，VE 0.5-2份。
2.根据权利要求1所述的施氏鲟精子低温保存稀释液，其特征在于：所述的低温保存稀释液由包括如下重量份的组分制得：
氯化钠1.5份，氯化钾1.2份，EDTA 4份，柠檬酸钠6.5份，磷酸氢钠1.2份，人参皂苷0.1份，白藜芦醇3份，大豆卵磷脂3份，左旋肉碱0.2份，青霉素0.15份，头孢噻呋0.15份，山梨醇1.5份，甜菜碱0.65份，海藻糖5.5份，乳糖6.2份，蔗糖4.5份，GSH 1.2份，VE 0.8份。
3.权利要求1或2所述的施氏鲟精子低温保存稀释液的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：将各组分溶于蒸馏水中，混合均匀后即成。
4.根据权利要求3所述的施氏鲟精子低温保存稀释液的制备方法，其特征在于：所述的各组分的质量之和与所述的蒸馏水的质量之比为10-20:100。
5.利用权利要求1或2所述的施氏鲟精子低温保存稀释液保存精子的方法，其特征在于：包括如下步骤：将所述的低温保存稀释液的温度降至10-15℃，然后将施氏鲟的精液与所述的低温保存稀释液混合、摇匀，然后将混合液进行分装，将小包装混合液在1-5℃环境下预冷，然后将预冷后的小包装混合液置于液氮面5-10cm处进行速冻，速冻完成后放入液氮中保存即成。
6.根据权利要求5所述的施氏鲟精子的保存方法的制备方法，其特征在于：所述的预冷步骤的时间为20-60min。
7.根据权利要求5所述的施氏鲟精子的保存方法的制备方法，其特征在于：所述的速冻步骤的时间为30-120min。
8.根据权利要求5所述的施氏鲟精子的保存方法的制备方法，其特征在于：所述的施氏鲟的精液与所述的低温保存稀释液的体积比为1:5-10。
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