CN115624024A

CN115624024A - 党参多糖作为添加剂在绵羊精液低温稀释液中的应用

Info

Publication number: CN115624024A
Application number: CN202211006359.0A
Authority: CN
Inventors: 李万宏; 汪郁沁; 路婷婷; 李建栋; 沈先林; 郭旭; 叶炜; 董彦琴
Original assignee: Gansu Runmu Biological Engineering Co ltd
Current assignee: Gansu Runmu Biological Engineering Co ltd
Priority date: 2022-08-22
Filing date: 2022-08-22
Publication date: 2023-01-20
Anticipated expiration: 2042-08-22
Also published as: CN115624024B

Abstract

本发明公开了党参多糖作为添加剂在绵羊精液低温稀释液中的应用，所述精液低温保存稀释液为脱脂奶粉‑无卵黄型基础稀释液，精液低温保存稀释液中党参多糖的添加量为200‑1000mg/L，优选200mg/L。本发明添加了党参多糖的绵羊精液低温保存稀释液应用后绵羊精液低温保存120 h后其总运动精子数可达49.38%，线粒体完整性可达74.76%，顶体完整性可达71.04%，保存168 h后，其总活力仍在47%以上。因此，本发明筛选得到的脱脂奶粉‑无卵黄型基础稀释液配方加入党参多糖，若应用于实际生产中，可以延长绵羊精液保存时间，提高精液保存质量，增加优秀种公羊的辐射范围，在生产中具有广阔的应用前景。

Description

党参多糖作为添加剂在绵羊精液低温稀释液中的应用

技术领域

本发明属于遗传育种技术领域，具体是党参多糖作为添加剂在绵羊精液低温稀释液中的应用。

背景技术

遗传育种与繁殖的科技贡献率在影响家畜生产效益的科技因素中占到了50%以上，近年来，随着对羊肉需求量的不断增加，导致羊肉供不应求。因此，在规模化羊场的饲养管理中，开展绵羊人工授精技术，充分利用优秀种公畜精液，减免自然交配造成的精液浪费，避免一些疾病的发生，同时结合同期发情技术，可以实现羊场的规模化饲养管理，大大的降低饲养管理成本。人工授精技术的核心是精液的保存技术，精液保存通常分为常温保存、低温保存和超低温保存。超低温冷冻保存在奶牛、肉牛等动物可以实现长时间保存，但是由于绵羊精子结构的特殊性，超低温冷冻和复苏过程中产生的温度、渗透压、氧化应激等剧烈变化引起精子细胞质或膜蛋白丢失以及蛋白质构像发生变化（Patricia Peris-Frau等， 2019，Freezing-Thawing Procedures Remodel the Proteome of Ram Sperm beforeand after In Vitro Capacitation），导致冷冻复苏后精子活力大大降低，采用一般常规人工输精时受胎率不高（陈世伟等，2014，绵羊冷冻精液研究进展），加上冷冻精液人工输精时采用腹腔镜输精方式，对设备、环境以及人员技术水平要求高等因素的限制，不能很好的应用于实际生产中。常温保存一般采用生理盐水、脱脂奶等作为稀释液，操作简单，成为现阶段规模化羊场首选的人工输精方式，但是其保存时间较短，在生产上具有一定的局限性，限制优秀种公羊利用和覆盖范围。

精液低温保存过程中常通过加入柠檬酸盐、Tris等缓冲物质调节保存液pH之外,还通过添加果糖、葡萄糖、蔗糖等能量物质为精子提供营养物质，此外还需要添加卵黄、甘油等添加剂（CN201910620798.2），这也是早期精液低温保存稀释剂的主要成分。在绵羊精液低温保存稀释液中用大豆卵磷脂替换卵黄等物质虽然可以降低动物源新病原菌传播风险，但是也缩短了精液低温保存时间，且精液保存72 h后，其精子活力仅有30%左右，远不能满足生产实际的需要。因此，精液稀释液添加剂的开发成为提高精液保存效果的重要突破口，保护物质种类、用量、配伍等因素是决定精液低温保存效果的核心因素，其组成情况直接关系到保存后精子质量。另外，经研究证实，精子质膜中含有较多的不饱和脂肪酸(GaffariTürk, et al., 2022, Effect of hydrated C60 fullerene on lipid,vitamin and amino acid composition in frozen-thawed ram semen)，精子新陈代谢过程中，容易引起脂质过氧化，使精子顶体结构、质膜以及DNA的完整性遭受严重破坏，精子活性迅速减弱，因此开发提高精液抗氧化能力的稀释液添加剂，提高精液保存效果，将为提高种公羊利用率提供技术支撑。

发明内容

基于以上所述，本发明的目的是提供一种可提高绵羊精液低温保存效果的稀释液添加剂及其应用，用于解决现有低温保存稀释液仍不能满足生产需求、长时间保持精子活性、延长精液存活时间的技术问题。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

党参多糖作为添加剂在绵羊精液低温稀释液中的应用，所述精液低温保存稀释液为脱脂奶粉-无卵黄型基础稀释液。

作为本发明技术方案的优选，所述精液低温保存稀释液中党参多糖的添加量为

200-1000mg/L；更优选地，所述精液低温保存稀释液中党参多糖的添加量为200mg/L。

进一步地，本发明党参多糖作为添加剂在绵羊精液低温保存稀释液中的应用方法为：采

集新鲜优秀种公羊精液于离心管中，采用添加了党参多糖的精液低温稀释液同温稀释至精子密度为3-5×10⁸个/mL，然后放入装有35℃温水的泡沫盒中置于4℃冰箱保存，每隔12h轻轻摇晃离心管防止精子沉淀。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明选择的低温稀释液添加剂党参多糖主要由多糖、皂苷、黄酮等多种生物活性物质组成，具有免疫调节、抗氧化等功能，其能够清除精液保存过程中产生的游离自由基，抑制活性氧水平，提高过氧化物酶活性。相比于单一的化学组分，其能从活性氧生成和消耗方面综合减缓氧化应激对精子的损伤，从而提高绵羊精液低温保存效果。实验结果表明，本发明添加了党参多糖的绵羊精液低温保存稀释液应用后绵羊精液低温保存120 h后其总运动精子数可达49.38%，线粒体完整性可达74.76%，顶体完整性可达71.04%，保存168h后，其总活力仍在47%以上。因此，本发明筛选得到的脱脂奶粉-无卵黄型基础稀释液配方加入党参多糖，若应用于实际生产中，可以延长绵羊精液保存时间，提高精液保存质量，增加优秀种公羊的辐射范围，在生产中具有广阔的应用前景。

具体实施方式

以下实施方式是对本发明的进一步说明，但不理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修饰或替换，均应落入本发明的保护范围。

一、试验试剂与耗材

分析纯中草药党参多糖、脱脂奶粉、大豆卵磷脂、青链霉素混合液(100×)双抗（细胞培养专用）购于北京索莱宝科技有限公司。果糖、甘油购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。吉姆萨染液、Mito-Tracker Red CMXRos(线粒体红色荧光探针)购自于上海碧云天生物技术有限公司。

二、具体操作过程

本发明中用的绵羊精液低温保存稀释液（脱脂奶粉-无卵黄型基础稀释液），应现用现配。

（一）绵羊精液低温稀释液的配制：

1、称取脱脂奶粉50g、大豆卵磷脂1.875g、果糖6.25 g于200 mL烧杯中充分搅拌溶解后定性滤纸过滤，然后高压灭菌。

2、将1中灭菌后溶液转移到无菌的250 mL容量瓶中并加入2.5 mL 100×的青霉素+链霉素溶液，之后用蒸馏水定容至250mL，得到稀释液I。

3、按照基础稀释液I：甘油=37:3的比例加入无菌甘油，混合均匀后得到低温基础稀释液。

4、不同添加量党参多糖绵羊精液低温保存稀释液配制：使用分析天平准确称取0、4、8、20mg 党参多糖，分别溶解于20mL低温基础稀释液中，即制成0、200、400、1000mg/L 不同添加量的党参多糖绵羊精液低温保存稀释液，将精液稀释液放在35℃水浴锅中备用。

（二）绵羊精液采集

假阴道法采集身体健康、没有生殖系疾病的2-3岁种公羊精液。选择新鲜采集的活力达到0.8以上，色泽和气味正常精液进行保存。

（三）精液稀释

1、将盛有精液的集精杯与精液稀释液放在同一个水浴锅中5min，确保精液和稀释液温度一样。

2、按照精液:稀释液1:8~10的比例，将精液稀释液沿着容器壁缓慢加入到精液中，轻轻摇匀，使得稀释后精子密度达到3~5×10⁸个/mL。

3、将装有稀释后精液的离心管放入装有200 mL、35℃温水的泡沫盒中后放入4℃冰箱进行保存。

4、每隔12h轻轻摇晃保存精液的离心管防止精子沉淀，对精液保存产生影响，降低精保存效果。

（四）精液保存效果评定

分别在保存24 h、72 h、120 h和168 h时取出保存的精液，在37℃的条件下评定精液质量，用于精液质量加测所用的载玻片、移液器等试剂耗材需提前在37℃恒温箱预热。主要检测指标如下：

1、精液活力、运动参数。取10 μL精液置于载玻片上，盖上盖玻片后立即使用minitube的精液品质自动分析仪检测精子活力以及运动参数（见表1和表2）。

2、顶体完整率。吸取10 μL精液并制作抹片，待自然风干后将载玻片放入4%的多聚甲醛溶液中浸渍约2h后，用蒸馏水冲洗。风干后的载玻片置于姬姆萨溶液中，染色1 h后用蒸馏水缓慢洗去多余浮色后风干载玻片。在1000倍显微镜下观察载玻片上精子的顶体形态结构并计算精子顶替完整率，精子顶体完整率=顶体完整精子数/精子总数× 100%。

3、线粒体完整性检测。取10 μL 精液于 PCR 管中，加入 10 μL 0.2μM的Mito-Tracker Red CMXRos工作液混匀，置于 37℃ 避光孵育染色 15 min后，取染色后精液 10μL 滴于载玻片上，根据荧光显微镜下精子着不同荧光对线粒体膜电位完整率进行区分，精子线粒体完整率=带有红色荧光的精子数/精子总数 × 100%。

（五）评定效果：

表1 党参多糖对精子保存后活力的影响

注：肩标字母a、b、c用于表示同一时间同列数据的差异显著性，肩标字母相异表示显著(P＜0.05)，含相同字母或无字母表示差异不显著(P＞0.05)。

表2 党参多糖对精子保存后运动参数的影响

表3 党参多糖对绵羊精子线粒体完整性影响

注：肩标字母a、b用于表示同一时间同行数据的差异显著性，肩标字母相异表示显著(P＜0.05)，含相同字母或无字母表示差异不显著(P＞0.05)。

表4 党参多糖对绵羊精子顶体完整率影响

由表1可知，精液低温保存72h、120h和168 h后，稀释液中添加浓度200mg/L、400mg/L和1000mg/L党参多糖能提高精子总运动活力，其中200mg/L组显著高于对照组（p<0.05）。

由表2可知，精液低温保存72 h-168h后，稀释液中添加不同浓度多糖对精子运动参数均有不同程度的影响，其中200mg/L 添加组保存168h后曲线速度、直线速度、平均路径速度、鞭打频率、前向性均高于对照组，但差异不显著（p>0.05）。由表3可知，精液低温保存24h-120h时，200mg/L党参添加组的线粒体完整性显著高于对照组（p<0.05）。由表4可知，精液低温保存24h-120h时，添加200mg/L党参可以提高精子顶体完整率，除24 h外，其余时间差异不显著（p>0.05）。

通过以上结果可以知道，党参多糖对绵羊低温保存效果具有显著促进作用，在绵羊精液4°C保存稀释液中加入200mg/L的党参多糖可增加保护功效，保存5d时精子总运动精子数达到49.38%，线粒体完整性达到74.76%，顶体完整性达到71.04%，保存效果良好且可靠，能为绵羊人工授精提供高质量低温保存精液。

Claims

1.党参多糖作为添加剂在绵羊精液低温保存稀释液中的应用，其特征在于，所述精液低温保存稀释液为脱脂奶粉-无卵黄型基础稀释液。

2.如权利要求1所述的党参多糖作为添加剂在绵羊精液低温稀释液中的应用，其特征在于，所述精液低温保存稀释液中党参多糖的添加量为200-1000mg/L。

3.如权利要求2所述的党参多糖作为添加剂在绵羊精液低温稀释液中的应用，其特征在于，所述精液低温保存稀释液中党参多糖的添加量为200 mg/L。

4.如权利要求1-3任一项所述的党参多糖作为添加剂在绵羊精液低温稀释液中的应用，其特征在于，采集新鲜优秀种公羊精液于离心管中，采用添加了党参多糖的精液低温保存稀释液同温稀释至精子密度为3-5×10⁸个/mL，然后放入装有35℃温水的泡沫盒中置于4℃冰箱保存，每隔12h轻轻摇晃离心管防止精子沉淀。