CN110447635A - 多糖物质用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法 - Google Patents

多糖物质用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多糖物质用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法，所述的多糖物质包括银耳多糖、香菇多糖、木耳多糖或虫草多糖中的一种或多种。本发明同时还提供了一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括多糖物质、营养物质、缓冲物质等。本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液，具有提高精液冷冻保存后精子活率、顶体和质膜完整率，使得山羊的繁殖性能和经济效益有显著提高的效果。

Description

多糖物质用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备 方法
技术领域
本发明属于动物生物技术领域，涉及动物繁殖技术，尤其涉及多糖物质用于制备山羊精液保存用稀释液的应用及制备方法。
背景技术
动物精液冷冻保存是将精液进行特殊处理，保存在超低温下，以达到长期保存的目的。但是精子在降温和冷冻保存的过程中，很容易产生各种损伤，包括物理性的、化学性的和生物性的损伤。与新鲜精液相比较，经冷冻-解冻处理的精液，其精子的成活率、精子活率、顶体完整率、线粒体活性和受胎率显著下降，而山羊的精液更是如此，这对于生产实践和科学研究来说是极其不利的因素。尽管山羊精液的冷冻保存技术已经有了长足的发展，但目前仍然存在很多问题有待解决。
发明内容
针对现有技术的缺陷或者不足，本发明提供了一种多糖物质用于制备山羊精子保存用稀释液的应用及制备方法。
本发明同时还提供了一种山羊精子冷冻保存用稀释液，所提供的山羊精子冷冻保存用稀释液用于保存山羊精子，包括多糖物质。
多糖物质用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用，所述的多糖物质包括银耳多糖、香菇多糖、木耳多糖或虫草多糖中的一种或多种。
一种山羊精子冷冻保存用稀释液，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括多糖物质以及营养物质，所述的多糖物质包括银耳多糖、香菇多糖、木耳多糖或虫草多糖中的一种或多种。
更优选的，一种山羊精子冷冻保存用稀释液，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括多糖物质、营养物质、缓冲物质、冷冻保护剂以及抗菌物质，所述的多糖物质包括银耳多糖、香菇多糖、木耳多糖或虫草多糖中的一种或多种。
更具体的，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括多糖物质、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。
优选的，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的pH值为7。
本发明山羊精子冷冻保存用稀释液的制备方法，包括如下步骤：
(1)将柠檬酸三钠0.25-1.25g，柠檬酸0.75-6g，碳酸氢钠0.062-0.5g，加50mL无菌水溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到A液；
(2)将果糖0.5-4g，卵磷脂0.125-1g，二甲基亚砜6-30mL，甘油6-30mL，加A液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到B液；
(3)将青霉素0.07-0.56g，链霉素0.06-0.48g，加B液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到C液；
(4)取多糖物质0.005-1.8g，用无菌水50mL溶解后定容至100mL，3000转/min离心20min，取上清液，得到D液；
(5)取D液20mL，加入C液，并定容至100mL，即得到添加多糖物质的山羊精子冷冻保存用稀释液。
更具体的，包括如下步骤：
(1)将柠檬酸三钠1.25g，柠檬酸3.35g，碳酸氢钠0.28g，加50mL无菌水溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到A液；
(2)将果糖2.25g，卵磷脂0.53g，二甲基亚砜18mL，甘油18mL，加A液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到B液；
(3)将青霉素0.25g，链霉素0.25g，加B液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到C液；
(4)取木耳多糖1.2g或虫草多糖0.25g或香菇多糖0.75g或银耳多糖1.2g，用无菌水50mL溶解后定容至100mL，3000转/min离心20min，取上清液，得到D液；
(5)取D液20mL，加入C液，并定容至100mL，即添加多糖物质的山羊精子冷冻保存用稀释液。
本发明的有益效果是：
本发明的羊精子冷冻保存用稀释液，添加了多糖物质，结果表明，该羊精液冷冻保存用稀释液，能显著提高精液冷冻保存后精子活率、顶体和质膜完整率，精液经冷冻-解冻处理后，精液的精子活率、顶体和质膜完整率最高分别可达到46.2±0.56％，55.00±2.23％和45.97±1.72％，间接提高了山羊的繁殖性能和经济效益。
进一步研究表明，添加有银耳多糖、香菇多糖、木耳多糖和虫草多糖的羊精子冷冻保存用稀释液保存的精液，在普通光学显微镜下观察到精子活力提高，而精子活力与受精水平有关，因此推测这四种多糖物质起到提高受精质量的特殊作用。
具体实施方式
本发明所述的多糖物质，可以采用银耳多糖、香菇多糖、木耳多糖或虫草多糖中的一种，也可以采用几种的组合，需保证其总量控制在0.005-1.8g。银耳多糖，俗称白木耳，是一种酸性杂多糖；香菇多糖是从优质香菇子实体中提取的有效活性成分，是香菇的主要有效成分；木耳多糖是从木耳中提取的多糖成分，具有降血脂降低胆固醇的功效；虫草多糖是冬虫夏草的主要有效成分。本发明的发明人针对精液经冷冻-解冻处理后，其精子的成活率、精子活率、顶体完整率、线粒体活性和受胎率显著下降的问题，开发出一种新的山羊精液保存用稀释液，在其中添加适量多糖物质，结果表明其能提高经冷冻保存-解冻后精液的精子活率、顶体和质膜的完整率。后期经过一系列的研究，能够证明山羊精液在冷冻过程中，多糖物质确实对精子起到保护作用，但是具体的内部机理目前还不明确，发明人还在进一步探索。
另外，为保证效果，本发明的用于山羊精液冷冻保存的稀释液，应现用现配。本发明的山羊精液保存用稀释液，包括柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠(三者共同起到维持渗透压以及酸碱调节作用)、果糖(作为能源，主要作用是补充精子能量，也是一种简单的稀释剂)、卵磷脂(具有类似卵黄中具有抗低温打击保护能力的主要功能性成份)、二甲基亚砜、甘油(均作为冷冻保护剂)、青霉素、链霉素(均作为抑菌物质)和多糖物质。
为了说明上述各实施例中山羊精子冷冻保存用稀释液对山羊精液的保存效果，进行了精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测，随机抽取10支细管冻精，37℃水浴20s解冻。取10μL精液，置于全自动精子质量分析仪的样品池中，观测精子的活率、顶体完整率和质膜完整率。同时，有数据表明，甘油等同时对精子具有一定的毒性，为了确定多糖物质以及与多糖物质配比的其他成分在山羊精子冷冻保存用稀释液中的最适添加浓度，实施例共设置13组，每组中多糖物质以及与多糖物质配比的其他成分在山羊精子冷冻保存用稀释液中的添加浓度均不同。同时，为进一步说明多糖物质的在山羊精子冷冻保存用稀释液所起到的有益效果，特与各对比例的效果加以对比。
实施例1：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括木耳多糖、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。其具体制备方法如下：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖0.5g，卵磷脂0.125g，准确量取二甲基亚砜6mL，甘油6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容(4)制备D液：用天平精确称取木耳多糖0.12g，无菌水50mL，充分溶解后，定容至100mL，3000转/min离心20min，取上清液，得到所谓D液。
(5)制备E液：准确量取D液20mL，加入C液，并定容至100mL，得到E液，即添加木耳多糖的山羊精子冷冻保存用稀释液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精液定为合格精液。取其5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入E液，混匀，使精子密度为900万/mL左右，得稀释山羊精液，再将其用10层纱布包裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：
将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中长期保存。
对比例1：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。其具体制备方法如下：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖0.5g，卵磷脂0.125g，准确量取二甲基亚砜6mL，甘油6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：准确量取无菌水20mL，加入C液，定容至100mL，得到所谓D液，即对比例所用的山羊精子冷冻保存稀释液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精液定为合格精液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精液定为合格精液。取其5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入D液，混匀，使精子密度为900万/mL左右，得稀释山羊精液，再将其用10层纱布包裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：
将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中长期保存。
实施例2：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括木耳多糖、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。其具体操作同实施例1，不同在于各组分用量分别为木耳多糖1.8g、果糖4g、柠檬酸三钠2g、柠檬酸6g、碳酸氢钠0.5g、卵磷脂1g、二甲基亚砜6mL、甘油6mL、青霉素0.07g和链霉素0.06g。
对比例2：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。其具体操作如对比例1，不同在于各组分用量分别为果糖4g、柠檬酸三钠2g、柠檬酸6g、碳酸氢钠0.5g、卵磷脂1g、二甲基亚砜6mL、甘油6mL、青霉素0.07g和链霉素0.06g。
实施例3：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括木耳多糖、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。其具体操作同实施例1，不同在于各组分用量分别为木耳多糖1.2g、果糖2.25g、柠檬酸三钠1.25g、柠檬酸3.35g、碳酸氢钠0.28g、卵磷脂0.53g、二甲基亚砜18mL、甘油18mL、青霉素0.25g和链霉素0.25g。
对比例3：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。其具体操作如对比例1，不同在于各组分用量分别为果糖2.25g、柠檬酸三钠1.25g、柠檬酸3.35g、碳酸氢钠0.28g、卵磷脂0.53g、二甲基亚砜18mL、甘油18mL、青霉素0.25g和链霉素0.25g。
实施例4：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括虫草多糖、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。其具体制备方法如下：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平准确称取果糖0.5g，卵磷脂0.125g，准确量取二甲基亚砜6mL，甘油6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平准确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：用天平精确称取虫草多糖0.04g，无菌水50mL，充分溶解后，定容至100mL，3000转/min离心20min，取上清液，得到所谓D液。
(5)制备E液：准确量取D液20mL，加入C液，并定容至100mL，得到所谓E液，即添加虫草多糖的山羊精子冷冻保存用稀释液。
其余操作步骤同实施例1。
以对比例1为对比。
实施例5：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括虫草多糖、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。其具体操作同实施例4，不同在于各组分用量分别为虫草多糖0.005g、果糖4g、柠檬酸三钠2g、柠檬酸6g、碳酸氢钠0.5g、卵磷脂1g、二甲基亚砜6mL、甘油6mL、青霉素0.07g和链霉素0.06g。
以对比例2为对比。
实施例6：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括虫草多糖、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。其具体操作同实施例4，不同在于各组分用量分别为虫草多糖0.25g、果糖2.25g、柠檬酸三钠1.25g、柠檬酸3.35g、碳酸氢钠0.28g、卵磷脂0.53g、二甲基亚砜18mL、甘油18mL、青霉素0.25g和链霉素0.25g。
以对比例3为对比。
实施例7：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括香菇多糖、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。其具体操作同实施例4，不同在于各组分用量分别为香菇多糖0.35g、果糖0.5g、柠檬酸三钠0.25g、柠檬酸0.75g、碳酸氢钠0.062g、卵磷脂0125g、二甲基亚砜6mL、甘油6mL、青霉素0.56g和链霉素0.48g。
以对比例1为对比。
实施例8：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括香菇多糖、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。其具体操作同实施例4，不同在于各组分用量分别为香菇多糖1.15g、果糖4g、柠檬酸三钠2g、柠檬酸6g、碳酸氢钠0.5g、卵磷脂1g、二甲基亚砜6mL、甘油6mL、青霉素0.07g和链霉素0.06g。
以对比例2为对比。
实施例9：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括香菇多糖、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。其具体操作同实施例4，不同在于各组分用量分别为香菇多糖0.75g、果糖2.25g、柠檬酸三钠1.25g、柠檬酸3.35g、碳酸氢钠0.28g、卵磷脂0.53g、二甲基亚砜18mL、甘油18mL、青霉素0.25g和链霉素0.25g。
以对比例3为对比。
实施例10：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括银耳多糖、果糖、柠檬酸、钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。其具体操作同实施例4，不同在于各组分用量分别为银耳多糖0.6g、果糖0.5g、柠檬酸三钠0.25g、柠檬酸0.75g、碳酸氢钠0.062g、卵磷脂0.125g、二甲基亚砜6mL、甘油6mL、青霉素0.56g和链霉素0.48g。
以对比例1为对比。
实施例11：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括银耳多糖、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。其具体操作同实施例4，不同在于各组分用量分别为银耳多糖1.8g、果糖4g、柠檬酸三钠2g、柠檬酸6g、碳酸氢钠0.5g、卵磷脂1g、二甲基亚砜6mL、甘油6mL、青霉素0.07g和链霉素0.06g。
以对比例2为对比。
实施例12：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括银耳多糖、虫草多糖、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。其具体操作同实施例4，不同在于各组分用量分别为银耳多糖和虫草多糖总量取1.6g(各为0.8g)、果糖0.5g、柠檬酸三钠2g、柠檬酸6g、碳酸氢钠0.5g、卵磷脂0.125g、二甲基亚砜6mL、甘油6mL、青霉素0.07g和链霉素0.06g。
对比例12：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。其具体操作如对比例1，不同在于各组分用量分别为果糖0.5g、柠檬酸三钠2g、柠檬酸6g、碳酸氢钠0.5g、卵磷脂0.125g、二甲基亚砜6mL、甘油6mL、青霉素0.07g和链霉素0.06g。
实施例13：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括银耳多糖、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。其具体操作同实施例4，不同在于各组分用量分别为银耳多糖1.2g、果糖2.25g、柠檬酸三钠1.25g、柠檬酸3.35g、碳酸氢钠0.28g、卵磷脂0.53g、二甲基亚砜18mL、甘油18mL、青霉素0.25g和链霉素0.25g。
以对比例3为对比。
所有结果如下：
实施例1的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是41.36±2.13％，50.18±1.91％和42.32±2.12％，与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了28.81±0.94％，顶体完整率提高了14.44±0.88％，质膜完整率提高了15.06±1.04％。
实施例2的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是33.50±1.72％，40.65±1.55％和34.28±1.72％，与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了28.05±0.76％，顶体完整率提高了13.76±0.71％，质膜完整率提高了14.38±0.84％。
实施例3的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是43.43±2.24％，52.69±2.13％和46.04±2.64％，与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了30.18±0.98％，顶体完整率提高了15.12±0.92％，质膜完整率提高了15.78±1.09％。
实施例4的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是44.00±0.53％，52.38±2.12％和43.78±1.64％，与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了34.56±0.78％，顶体完整率提高了15.76±1.12％，质膜完整率提高了10.84±1.14％。
实施例5的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是35.64±0.43％，42.43±1.72％和35.46±1.72％，与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了33.76±0.63％，顶体完整率提高了15.07±0.91％，质膜完整率提高了10.18±0.92％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
实施例6的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是46.2±0.56％，55.00±2.23％和45.97±1.72％，与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了36.20±0.82％，顶体完整率提高了16.51±1.18％，质膜完整率提高了11.35±1.19％。
实施例7的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是43.25±5.19％，52.13±4.83％和44.26±2.98％，与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了35.24±2.19％，顶体完整率提高了17.09±2.05％，质膜完整率提高了16.94±1.21％。
实施例8的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是35.03±4.21％，42.23±3.91％和35.85±2.41％，与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了34.44±1.78％，顶体完整率提高了16.40±1.66％，质膜完整率提高了16.24±0.98％。
实施例9的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是45.41±5.45％，54.73±5.07％和46.47±3.13％，与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了36.92±2.31％，顶体完整率提高了17.91±2.15％，质膜完整率提高了17.74±1.27％。
实施例10的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是42.96±3.26％，51.78±4.35％和44.65±2.74％，与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了31.22±1.27％，顶体完整率提高了14.43±1.26％，质膜完整率提高了16.98±1.32％。
实施例11的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是34.79±2.64％，41.94±3.52％和36.17±2.22％，与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了30.44±1.03％，顶体完整率提高了13.75±1.02％，质膜完整率提高了16.29±1.07％。
实施例12的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是39.88±2.95％，46.86±3.94％和40.41±2.48％，与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了30.86±1.15％，顶体完整率提高了14.13±1.14％，质膜完整率提高了16.67±1.19％。
实施例13的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是45.11±3.42％，54.37±4.57％和46.88±2.88％，与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了32.70±1.33％，顶体完整率提高了15.12±1.33％，质膜完整率提高了17.79±1.39％。
以上均表明，本发明所公布的稀释液对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。如各实施例和不添加多糖物质的各对比例所示，实施例组与对比例组相比精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，由此表明，本发明添加多糖物质的稀释液对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。含不同含量多糖物质的山羊精子冷冻保存用稀释液，均能显著提高精子的活率、顶体完整率和质膜完整率，但是实施例6添加0.25g虫草多糖的稀释液保存效果最优，说明多糖物质的添加量并无一般曲线规律可言，也并不是越多越好，其与山羊精子冷冻保存用稀释液中的其余成分有一个最佳的配比，只有添加多糖物质以及各组分适配两个条件同时达到，才能显示最佳效果。
通过以上结果可以得出，本发明稀释粉配方中添加0.005-1.8g的多糖物质能显著延长精子有效保存时间，提高精子的活率、顶体完整率和质膜完整率，其中添加0.25g虫草多糖的效果更好，精液经冷冻-解冻处理后，精液的精子活率、顶体和质膜完整率分别可以达到46.2±0.56％，55.00±2.23％和45.97±1.72％，与对比例不添加多糖物质的山羊精液冷冻保存用稀释液相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)。
进一步，为了说明本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液对多个品种的山羊的各个年龄阶段精液冷冻保存均具有良好的效果，特进行实施例14试验：
实施例14：
本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液对多个品种的山羊的各个年龄阶段精液冷冻保存均具有良好的效果，试验已经对不同年龄段的陕西关中奶山羊、不同年龄段的黑山羊以及黄羊的精液冷冻保存效果均进行了验证，试验方法同上(不做详述)，试验以虫草多糖为例，结果表明：本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液，能有效提高解冻后精液的精子活率、顶体完整率，降低精子畸形率，提高奶山羊冻精生产效率冻精品质。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims (7)

1.多糖物质用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用，所述的多糖物质包括银耳多糖、香菇多糖、木耳多糖或虫草多糖中的一种或多种。
2.一种山羊精子冷冻保存用稀释液，其特征在于，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括多糖物质以及营养物质，所述的多糖物质包括银耳多糖、香菇多糖、木耳多糖或虫草多糖中的一种或多种。
3.一种山羊精子冷冻保存用稀释液，其特征在于，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括多糖物质、营养物质、缓冲物质、冷冻保护剂以及抗菌物质，所述的多糖物质包括银耳多糖、香菇多糖、木耳多糖或虫草多糖中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的山羊精子冷冻保存用稀释液，其特征在于，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括多糖物质、果糖、柠檬酸钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、甘油、青霉素和链霉素。
5.如权利要求4所述的山羊精子冷冻保存用稀释液，其特征在于，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的pH值为7。
6.权利要求3所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将柠檬酸钠0.25-1.25g，柠檬酸0.75-6g，碳酸氢钠0.062-0.5g，加50mL无菌水溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到A液；
(2)将果糖0.5-4g，卵磷脂0.125-1g，二甲基亚砜6-30mL，甘油6-30mL，加A液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到B液；
(3)将青霉素0.07-0.56g，链霉素0.06-0.48g，加B液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到C液；
(4)取多糖物质0.005-1.8g，用无菌水50mL溶解后定容至100mL，3000转/min离心20min，取上清液，得到D液；
(5)取D液20mL，加入C液，并定容至100mL，即得到添加多糖物质的山羊精子冷冻保存用稀释液。
7.权利要求3所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将柠檬酸钠1.25g，柠檬酸3.35g，碳酸氢钠0.28g，加50mL无菌水溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到A液；
(2)将果糖2.25g，卵磷脂0.53g，二甲基亚砜18mL，甘油18mL，加A液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到B液；
(3)将青霉素0.25g，链霉素0.25g，加B液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到C液；
(4)取木耳多糖1.2g或虫草多糖0.25g或香菇多糖0.75g或银耳多糖1.2g，用无菌水50mL溶解后定容至100mL，3000转/min离心20min，取上清液，得到D液；
(5)取D液20mL，加入C液，并定容至100mL，即添加多糖物质的山羊精子冷冻保存用稀释液。
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