BR112019014499A2 - Meio de coloração de espermatozoide, método de processamento de espermatozoide, método de congelamento de uma amostra de espermatozoide manipulada, e, sistema. - Google Patents
Meio de coloração de espermatozoide, método de processamento de espermatozoide, método de congelamento de uma amostra de espermatozoide manipulada, e, sistema. Download PDFInfo
- Publication number
- BR112019014499A2 BR112019014499A2 BR112019014499-4A BR112019014499A BR112019014499A2 BR 112019014499 A2 BR112019014499 A2 BR 112019014499A2 BR 112019014499 A BR112019014499 A BR 112019014499A BR 112019014499 A2 BR112019014499 A2 BR 112019014499A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- sperm
- vol
- cryoprotectant
- fact
- sheath fluid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 147
- 238000007710 freezing Methods 0.000 title claims description 57
- 230000008014 freezing Effects 0.000 title claims description 56
- 238000004040 coloring Methods 0.000 title claims description 29
- 238000003672 processing method Methods 0.000 title claims description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 299
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims abstract description 290
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims abstract description 142
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 27
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 642
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 106
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 96
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 75
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 64
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 claims description 47
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 47
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 claims description 47
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 claims description 47
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 claims description 47
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 claims description 41
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 claims description 36
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 claims description 33
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 31
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 30
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 30
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 30
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 claims description 30
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 29
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 claims description 28
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 27
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 27
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 25
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 claims description 25
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 24
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 19
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 18
- HEBKCHPVOIAQTA-QWWZWVQMSA-N D-arabinitol Chemical compound OC[C@@H](O)C(O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 18
- OXQKEKGBFMQTML-UHFFFAOYSA-N D-glycero-D-gluco-heptitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)CO OXQKEKGBFMQTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- FBPFZTCFMRRESA-ZXXMMSQZSA-N D-iditol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-ZXXMMSQZSA-N 0.000 claims description 18
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- SKCKOFZKJLZSFA-UHFFFAOYSA-N L-Gulomethylit Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)CO SKCKOFZKJLZSFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N Ribitol Natural products OCC(C)C(O)C(O)CO JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- SKCKOFZKJLZSFA-FSIIMWSLSA-N fucitol Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO SKCKOFZKJLZSFA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 18
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 claims description 18
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 claims description 18
- HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N ribitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N 0.000 claims description 18
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 18
- OXQKEKGBFMQTML-KVTDHHQDSA-N volemitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(O)[C@H](O)[C@H](O)CO OXQKEKGBFMQTML-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 claims description 18
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 claims description 18
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 claims description 18
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 claims description 18
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 2-oxoglutarate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC(=O)C([O-])=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 16
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 13
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 13
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 13
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 13
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 13
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 claims description 12
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 11
- GTTSNKDQDACYLV-UHFFFAOYSA-N Trihydroxybutane Chemical compound CCCC(O)(O)O GTTSNKDQDACYLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 claims description 10
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 10
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 10
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 claims description 10
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 claims description 10
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 9
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 7
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 6
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 claims description 6
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 claims description 6
- 239000007994 TES buffer Substances 0.000 claims description 5
- YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N Citric acid monohydrate Chemical compound O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 claims description 4
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 229960002303 citric acid monohydrate Drugs 0.000 claims description 4
- 230000003300 photodamaging effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002679 ablation Methods 0.000 claims description 3
- 229960004106 citric acid Drugs 0.000 claims description 3
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 3
- 230000008832 photodamage Effects 0.000 claims description 3
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 2
- MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N methylazanide Chemical compound [NH-]C MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- GJJVAFUKOBZPCB-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-2-(4,8,12-trimethyltrideca-3,7,11-trienyl)-3,4-dihydrochromen-6-ol Chemical compound OC1=CC=C2OC(CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)(C)CCC2=C1 GJJVAFUKOBZPCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 claims 4
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 claims 4
- 229930003802 tocotrienol Natural products 0.000 claims 4
- 239000011731 tocotrienol Substances 0.000 claims 4
- 235000019148 tocotrienols Nutrition 0.000 claims 4
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 claims 4
- 229940001468 citrate Drugs 0.000 claims 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims 3
- 235000020954 vitamin B12 vitamer Nutrition 0.000 claims 3
- 239000011620 vitamin B12 vitamer Substances 0.000 claims 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims 2
- 229960001790 sodium citrate Drugs 0.000 claims 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 130
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 111
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 75
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 62
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 54
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 53
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 45
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 43
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 37
- 244000309464 bull Species 0.000 description 31
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 30
- -1 TEST Chemical compound 0.000 description 27
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 21
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 20
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 20
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 18
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 18
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 16
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 15
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 15
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 14
- FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N galactitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N 0.000 description 14
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 13
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 13
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 13
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 8
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 7
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 6
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 6
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 6
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 6
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 6
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 5
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 5
- 230000019100 sperm motility Effects 0.000 description 5
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical compound O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M cyanocobalamin Chemical compound N#C[Co+]N([C@]1([H])[C@H](CC(N)=O)[C@]\2(CCC(=O)NC[C@H](C)OP(O)(=O)OC3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)C)C/2=C(C)\C([C@H](C/2(C)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M 0.000 description 4
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 244000309465 heifer Species 0.000 description 4
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 4
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 4
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 4
- 229940118019 malondialdehyde Drugs 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- DLIIMZHTXKZGHW-UHFFFAOYSA-N 1-amino-3-hydroxy-2-methylpropane-2-sulfonic acid Chemical compound NCC(C)(CO)S(O)(=O)=O DLIIMZHTXKZGHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 3
- OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N Lincomycin Natural products CN1CC(CCC)CC1C(=O)NC(C(C)O)C1C(O)C(O)C(O)C(SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229930194936 Tylosin Natural products 0.000 description 3
- 239000004182 Tylosin Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 3
- 150000004683 dihydrates Chemical class 0.000 description 3
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 210000002977 intracellular fluid Anatomy 0.000 description 3
- OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N lincomycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N 0.000 description 3
- 229960005287 lincomycin Drugs 0.000 description 3
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 3
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 3
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 3
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 3
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 3
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 3
- WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N tylosin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)O[C@H]([C@@H]([C@H]1N(C)C)O)O[C@@H]1[C@@H](C)[C@H](O)CC(=O)O[C@@H]([C@H](/C=C(\C)/C=C/C(=O)[C@H](C)C[C@@H]1CC=O)CO[C@H]1[C@@H]([C@H](OC)[C@H](O)[C@@H](C)O1)OC)CC)[C@H]1C[C@@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)O1 WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N 0.000 description 3
- 229960004059 tylosin Drugs 0.000 description 3
- 235000019375 tylosin Nutrition 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004135 Bone phosphate Substances 0.000 description 2
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- 241000157855 Cinchona Species 0.000 description 2
- 235000001258 Cinchona calisaya Nutrition 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 108010063907 Glutathione Reductase Proteins 0.000 description 2
- 102000006587 Glutathione peroxidase Human genes 0.000 description 2
- 108700016172 Glutathione peroxidases Proteins 0.000 description 2
- 102100036442 Glutathione reductase, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 2
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 2
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 2
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 2
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 235000000639 cyanocobalamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011666 cyanocobalamin Substances 0.000 description 2
- 229960002104 cyanocobalamin Drugs 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 150000002211 flavins Chemical class 0.000 description 2
- 230000009746 freeze damage Effects 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 2
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M lipoate Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 2
- 125000003410 quininyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 229960000999 sodium citrate dihydrate Drugs 0.000 description 2
- PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M sodium fluoride Chemical compound [F-].[Na+] PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 description 2
- 125000002640 tocopherol group Chemical class 0.000 description 2
- 235000019149 tocopherols Nutrition 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 2
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 2
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 2
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 2
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YSGQGNQWBLYHPE-CFUSNLFHSA-N (7r,8r,9s,10r,13s,14s,17s)-17-hydroxy-7,13-dimethyl-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-one Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@H](O)CC[C@H]2[C@@H]2[C@H](C)CC3=CC(=O)CC[C@@H]3[C@H]21 YSGQGNQWBLYHPE-CFUSNLFHSA-N 0.000 description 1
- CWUAAQVTCQLNTH-UHFFFAOYSA-N 1-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(C)N1CCN(CCO)CC1 CWUAAQVTCQLNTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWFBTOBONSHHKE-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;propane-1,2,3-triol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(O)CO OWFBTOBONSHHKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- ONXOKWFYBIQOFQ-VSXSCALHSA-N ac1l4s0d Chemical compound OS(O)(=O)=O.O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O.O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]1N(C)C[C@H](C(C)C)C1 ONXOKWFYBIQOFQ-VSXSCALHSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 229940111685 dibasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- HSSWOFWCOAQLHZ-UHFFFAOYSA-L disodium;2-oxopentanedioate;dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC(=O)C([O-])=O HSSWOFWCOAQLHZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000000576 food coloring agent Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- ZILMEHNWSRQIEH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O.CCCCCC(O)=O ZILMEHNWSRQIEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 238000000608 laser ablation Methods 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- JCXJVPUVTGWSNB-UHFFFAOYSA-N nitrogen dioxide Inorganic materials O=[N]=O JCXJVPUVTGWSNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000028 nontoxic concentration Toxicity 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036593 pulmonary vascular resistance Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 210000005132 reproductive cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000011775 sodium fluoride Substances 0.000 description 1
- 235000013024 sodium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000008347 soybean phospholipid Substances 0.000 description 1
- 230000009303 sperm storage Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0278—Physical preservation processes
- A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0608—Germ cells
- C12N5/0612—Germ cells sorting of gametes, e.g. according to sex or motility
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0215—Disinfecting agents, e.g. antimicrobials for preserving living parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
as modalidades da presente invenção referem-se geralmente a processos, sistemas e composições úteis na manipulação de uma razão de espermatozoide com cromossomo x viável para espermatozoide com cromossomo y viável em pelo menos uma população de espermatozoide e útil para conservar a população de espermatozoide manipulada resultante. em algumas modalidades, um crioprotetor pode ser incorporado em vários meios utilizados na manipulação da amostra de espermatozoide, tal como num meio de coloração, um fluido de bainha e um meio de coleta.
Description
RELATÓRIO DESCRITIVO
Pedido de Patente de Invenção para “MEIO DE COLORAÇÃO DE ESPERMATOZÓIDE, MÉTODO DE PROCESSAMENTO DE ESPERMATOZÓIDE, MÉTODO DE CONGELAMENTO DE UMA AMOSTRA DE ESPERMATOZÓIDE MANIPULADA, E, SISTEMA”
CAMPO TÉCNICO [0001] De modo geral, esta divulgação refere-se ao processamento de esperma e, mais particularmente, refere-se a processos, sistemas e composições úteis na manipulação de uma razão de espermatozóides com cromossomo X viáveis para espermatozóides com cromossomo Y viáveis em pelo menos uma população de espermatozóides e úteis na conservação da população de espermatozóides manipulada resultante.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [0002] O conteúdo cromossômico de gametas haploides masculinos determina o sexo da prole dos mamíferos. Mais especificamente, a fertilização de um oócito com um espermatozóide com cromossomo Y produz prole masculina e fertilização com um espermatozóide com cromossomo X produz prole do sexo feminino. Embora várias tecnologias tenham sido investigadas para predeterminar o sexo da prole de mamíferos, apenas a triagem por citometria de fluxo goza de ampla aceitação comercial.
[0003] Os citômetros de fluxo modificados para seleção de espermatozóides detectam diferenças relativas no conteúdo de DNA de espermatozóides com cromossomo X e espermatozóides com cromossomo Y. A fim de medir o conteúdo de DNA dos espermatozóides, uma população de espermatozóides é geralmente corada estequiometricamente com um
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 124/278
2/105 corante fluorescente seletivo para DNA que se liga ao DNA nuclear. Um tal corante fluorescente seletivo para DNA, Hoechst 33342, por vezes referido como bisbenzimida Hoechst 33342, pode ser utilizado em quantidades suficientes para diferenciar pequenas variações no DNA nuclear sem exibir a toxicidade de outros corantes.
[0004] Essas diferenças relativas entre espermatozóides com cromossomo X e espermatozóides com cromossomo Y são tipicamente pequenas variações. Em bovinos, por exemplo, os touros Holstein têm uma diferença de cerca de 3,8% no conteúdo de DNA, enquanto os touros Jersey têm uma diferença de 4,1%. Devido à natureza inexata da coloração estequiométrica do DNA, essas pequenas diferenças são difíceis de determinar. Amostras de esperma, mesmo amostras dentro de uma única raça, podem variar muito em concentração, pH, motilidade e morfologia. Como tal, as condições de coloração que funcionaram bem em uma circunstância podem subestimar ou superestimar outras amostras de esperma, mesmo amostras de esperma coletadas da mesma raça, ou mesmo do mesmo animal. A forma do espermatozóide cria dificuldades adicionais na diferenciação de células com cromossomo X das com cromossomo Y. Em particular, as cabeças dos espermatozóides, que contêm o DNA nuclear, são mais ou menos semelhantes a um remo na maioria das espécies. Essa geometria apresenta um efeito de confusão adicional produzindo diferentes níveis de emissões fluorescentes em diferentes ângulos e essas diferenças superam as diferenças detectáveis nos espermatozóides com cromossomos X e Y. A maioria dos citômetros de fluxo para classificação de espermatozóides inclui um detector lateral para determinar a orientação espermática e um bocal de orientação para fornecer ao espermatozóide uma orientação mais uniforme.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 125/278
3/105 [0005] Apesar dessas dificuldades, o Hoechst 33342 pode ser usado em concentrações não tóxicas. Infelizmente, o processo de coloração é prejudicial às células não regenerativas e de tempo crítico. Em particular, a coloração uniforme com Hoechst 33342 requer a incubação a temperaturas elevadas e pHs elevados, e ambos elevando a temperatura do esperma e elevando o pH do esperma contribuem para danos nos espermatozóides. Uma vez corado, a pressão experimentada pelo esperma em um citômetro de fluxo pode apresentar danos adicionais aos espermatozóides, e as forças de cisalhamento associadas podem causar mais danos.
[0006] O tempo de vida limitado dos espermatozóides frequentemente requer o congelamento para armazenamento e envio. Os fluidos intracelulares, incluindo a água, são removidos da célula durante este processo para reduzir o volume de fluidos intracelulares que congelam. Caso contrário, os fluidos intracelulares se cristalizariam e se expandiríam a partir do seu volume de líquido. Essa expansão causa estresse intracelular e dano mecânico aos espermatozóides e reduz a fertilidade do esperma. Um número de crioprotetores pode ser adequado para este fim, sendo o mais comum o glicerol. Mesmo o glicerol, no entanto, apresenta vários inconvenientes. Por exemplo, o glicerol apresenta pelo menos um grau de toxicidade ao espermatozóide, cujo efeito pode tomar-se mais pronunciado com maiores quantidades de glicerol. Além disso, o glicerol pode ser hiperosmótico para o espermatozóide, o que pode resultar em um grau de choque para o espermatozóide ao qual o glicerol foi adicionado. Tais propriedades hiperosmóticas podem fazer com que um espermatozóide entre em contato com o glicerol para encolher ou expandir rapidamente, como resultado de uma diferença na concentração de soluto através da membrana da célula do espermatozóide. Esse rápido encolhimento e expansão pode causar danos ao
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 126/278
4/105 espermatozóide. Esta toxicidade e danos podem ter um efeito agravante, particularmente para espermatozóides triados que tenham passado pelas etapas de coloração e triagem prejudiciais.
[0007] Na maioria dos ambientes comerciais, entretanto, o benefício do congelamento dos espermatozóides triados geralmente supera o impacto negativo do dano causado e certos procedimentos foram desenvolvidos para minimizar os efeitos adversos do glicerol no esperma. Como um exemplo, o glicerol pode ser combinado com esperma a temperaturas reduzidas para mitigar os efeitos tóxicos do glicerol no esperma. Para este propósito, os extensores ou outros meios incorporando glicerol podem ser preparados num processo de múltiplas etapas envolvendo duas ou mais frações de extensor. Em particular, os extensores de esperma podem compreender uma fração A sem glicerol e uma fração B com glicerol. As frações A e B permitem que um extensor de esperma seja introduzido em duas ou mais etapas, por exemplo, uma primeira etapa na qual uma fração A é adicionada ao esperma, como esperma selecionado por sexo, que pode estar à temperatura ambiente seguido de uma segunda etapa em que o esperma e a fração A são arrefecidos a uma temperatura mais baixa e a fração B contendo glicerol adicionado a uma temperatura mais baixa. Além disso, para reduzir os efeitos hiperosmóticos do glicerol no esperma, a fração B pode ser adicionada em múltiplas etapas, possivelmente de modo a reduzir o choque para o esperma submetendo o esperma a quantidades reduzidas de glicerol em cada etapa de glicerol adicionado. Como descrito no Pedido Internacional WO/200137655, por exemplo, o esperma estendido pode ser reconcentrado por centrifugação e suspensão em um extensor de congelamento, às vezes chamado de um extensor AB que possui metade do conteúdo de glicerol da fração B.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 127/278
5/105
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0008] Certas modalidades da invenção reivindicada são resumidas abaixo. Estas modalidades não se destinam a limitar o escopo da invenção reivindicada, mas servem como breves descrições de formas possíveis da invenção. A invenção pode abranger uma variedade de formas que diferem destes resumos.
[0009] Uma modalidade ampla descrita neste documento refere-se à composição de um meio de coloração de esperma que inclui um tampão, um corante seletivo para DNA; e um crioprotetor. O crioprotetor pode ser um álcool de açúcar, tal como etilenoglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galactitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; um glicilglicitol, ou qualquer combinação de álcoois de açúcar. Altemativamente, o crioprotetor pode ser um glicol, tal como propilenoglicol, butano triol ou uma combinação dos mesmos. O agente crioprotetor no meio de coloração pode ter uma concentração em volume/volume (vol./vol.) entre cerca de 0,1% e cerca de 1%; entre cerca de 1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 3%; entre cerca de 3% e cerca de 4%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; ou entre cerca de 1,5% e cerca de 3%. O tampão pode ser qualquer um de HEPES (ácido(4-(2-hidroxietil)1-piperazinoetanossulfônico)), bicarbonato de sódio, MOPS (ácido(3-(Nmorfolino)propanossulfônico)), TRIS (tris(hidroximetil)aminometano)), TES (ácido2- [[ 1,3-dihidroxi-2-(hidroximetil)propan-2il]amino]etanossulfônico), TALP (Tyrode acrescido de Albumina-LactatoPiruvato), TCA (ácido tricloroacético), PBS (solução salina tamponada com fosfato), leite, derivados dos mesmos ou combinações dos mesmos. O corante seletivo para DNA pode ser um corante fluorescente seletivo para DNA tal como Hoechst 33342, que pode ser fornecido a uma concentração
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 128/278
6/105 entre cerca de 10 pM e cerca de 200 pM, entre cerca de 20 uM e cerca de 100 pM, entre cerca de 30 pM e cerca de 70 pM. O meio de coloração de espermapode compreender uma composição de meios de esperma incubados a uma temperatura entre cerca de 30°C e cerca de 39°C, entre cerca de 32°C e cerca de 37°C, ou a cerca de 34°C.
[00010] Outra modalidade ampla da invenção descrita neste documento refere-se a um método de processamento de esperma em que o crioprotetor é introduzido em fases anteriores à contemplada anteriormente. Amostras de esperma com espermatozóides com cromossomo X viáveis para espermatozóides com cromossomo Y viáveis são coradas com um meio de coloração e colocadas em contato com um fluido de bainha em um caminho de fluxo. O meio de coloração e/ou o fluido de bainha incluem um crioprotetor. O método pode continuar manipulando a razão de espermatozóides com cromossomo X viáveis para espermatozóides com cromossomo Y viáveis na amostra de esperma para formar pelo menos uma população de espermatozóides manipulada. Certas modalidades podem ainda incluir a etapa de coletar a população de espermatozóides manipulada num meio de coleta, por vezes referido como um fluido de retenção ou um fluido de coleta. Em algumas modalidades, cada um dos meios de coloração, o fluido de bainha e o meio de coleta incluem uma quantidade de crioprotetor. Certas modalidades podem ainda incluir a etapa de criopreservar/congelar a amostra de esperma manipulada. O crioprotetor pode ser um poliálcool, uma amida de baixo peso molecular ou metilamida; numa modalidade, o poliálcool é um álcool de açúcar, tal como etilenoglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galactitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; um glicilglicitol, ou qualquer combinação de
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 129/278
7/105 álcoois de açúcar. Noutra modalidade, o poliálcool pode ser um glicol, tal como propileno glicol, butano triol ou combinações dos mesmos.
[00011] Quando presente no meio de coloração, o crioprotetor pode ter um vol./vol. ou concentração de peso/volume (p/vol.) entre cerca de 0,1% e cerca de 1%; entre cerca de 1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 3%; entre cerca de 4% e cerca de 5%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%; ou entre cerca de 1,5% e cerca de 3%.
[00012] Quando presente no fluido de bainha, o crioprotetor pode ter uma concentração de vol./vol. ou peso/vol. entre cerca de 0,1% e cerca de 6%; entre cerca de 0,1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; entre cerca de 4% e cerca de 6%; entre cerca de 1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 3%; cerca de 3%; entre cerca de 3% e cerca de 4%; entre cerca de 4% e cerca de 5%; entre cerca de 5% e cerca de 6%; entre cerca de 2% e cerca de 6%; cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%; ou entre cerca de 3% e cerca de 5%. Quando presente nos meios de coleta, o crioprotetor pode ter uma concentração de vol./vol. ou peso/vol. entre cerca de 1 % e cerca de 2% de crioprotetor em volume; entre cerca de 2% e cerca de 4% de crioprotetor em volume; entre cerca de 4% e cerca de 6% de crioprotetor em volume; entre cerca de 3% e cerca de 5% de crioprotetor em volume; cerca de 1%, 2%, 3%, 4% ou 5% de crioprotetor em volume; entre cerca de 3,5% e cerca de 5,5% de crioprotetor em volume ou a cerca de 4,5% em volume.
[00013] Em certas modalidades do método amplo, o crioprotetor pode ser adicionado em mais de um dentre meio de coloração, fluido de bainha, meio de coleta. O crioprotetor pode estar presente em quantidades diferentes em cada um dos meios de coloração, fluido de bainha, meio de coleta. Numa modalidade, a concentração de crioprotetor é aumentada, quando presente, em cada etapa subsequente em que o crioprotetor está presente.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 130/278
8/105
Similarmente, em modalidades nas quais a amostra de esperma manipulada é estendida em um congelador, e onde crioprotetor foi adicionado em mais de um dos meios de coloração, fluido de bainha, o meio de coleta do crioprotetor pode estar presente em um extensor de congelamento em uma concentração vol./vol. ou peso/vol. menor que 6%. Numa tal modalidade, o crioprotetor pode estar presente no extensor de congelamento a uma concentração de vol./vol. ou peso/vol. entre cerca de 1% e cerca de 6%, entre cerca de 3% e cerca de 5%, entre cerca de 3,5% e cerca de 5,5%, cerca de 3,5%, entre cerca de 4% e cerca de 5%, ou com uma concentração de cerca de 4,5%.
[00014] Uma modalidade ampla descrita neste documento refere-se a um sistema para manipular uma amostra de esperma na presença de um crioprotetor. O sistema inclui uma fonte de amostra contendo uma amostra de esperma e uma fonte de bainha contendo fluido de bainha com um aditivo crioprotetor. Uma estrutura de distribuição de fluido forma um fluxo coaxial de amostra de esperma da fonte de amostra cercada por fluido de bainha da fonte de fluido de bainha e direciona o fluxo coaxial através de um local de interrogação. Uma fonte de radiação eletromagnética ilumina o espermatozóide no local de interrogação e pelo menos um detector gera sinais em resposta a essa iluminação. Um analisador determina as características do espermatozóide com base nos sinais produzidos pelo detector pelo menos.
[00015] Em algumas modalidades do sistema para manipular uma amostra de esperma, a estrutura de fornecimento de fluido compreende um bocal, tal como um bocal de orientação. Enquanto em outras modalidades a estrutura de distribuição de fluido compreende um canal de fluxo, tal como numa cuvete ou num chip microfluídico. Algumas modalidades do sistema
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 131/278
9/105 incluem os componentes necessários para formar, carregar e defletir gotículas do fluxo coaxial, enquanto noutras modalidades, o laser fotodanificador (isto é, ablação) danifica espermatozóides selecionados no fluxo coaxial.
[00016] O crioprotetor presente no fluido de bainha se tal sistema pode ser um álcool de açúcar, tal como etilenoglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galactitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; um glicilglicitol, ou qualquer combinação de álcoois de açúcar. Altemativamente, o crioprotetor pode ser um glicol, tal como propilenoglicol, butano triol ou uma combinação dos mesmos. O crioprotetor pode estar presente no fluido de bainha a uma concentração de vol./ vol. ou peso/vol. entre cerca de 0,1% e cerca de 6%; entre cerca de 0,1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; entre cerca de 4% e cerca de 6%; entre cerca de 1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 3%; entre cerca de 3% e cerca de 4%; entre cerca de 4% e cerca de 5%; entre cerca de 5% e cerca de 6%; entre cerca de 2% e cerca de 6%; ou entre cerca de 3% e cerca de 5%.
[00017] Ainda outra modalidade ampla descrita neste documento referese a um método de processamento de esperma em que o crioprotetor é introduzido em fases anteriores à contemplada anteriormente. Amostras de esperma com espermatozóides com cromossomo X viáveis para espermatozóides com cromossomo Y viáveis são coradas com um meio de coloração que possui um corante seletivo para DNA e injetadas em um fluxo de fluido de bainha. Os espermatozóides corados na amostra de esperma são então expostos a uma fonte de radiação eletromagnética que causa uma resposta detectável no corante seletivo para DNA. A resposta detectável do corante seletivo para DNA é então detectada e uma razão de espermatozóides
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 132/278
10/105 com cromossomo X viáveis para espermatozóides com cromossomo Y viáveis é manipulada para formar pelo menos uma população de espermatozóides manipulada. A pelo menos uma população de espermatozóides manipulada é coletada em um ou mais recipientes de coleta possuindo meios de coleta. Neste método amplo, um ou mais dentre os meios de coloração, fluido de bainha e meio de coleta incluem um crioprotetor.
[00018] O crioprotetor pode ser um álcool de açúcar, tal como etilenoglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galactitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; um glicilglicitol, ou qualquer combinação de álcoois de açúcar. Altemativamente, o crioprotetor pode ser um glicol, tal como propilenoglicol, butano triol ou uma combinação dos mesmos.
[00019] Quando presente no meio de coloração, o crioprotetor pode ter uma concentração vol./vol. ou concentração de peso/volume entre cerca de 0,1% e cerca de 1%; entre cerca de 1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 3%; entre cerca de 4% e cerca de 5%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; ou entre cerca de 1,5% e cerca de 3%.
[00020] Quando presente no fluido de bainha, o crioprotetor pode ter uma concentração de vol./vol. ou peso/vol. de menos de 6%; menos de 5%; menos de 4%; menos de 3%; menos de 2%; menos de 1%; entre cerca de 0,1 % e cerca de 6%; cerca de 0,1 % e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; entre cerca de 4% e cerca de 6%; entre cerca de 1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 3%; entre cerca de 3% e cerca de 4%; entre cerca de 4% e cerca de 5%; entre cerca de 5% e cerca de 6%; entre cerca de 2% e cerca de 6%; ou entre cerca de 3% e cerca de 5%.
[00021] Da mesma forma, quando presente nos meios de coleta, o crioprotetor pode ter uma concentração de vol./vol. ou peso/vol. entre cerca
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 133/278 /105 de 1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; entre cerca de 4% e cerca de 6%; entre cerca de 3% e cerca de 5%; entre cerca de 3,5% e cerca de 5,5%; ou a uma concentração de cerca de 4,5.
[00022] O crioprotetor pode estar presente em quantidades diferentes em cada um dos meios de coloração, fluido de bainha, meio de coleta. Numa modalidade, a concentração de crioprotetor é aumentada, quando presente, em cada etapa subsequente em que o crioprotetor está presente.
[00023] Em modalidades nas quais a amostra de esperma manipulada é estendida em um extensor de congelamento para congelamento, e onde crioprotetor foi adicionado em mais de um dos meios de coloração, fluido de bainha, o meio de coleta do crioprotetor pode estar presente no extensor de congelamento em uma concentração vol./vol. ou peso/vol. menor que 6%. Numa tal modalidade, o crioprotetor pode estar presente numa concentração entre 1% e 6%, entre 3,5% e 5,5%, entre 4% e 5%, ou numa concentração de cerca de 4,5%.
[00024] Ainda outra modalidade ampla descrita neste documento referese a um método de congelamento/criopreservação de uma população de espermatozóides manipulada coletada como uma mistura que inclui um crioprotetor. Uma tal modalidade compreende o contato de uma amostra de esperma corada com um fluido de cobertura num trajeto de fluxo; manipulação de uma razão de espermatozóides com cromossomo X viáveis para espermatozóides com cromossomo Y viáveis para formar pelo menos uma população de espermatozóides manipulada; coletar a amostra de esperma manipulada na presença de um crioprotetor; concentração da amostra de esperma coletado; ressuspender a amostra de esperma concentrada em um extensor de congelamento; e congelar a amostra de esperma ressuspensa. O método pode ainda compreender a etapa de arrefecer
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 134/278 / 105 o esperma durante um período inferior a 90 minutos. Adicionalmente, a etapa de coletar uma mistura compreende ainda: coletar a mistura num recipiente que contenha entre cerca de 5 ml e cerca de 50 ml de meio de coleta. Em certas modalidades, a etapa de coletar uma mistura compreende ainda a coleta de uma amostra de esperma separada de um citômetro de fluxo até o recipiente ser fundido entre cerca de 60% e cerca de 90% da capacidade dos recipientes. Em outras modalidades, a etapa de concentração da mistura coletada é realizada no recipiente. Ainda noutra modalidade, a etapa de concentração da amostra de esperma coletada segue diretamente a etapa de coletada da amostra de esperma manipulado na presença de um crioprotetor sem que ocorra qualquer outra diluição entre as etapas. O extensor de congelamento nesta modalidade pode extrair menos de 6% vol./ vol. ou peso/vol. de crioprotetor; entre 3,5 e 5,5% vol./vol. ou peso/vol. de crioprotetor; ou entre 4 e 5% vol./vol. ou peso/vol. de crioprotetor. Numa outra modalidade, a etapa de manipulação de uma razão de espermatozóides com cromossomo X viáveis para espermatozóides com cromossomo Y viáveis para formar pelo menos uma população de espermatozóides manipulada pode compreender ou formar gotículas que se espera contenham esperma selecionado e defletir essas gotículas para coleta ou esperma fotodanificador selecionado esperma no caminho do fluxo.
[00025] Um outro aspecto da invenção inclui o uso de esperma processado usando qualquer um dos métodos descritos neste documento para fertilizar um oócito. Tal fertilização pode ser conseguida contatando o esperma processado com um oócito. Esta modalidade da invenção abrange a utilização de quaisquer técnicas de fertilização in vitro (FIV) conhecidas na técnica, ou quaisquer técnicas de inseminação artificial que sejam conhecidas na técnica, para conseguir a fertilização.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 135/278 /105 [00026] No que diz respeito a qualquer e todas as modalidades da invenção divulgadas neste documento, incluindo as modalidades acima mencionadas, o fluido de bainha, meio de coloração ou meio de coleta pode compreender qualquer um dos crioprotetores acima mencionados a uma concentração vol./vol. ou peso/vol. inferior a 8%; inferior a 7%; 6%; inferior a 6%; inferior a 5%; 4,5%; inferior a 4%; inferior a 3%; inferior a 2%; ou inferior a 1%.
[00027] Adicionalmente, com respeito a qualquer e todas as modalidades da invenção divulgadas neste documento, incluindo as modalidades acima mencionadas, o fluido de bainha, meio de coloração ou meio de coleta pode compreender qualquer dos crioprotetores acima mencionados em qualquer das seguintes concentrações: 10 mM a 1000 mM; 10 mM a 500 mM; 10 mM a 300 mM; 10 mM a 200 mM; 10 mM a 150 mM; menos de 1000 mM; menos de 900 mM; menos de 800 mM; menos de 700 mM; menos de 600 mM; menos de 500 mM; menos de 400 mM; menos de 300 mM; menos de 200 mM; menos de 150 mM; menos de 100 mM; menos de 50 mM; ou menos de 25 mM.
[00028] Numa modalidade adicional da invenção, o crioprotetor para utilização em qualquer das modalidades acima mencionadas, incluindo num meio de coloração, num fluido de bainha, num fluido de captura ou num meio de congelamento, pode compreender eritritol. Numa outra modalidade, o eritritol está numa concentração de cerca de 10 a 300 mM, cerca de 15 a 250 mM, cerca de 25 a 125 mM, cerca de 40 a 80 mM, cerca de 0,01 a 1000 mM, cerca de 0,01 a 400 mM, cerca de 35 mM, cerca de 65 mM, cerca de 135 mM, cerca de 270 mM, cerca de 400 mM, cerca de 400 a 1000 mM, cerca de 400 a 500 mM ou cerca de 400 a 600 mM.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 136/278 / 105 [00029] A FIG. 1 ilustra um esquema de um citômetro de fluxo para manipular uma amostra de esperma de acordo com certas modalidades descritas neste documento.
[00030] A FIG. 2 ilustra uma representação gráfica de parâmetros adquiridos num citômetro de fluxo enquanto manipula uma amostra de esperma de acordo com várias modalidades descritas neste documento.
[00031] A FIG. 3 ilustra uma representação gráfica de parâmetros adquiridos num citômetro de fluxo enquanto manipula uma amostra de esperma de acordo com várias modalidades descritas neste documento.
[00032] A FIG. 4 ilustra uma representação gráfica de parâmetros de triagem adquiridos num citômetro de fluxo enquanto se tria esperma de acordo com várias modalidades descritas neste documento.
[00033] As FIGS. 5-7 ilustram modalidades alternativas na utilização de crioprotetor em várias etapas de processamento de amostras de esperma.
[00034] A FIG. 8 ilustra uma modalidade envolvendo congelar uma amostra de esperma.
[00035] A FIG. 9 mostra as razões de pico a vale obtidas quando se utiliza fluido de bainha contendo quantidades variáveis de glicerol.
[00036] A FIG. 10 mostra a motilidade pós-descongelamento do esperma triado usando quantidades variáveis de glicerol no fluido de bainha.
[00037] A FIG. 11 mostra a viabilidade pós-descongelamento e percentagem de acros somas intactos (PIA) de esperma triado utilizando quantidades variáveis de glicerol no fluido de bainha.
[00038] A FIG. 12 mostra os PVRs obtidos quando se utiliza fluido de bainha contendo quantidades variáveis de glicerol.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 137/278 /105 [00039] A FIG. 13 mostra a motilidade pós-descongelamento, viabilidade e PIAs do esperma triado usando quantidades variáveis de glicerol no fluido de bainha.
[00040] A FIG. 14 mostra a convergência da motilidade pósdescongelamento, viabilidade e PIAs de esperma triado utilizando quantidades variáveis de glicerol no fluido de bainha.
[00041] A FIG. 15 mostra a motilidade pós-descongelamento, viabilidade e PIAs do esperma triado usando quantidades variáveis de glicerol no fluido de bainha.
[00042] A FIG. 16 mostra a convergência da motilidade pósdescongelamento, viabilidade e PIAs do esperma triado usando quantidades variáveis de glicerol no fluido de bainha.
[00043] A FIG. 17 mostra motilidade pós-descongelamento, viabilidade e PIAs de esperma triado usando diferentes glicois no fluido de bainha.
[00044] A FIG. 18 mostra a convergência da motilidade pósdescongelamento, viabilidade e PIAs de esperma classificado usando diferentes glicois no fluido de bainha.
[00045] A FIG. 19 mostra a motilidade pós-descongelamento do esperma triado usando quantidades variáveis de glicerol no fluido de bainha.
[00046] A FIG. 20 mostra a viabilidade pós-descongelamento e PIAs do esperma triado usando quantidades variáveis de glicerol no fluido de bainha.
[00047] A FIG. 21 mostra motilidade pós-descongelamento de esperma triado usando diferentes glicois no fluido de bainha.
[00048] A FIG. 22 mostra viabilidade de pós-descongelamento e PIAs de esperma triado usando diferentes glicois no fluido de bainha.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 138/278
16/105 [00049] A FIG. 23 mostra motilidade Oh pós-descongelamento para esperma triado usando 3% de glicerol no fluido de bainha e criopreservado em meios com concentrações variadas de glicerol.
[00050] A FIG. 24 mostra a viabilidade pós-descongelamento Oh e PIAs para esperma triado usando 3% de glicerol no fluido de bainha e criopreservado em meios com concentrações variadas de glicerol.
[00051] A FIG. 25 mostra 3 horas de motilidade pós-descongelamento para esperma triado utilizando 3% de glicerol no fluido de bainha e criopreservado em meios com concentrações variáveis de glicerol.
[00052] A FIG. 26 mostra 3h de viabilidade pós-descongelamento e PIAs para esperma triado usando 3% de glicerol no fluido de bainha e criopreservado em meios com concentrações variadas de glicerol.
[00053] A FIG. 27 mostra convergência de motilidade pósdescongelamento para esperma triado usando 3% de glicerol no fluido de bainha e criopreservado em meios com concentrações variadas de glicerol.
[00054] A FIG. 28 mostra a convergência da viabilidade pósdescongelamento e PIAs para esperma triado usando 3% de glicerol no fluido de bainha e criopreservado em meios com concentrações variadas de glicerol.
[00055] A FIG. 29 mostra a motilidade Oh pós-descongelamento e viabilidade de PIAs para esperma triado usando várias quantidades de glicerol no fluido de bainha e criopreservado em meios com concentrações variadas de glicerol.
[00056] A FIG. 30 mostra motilidade pós-descongelamento de 3h e viabilidade de PIAs para esperma triado usando várias quantidades de
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 139/278 / 105 glicerol no fluido de bainha e criopreservado em meios com concentrações variadas de glicerol.
[00057] A FIG. 31 mostra a convergência da motilidade pósdescongelamento e viabilidade de PIAs para esperma triado usando várias quantidades de glicerol no fluido de bainha e criopreservado em meios com concentrações variadas de glicerol.
[00058] A FIG. 32 mostra resultados de IVF usando esperma classificado com glicerol no fluido de bainha ou ausente do fluido de bainha.
[00059] A FIG. 33 mostra a motilidade pós-descongelamento, PIAs, convergência e viabilidade de esperma triados com glicerol no fluido de bainha ou ausentes do fluido de bainha.
[00060] A FIG. 34 mostra taxas de concepção para esperma triados com glicerol no fluido de bainha ou ausentes do fluido de bainha.
[00061] A FIG. 35 mostra a motilidade pós-descongelamento, viabilidade e PIAs para esperma triados com AB preparados com criolizador ou com AB preparados com 100% de glicerol vol./vol.
[00062] A FIG. 36 mostra a motilidade pós-descongelamento, viabilidade e PIAs para esperma triado com glicerol no fluido de captura e no fluido de bainha ou ausentes do fluido de captura e do fluido de bainha.
[00063] A FIG. 37 mostra a motilidade do esperma mantido em Caprogen com glicerol e Caprogen com várias concentrações de eritritol.
MODOS PARA REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO [00064] Os espermatozóides podem ser obtidos, ou fornecidos, em virtude da obtenção de uma amostra de esperma ou de uma solução espermática que contenha espermatozóide. Conforme usado ao longo do
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 140/278
18/105 termo, o termo espermatozóide refere-se ao singular ou ao plural da célula reprodutiva masculina, enquanto uma amostra de esperma refere-se ao fluido transportador além dos espermatozóides nele contidos. Exemplos de amostras de esperma incluem sêmen puro ou esperma estendido em outra solução, como um extensor ou tampão, e inclui esperma congeladodescongelado. Uma amostra de esperma pode ser obtida no mesmo local em que as etapas restantes são executadas, ou pode ser estendida em um extensor de esperma apropriado para transporte para uma instalação de triagem. Uma vez obtido, o esperma pode ser mantido à temperatura ambiente, resfriado ou até mesmo congelado em um extensor apropriado para uso posterior. Espermatozóides para coloração e triagem podem ser adquiridos de um mamífero, ou podem ser espermatozóides adquiridos do armazenamento, como uma palha congelada ou resfriada obtida do armazenamento. Altemativamente, o esperma congelado ou estendido pode ser agrupado.
[00065] Uma amostra de esperma pode originar-se de mamíferos, tais como mamíferos não humanos listados por Wilson, D.E. e Reeder, D.M., Mammal Species of the World, Smithsonian Institution Press, (1993), cujo conteúdo total é incorporado neste documento por referência. No momento da coleta, ou descongelamento, ou mesmo agrupamento, o esperma pode ser verificado quanto à concentração, pH, motilidade e/ou morfologia. Além disso, antibióticos podem ser adicionados antes de outras etapas de processamento.
[00066] Uma vez obtido, o esperma pode opcionalmente ser padronizado para uma concentração predeterminada e/ou para um pH predeterminado. Como utilizado neste documento, a padronização pode ser entendida como uma ação realizada de modo a trazer várias características de um ejaculado para um intervalo predeterminado ou
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 141/278
19/105 próximo do referido intervalo predeterminado. Enquanto ejaculados bovinos, por exemplo, podem variar muito em pH e concentração espermática, a etapa de padronizar concentração de esperma ou pH, pode incluir a adição de um tampão de alta capacidade que serve para padronizar o pH e tamponar contra a tendência de ejaculados se tornarem mais ácidos com o tempo.
[00067] Cada uma das concentrações e pH predeterminados pode ser específica para diferentes espécies, ou mesmo para diferentes raças de animais dentro de uma espécie. Numa modalidade, o esperma pode ser combinado com um extensor inicial na forma de um tampão de alta capacidade, ou um extensor tendo uma capacidade de tamponamento de pH grande. Os extensores adequados podem incluir citrato de TRIS, citrato de sódio, bicarbonato de sódio, HEPES, TRIS, TESTE, MOPS, KMT, TALP, derivados dos mesmos e combinações dos mesmos. Qualquer extensor tendo um tampão com uma elevada capacidade para tamponar o pH pode também ser utilizado e pode ser utilizado em combinação com componentes adicionais que promovem a viabilidade do esperma. Como exemplo de um aditivo, a proteína pode ser incorporada na forma de gema de ovo, leite, lipoproteínas, lecitina, caseína ou albumina ou outras fontes de proteína. Uma fonte de energia também pode ser incorporada na forma de um monossacarídeo, como frutose, glicose ou manose, ou mesmo um dissacarídeo ou trissacarídeo. Adicionalmente, antioxidantes e antibióticos podem ser empregados no extensor inicial para promover a viabilidade espermática.
[00068] O extensor inicial pode ser ajustado a um pH predeterminado para padronizar o pH de todas as amostras de esperma obtidas, tal como um pH entre cerca de 6,8 e 7,4. Numa modalidade, o extensor é ajustado para
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 142/278 /105 um pH de 7,2. Além disso, o sêmen pode se tomar cada vez mais ácido ao longo do tempo, possivelmente devido a proteínas no fluido seminal, ou devido a produtos ácidos do metabolismo ou subprodutos de células mortas ou moribundas. O extensor inicial introduz suficientes sítios de ligação livres de prótons (isto é, H+) para manter o pH próximo do alvo predeterminado. Mesmo à luz da tendência natural do esperma se tomar mais ácido ao longo do tempo, o extensor inicial fornece um meio de estabilizar o pH em etapas adicionais de processamento.
[00069] O extensor inicial pode conter aditivos com a finalidade de manter a saúde do esperma. O extensor inicial pode incluir antibióticos para prevenir a proliferação de bactérias. Como exemplos não limitativos, a tilosina, a gentamicina, a lincomicina, a linco-espectina, a espectinomicina, a penicilina, a estreptomicina e combinações dos mesmos podem ser incorporadas no extensor inicial.
[00070] Os antioxidantes também podem ser incorporados no extensor inicial para reduzir os radicais livres e as tensões oxidativas. Enquanto a discussão instantânea se relaciona com o uso de antioxidantes num extensor inicial, deve ser apreciado que os antioxidantes podem ser incorporados em múltiplos estágios do processo de triagem de esperma, independentemente ou em combinação, como descrito no Pedido Internacional de Patente WO2012167151, cujos conteúdos totais são incorporados neste documento por referência. Uma lista não limitativa de antioxidantes que podem ser incorporados inclui: catalase, SOD, mímica SOD, glutationa, glutationa redutase, glutationa peroxidase, piruvato, ácido caproico, mercaptoetanol, BHT, ácido lipoico, flavinas, quininas, vitamina K (e relacionados vitaminas), vitamina BI2, vitamina B12 vitaminas, vitamina E (e vitaminas relacionadas), tocoferóis, tocotrienois, a-tocoferil, alfa-cetoglutarato (AKG),
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 143/278 / 105 malondialdeído (MDA), dimetilargmina assimétrica (ADMA) e derivados dos mesmos biologicamente ativos, e combinações dos mesmos.
[00071] A concentração de antioxidantes pode estar no intervalo de 0,01 mg / ml a 0,5 mg / ml e, como exemplos não limitativos, os antioxidantes listados acima podem ser fornecidos na concentração de 0,01 mg / ml a 5,0 mg / ml; 0,01 mg / ml a 0,25 mg / ml; 0,01 mg / ml a 0,5 mg / ml; 0,01 mg / ml a 1 mg / ml; 0,01 mg / ml a 2,5 mg / ml; 0,01 mg / ml a 5 mg / ml; 0,05 mg / ml a 0,1 mg / ml; 0,05 mg / ml a 1,0 mg / ml; 0,05 mg / ml a 2,5 mg / ml; 0,1 mg / ml a 0,25 mg / ml; 0,1 mg / ml a 0,5 mg / ml; 0,1 mg / ml a 1 mg / ml; 0,1 mg / ml a 2,5 mg / ml; 0,1 mg / ml a 5 mg / ml; 0,15 mg / ml a 0,45 mg / ml; 0,15 mg / ml a 0,5 mg / ml; 0,25 mg / ml a 0,35 mg / ml; 0,25 mg / mia 0,5 mg / ml; 0,25 mg / ml a 1 mg / ml; 0,25 mg / ml a 2,5 mg / ml; 0,25 mg / ml a 5 mg / ml; 0,35 mg / ml a 0,5 mg / ml; 0,35 mg / ml a 1 mg / ml; 0,35 mg / ml a 2,5 mg / ml; 0,35 mg / ml a 5 mg / ml; 0,5 mg / ml a 1 mg / ml; 0,5 mg / ml a 2,5 mg / ml; 0,5 mg / ml a 5 mg / ml; 1 mg / ml a 2,5 mg / ml; e 1 mg / ml a 5 mg / ml.
[00072] Como um exemplo, a amostra de esperma pode ser diluída no tampão de alta capacidade em razões de cerca de 1:1 a cerca de 1:10. A mistura resultante terá uma concentração de esperma muitas vezes abaixo das concentrações de esperma naturais para uma espécie particular. O esperma estendido pode ser centrifugado para reconcentrar o esperma. Centrifugando o esperma e removendo o sobrenadante permite que o esperma seja reconcentrado em uma concentração predeterminada. A concentração predeterminada pode ser selecionada com base em etapas adicionais de processamento de esperma. Por exemplo, no caso de triagem por sexo de bovinos, o esperma pode ser reconcentrado entre cerca de 2400 milhões de espermatozóides por ml e cerca de 500 milhões de
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 144/278 / 105 espermatozóides por ml para simular um intervalo natural de concentrações enquanto substituem os componentes do plasma seminal pelo extensor. Outras concentrações, tais como entre cerca de 1400 milhões de espermatozóides por ml e cerca de 2100 milhões de espermatozóides por ml, ou entre cerca de 1700 milhões de espermatozóides por ml e cerca de 2100 milhões de espermatozóides por ml podem também ser alcançadas para processamento adicional.
[00073] Numa modalidade, a concentração de esperma e o pH podem fornecer um ponto de partida uniforme para processamento adicional. Por exemplo, um pH e concentração relativamente consistentes podem fornecer uma maior previsibilidade na coloração do esperma, por exemplo, com um corante seletivo para o DNA. Se cada amostra for ajustada para o mesmo pH e concentração pré-determinados, menos ensaios podem ser necessários em cada nova coleção para garantir uma coloração adequada para a classificação por sexo.
[00074] Uma população de espermatozóides incluirá espermatozóides com cromossomo X e espermatozóides com cromossomo Y. Além disso, cada um dos espermatozóides com cromossomo X e dos espermatozóides com cromossomo Y incluirá espermatozóides viáveis e espermatozóides não viáveis. Espermatozóides viáveis podem ser considerados espermatozóides com membranas intactas, enquanto espermatozóides não viáveis podem ser considerados espermatozóides com membranas comprometidas. A distinção entre espermatozóides viáveis e espermatozóides não viáveis na classificação convencional de espermatozóides é determinada com a inclusão de um corante de extinção que permeia os espermatozóides com a membrana comprometida. O espermatozóide que tende a estar morto ou a morrer absorve o corante de extinção e produz sinais de fluorescência
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 145/278 /105 distintos da população de espermatozóides restante, enquanto os espermatozóides com membranas intactas tendem a ser viáveis e impedir a captação do corante de extinção. Os espermatozóides viáveis, na dosagem apropriada, geralmente serão capazes de realizar fertilização em uma inseminação artificial, enquanto espermatozóides não viáveis, ou espermatozóides com a membrana comprometida, podem ser incapazes de realizar a fertilização em uma desinsuflação artificial ou terão uma capacidade muito reduzida de fazê-lo. No entanto, alguns espermatozóides capazes de fertilização podem ter membranas comprometidas, e alguns espermatozóides com membranas intactas podem ser incapazes de fertilização.
[00075] Estandardizados ou não, os espermatozóides podem ser corados com um meio de coloração para a introdução de um corante seletivo para o DNA. Na etapa de coloração, pelo menos, uma porção da população de espermatozóides é incubada com um meio de coloração e um corante fluorescente seletivo para DNA para corar estequiometricamente o conteúdo de DNA de cada célula na população de esperma. Hoechst 33342 tende a ser menos tóxico do que outros corantes seletivos para o DNA. O veículo para distribuir este corante pode estar na forma de um tampão TALP modificado ajustado a um pH de cerca de 7,4. Hoechst 33342 é descrito na patente US 5,135,759 e é comumente usado para este fim. No entanto, outros corantes excitáveis por radiação UV, bem como corantes excitáveis à luz visível, poliamidas fluorescentes, sequências de nucleotídeos fluorescentes e anticorpos específicos de sexo também podem ser utilizados.
[00076] O espermatozóide num estado natural muitas vezes não é prontamente permeável a esses corantes. De modo a produzir uma coloração uniforme, a primeira etapa de coloração pode incluir a incubação de pelo
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 146/278 / 105 menos uma porção da população de espermatozóides a uma temperatura elevada num meio de coloração (por vezes referido neste documento como um tampão de coloração) a um pH elevado para além do corante. Exemplos de soluções de coloração apropriadas podem ser um TALP, TES-TRIS, citrato de TRIS, citrato de sódio ou um meio baseado em HEPES, cada um descrito em W02005/095960, que é incorporado neste documento por referência. Um exemplo não limitativo de um TALP modificado descrito no documento WO2001/37655, incorporado neste documento por referência, é ilustrado na Tabela 1.
TABELA 1 - Tampão TALP modificado
| Ingrediente | Concentração |
| NaCl | 95,0 mM |
| KC1 | 3,0 mM |
| NaHPO4 | 0,3 mM |
| NaHCO3 | 10,0 mM |
| MgCL26H2O | 0,4 mM |
| Na Piruvato | 2,0 mM |
| Glicose | 5,0 mm |
| Na Lactato | 25,0 mM |
| HEPES | 40,0 mM |
| Albumina de soro bovino | 3,0 mg/ml |
[00077] Como um exemplo, a população de esperma, ou uma parte da população de espermatozóides, pode ser diluída com o meio de coloração entre 640xl06e 40xl06 espermatozoides/ml, a cerca de 320xl06e 80xl06 espermatozoides/ml, ou para cerca de 160x10s espermatozoides/ml no tampão. O corante fluorescente seletivo para DNA pode ser adicionado ao esperma suspenso no tampão numa concentração entre cerca de 10 pM e 200
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 147/278 /105 pM; entre cerca de 20 pM e 100 pM, ou entre cerca de 30 pM e 70 pM. O pH do tampão pode estar entre cerca de 6,8 e 7,9; cerca de 7,1 e 7,6; ou a cerca de 7,4, a fim de ajudar a garantir uma coloração uniforme do DNA nuclear. Os versados na técnica apreciarão que o pH pode ser elevado com a adição de NaOH e diminuído com a adição de HC1. Opcionalmente, os antioxidantes e concentrações previamente descritos podem ser incorporados na solução de coloração.
[00078] A população de espermatozóides pode ser incubada entre 3039°C, entre cerca de 32-37°C, ou a cerca de 34°C. O período de incubação pode variar entre cerca de 20 minutos e cerca de três horas, entre cerca de 30 minutos e cerca de 90 minutos, ou durante cerca de 45 minutos a cerca de 60 minutos. Como um exemplo, a população de espermatozóides pode ser incubada por cerca de 45 minutos a 34°C. Mesmo dentro de uma única espécie, a concentração espermática e o pH e outros fatores que afetam a capacidade de coloração podem variar de animal para animal. Os versados na técnica podem apreciar pequenas variações para a incubação de esperma entre espécies e mesmo entre raças ou animais da mesma raça para obter uma coloração uniforme sem sobrepor a coloração de uma população de esperma.
[00079] Além do corante fluorescente de DNA seletivo, um corante de extinção pode ser aplicado com a finalidade de permear os espermatozóides com a membrana comprometida e extinguir os sinais que eles produzem. Um corante de extinto pode ser entendido como incluindo corantes que se associam diferencialmente a espermatozóides com membrana comprometida. Pode ser que esses corantes entrem mais facilmente no espermatozóide com membrana comprometida, porque as membranas estão quebrando ou, de outra forma, cada vez mais porosas. Também pode ser que os corantes de extinção prontamente entrem em todas as membranas
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 148/278 /105 espermáticas e que os espermatozóides saudáveis bombeiam ativamente para fora os corantes de extinção mais rapidamente do que os espermatozóides com membrana comprometida. Em ambos os casos, espermatozóides com os quais os corantes de extinção se associam incluem uma grande porção de espermatozóides mortos e morrendo, embora não necessariamente todo os espermatozóides estejam mortos ou morrendo. Os sinais extintos produzidos a partir de espermatozóides com a membrana comprometida, tendo uma associação com o corante de extinção, são suficientemente distintos dos sinais dos espermatozóides saudáveis, que podem ser removidos da análise adicional e da triagem aplicada aos espermatozóides viáveis.
[00080] Numa modalidade, uma segunda etapa de coloração é préformada, o que reduz ainda mais a concentração de espermatozóides e introduz o corante de extinção. O pH do segundo meio de coloração pode ser direcionado para atingir um pH alvo na amostra final de esperma. Exemplos não limitativos de processos de coloração de duas etapas descritas no Pedido Internacional PCT publicado WO 2011/123166 e no Pedido Internacional PCI7US12/58008, a divulgação completa de ambos é incorporada neste documento por referência.
[00081] Noutra modalidade, o corante de extinção e o corante seletivo para DNA são aplicados em conjunto numa única diluição. Nesta modalidade, o corante de extinção é incubado juntamente com o corante seletivo para DNA a uma temperatura elevada na solução corada. Como exemplo, o meio de coloração pode ser um TALP modificado com um pH de 7,4. Contudo, podem ser empregues outros corantes incluindo um TESTRIS, citrato de TRIS, citrato de sódio ou um meio baseado em HEPES possuindo o corante seletivo para DNA e o corante de extinção e o pH pode variar entre cerca de 7,0 e 7,8. Numa modalidade, pode existir uma sinergia
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 149/278 / 105 quando o esperma é padronizado a um pH elevado de cerca de 7,2 antes da coloração a um pH de 7,4. Desta forma, o pH ao qual o esperma é exposto permanece em um intervalo constante com variações mínimas. Como tanto o meio de coloração quanto o extensor inicial têm alta capacidade de tamponamento, acredita-se que a tendência natural do esperma se tomar mais ácido ao longo do tempo será evitada.
[00082] Numa modalidade, independente de se utilizar um protocolo de coloração de uma etapa ou de duas etapas, um crioprotetor pode ser incorporado na etapa ou nas etapas de coloração. Deve ser entendido que, como usado neste documento o termo crioprotetor refere-se a uma substância que protege as células ou o tecido biológico dos danos por congelamento. Os crioprotetores podem incluir aquelas substâncias que agem para remover a água intracelular para evitar danos associados com a formação e expansão do gelo intracelular. Tal ação pode ser induzida pelo aumento das concentrações de soluto dentro das células. Substâncias que protegem células e tecidos de outros tipos de danos, como choque osmótico e resfriamento, mas não congelam, não são consideradas crioprotetoras. Como apenas alguns exemplos, fontes de lipoproteínas, fosfolipídios, lecitina e similares, como gema de ovo, extrato de gema de ovo, leite, extrato de leite, caseína, albumina, lecitina e colesterol, não são crioprotetoras, como o termo é usado neste documento. Adicionalmente, fontes de energia tais como monossacarídeos, dissacarídeos e trissacarídeos, não são crioprotetoras como utilizado neste documento.
[00083] Os crioprotetores que podem ser incorporados na etapa de coloração incluem um número de álcoois de açúcar e glicóis. Como exemplos não limitativos, álcoois de açúcar tais como etilenoglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galactitol; iditol; volemitol;
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 150/278 /105 fucitol; inositol; um glicilglicitol e combinações dos mesmos podem ser incluídos como crioprotetores introduzidos no momento da coloração. A Patente US 3,185,623, cujo conteúdo completo é incorporado neste documento por referência, descreve um número de álcoois de carboidrato (isto é, álcoois de açúcar ou alditois) que podem ser crioprotetores adequados utilizáveis na presente invenção. Adicionalmente, glicóis tais como propilenoglicol, butano triol podem ser incluídos como crioprotetores. Muitos destes crioprotetores são tóxicos para o esperma em determinadas concentrações e temperaturas. O glicerol, por exemplo, é geralmente adicionado ao esperma após o resfriamento do esperma a uma temperatura de 5°C especificamente devido a essa toxicidade. Inesperadamente, como descrito em mais detalhe nos Exemplos, a presença de um crioprotetor durante a etapa de coloração mostrou melhorar a motilidade pósdescongelamento de esperma congelado subsequente e melhorar a resolução de triagem de esperma. Este é um resultado particularmente surpreendente e inesperado, tendo em vista o fato de que a coloração espermática para fins de triagem por sexo é tipicamente realizada a temperaturas superiores a 34°C.
[00084] O crioprotetor pode ser fornecido durante a etapa de coloração, tal como num meio de coloração, em concentrações de vol./vol. ou peso/vol. entre cerca de 0,1% e cerca de 5%. Por exemplo, a amostra de esperma corada para sofrer processamento adicional, tal triagem num citômetro de fluxo pode compreender crioprotetor a uma concentração de vol./vol. ou peso/vol. entre cerca de 0,1% e cerca de 1%; entre cerca de 1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 3%; entre cerca de 3% e cerca de 4%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; ou entre cerca de 1,5% e cerca de 3%.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 151/278 /105 [00085] O corante pode ser suplementado com um antioxidante nos intervalos de concentração anteriormente descritas. Em algumas modalidades, pressões elevadas podem aumentar os radicais livres e as tensões oxidativas suportadas pelo esperma a ser corado. Por conseguinte, os antioxidantes podem servir para neutralizar os radicais livres e reduzir as tensões oxidativas suportadas pelo esperma a ser corado. Uma lista não limitativa de antioxidantes que podem ser incorporados inclui: catalase, SOD, mímica SOD, glutationa, glutationa redutase, glutationa peroxidase, piruvato, ácido caproico, mercaptoetanol, BHT, ácido lipoico, flavinas, quininas, vitamina K (e relacionados vitaminas), vitamina BI2, vitamina B12 vitaminas, vitamina E (e vitaminas relacionadas), tocoferóis, tocotrienois, a-tocoferil, alfa-cetoglutarato (AKG), malondialdeído (MDA), dimetilargmina assimétrica (ADMA) e derivados dos mesmos biologicamente ativos, e combinações dos mesmos. Qualquer uma das concentrações descritas anteriormente pode ser usada.
[00086] A etapa ou etapas de coloração podem opcionalmente incluir componentes para reduzir a motilidade ou a respiração dos espermatozóides durante a coloração. Como apenas alguns exemplos, a etapa ou etapas de coloração podem reduzir a respiração do espermatozóide incluindo aditivos, ou reduzindo e/ou reduzindo a exposição espermática a certas substâncias. Em particular, pode ser utilizada uma mancha com baixo teor de açúcar, na qual apenas está presente o nível residual de frutose, sacarose, glucose ou outro açúcar. Da mesma forma, a respiração do espermatozóide pode ser reduzida pela coloração sob uma pressão parcial de nitrogênio ou dióxido de carbono para deslocar o oxigênio na mancha. Altemativamente, substâncias podem ser adicionadas à mancha que têm certas proporções de potássio e sódio que tendem a reduzir a respiração do espermatozóide. Como outra
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 152/278 /105 alternativa, o flúor ou fluoreto de sódio pode ser adicionado à etapa de coloração ou etapas, a fim de reduzir a respiração do espermatozóide.
[00087] Estandardizada ou não e se corada em uma única etapa ou em duas etapas, a população espermática pode ser classificada por um instrumento de triagem de partículas, como citômetro de fluxo, incluindo, sem limitação, um citômetro de jato, um citômetro de fluxo com um cuvete, ou um chip microfluídico. Referindo-se à FIG. 1, um citômetro de fluxo de jato de ar (10) é ilustrado, embora a triagem possa ser realizada com chips microfluídicos ou outros tipos de citômetros de fluxo, incluindo citômetro de fluxo com câmaras fechadas e citômetros e citômetros incorporando lasers de ablação. O citômetro de fluxo (10) inclui uma fonte de células (12) para produzir um fluxo de amostra de esperma, tal como um fluxo de amostra de esperma corada, para classificação. A taxa à qual a amostra de esperma é distribuída ao bocal (14) pode ser considerada a taxa de fluxo da amostra e pode ser determinada por uma pressão de amostra. O fluxo de amostra de esperma corada é depositado dentro de um bocal (14) e introduzido ou fluído para dentro de uma corrente de fluido (16) de fluido de bainha (18). O fluido de bainha (18) pode ser fornecido por uma fonte de fluido de bainha (20) de modo que à medida que a fonte de célula (12) fornece o esperma ao fluido de bainha (18) eles são alimentados concomitantemente através do bocal (14). O fluido de bainha (18) pode ser fornecido a uma taxa de fluxo de bainha que é determinado por uma pressão de fluido de bainha.
[00088] Enquanto os fluidos da bainha utilizados em citometria de fluxo geralmente compreendiam uma solução salina tamponada com fosfato (PBS), talvez suplementada com albumina sérica bovina (BSA), a triagem de esperma incorporou citrato de sódio, citrato TRIS ou ácido cítrico como fluido de bainha para preservar a saúde dos espermatozóides durante o
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 153/278 /105 processo de triagem. Como descrito no Pedido de Patente Internacional WO 99/33956, cujo conteúdo completo é incorporado neste documento por referência, tampões adequados podem ser incorporados como fluidos de bainha. Em certas modalidades da presente invenção, os fluidos da bainha anterior são suplementados com um crioprotetor. Como descrito acima, os crioprotetores se referem a substâncias que protegem as células ou tecido biológico dos danos por congelamento e podem incluir aquelas substâncias que agem para remover a água intracelular para evitar danos associados com a formação e expansão do gelo intracelular. Tal ação pode ser induzida pelo aumento das concentrações de soluto dentro das células. Substâncias que protegem células e tecidos de outros tipos de danos, como choque osmótico e resfriamento, mas não congelam, não são consideradas crioprotetoras.
[00089] Os crioprotetores incluem um número de álcoois de açúcar e glicóis descritos acima. Como exemplos não limitativos, álcoois de açúcar tais como etilenoglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galactitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; um glicilglicitol e combinações dos mesmos podem ser incluídos no fluido de bainha como um crioprotetor. Adicionalmente, glicóis tais como propilenoglicol, butano triol podem ser incluídos no fluido de bainha como um crioprotetor. Inesperadamente, como descrito em mais detalhe nos Exemplos, a presença de um crioprotetor no fluido de bainha mostrou melhorar a motilidade pósdescongelamento de esperma congelado subsequente e melhorar a resolução de triagem de esperma. Surpreendentemente, como visto no Exemplo 1, a modificação de um instrumento de triagem pela inclusão de um crioprotetor no fluido de bainha de acordo com certas modalidades da invenção melhorou a resolução de triagem, o que significa que produtividade, produtividade e pureza poderíam ser simultaneamente melhoradas em vários graus.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 154/278 /105 [00090] Em algumas modalidades, o mesmo crioprotetor pode ser utilizado durante a etapa de coloração e no fluido de bainha. Como um exemplo não limitativo de uma tal modalidade, o glicerol pode ser fornecido numa primeira concentração vol./vol. ou peso/vol. durante a etapa de coloração e a uma segunda concentração vol./vol. ou peso/vol. no fluido de bainha. Em uma modalidade, a primeira concentração vol. / Vol. ou peso/vol. a fornecida durante a coloração pode ser menor do que a segunda concentração vol./vol. ou peso/vol. fornecida no fluido de bainha. Desta forma, as células espermáticas submetidas ao processo de triagem de esperma podem ser expostas a uma concentração relativa gradualmente crescente de fluido de bainha. Altemativamente, a quantidade de crioprotetor presente no meio de coloração e no fluido de bainha pode ser coordenada, de modo que durante o curso de qualquer processo que esteja manipulando a amostra de esperma, uma concentração predeterminada de crioprotetor é alcançada no final dessa manipulação. Em modalidades alternativas, o crioprotetor pode ser incorporado em apenas um dos fluidos de bainha e o meio de coloração.
[00091] Em algumas modalidades, o crioprotetor pode ser fornecido no fluido de bainha a concentrações entre cerca de 0,1% vol./vol. ou peso/vol. e cerca de 6% vol./vol. ou peso/vol. Por exemplo, a solução de esperma corada para sofrer processamento adicional, tal como triagem num citômetro de fluxo, pode compreender crioprotetor a uma concentração de vol./vol. ou peso/vol. entre cerca de 0,1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; entre cerca de 4% e cerca de 6%; entre cerca de 1 % e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 3%; entre cerca de 3% e cerca de 4%; entre cerca de 4% e cerca de 5%; entre cerca de 5% e cerca de 6%; entre cerca de 2% e cerca de 6%; ou entre cerca de 3% e cerca de 5%.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 155/278 /105 [00092] Os versados na técnica podem compreender que a modalidade descrita se refere a um citômetro de fluxo de jet-in-air que forma gotículas, mas que o fluido de bainha com um aditivo crioprotetor fornece os mesmos benefícios noutros sistemas de classificação, como em sistemas que utilizam sistemas de comutação de fluidos que utilizam lasers foto-danificadores e em chips microfluídicos.
[00093] Durante a operação a operação de triar o esperma, o fluido de bainha (18) forma um fluxo de fluido que envolve coaxialmente a amostra de esperma tendo esperma corado que sai do bocal (14) no orifício do bocal (22). Fornecendo um oscilador (24) que pode ser controlado com precisão com um controle de oscilador (26), ondas de pressão podem ser estabelecidas dentro do bocal (14) e transmitidas para os fluidos que saem do bocal (14) no orifício do bocal (22). Em resposta às ondas de pressão, a corrente de fluido (16) que sai do orifício do bocal (22) forma eventualmente gotículas regulares (28) em intervalos precisos. A frequência, e até certo ponto a forma das gotículas formadas pode ser controlada por uma frequência de acionamento de queda e amplitude de acionamento de queda fornecida ao oscilador (24) ou ao controlador oscilador (26).
[00094] Cada gotícula, assim formada, retém o fluido de bainha e a amostra de esperma que formou anteriormente uma porção da corrente de fluido (16). Como o esperma corado estão cercados pelo fluxo de fluido (16) ou pelo ambiente de fluido de bainha, as gotículas (28) contêm idealmente esperma individualmente isolado. No entanto, a concentração da amostra, a pressão da amostra e outros parâmetros do instrumento ditam a frequência com que várias células ocuparão regularmente uma única gotícula, bem como a porcentagem de gotículas contendo esperma.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 156/278 /105 [00095] O citômetro de fluxo (10) atua para triar as gotículas com base nas características do esperma previsto para estar contido nas gotículas. Isto pode ser conseguido através de um sistema de detecção de células (30) em comunicação com um analisador (36). O sistema de detecção de células (30) inclui pelo menos um sensor (32) responsivo às células contidas no fluxo de fluido (16). Como um exemplo, dois tubos fotomultiplicadores ortogonais (PMTs) podem ser incorporados em um citômetro de fluxo de seleção de esperma para detecção de fluorescência a 0 e 90 graus, embora outras configurações de sensores possam ser prontamente empregadas, tais como aquelas descritas no documento W02010/021627, que é incorporado neste documento por referência.
[00096] O sistema de detecção de células (30) fornece dados para o analisador (36), o que pode causar uma ação dependendo da presença relativa ou ausência relativa de uma característica de células na corrente de fluido (16). Certas características, como o conteúdo relativo de DNA do esperma, podem ser detectadas através da excitação com uma fonte de radiação eletromagnética (34), como um laser que gera um feixe de irradiação ao qual o esperma corado responde. A fonte de radiação eletromagnética (34) pode ser um laser operado no comprimento de onda UV, tal como a cerca de 355 nm. Um exemplo de tal laser pode ser um Vanguard 350 (disponibilizado por Spectra-Physics), que opera a 350mW. Várias ópticas podem ser empregadas para moldar o perfil de feixe do laser, dividir o feixe em mais de um fluxo ou reduzir a potência do feixe em um fluxo. Exemplos não limitativos de tal óptica podem ser encontrados em WO/2004/104178 e WO/2001/85913, cada um sendo incorporado neste documento por referência.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 157/278 /105 [00097] As características dos espermatozóides individuais, particularmente a presença de um cromossomo X ou um cromossomo Y, podem ser determinadas a partir da fluorescência detectada produzida em resposta à fonte de radiação eletromagnética (34). Em particular, as configurações do sistema de detecção celular (30) podem estar em comunicação com um analisador (36) para fornecer uma variedade de fluorescência na formação, tal como a fluorescência direta de um evento, a fluorescência lateral de um evento ou a quantidade de dispersão associada a um evento. O analisador (36) pode incluir instruções escritas para analisar os sinais produzidos por um ou mais sensores (32) no sistema de detecção de células (30). O corante fluorescente seletivo para DNA se liga estequiometricamente ao DNA espermático. Como os espermatozóides com cromossomos X contêm mais DNA que os espermatozóides com cromossomo Y, os espermatozóides com cromossomo X podem se ligar a uma quantidade maior de corante fluorescente seletivo para DNA do que os espermatozóides com cromossomo Y. Assim, medindo a fluorescência emitida pelo corante ligado após a excitação, é possível diferenciar entre espermatozóides com de X e espermatozóides com Y. Distinções, como espermatozóides viáveis ou não viáveis, podem ser diferenciadas, além do esperma orientado e não orientado pelo analisador (36), de acordo com a lógica de triagem incorporada nas regiões de propagação.
[00098] Uma vez que um analisador diferencia espermatozóides com base em uma característica espermática, as gotículas com os espermatozóides com cromossomo X podem ser carregadas positivamente e, assim, defletirem em uma direção, enquanto as gotículas com espermatozóides com cromossomo Y podem ser carregadas negativamente e assim desviarem da outra maneira, e a corrente desperdiçada (isto é, as
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 158/278 /105 gotículas que não arrastam uma partícula ou célula ou arrastam células indesejáveis ou não triáveis) pode ser deixada sem carga e assim coletada de uma corrente não refletida num tubo de sucção ou semelhante. Altemativamente, um dos espermatozóides com cromossomo X ou com cromossomo Y pode ser coletado, enquanto o outro é descartado com os resíduos.
[00099] Como resultado, o citômetro de fluxo (10) atua para separar os espermatozóides corados, fazendo com que as gotículas (28) contendo espermatozóides sejam direcionadas para um ou mais recipientes de coleta (40). Os recipientes de coleta (40) podem ser tubos de coleta, tais como tubos de centrifugação ou tubos Falcon. Numa modalidade, um ou mais recipientes de coleta compreendem um tubo de centrifugação de 50 mL. O um ou mais recipientes de coleta podem incluir um meio de coleta que atua tanto para amortecer as células em gotículas desviados do impacto com o fundo do recipiente e que inclui componentes para preservar a saúde dos espermatozóides separados. A título de exemplo, pode utilizar-se um fluido de retenção de Tris Citrato e gema de ovo com certas modalidades da presente invenção. Outros fluidos de captura que podem ser utilizados em certas modalidades incluem citrato de TRIS, citrato de sódio, bicarbonato de sódio, HEPES, TRIS, TESTE, MOPS, KMT, TALP, derivados dos mesmos e combinações dos mesmos. No entanto, outros extensores com um tampão para tamponar o pH podem também ser utilizados, e podem ser utilizados em combinação com componentes adicionais que promovem a viabilidade espermática após a triagem. Como exemplo de um aditivo, a proteína é comumente incorporada no fluido de captura na forma de gema de ovo. No entanto, outras formas de proteína tais como, leite, lipoproteínas, lecitina, caseína ou albumina ou outras fontes proteicas podem altemativamente ser
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 159/278 /105 usadas, ou mesmo usadas em combinação com gema de ovo. Numa modalidade, um substituto de gema de ovo, tal como fosfolípídeo disponível a partir de lecitina de soja, pode ser utilizado em gema de ovo. Uma fonte de energia também pode ser incorporada na forma de um monos sacarídeo, como frutose, glicose ou manose, ou mesmo um dissacarídeo ou trissacarídeo. Adicionalmente, antioxidantes e antibióticos podem ser empregados no extensor inicial para promover a viabilidade espermática.
[000100] Em uma modalidade, o meio de coleta inclui um crioprotetor. Os crioprotetores adequados para adição aos meios de coleta incluem vários álcoois de açúcar e glicóis descritos acima. Como exemplos não limitativos, álcoois de açúcar tais como etilenoglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galactitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; um glicilglicitol e combinações dos mesmos podem ser incluídos no fluido de captura como um crioprotetor. Adicionalmente, glicóis tais como propilenoglicol, butano triol podem ser incluídos no fluido de captura como um crioprotetor.
[000101] Em algumas modalidades, a coleta de uma amostra de esperma manipulada num meio de coleta pode ser a primeira vez que o esperma entra em contato com um crioprotetor. Em algumas modalidades, o meio de coloração e/ou o fluido de bainha incluem um crioprotetor para além do meio de coleta. Em outras modalidades, o meio de coloração e/ou o fluido de bainha contém um crioprotetor, enquanto o meio de coleta não o faz. Em cada uma das referidas modalidades, o esperma coletado num meio de coleta é coletado numa mistura que inclui esperma e um crioprotetor em virtude do crioprotetor presente no meio de coleta ou, altemativamente, devido a quaisquer quantidades de crioprotetor presente no meio de coloração ou no fluido de bainha, que são coletados com o esperma manipulado ou coletado.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 160/278 /105 [000102] Em modalidades, em que o crioprotetor está presente no meio de coleta e em, pelo menos, um outro fluido, o mesmo crioprotetor pode ser utilizado no meio de coleta, tal como no meio de coloração e/ou no fluido de bainha. Como um exemplo não limitative de uma tal modalidade, o glicerol pode ser fornecido numa primeira concentração vol./vol. ou peso/vol. durante a etapa de coloração e a uma segunda concentração vol./vol. ou peso/vol. no fluido de bainha. Em uma modalidade, a primeira concentração vol. / Vol. ou peso/vol. a fornecida durante a coloração pode ser menor do que a segunda concentração vol./vol. ou peso/vol. fornecida no fluido de bainha. Desta forma, as células espermáticas submetidas ao processo de triagem de esperma podem ser expostas a uma concentração relativa gradualmente crescente de fluido de bainha. Altemativamente, a quantidade de crioprotetor presente nos meios de coleta pode ser coordenada com a quantidade de crioprotetor presente no meio de coloração e/ou no fluido de bainha, de modo que durante o processo manipular a amostra de esperma, uma concentração predeterminada do crioprotetor é atingida no final dessa manipulação. Em modalidades alternativas, o crioprotetor pode ser incorporado em apenas um dos fluidos de bainha, meio de coloração ou meio de coleta.
[000103] Em algumas modalidades, o agente crioprotetor pode ser fornecido no meio de coleta a uma concentração de vol./vol. ou peso/vol. entre cerca de 1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; entre cerca de 4% e cerca de 6%; entre cerca de 3% e cerca de 5%; entre cerca de 3,5% e cerca de 5,5%; ou cerca de 4,5%.
[000104] Numa modalidade, o crioprotetor é adicionado ao fluido de captura, mas não ao fluido de bainha ou à(s) etapa(s) de coloração. Noutra modalidade, o crioprotetor é adicionado a quaisquer dois fluidos de captura,
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 161/278 /105 fluido de bainha e a(s) etapa(s) de coloração. Ainda noutra modalidade, o crioprotetor é adicionado a cada fluido de captura, fluido de bainha e mancha. Como um exemplo não limitativo de uma tal modalidade, na qual o crioprotetor é adicionado em mais de uma etapa de processamento, o glicerol pode ser fornecido numa primeira concentração de vol./vol. ou peso/vol. durante a etapa de coloração e a uma segunda concentração de vol./vol. ou peso/vol. no fluido de bainha. Em uma modalidade, a primeira concentração vol./vol. ou peso/vol. a fornecida durante a coloração pode ser menor do que a segunda concentração vol./vol. ou peso/vol. fornecida no fluido de bainha. Desta forma, as células espermáticas submetidas ao processo de triagem de esperma podem ser expostas a uma concentração relativa gradualmente crescente de fluido de bainha. Como um exemplo não limitativo de uma modalidade na qual um crioprotetor é adicionado em cada um dos fluidos de captura, o fluido de bainha e a(s) etapa(s) de coloração de glicerol pode ser fornecida numa primeira concentração de vol./vol. ou peso/vol. durante a etapa de coloração, a uma segunda concentração de vol./vol. ou peso/vol. no fluido de bainha, e a uma terceira concentração de vol./vol. ou peso/vol. no fluido de captura. Numa modalidade, a concentração de vol./vol ou peso/vol. do crioprotetor pode ser aumentada em cada etapa sucessiva em que é introduzida. Por exemplo, a primeira concentração de crioprotetor durante a etapa de coloração pode ser uma concentração mais baixa do que a segunda concentração de crioprotetor no fluido de bainha e a terceira concentração de crioprotetor no fluido de captura. A introdução gradual de crioprotetor pode beneficiar particularmente a capacidade do esperma em sobreviver ao eventual congelamento e descongelamento, ou pode melhorar a saúde dos espermatozóides viáveis que são eventualmente congelados e descongelados.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 162/278 /105 [000105] Numa modalidade alternativa, as placas de deflexão (38) e outros componentes necessários para a formação de gotículas, tais como o oscilador (24) ou o controlador oscilador (26), podem ser substituídos por um laser foto-danificador, por vezes também referido como ablação a laser. Numa tal modalidade, o analisador (36) e o controlador (42) podem cooperar no disparo de um laser foto-danificador temporizado para atingir as células na corrente de fluido (16) numa segunda localização a jusante da fonte de radiação eletromagnética (34) as classificações das células. Tal laser pode ser operado em um comprimento de onda diferente quando comparado à fonte de radiação eletromagnética (34), ou a uma potência maior para assegurar que as células espermáticas sejam retiradas, desativadas ou tomadas incapazes de fertilização. As modalidades que incorporam esse laser foto-danificador ainda utilizam um meio de coloração e um fluido de bainha e podem opcionalmente utilizar um meio de coleta. De acordo com certas modalidades da presente invenção, qualquer um dos meios de coloração, fluido de bainha e meio de coleta, quando presente, pode incluir um crioprotetor.
[000106] Numa outra alternativa, certos aspectos da presente invenção podem ser igualmente aplicáveis em chips microfluídicos. Como apenas um exemplo, os chips microfluídicos, tais como os descritos nos Pedidos Internacionais WO 2011/097032 e WO 2011/097032, cada um incorporado neste documento por referência, podem igualmente beneficiar da inclusão de um fluido de bainha contendo crioprotetor. De modo semelhante, as modalidades que incorporam canais de fluxo em chips microfluídicos ainda utilizam um meio de coloração e podem opcionalmente utilizar um fluido de bainha e um meio de coleta. De acordo com certas modalidades da presente
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 163/278 / 105 invenção, qualquer um dos meios de coloração, fluido de bainha e meio de coleta, quando presente, pode incluir um crioprotetor.
[000107] A FIG. 2 ilustra uma representação bivariada da fluorescência lateral e fluorescência direta de um citômetro de fluxo jet-in-air de esperma corado, que pode ser gerado por um analisador (36). A representação visual de dados pode ser usada por um operador para receber feedback relativo à amostra submetida a triagem e para demonstrar graficamente certos aspectos da lógica de triagem atual. Rl, por exemplo, pode ser visto como uma região de propagação que pode ser aplicada à lógica de triagem do citômetro de fluxo. Saída numérica adicional pode ser fornecida em uma exibição do analisador (36). Tal saída numérica pode ser na forma de parâmetros de classificação medidos, tais como uma taxa de evento, uma taxa de aborto, taxa de triagem, eficiência de triagem, ou a porcentagem de partículas em qualquer região ou porta. Rl é ilustrado como uma região que pode ser considerada a região orientada ao vivo, porque os limites de Rl incluem duas populações densas de células que refletem uma população de espermatozóides com cromossomo X estreitamente relacionada e uma população de espermatozóides com cromossomo Y. R2 é uma região de gating em tomo dos espermatozóides não viáveis, ou o espermatozóide com a membrana comprometida cuja fluorescência é extinta por um corante de extinção. Embora possa ser empregada uma variedade de lógicas de triagem, duas estratégias relacionadas a Rl e R2 podem ser uma primeira etapa em uma lógica de triagem, na qual todos os eventos que caem em Rl são aceitos para processamento ou propagação adicional. Como alternativa, todos os eventos que estão fora do R2 são aceitos para processamento adicional ou propagação.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 164/278 / 105 [000108] A FIG. 3 ilustra um gráfico uni variado na forma de um histograma que pode ser produzido pelo analisador (36) e gerado em uma apresentação gráfica para um operador. Os dados ilustrados na FIG. 3 pode representar o número de ocorrências de intensidades de sinal de pico a partir da fluorescência lateral ou direta dentro de um determinado período. No caso dos espermatozóides, espermatozóides com cromossomo X e espermatozóides com cromossomo Y tendem a ter intensidades de pico que variam entre 2 e 5%, dependendo da espécie, e essa diferença é refletida na distribuição bimodal das intensidades de pico vistas na FIG. 2. Como os espermatozóides com cromossomo X e os espermatozóides com cromossomo Y tendem a ter valores de fluorescência diferentes, cada um dos picos representa espermatozóides com cromossomo X de espermatozóides com cromossomo Y. Com base na lógica de triagem aplicada no analisador (36), a população de células no histograma pode ser apenas aquelas células que foram determinadas como sendo células orientadas viáveis, tais como aquelas que caem em RI na FIG. 2, ou podem representar células que não foram consideradas mortas ou indesejáveis, como todos os eventos, exceto os que caem em R2. Uma variedade de parâmetros de triagem pode ser derivada da informação contida neste histograma. Por exemplo, o nível de distinção entre os dois picos pode fornecer uma indicação de como uma pureza triada pode parecer. A FIG. 3 ilustra ainda medições de intensidade relativa no ponto mais baixo entre os dois grupos, o que pode ser considerado um valor V e uma segunda intensidade relativa no pico ou picos do histograma em P. Uma inspeção visual de um histograma pode fornecer um operador com uma ideia de como um citômetro de fluxo está funcionando, mas instruções executadas por computador para determinar um valor P, um valor V e uma razão de V para P não foram implementadas em triadores comerciais de esperma. A razão entre o vale e o pico pode ser determinada
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 165/278 /105 como um parâmetro de triagem medido periodicamente durante o decorrer da triagem. A relação entre o vale e o pico, embora não seja necessariamente determinante da pureza de triagem, pode fornecer um meio de estimar rapidamente os valores de pureza, seja automaticamente pela execução da instrução escrita no analisador (36), seja manualmente pela inspeção visual de um operador. Alternativamente, a relação inversa, ou seja, uma relação entre pico e vale, fornece informações semelhantes ao valor inverso.
[000109] Voltando para a FIG. 4, um segundo gráfico bimodal pode ser gerado pelo analisador (36) em resposta a sinais adquiridos pelo sistema de detecção de células (30). O gráfico bimodal pode representar um primeiro eixo que ilustra o valor da intensidade de pico de um sinal de fluorescência direta ou a intensidade de pico do sinal de fluorescência lateral. Como na FIG. 3, os dados ilustrados na FIG. 4 pode ser delimitado de tal modo que apenas os eventos que caem dentro de RI na FIG. 2 estejam incluídos. Altemativamente, no caso de espermatozóides, todos os eventos que não caírem na porta morta R2 também podem ser exibidos.
[000110] R3 pode representar uma porta de triagem de X para coletar o espermatozóide com cromossomo X. O termo porta de triagem de X pode ser usado de forma intercambiável neste documento com o termo porta X. Com referência à FIG. 4, pode demonstrar como a alteração das dimensões das regiões de propagação pode afetar a eficiência, a pureza e a produtividade. Se a região R3 fosse expandida, poderia ser visto que, a cada segundo, mais espermatozóides seriam triados como espermatozóides com cromossomo X, resultando em maior eficiência de classificação e maior produtividade. No entanto, a expansão da porta ou região R3 começaria a incluir eventos com uma probabilidade crescente de serem espermatozóides com cromossomo Y. Para aumentar a pureza tríada dos espermatozóides, a
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 166/278 / 105 região R3 pode ser menor e/ou afastada da região do cromossomo Y. Como menos eventos caem dentro da porta de triagem de X, menos espermatozóides são classificados na população de espermatozóides com cromossomo X e aqueles que têm maior probabilidade de realmente ser espermatozóides com cromossomo X, significando que a pureza coletada pode ser aumentada. No entanto, tanto a eficiência, em termos de células coletadas, quanto a produtividade, em termos de tipos por segundo, diminuirão à medida que menos eventos caírem na região R3 e mais eventos coincidentes forem abortados. Adicionalmente, à medida que outros parâmetros do instrumento são modificados, os gráficos ilustrados das FIG. 2, FIG. 3 e FIG. 4 podem mudar de forma e natureza. Por exemplo, aumentar uma pressão de amostra ou uma taxa de fluxo de amostra pode resultar em uma redução na razão vale/pico, ou diminuir a distinção bimodal entre espermatozóide com cromossomo X e espermatozóide com cromossomo Y. [000111] O esperma processado pode então ser reunido e congelado de acordo com metodologias conhecidas para esperma convencional ou de sexo selecionado. Como apenas um exemplo, as metodologias de congelamento descritas no Pedido de Patente Internacional WO/200137655, incorporado neste documento por referência na sua totalidade, podem se beneficiar particularmente de certas modalidades da invenção descrita em que um crioprotetor é introduzido nos processos de triagem de esperma em etapas anteriores, tal como no momento ou coloração, no fluido de bainha, ou mesmo no fluido de captura. Altemativamente, a inclusão de um crioprotetor em uma ou mais etapas anteriores pode ser incorporada em uma nova metodologia de congelamento.
[000112] Numa modalidade, o esperma triado coletado pode ser arrefecido a uma temperatura de cerca de 5 °C, ou a outra temperatura de
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 167/278 /105 arrefecimento adequada com base no esperma de espécie particular. Altemativamente, o esperma pode ser coletado em um recipiente de coleta que já esteja arrefecido. Dependendo do tamanho do recipiente de coleta, o esperma coletado pode ser agrupado com outros recipientes de coleta. Recipientes de coleta agrupados podem ser centrifugados e o sobrenadante escorrer. De acordo com algumas metodologias anteriores, o esperma isolado seria ressuspenso em uma fração A (ou fração livre de crioprotetor) do diluente e uma fração B (ou fração contendo crioprotetor) com o dobro da concentração desejada de crioprotetor seria adicionada em um volume igual à fração. Algumas metodologias anteriores adicionaram a fração B em dois volumes iguais com cerca de 15 minutos de intervalo, enquanto outras metodologias introduziram a fração B através de um gotejamento constante. [000113] Em algumas modalidades da invenção, os crioprotetores estão incluídos em vários meios ao longo das etapas de coloração, triagem e coleta, que podem reduzir, ou mesmo eliminar, a necessidade de arrefecer uma amostra de esperma manipulado antes da reconcentração. Além disso, a inclusão do crioprotetor nas várias etapas de coloração e classificação pode eliminar a necessidade do uso de um paradigma de fração A e B.
[000114] Voltando para a FIG. 5, uma modalidade ilustrada da presente invenção refere-se a um método no qual crioprotetores são adicionados a múltiplos meios durante o processamento de esperma, tal como no meio de coloração, o fluido de bainha e no meio de coleta. Na etapa (510), o método começa com a etapa de coloração de uma amostra de esperma num meio de coloração. A amostra de esperma pode ser sêmen puro ou esperma estendido em outra solução, como as descritas anteriormente. Como exemplo, a amostra de esperma pode ser padronizada por extensão e reconcentração da maneira descrita anteriormente. Altemativamente, a amostra de esperma
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 168/278 /105 pode assumir a forma de sêmen puro, ou sêmen puro estendido com um tampão e/ou tendo antibióticos adicionados.
[000115] Padronizado ou não, o corante fluorescente seletivo para DNA pode ser Hoechst 33342 fornecido num tampão TALP modificado (Tabela 1). A própria etapa de coloração pode ser realizada numa única diluição que inclui adicionalmente um corante de extinção. Altemativamente, a etapa 510 pode ser realizada em duas diluições, tal como numa primeira diluição com um TALP modificado tendo o corante fluorescente seletivo para DNA seguido por uma segunda diluição num TALP modificado possuindo um corante de extinção. Pode ser entendido que outros corantes fluorescentes seletivos de DNA e outros corantes de extinção podem ser utilizados de acordo com este exemplo. Para o propósito desta modalidade, cada um será referido como um meio de coloração.
[000116] Independentemente do local onde foi obtida em uma ou duas diluições, a amostra de esperma pode ser diluída entre 640xl06 e 40xl06 esperma/ml, para cerca de 320xl06 e 80xl06 esperma/ml, para cerca de 160x106 esperma/ml ou para cerca de 120x106 esperma/ml no meio de coloração. O corante fluorescente seletivo para DNA pode ser adicionado ao esperma suspenso no meio de coloração numa concentração entre cerca de 10 pM e 200 pM; entre cerca de 20 pM e 100 pM, ou entre cerca de 30 pM e 70 pM. O pH do meio de coloração pode estar entre cerca de 6,8 e 7,9; cerca de 7,1 e 7,6; ou a cerca de 7,4. No caso de duas diluições, a segunda diluição pode ser realizada a ou próximo do mesmo pH que a primeira diluição ou a um pH baixo, tal como entre 5,0 e 6,0, ou a cerca de 5,5. Opcionalmente, os antioxidantes e concentrações previamente descritos podem ser incorporados no meio de coloração. A amostra de esperma pode ser incubada entre 30-39°C, entre cerca de 32-37°C, ou a cerca de 34°C. O
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 169/278 / 105 período de incubação pode variar entre cerca de 20 minutos e cerca de três horas, entre cerca de 30 minutos e cerca de 90 minutos, ou durante cerca de 45 minutos a cerca de 60 minutos.
[000117] Na etapa 512, pode ver-se que o meio de coloração utilizado na etapa 510 inclui uma primeira quantidade de crioprotetor. O crioprotetor pode ser um álcool de açúcar apropriado, tal como etilenoglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galactitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; um glicilglicitol, ou combinações dos mesmos. O crioprotetor pode também ser um glicol adequado, tal como propilenoglicol, butano triol ou combinações dos mesmos. Pode ser entendido que o crioprotetor selecionado pode ser específico para a espécie animal, ou talvez até para a raça. Como exemplo, o glicerol pode ser selecionado no caso de esperma bovino e efetuando as etapas ilustradas na FIG. 5 a toxicidade do glicerol pode ser mitigada. Pode ser apreciado, outros crioprotetores adequados podem ser utilizados se forem adequados para preservar uma amostra de esperma e que as etapas da FIG. 5 também pode mitigar os efeitos tóxicos desses crioprotetores.
[000118] A primeira quantidade de crioprotetor pode ser uma concentração de crioprotetor de vol./vol. ou peso/vol. nos meios de coloração entre cerca de 0,1% e cerca de 5%; entre cerca de 0,1% e cerca de 1%; entre cerca de 1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 3%; entre cerca de 3% e cerca de 4%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; ou entre cerca de 1,5% e cerca de 3%.
[000119] Uma vez corada, a amostra de esperma pode ser colocada em contato com um fluido de bainha na etapa 520. A etapa de contato com a amostra de esperma pode ser incidente no processamento da amostra de esperma, como por citometria de fluxo, por meio de um citômetro de fluxo
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 170/278 /105 em jato ou em um processo similar em um chip microfluídico. Numa modalidade, a etapa de contatar a amostra de esperma com fluido de bainha ocorre num citômetro de fluxo de jet-in-air, como descrito em relação à Fig.
1. Pode ser entendido, no entanto, que a etapa 520 não se limita ao processamento num citômetro de fluxo de jet-in-air, mas abrange qualquer método de processamento de esperma em que um esperma contendo amostra de esperma é contatado com um fluido de bainha. Como um exemplo não limitativo, a triagem em um chip microfluídico geralmente requer o estabelecimento de um fluxo coaxial de amostra e fluido de bainha através de um canal de fluxo. No caso dos espermatozóides, uma amostra de esperma seria transportada através de um ou mais canais de fluxo em um fluxo laminar, enquanto cercada por um fluido de bainha para focalizar a localização dos espermatozóides e impedir que eles toquem o interior do canal de fluxo. Os fluxos laminares da amostra de esperma e do fluido de bainha em cada canal evitariam, ou pelo menos minimizariam, qualquer mistura da amostra de esperma e do fluido de bainha, mantendo os fluidos em contato.
[000120] Na etapa 522, pode ver-se que o fluido de bainha utilizado na etapa 520 inclui uma segunda quantidade de crioprotetor. O crioprotetor pode ser o mesmo que o crioprotegido no meio de coloração. Altemativamente, o crioprotetor pode ser outro crioprotetor, tal como um álcool de açúcar adequado, incluindo etilenoglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galactitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; um glicilglicitol, ou combinações dos mesmos, ou um glicol adequado, tal como propilenoglicol, butanotriol ou combinações dos mesmos. O fluido de bainha pode incluir uma segunda quantidade de agente crioprotetor entre cerca de 0,1 % e cerca de 2% de agente crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.;
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 171/278 /105 entre cerca de 2% e cerca de 4% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.;
entre cerca de 4% e cerca de 6% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.;
entre cerca de 1% e cerca de 2% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.;
entre cerca de 2% e cerca de 3% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.;
entre cerca de 3% e cerca de 4% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.;
entre cerca de 4% e cerca de 5% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.;
entre cerca de 5% e cerca de 6% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.;
entre cerca de 2% e cerca de 6% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.;
ou entre cerca de 3% e cerca de 5% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.. Numa modalidade, a segunda quantidade de crioprotetor no fluido de bainha é aproximadamente a mesma que a primeira quantidade de crioprotetor encontrada no meio de coloração. Numa modalidade alternativa, a segunda quantidade de crioprotetor no fluido de bainha está a uma concentração maior de vol./vol. ou peso/vol. em comparação com a primeira quantidade de crioprotetor no meio de coloração. Em ainda outra modalidade, a concentração de vol./vol. ou peso/vol. de crioprotetor tanto no meio de coloração como no fluido de bainha pode ser coordenada para chegar a uma concentração desejada de crioprotetor.
[000121] Na etapa 530, a amostra de esperma é manipulada. Numa modalidade, a amostra de esperma é manipulada para produzir uma amostra de esperma manipulada tendo uma razão manipulada de espermatozóides com cromossomo X viáveis para espermatozóides com cromossomo Y viáveis. A etapa de manipulação pode ser realizada pela separação física de um subconjunto de células, tal como é o caso na modalidade de formação de gotículas descrita acima com referência à FIG. 1. Mas a etapa de manipulação não é tão limitada e inclui troca de fluido ou desvio de células nos canais de fluxo de chips microfluídicos. Altemativamente, um laser foto
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 172/278 /105 danificador poderia ser usado em conjunto com um citômetro de fluxo de jet-in-air ou um chip microfluídico para incapacitar células espermáticas selecionadas na amostra espermática, deixando uma amostra de esperma manipulada tendo uma razão manipulada de espermatozóides com cromossomo X viáveis para espermatozóides com cromossomo Y viáveis. Altemativamente, a amostra de esperma pode ser manipulada com base em outras características. Como apenas um exemplo, uma amostra de esperma pode fluir através de um citômetro de fluxo para separar espermatozóides presumivelmente viáveis de espermatozóides com membranas comprometidas.
[000122] Uma modalidade do método representado na FIG. 5 termina na produção de uma amostra de esperma manipulada da etapa 530, enquanto outras modalidades do método continuam na etapa de coleta da amostra de esperma 540 manipulada e/ou a etapa de congelar a amostra 550 de esperma manipulada. Em uma modalidade, o método da FIG. 5 prossegue opcionalmente para a etapa 540, em que a amostra de esperma manipulada é coletada num meio de coletada. No caso da citometria de fluxo, o meio de coleta pode ser descrito como um fluido captador localizado em um vaso de coleta ou um tubo de captura no qual espermatozóides selecionados são defletidos. Como pode ser entendido a partir da etapa 542, o meio de coleta nesta modalidade também contém opcionalmente uma quantidade de crioprotetor, que pode ser considerada uma terceira quantidade de crioprotetor. Novamente, o crioprotetor pode ser o mesmo que o crioprotegido no meio de coloração e/ou no fluido de bainha. Altemativamente, o crioprotetor pode ser outro crioprotetor, tal como um álcool de açúcar adequado, incluindo etilenoglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galactitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol;
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 173/278 /105 um glicilglicitol, ou combinações dos mesmos, ou um glicol adequado, tal como propilenoglicol, butanotriol ou combinações dos mesmos. Os meios de coleta podem incluir uma terceira quantidade de crioprotetor entre cerca de 1% e cerca de 2% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cerca de
2% e cerca de 4% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cercade
4% e cerca de 6% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cercade
6% e cerca de 8% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cercade
3% e cerca de 7% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; ou entre cerca de 3,5% e cerca de 5,5% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol..
[000123] Em certas modalidades da invenção, um crioprotetor está incluído apenas no fluido de bainha e não está presente no meio de coloração ou no meio de coleta. Noutra modalidade da invenção, um crioprotetor está incluído no fluido de bainha, no meio de coloração e no meio de congelamento, mas não está incluído no meio de coleta.
[000124] Numa modalidade, o método prossegue a partir da etapa de manipulação da amostra de espermatozóide 530 diretamente para a etapa de congelamento da amostra de espermatozóide manipulada 550. Por exemplo, no caso de manipulação da amostra de espermatozóide com um chip microfluídico, um meio de coleta pode não ser necessário, pois não são formadas gotículas que exijam o amortecimento de um meio de coleta. No entanto, são previstas modalidades em que um meio de coleta é utilizado em ligação com a manipulação de uma amostra de espermatozóide num chip microfluídico.
[000125] Para o método incorporado pela FIG. 5, o congelamento da etapa 550 pode ser conseguido por uma técnica convencional, tal como as descritas no documento WO/200137655. Apenas a título de exemplo, um desses métodos pode começar por estender a amostra de espermatozóide
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 174/278 /105 manipulada para ser congelada em uma fração A. Altemativamente, a amostra de espermatozóide manipulada poderia ter sido coletada em um meio de coleta, incluindo um diluente de fração A na etapa de coleta 540. Apenas a título de exemplo, a fração A pode compreender um diluente de citrato TRIS com 20% de gema de ovo. Outros diluentes adequados podem incluir citrato de sódio, Tris[hidroximetil]amometano e TES (ácido NTris[Hidroximetil]metil-2-aminoetanossulfônico) e tampões de glutamato monossódico; leite; meio tamponado com HEPES; e qualquer combinação destes.
[000126] A etapa de congelamento 550 pode continuar com o arrefecimento da amostra de espermatozóide manipulada. A amostra de espermatozóide manipulada pode ser arrefecida a uma temperatura entre cerca de 8°C e 4°C. Num exemplo específico, a amostra de espermatozóide manipulada pode ser arrefecida até cerca de 5°C. Após o arrefecimento, uma fração B pode ser adicionada em uma ou mais etapas e, em seguida, a amostra de espermatozóide manipulada pode ser reconcentrada. A reconcentração pode incluir a centrifugação da amostra de espermatozóide manipulada até um sedimento e a ressuspensão do espermatozóide em um diluente final, às vezes chamado de diluente AB. Como um exemplo, o diluente AB pode ter uma concentração de crioprotetor que é metade da concentração do crioprotetor na fração B. Como um exemplo não limitativo, essa concentração pode ser de cerca de 6% no caso do glicerol. Outros métodos de congelamento são contemplados para utilização de acordo com a modalidade representada na FIG. 5 Em particular, certos métodos de congelamento descritos abaixo podem fornecer uma sinergia com o método de processamento representado na FIG. 5.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 175/278 /105 [000127] O método representado na FIG. 6 reflete em grande parte o método representado na FIG. 5, exceto que o meio de coloração não é fornecido com um crioprotetor. Na etapa (610), o método começa com a etapa de coloração de uma amostra de espermatozóide num meio de coloração. A amostra de espermatozóide pode ser sêmen puro ou espermatozóide estendido em outra solução, como as descritas anteriormente. Como exemplo, a amostra de espermatozóide pode ser padronizada por extensão e reconcentração da maneira descrita anteriormente. Altemativamente, a amostra de espermatozóide pode assumir a forma de sêmen puro, ou sêmen puro estendido com um tampão e/ou tendo antibióticos adicionados.
[000128] Padronizado ou não, o corante fluorescente seletivo de DNA pode ser Hoechst 33342 fornecido num tampão TALP modificado (Tabela 1). A própria etapa de coloração pode ser realizada numa única diluição que inclui adicionalmente um corante de extinção. Altemativamente, a etapa 510 pode ser realizada em duas diluições, tal como numa primeira diluição comum TALP modificado possuindo o corante fluorescente seletivo para DNA seguido por uma segunda diluição num TALP modificado possuindo um corante de extinção. Pode ser entendido que outros corantes fluorescentes seletivos de DNA e outros corantes de extinção podem ser utilizados de acordo com este exemplo. Para o propósito desta modalidade, cada um será referido como um meio de coloração.
[000129] Independentemente do local onde foi obtida em uma ou duas diluições, a amostra de espermatozóide pode ser diluída entre 640xl06 e 40xl06 espermatozoide/ml, para cerca de 320xl06 e 80xl06 espermatozoide/ml, para cerca de 160x106 espermatozoide/ml ou para cerca de 120xl06 espermatozoide/ml no meio de coloração. O corante fluorescente
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 176/278 /105 seletivo de DNA pode ser adicionado ao espermatozóide suspenso no meio de coloração numa concentração entre cerca de 10 pM e 200 pM; entre cerca de 20 pM e 100 pM, ou entre cerca de 30 pM e 70 pM. O pH do meio de coloração pode estar entre cerca de 6,8 e 7,9; cerca de 7,1 e 7,6; ou a cerca de 7,4. No caso de duas diluições, a segunda diluição pode ser realizada a ou próximo do mesmo pH que a primeira diluição ou a um pH baixo, tal como entre 5,0 e 6,0, ou a cerca de 5,5. Opcionalmente, os antioxidantes e concentrações previamente descritos podem ser incorporados no meio de coloração. A amostra de espermatozóide pode ser incubada entre 30-39°C, entre cerca de 32-37°C, ou a cerca de 34°C. O período de incubação pode variar entre cerca de 20 minutos e cerca de três horas, entre cerca de 30 minutos e cerca de 90 minutos, ou durante cerca de 45 minutos a cerca de 60 minutos.
[000130] Uma vez corada, a amostra de espermatozóide pode ser colocada em contato com um fluido de bainha na etapa 620. A etapa de contato com a amostra de espermatozóide pode ser incidente no processamento da amostra de espermatozóide, como por citometria de fluxo, por meio de um citômetro de fluxo em jato ou em um processo similar em um chip microfluídico. Numa modalidade, a etapa de contatar a amostra de espermatozóide com fluido de bainha ocorre num citômetro de fluxo de jetin-air, como descrito em relação à Fig. 1. Pode ser entendido, no entanto, que a etapa 620 não se limita ao processamento num citômetro de fluxo de jetin-air, mas abrange qualquer método de processamento de espermatozóide em que um espermatozóide contendo amostra de espermatozóide é contatado com um fluido de bainha. Como um exemplo não limitativo, a triagem em um chip microfluídico geralmente requer o estabelecimento de um fluxo coaxial de amostra e fluido de bainha através de um canal de fluxo. No caso
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 177/278 /105 dos espermatozóides, uma amostra de espermatozóides seria transportada através de um ou mais canais de fluxo em um fluxo laminar, enquanto cercada por um fluido de bainha para focalizar a localização dos espermatozóides e impedir que eles toquem o interior do canal de fluxo. Os fluxos laminares da amostra de espermatozóides e do fluido de bainha em cada canal evitariam, ou pelo menos minimizariam, qualquer mistura da amostra de espermatozóides e do fluido de bainha, mantendo os fluidos em contato.
[000131] Na etapa 622, pode ver-se que o fluido de bainha utilizado na etapa 620 inclui uma primeira quantidade de crioprotetor que pode ser um álcool de açúcar adequado incluindo etilenoglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galactitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; um glicilglicitol, ou suas combinações, ou um glicol adequado, tal como propilenoglicol, butanotriol ou suas combinações. A primeira quantidade de crioprotetor no fluido de bainha pode ser entre cerca de 0,1 % e cerca de 2% de agente crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cerca de 2% e cerca de 4% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cerca de 4% e cerca de 6% de crioprotector por vol./vol. ou peso/vol.; entre cerca de 1% e cerca de 2% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cerca de 2% e cerca de 3% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cerca de 3% e cerca de 4% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cerca de 4% e cerca de 5% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cerca de 5% e cerca de 6% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cerca de 2% e cerca de 6% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; ou entre cerca de 3% e cerca de 5% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol. Numa modalidade, a segunda quantidade de crioprotetor no fluido de bainha é aproximadamente a mesma que a primeira quantidade de crioprotetor encontrada no meio de
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 178/278 /105 coloração. Numa modalidade alternativa, a segunda quantidade de crioprotetor no fluido de bainha está a uma concentração maior de vol./vol. ou peso/vol. em comparação com a primeira quantidade de crioprotetor no meio de coloração.
[000132] Na etapa 630, a amostra de espermatozóide é manipulada. Numa modalidade, a amostra de espermatozóide é manipulada para produzir uma amostra de espermatozóide manipulada tendo uma razão manipulada de espermatozóide com cromossomo X viável para espermatozóide com cromossomo Y viável. A etapa de manipulação pode ser realizada pela separação física de um subconjunto de células, tal como é o caso na modalidade de formação de gotículas descrita acima com referência à FIG.
1. Mas a etapa de manipulação não é tão limitada e inclui troca de fluido ou desvio de células nos canais de fluxo de chips microfluídicos. Altemativamente, um laser foto-nocivo podería ser usado em conjunto com um citômetro de fluxo de jet-in-air ou um chip microfluídico para incapacitar células espermáticas selecionadas na amostra espermática, deixando uma amostra de espermatozóide manipulada tendo uma razão manipulada de espermatozóide com cromossomo X viável para espermatozóide com cromossomo Y viável. Alternativamente, a amostra de espermatozóide pode ser manipulada com base em outras características. Como apenas um exemplo, uma amostra de espermatozóide pode fluir através de um citômetro de fluxo para separar espermatozóide presumivelmente viável de espermatozóides com membranas comprometidas.
[000133] Uma modalidade do método representado na FIG. 6 termina na produção de uma amostra de espermatozóide manipulada da etapa 630, enquanto outras modalidades do método continuam na etapa de coleta da amostra de espermatozóide 640 manipulada e/ou a etapa de congelar a
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 179/278 /105 amostra 650 de espermatozóide manipulada. Em uma modalidade, o método da FIG. 6 prossegue opcionalmente para a etapa 640, em que a amostra de espermatozóide manipulada é coletada num meio de coleta. No caso da citometria de fluxo, o meio de coleta pode ser descrito como um fluido captador localizado em um vaso de coleta ou um tubo de captura no qual espermatozóides selecionados são defletidos. Como pode ser entendido a partir da etapa 642, o meio de coleta também contém opcionalmente uma quantidade de crioprotetor, que pode ser considerada uma segunda quantidade de crioprotetor. O crioprotetor pode ser o mesmo que o crioprotegido no fluido de bainha. Alternativamente, o crioprotetor pode ser outro crioprotetor, tal como um álcool de açúcar adequado, incluindo etilenoglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galactitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; um glicilglicitol, ou combinações destes, ou um glicol adequado, tal como propilenoglicol, butanotriol ou combinações destes. Os meios de coleta podem incluir uma segunda quantidade de crioprotetor entre cerca de 1% e cerca de 2% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cerca de 2% e cerca de 4% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cerca de 4% e cerca de 6% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cerca de 6% e cerca de 8% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cerca de 3% e cerca de 7% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; ou entre cerca de 3,5% e cerca de 5,5% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol..
[000134] Numa modalidade, o método prossegue a partir da etapa de manipulação da amostra de espermatozóide 630 diretamente para a etapa de congelamento da amostra de espermatozóide manipulada 650. Por exemplo, no caso de manipulação da amostra de espermatozóide com um chip microfluídico, um meio de coleta pode não ser necessário, pois não são
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 180/278 /105 formadas gotículas que exijam o amortecimento de um meio de coleta. No entanto, são previstas modalidades em que um meio de coleta é utilizado em ligação com a manipulação de uma amostra de espermatozóide num chip microfluídico.
[000135] Para o método incorporado pela FIG. 6, o congelamento da etapa 650 pode ser conseguido por uma técnica convencional, tal como as descritas no documento WO/200137655. Apenas a título de exemplo, um desses métodos pode começar por estender a amostra de espermatozóide manipulada para ser congelada em uma fração A. Altemativamente, a amostra de espermatozóide manipulada poderia ter sido coletada em um meio de coleta, incluindo um diluente de fração A na etapa de coleta 540. Apenas a título de exemplo, a fração A pode compreender um diluente de citrato TRIS com 20% de gema de ovo. Outros diluentes adequados podem incluir citrato de sódio, Tris[hidroximetil]amometano e TES (ácido NTris[Hidroximetil]metil-2-aminoetanossulfônico) e tampões de glutamato monossódico; leite; meio tamponado com HEPES; e qualquer combinação destes.
[000136] A etapa de congelamento 650 pode continuar com o arrefecimento da amostra de espermatozóide manipulada. A amostra de espermatozóide manipulada pode ser arrefecida a uma temperatura entre cerca de 8°C e 4°C. Num exemplo específico, a amostra de espermatozóide manipulada pode ser arrefecida até cerca de 5°C. Após o arrefecimento, uma fração B pode ser adicionada em uma ou mais etapas e, em seguida, a amostra de espermatozóide manipulada pode ser reconcentrada. A reconcentração pode incluir a centrifugação da amostra de espermatozóide manipulada até um sedimento e a ressuspensão do espermatozóide em um diluente final, às vezes chamado de diluente AB. Como um exemplo, o
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 181/278 /105 diluente AB pode ter uma concentração de crioprotetor que é metade da concentração do crioprotetor na fração B. Como exemplo não limitativo, essa concentração pode ser de cerca de 6% vol./vol. ou peso/vol. no caso do glicerol. Outros métodos de congelamento são contemplados para utilização de acordo com a modalidade representada na FIG. 6. Em particular, certos métodos de congelamento descritos abaixo podem fornecer uma sinergia com o método de processamento representado na FIG. 6.
[000137] O método representado na FIG. 7 difere do método descrito na FIG. 5 em que o fluido de bainha não é suplementado com crioprotetor. Na etapa (710), o método começa com a etapa de coloração de uma amostra de espermatozóide num meio de coloração. A amostra de espermatozóide pode ser sêmen puro ou espermatozóide estendido em outra solução, como as descritas anteriormente. Como exemplo, a amostra de espermatozóide pode ser padronizada por extensão e reconcentração da maneira descrita anteriormente. Altemativamente, a amostra de espermatozóide pode assumir a forma de sêmen puro, ou sêmen puro estendido com um tampão e/ou tendo antibióticos adicionados.
[000138] Padronizado ou não, o corante fluorescente seletivo de DNA pode ser Hoechst 33342 fornecido num tampão TALP modificado (Tabela 1). A própria etapa de coloração pode ser realizada numa única diluição que inclui adicionalmente um corante de extinção. Altemativamente, a etapa 510 pode ser realizada em duas diluições, tal como numa primeira diluição com um TALP modificado possuindo o corante fluorescente seletivo para DNA seguido por uma segunda diluição num TALP modificado possuindo um corante de extinção. Pode ser entendido que outros corantes fluorescentes seletivos de DNA e outros corantes de extinção podem ser utilizados de
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 182/278 /105 acordo com este exemplo. Para o propósito desta modalidade, cada um será referido como um meio de coloração.
[000139] Independentemente do local onde foi obtida em uma ou duas diluições, a amostra de espermatozóide pode ser diluída entre 640xl06 e 40xl06 espermatozoide/ml, para cerca de 320xl06 e 80xl06 espermatozoide/ml, para cerca de 160x106 espermatozoide/ml ou para cerca de 120x106 espermatozóide/ ml no meio de coloração. O corante fluorescente seletivo de DNA pode ser adicionado ao espermatozóide suspenso no meio de coloração numa concentração entre cerca de 10 pM e 200 pM; entre cerca de 20 pM e 100 pM, ou entre cerca de 30 pM e 70 pM. O pH do meio de coloração pode estar entre cerca de 6,8 e 7,9; cerca de 7,1 e 7,6; ou a cerca de 7,4. No caso de duas diluições, a segunda diluição pode ser realizada a ou próximo do mesmo pH que a primeira diluição ou a um pH baixo, tal como entre 5,0 e 6,0, ou a cerca de 5,5. Opcionalmente, os antioxidantes e concentrações previamente descritos podem ser incorporados no meio de coloração. A amostra de espermatozóide pode ser incubada entre 30-39°C, entre cerca de 32-37°C, ou a cerca de 34°C. O período de incubação pode variar entre cerca de 20 minutos e cerca de três horas, entre cerca de 30 minutos e cerca de 90 minutos, ou durante cerca de 45 minutos a cerca de 60 minutos.
[000140] Na etapa 712, pode ver-se que o meio de coloração utilizado na etapa 710 inclui uma primeira quantidade de crioprotetor. O crioprotetor pode ser um álcool de açúcar apropriado, tal como etilenoglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galactitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; um glicilglicitol, ou combinações dos mesmos. O crioprotetor pode também ser um glicol adequado, tal como propilenoglicol, butano triol ou combinações dos mesmos. Pode ser entendido que o
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 183/278 /105 crioprotetor selecionado pode ser específico para a espécie animal, ou talvez até para a raça. Como exemplo, o glicerol pode ser selecionado no caso de espermatozóide bovino e efetuando as etapas ilustradas na FIG. 7 a toxicidade do glicerol pode ser mitigada. Pode ser apreciado, outros crioprotetores adequados podem ser utilizados se forem adequados para preservar uma amostra de espermatozóide e que as etapas da FIG. 7 também pode mitigar os efeitos tóxicos desses crioprotetores.
[000141] A primeira quantidade de crioprotetor pode ser uma concentração de crioprotetor de vol./vol. ou peso/vol. nos meios de coloração entre cerca de 0,1% e cerca de 5%; entre cerca de 0,1% e cerca de 1%; entre cerca de 1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 3%; entre cerca de 3% e cerca de 4%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; ou entre cerca de 1,5% e cerca de 3%.
[000142] Uma vez corada, a amostra de espermatozóide pode ser colocada em contato com um fluido de bainha na etapa 720. A etapa de contato com a amostra de espermatozóide pode ser incidente no processamento da amostra de espermatozóide, como por citometria de fluxo, por meio de um citômetro de fluxo em jato ou em um processo similar em um chip microfluídico. Numa modalidade, a etapa de contatar a amostra de espermatozóide com fluido de bainha ocorre num citômetro de fluxo de jetin-air, como descrito em relação à Fig. 1. Pode ser entendido, no entanto, que a etapa 720 não se limita ao processamento num citômetro de fluxo de jetin-air, mas abrange qualquer método de processamento de espermatozóide em que um espermatozóide contendo amostra de espermatozóide é contatado com um fluido de bainha. Como um exemplo não limitativo, a triagem em um chip microfluídico geralmente requer o estabelecimento de um fluxo coaxial de amostra e fluido de bainha através de um canal de fluxo. No caso
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 184/278 /105 dos espermatozóides, uma amostra de espermatozóides seria transportada através de um ou mais canais de fluxo em um fluxo laminar, enquanto cercada por um fluido de bainha para focalizar a localização dos espermatozóides e impedir que eles toquem o interior do canal de fluxo. Os fluxos laminares da amostra de espermatozóides e do fluido de bainha em cada canal evitariam, ou pelo menos minimizariam, qualquer mistura da amostra de espermatozóides e do fluido de bainha, mantendo os fluidos em contato.
[000143] Na etapa 730, a amostra de espermatozóide é manipulada. Numa modalidade, a amostra de espermatozóide é manipulada para produzir uma amostra de espermatozóide manipulada tendo uma razão manipulada de espermatozóide com cromossomo X viável para espermatozóide com cromossomo Y viável. A etapa de manipulação pode ser realizada pela separação física de um subconjunto de células, tal como é o caso na modalidade de formação de gotículas descrita acima com referência à FIG.
1. Mas a etapa de manipulação não é tão limitada e inclui troca de fluido ou desvio de células nos canais de fluxo de chips microfluídicos. Altemativamente, um laser foto-nocivo poderia ser usado em conjunto com um citômetro de fluxo de jet-in-air ou um chip microfluídico para incapacitar células espermáticas selecionadas na amostra espermática, deixando uma amostra de espermatozóide manipulada tendo uma razão manipulada de espermatozóide com cromossomo X viável para espermatozóide com cromossomo Y viável. Alternativamente, a amostra de espermatozóide pode ser manipulada com base em outras características. Como apenas um exemplo, uma amostra de espermatozóide pode fluir através de um citômetro de fluxo para separar espermatozóide presumivelmente viável de espermatozóides com membranas comprometidas.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 185/278 /105 [000144] Uma modalidade do método representado na FIG. 7 termina na produção de uma amostra de espermatozóide manipulada da etapa 730, enquanto outras modalidades do método continuam na etapa de coleta da amostra de espermatozóide 740 manipulada e/ou a etapa de congelar a amostra 750 de espermatozóide manipulada. Em uma modalidade, o método da FIG. 7 prossegue opcionalmente para a etapa 740, em que a amostra de espermatozóide manipulada é coletada num meio de coletada. No caso da citometria de fluxo, o meio de coleta pode ser descrito como um fluido captador localizado em um vaso de coleta ou um tubo de captura no qual espermatozóides selecionados são defletidos. Como pode ser entendido a partir da etapa 742, o meio de coleta também contém uma quantidade de crioprotetor, que pode ser considerada uma terceira quantidade de crioprotetor. Novamente, o crioprotetor pode ser o mesmo que o crioprotegido no meio de coloração e/ou no fluido de bainha. Altemativamente, o crioprotetor pode ser outro crioprotetor, tal como um álcool de açúcar adequado, incluindo etilenoglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galactitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; um glicilglicitol, ou combinações destes, ou um glicol adequado, tal como propilenoglicol, butanotriol ou combinações destes. Os meios de coleta podem incluir uma terceira quantidade de crioprotetor entre cerca de 1 % e cerca de 2% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cerca de 2%e cerca de 4% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cerca de 4%e cerca de 6% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cerca de 3%e cerca de 7% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; entre cerca de 3,5% e cerca de 5,5% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.; ou entre cerca de 4,5% de crioprotetor por vol./vol. ou peso/vol.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 186/278 /105 [000145] Numa modalidade, o método prossegue a partir da etapa de manipulação da amostra de espermatozóide 530 diretamente para a etapa de congelamento da amostra de espermatozóide manipulada 750. Por exemplo, no caso de manipulação da amostra de espermatozóide com um chip microfluídico, um meio de coleta pode não ser necessário, pois não são formadas gotículas que exijam o amortecimento de um meio de coleta. No entanto, são previstas modalidades em que um meio de coleta é utilizado em ligação com a manipulação de uma amostra de espermatozóide num chip microfluídico.
[000146] Para o método incorporado pela FIG. 7, o congelamento da etapa 750 pode ser obtido por uma técnica convencional, tal como as descritas no documento WO/200137655. Apenas a título de exemplo, um desses métodos pode começar por estender a amostra de espermatozóide manipulada para ser congelada em uma fração A. Altemativamente, a amostra de espermatozóide manipulada poderia ter sido coletada em um meio de coleta, incluindo um diluente de fração A na etapa de coleta 540. Apenas a título de exemplo, a fração A pode compreender um diluente de citrato TRIS com 20% de gema de ovo. Outros diluentes adequados podem incluir citrato de sódio, Tris[hidroximetil]aminometano e TES (ácido NTris[Hidroximetil]metil-2-aminoetanossulfônico) e tampões de glutamato monossódico; leite; meio tamponado com HEPES; e qualquer combinação destes.
[000147] A etapa de congelamento 750 pode continuar com o arrefecimento da amostra de espermatozóide manipulada. A amostra de espermatozóide manipulada pode ser arrefecida a uma temperatura entre cerca de 8°C e 4°C. Num exemplo específico, a amostra de espermatozóide manipulada pode ser arrefecida até cerca de 5°C. Após o arrefecimento, uma
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 187/278 /105 fração B pode ser adicionada em uma ou mais etapas e, em seguida, a amostra de espermatozóide manipulada pode ser reconcentrada. A reconcentração pode incluir a centrifugação da amostra de espermatozóide manipulada até um sedimento e a ressuspensão do espermatozóide em um diluente final, às vezes chamado de diluente AB. Como um exemplo, o diluente AB pode ter uma concentração de crioprotetor que é metade da concentração do crioprotetor na fração B. Como exemplo não limitativo, essa concentração pode ser de cerca de 6% vol./vol. ou peso/vol. no caso do glicerol. Outros métodos de congelamento são contemplados para utilização de acordo com a modalidade representada na FIG. 7 Em particular, certos métodos de congelamento descritos abaixo podem fornecer uma sinergia com o método de processamento representado na FIG. 7.
[000148] A FIG. 8 ilustra um novo método para congelar espermatozóide, que pode ser usado em conjunto com qualquer um dos métodos de classificação, ou sistemas, descritos acima, nos quais o crioprotetor é introduzido em um processo para manipular uma população de espermatozóide. Como exemplos não limitativos, a amostra de espermatozóide pode ser manipulada para alterar a razão entre o espermatozóide com cromossomo X viável e o espermatozóide com cromossomo Y viável com um citômetro de fluxo de jat-in-air ou com um chip microfluídico. O mecanismo para manipular a amostra de espermatozóide pode ser deflexão de gotas, troca de fluido, foto-dano com um laser ou outro meio.
[000149] Independentemente dos meios utilizados para manipular uma amostra de espermatozóide, a etapa 810 começa com a coleta de uma amostra de espermatozóide manipulada numa mistura que inclui crioprotetor. O crioprotetor pode estar presente em um recipiente antes de
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 188/278 /105 receber a amostra de espermatozóide manipulada, o crioprotetor pode estar presente na amostra de espermatozóide antes da manipulação.
[000150] Como descrito anteriormente, numa modalidade os espermatozóides são corados num meio de coloração que inclui um crioprotetor. Da mesma forma, durante a manipulação da amostra de espermatozóide, o espermatozóide pode ser contatado com um fluido de bainha com um crioprotetor. Se corado em um meio de coloração que inclui um crioprotetor ou classificado em um sistema que inclui um fluido de cobertura com um crioprotetor, ou ambos, o crioprotetor permanece na amostra de espermatozóide e é coletado na etapa 810 junto com as células de espermatozóide manipuladas.
[000151] Em modalidades nas quais o espermatozóide é coletado com uma concentração suficiente de crioprotetor, o processo de congelamento pode ser simplificado para omitir ou modificar etapas que foram previamente necessárias para efetuar a introdução gradual de crioprotetor no espermatozóide. Por exemplo, em uma modalidade, espermatozóide manipulado em contato com meios de coloração contendo glicerol, fluido de bainha ou fluido de captura podem ser retirados diretamente do triados, concentrados por centrifugação, ressuspensos em um crioprotetor e então criopreservados. Numa modalidade adicional, após ressuspensão no crioprotector, os espermatozóides são mantidos durante um período de conservação inferior a 24 horas, inferior a 8 horas, inferior a 4 horas, 2 horas, inferior a 2 horas ou inferior a 1 hora antes da criopreservação. Ainda numa outra modalidade, os espermatozóides são arrefecidos durante o tempo de espera. Numa modalidade específica da invenção, os espermatozóides são colocados em contato com fluido de bainha compreendendo glicerol a 3% (vol./vol. ou peso/vol.), concentrados por centrifugação, ressuspensos num
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 189/278 /105 crioprotector compreendendo glicerol a 4,5% (vol./vol. on peso/vol.) e, em seguida, criopreservado. As modalidades acima mencionadas, portanto, não incluem etapas de arrefecimento do espermatozóide e adição de crioprotetor ao espermatozóide arrefecido, antes da etapa de concentração do espermatozóide.
CONFIGURAÇÃO E CONDIÇÕES DOS EXEMPLOS 1-10 [000152] Configuração do Triador - Todas as análises e triagem foram realizadas em um triador de espermatozóide modificado MoFlo-SX (Beckman Coulter, Brea California) usando atualizações de hardware de processamento digital da Genesis (disponível em CytonomeST, Boston, Massachusetts) e software específico de triagem de espermatozóide. O software de triagem Genesis inclui uma função de registro de parâmetros que registra valores médios para vários parâmetros como Taxa de Eventos (em KHz), Taxa de Triagem (em KHz), Taxa de Abortos (em KHz), quantidade de espermatozóide morto (como taxa de eventos espermatozóide morto por Taxa de Eventos - em %), quantidade orientada ao vivo (como taxa de eventos de espermatozóide orientados ao vivo divididos por Taxa de Eventos - em %, quantidade restrita a X (como porcentagem de espermatozóides orientados ao vivo escolhidos para serem coletados) e Razão Pico a Vale (PVR). A triagem em massa refere-se ao uso da quantidade restrita a X para incluir espermatozóides com cromossomos X e espermatozóide com cromossomos Y para fornecer espermatozóides que são tratados pelo método de triagem, mas não são selecionados por sexo, com base na experiência de que a qualidade da espermatozóide após a triagem e o congelamento não são influenciados pelo sexo do espermatozóide e a triagem em massa é cerca de duas vezes mais rápida que a triagem sexual. O fluido de bainha pressurizado foi fornecido a partir de um saco estéril de fluido de bainha dentro de um
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 190/278 /105 tanque pressurizado com cabeça de ar, ou de um saco ou béquer aberto de fluido de bainha que fornece um sistema de distribuição de fluido de precisão SheathMaster™ (CytonomeST) em que a pressão é aplicada a um plenum (câmara) pressurizado de pequeno volume. Em ambos os casos, a taxa de fluxo do fluido de bainha é controlada com precisão pela pressão do ar controlada pela estação de amostragem MoFlo. Um fluido de bainha à base de TRIS para produção comercial de sêmen sexado foi usado para todas as triagens.
[000153] Método Descontínuo da Mudança de fluido de bainha - Um múltiplo de fluido de bainha à base de TRIS, cada um contendo uma quantidade especificada de glicerol, foi colocado em sacos estéreis ou béqueres abertos e usado para fornecer triador de tanque pressurizado ou sistema de distribuição de fluido SheathMaster™, respectivamente. A concentração do glicerol para cada fluido de bainha é conhecida pela sua composição.
[000154] Coloração de Espermatozóide - 160 milhões por mL de espermatozóide bovino recém-ejaculado são corados com 65,0 mM Hoechst 33342 em TALP modificado por 60 minutos a 34°C, arrefecido à temperatura ambiente e diluído com 1/3 volume da mesma TALP modificada suplementada com 8% v/v de gema de ovo clarificada para criar uma concentração final de espermatozóide de 120 milhões de espermatozóides por mililitro e uma concentração de gema de ovo de 2% v/v, então filtrada através de um filtro Partee de 50 microns.
[000155] Alinhamento de Espermatozóide para Estabelecer/Medir uma PVR - PVR (razão pico-a-vale) é uma medida objetiva da representação gráfica univariada representada graficamente na interface gráfica do usuário do computador Genesis executando o triador. O gráfico univariado da FIG.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 191/278 /105 ilustra a frequência de eventos com diferentes intensidades de fluorescência na direção para frente. A representação em uma amostra de sêmen corada corretamente alinhada corresponde a duas curvas sobrepostas, com números semelhantes de eventos em duas intensidades de pico diferentes (dois máximos), juntamente com uma localização onde as duas curvas começam a se sobrepor e o número de amostras de cada uma das curvas é aproximadamente igual (mínimo local único aproximadamente equidistante entre os dois máximos). O mínimo local pode ser chamado de vale (V), enquanto os dois máximos locais podem ser chamados de picos (P), o valor P como utilizado no exemplo é uma média dos valores de intensidade de dois picos. Valores ordinais para P e V foram determinados em software, a partir do qual foi calculada uma PVR com a seguinte equação: ((P-V)/P)* 100. Antes da análise, o alinhamento foi realizado no triador de espermatozóide por um operador treinado, a fim de corrigir o posicionamento da óptica, o bocal de triagem de espermatozóide e ponta, bem como o Detector de Fluorescência Direta (FAF) e o Detector de Fluorescência Lateral (SAF). Além disso, o ganho de sinal apropriado deve ser aplicado ao FAF e ao SAF.
[000156] Análise de Dados Registrados para PVR - O software de operação do triador Genesis fornece um cálculo em tempo real da PVR. Para cada 25.000 eventos, a PVR é calculada e armazenada em buffer como um valor bruto, enquanto 100 medições consecutivas de valor bruto de PVR são calculadas. O valor médio de PVR pode ser registrado (logado) sob demanda pelo operador. Geralmente, operar um citômetro de fluxo com taxas de eventos inferiores cria razões de PVR melhoradas devido à precisão melhorada dos valores medidos de evento individual (espermatozóide) provocados pela secção transversal do fluxo de amostra de núcleo mais
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 192/278 /105 estreita. O alinhamento foi primeiro otimizado para triagem em 40.000 eventos por segundo, em seguida, a porta de triagem (exemplos dos quais são vistos como Rl, R3 e R4 na Figura 4) foi aplicada para coletar simultaneamente as populações X viva e Y viva (triagem em massa) e o triador é operado sem qualquer modificação adicional por um período de tempo correspondente a 500.000 a 700.000 células classificadas antes da demanda por valor médio, assegurando que os parâmetros registrados sejam uma média representativa. Após a demanda por valor médio de 40.000 eventos por segundo, o operador reduz a pressão da amostra de espermatozóide para ajustar a uma nova pressão que estabeleceu uma taxa de eventos de cerca de 30.000, com a porta de triagem aplicada às populações X-vivas e Y-vivas simultaneamente (triagem em massa) e o triador é operado sem qualquer modificação adicional por um período de tempo correspondente a 500.000 a 700.000 células tríadas antes da demanda por valor médio. Isso é repetido para uma amostra sendo executada a 20.000 eventos por segundo. A pressão da amostra é então aumentada para estabelecer uma taxa média de evento de 40.000 por segundo, seguida de alinhamento (se necessário) e três medições consecutivas, como acima. Isso é feito em série ao longo do tempo e os dados registrados são analisados.
EXEMPLO 1 [000157] A Tabela 2 resume os tratamentos para o Exemplo 1.
Tabela 2.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 193/278 / 105
| PADRÃO. | COLORAÇÃO | CAPTURA | VOL. TRIADO | TRIAGEM | ARREFECIMENTO | CONGELAMENTO | |
| Controle | MEIO DE RETENÇÃO (1:3) | TALP 2% EY (120Mil./mL) | TRIS A (3,5mL) | 20mL | 0% de gli vol./vol. SF | MEIO DE CONGELAMENTO (12% gli vol./vol.) (1:1) | AB (6% de gli vol./vol.) (4 Mil./canudo) |
| TI | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 0% de gli vol./vol. SF | - | |||
| T2 | TRIS A (7,0mL) | 40mL | l%de Gli vol./vol/ SF | - | |||
| T3 | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 2% de Gli vol./vol/ SF | ||||
| T4 | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 4% de Gli vol./vol/ SF | ||||
| T5 | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 8% de Gli vol./vol/ SF |
1. Um ejaculado foi obtido de um touro.
2. Ejaculado foi a qualidade verificada (QCed) para a motilidade e morfologia e as concentrações de célula de espermatozóide estimadas.
3. O ejaculado foi padronizado através da combinação com meios de retenção (sais fisiológicos salinos e tampão com gema de ovo e nutrientes) numa razão 1:3, respectivamente, e depois corados de acordo com o procedimento de coloração acima mencionado.
4. O fluido de bainha de controle (SF) foi ligado ao citômetro de fluxo e o fluido residual foi recolhido num tubo pré-pesado durante 3 minutos.
5. O fluido no tubo foi pesado para determinar a taxa de fluxo com cada fluido de bainha específico.
6. A amostra corada foi colocada no triador e o atraso da gota foi verificado.
7. Dados registrados do citômetro de fluxo foram
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 194/278 / 105 coletados para 1 milhão de espermatozóide tríades por sexo em 30.000, 20.000 e 40.000 eps.
8. Após a coleta dos dados registrados, um (1) tubo de captura de até 20 mL foi tríade em massa.
9. Para os grupos de tratamento, as etapas 7 e 8 foram repetidas utilizando cada fluido de bainha de tratamento descrito acima na Tabela 2.
10. Após a coleta dos dados registrados, 1 tubo de captura por tratamento até 40 mL foi tríade em massa.
11. Todos os tubos de captação foram colocados em câmara fria por 90 minutos.
12. Adicionaram-se 20 mL de meio de congelamento (12% vol./vol. de glicerol) ao controle (adição em duas etapas).
13. Todos os tubos de captura foram centrifugados e o sobrenadante foi decantado.
14. Um volume apropriado de AB (6% de glicerol vol./vol.) foi adicionado a cada tubo de captura, a fim de trazer a concentração de espermatozóide por canudo de IA (inseminação artificial) de % cc para 4 milhões de células/canudo.
15. Espermatozóides diluídos foram mantidos em câmara fria durante a noite.
16. Os espermatozóides foram colocados em canudos e criopreservados.
17. As etapas 1-16 foram replicadas mais duas vezes usando ejaculados do mesmo touro.
18. A PVR foi avaliada para o controle e cada tratamento. Os resultados são mostrados na Figura 9. A motilidade espermática (IVOS II), viabilidade (PI) e PIA (PNA) também foram avaliadas em 0 e 3 horas pós-descongelamento. Os resultados são mostrados nas Figuras 10 e 11, respectivamente.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 195/278 /105
EXEMPLO 2 [000158] Em vez do método descontínuo de mudança de fluido de bainha descrito acima, o Exemplo 2 utilizou um método de fluido de bainha gradiente de mudança de fluido de bainha como se segue.
[000159] Método de Fluido de Bainha Gradiente com Mudança do fluido de bainha - O Béquer 1, que fornece fluido de bainha ao sistema de distribuição de fluido SheathMaster™ contendo Bovine Shain Fluid com 0% de glicerol, é agitado por uma barra de agitação magnética. Fluido de Bainha Bovino contendo 6% vol./vol. ode glicerol (820 mM) no béquer 2 é bombeado lentamente para o Béquer 1 com uma bomba peristáltica proporcionando uma concentração de glicerol continuamente crescente no Béquer 1 durante um período de cerca de 3 horas, em que a concentração final de glicerol é de cerca de 5,5% vol./vol. (750mM). A concentração de glicerol em intervalos de tempo é determinada medindo a osmolaridade do fluido de bainha que sai do bocal e comparando a medição com uma curva padrão apropriada. A curva típica para o glicerol no fluido de bainha é Percentagem de Glicerol (G) = (Medida mOsm (X) - 300)/161, ou diferentemente declarado, cada aumento em 161 mOsm corresponde a um aumento de 1 % (vol./vol) na concentração de glicerol.
1. Ejaculados frescos foram obtidos de três touros.
2. Ejaculados foram QCed, padronizados e corados de acordo com os procedimentos delineados no Exemplo 1.
3. Um béquer contendo 0% de fluido de bainha de glicerol foi ligado ao sistema de distribuição de fluido de um citômetro de fluxo. O fluido foi continuamente misturado com uma barra de agitação magnética.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 196/278 / 105
4. A amostra de espermatozóide corada foi colocada no citômetro de fluxo e o atraso da gota foi verificado.
5. 1 milhão de espermatozóides foram triados por sexo a 20.000 eps, depois 30.000 eps e, finalmente, 40.000 eps.
6. 6,0% de glicerol vol./vol. O fluido de bainha foi bombeado com uma bomba peristáltica para o fluido de bainha de glicerol a 0% a uma taxa de fluxo média de 204 g/h.
7. Os dados do citômetro de fluxo registado foram continuamente coletados nas diferentes taxas de eventos que até apenas 6,0% de glicerol vol./vol. de fluido de bainha estava disponível.
A PVR foi calculada para cada amostra de controle e tratamento. Os resultados são mostrados na Figura 12.
EXEMPLO 3 [000160] A Tabela 3 resume os tratamentos para o Exemplo 3.
Tabela 3.
| PADRÃO. | COLORAÇÃ O | CAPTURA (Volume) | VOL. TRIADO | TRIAGEM | MEIO DE ARREFECIMENTO | TEMPO DE ARREFECIMENTO | CONGEL AMENTO | |
| Controle | MEIO DE RETENÇÃ 0(1:3) | TALP 2% EY (120Mil./mL) | TRIS A (3,5mL) | 20mL | 0% de gli vol./vol.SF | MEIO DE CONGELAMENTO (12% gli vol./vol.) (1:1) | 90 minutos | AB FRIO |
| TI | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 3,5% de gli vol./vol. 3% de glicerol | - | 90 minutos | |||
| T2 | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 3,5% de gli vol./vol. 3% de glicerol | - | 30 minutos |
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 197/278 /105
| T3 | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 3,5% de gli vol./vol. 3% de glicerol | - | 0 minutos | |||
| T4 | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 3,5% de gli vol./vol. 3% de glicerol | - | 0 minutos | AB À TEMPERA TURA AMBIENT E |
1. Ejaculados foram obtidos de dez touros.
2. Ejaculados foram QCed, padronizados e corados de acordo com os procedimentos delineados no Exemplo 1.
3. 1 tubo de captura de até 20mL foi triado em massa. Controle - Colocar os tubos em câmara fria por 90 minutos.
Adicionados 20 mL de meio de congelamento (12% vol./vol. de glicerol) ao controle (adição em duas etapas).
4. Etapa 3 repetida. 4 tubos de captura até 40 mL foram triados em massa utilizando fluido de bainha (SF) a 3,5% de glicerol vol./vol.
Tratamento 1 - Tubos colocados em câmara fria por 90 minutos.
Tratamento 2 - Tubos colocados em câmara fria por 30 minutos.
Tratamento 3 - Manter à temperatura ambiente até estar pronto para centrifugar
Tratamento 4 - Manter à temperatura ambiente até estar pronto para centrifugar
5. Todos os tubos de captura foram centrifugados e o sobrenadante foi decantado.
6. Um volume adequado de AB frio (6% de glicerol vol./vol.) foi adicionado a cada tubo de captura, a fim de trazer a concentração de espermatozóide por canudo de IA de % cc a 4 milhões de células/canudo, exceto que a temperatura ambiente AB foi adicionada ao tratamento 4.
7. Espermatozóide diluído mantido durante a noite na
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 198/278 /105 câmara fria.
8. As células de espermatozóide foram colocadas em canudos e criopreservados (3 canudos por tratamento a 4 milhões de células/canudo).
9. Foram avaliadas 0 e 3 h de motilidade (IVOS), viabilidade (PI) e PIA (PNA) após o descongelamento. Os resultados são mostrados na Figura 13. Convergência (3hr/0hr) para motilidade, viabilidade e PIA são mostrados na Figura 14.
EXEMPLO 4 [000161] A Tabela 4 resume os tratamentos para o Exemplo 4.
Tabela 4.
| PADRÃO. | COLORAÇÃO | CAPTURA (Volume) | VOL. TRIADO | TRIAGEM | MEIO DE ARREFECIMENT | TEMPO DE ARREFECIMENT | CONGELA MENTO | |
| Controle | TRIS A (3,5mL) | 20mL | 0% de gli vol./vol. 3% de glicerol | MEIO DE CONGELAMENTO (12% gli vol./vol.) (1:1) | 90 minutos | AB (6% de gli vol./vol.) | ||
| TI | MEIO DE RETENÇÃO (1:3) | TALP 2% EY (120Mil./mL) | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 3,0% de gli vol./vol. 3% de glicerol | - | 90 minutos | AB (5% de gli vol./vol.) |
| T2 | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 3,0% de gli vol./vol. 3% de glicerol | - | 0 minuto | AB (5% de gli vol./vol.) | ||
| T3 | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 5,0% de gli vol./vol. 3% de glicerol | - | 90 minutos | AB (5% de gli vol./vol.) | ||
| T4 | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 5,0% de gli vol./vol. SE | - | 0 minuto | AB (5% de gli vol./vol.) |
1. Ejaculados foram obtidos de cinco touros.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 199/278 / 105
2. Ejaculados foram QCed, padronizados e corados de acordo com os procedimentos delineados no Exemplo 1.
3. 1 tubo de captura de até 20mL foi triado em massa.
Controle - tubos de captura colocados em câmara fria por 90 minutos.
Adicionados 20 mL de meio de congelamento (12% vol./vol. de glicerol) ao controle (adição em duas etapas).
Todos os tubos de captura foram centrifugados e o sobrenadante foi decantado.
Um volume adequado de AB (6% de glicerol vol./vol.) foi adicionado a cada tubo de captura, a fim de trazer a concentração de espermatozóide por canudo de IA (inseminação artificial) de % cc para 4 milhões de células/canudo.
4. Fluido de bainha (SF) a 3,0% de glicerol conectado e tanque pressurizado.
5. 2 tubos de captura de até 40 mL foram triados em massa: Tratamento 1 - Tubos de captura colocados em câmara fria por minutos.
Tratamento 2 - Tubos de captura colocados em câmara fria por 0 minutos.
6. Fluido de bainha a 5,0% de glicerol vol./vol. conectado e tanque pressurizado.
7. 4 tubos de captura de até 40 mL triados em massa:
Tratamento 3 - Tubos de captura colocados em câmara fria por 90 minutos.
Tratamento 4 - Tubos de captura colocados em câmara fria por 0 minutos.
Todos os tubos centrifugados e o sobrenadante foi decantado.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 200/278 /105
AB (5% de glicerol vol./vol.) adicionado a cada tubo para um final de 4 milhões de espermatozóides por canudo.
8. Espermatozóide diluído mantido durante a noite na câmara fria.
9. As células de espermatozóide foram colocadas em canudos e criopreservadas.
10. Foram avaliadas 0 e 3 h de motilidade (IVOS), viabilidade (PI) e PIA (PNA) após o descongelamento. Os resultados são mostrados na Figura 15. Convergência (3hr/0hr) para motilidade, viabilidade e PIA são mostrados na Figura 16.
EXEMPLO 5
A Tabela 5 resume os tratamentos para o Exemplo 5.
Tabela 5.
| Padrão.; Coloração | Volume de Captura | Volume de Triagem | Concentração em SF (normalizado para glicerol) | Tempo de Arrefecimento | Crioprotetor para congelamento | |
| Glicerol (Controle) | MEIO DE RETENÇÃO (1:3); TALP 2% EY (120 Mil./mL) | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 3,5% de gli vol./vol. 3% de glicerol | 0 minuto | 5,0% de gli vol./vol. AB |
| Etilenoglicol | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 3,5% de EG vol./vol. 3% de glicerol | 0 minuto | 5,0% de gli vol./vol. AB | |
| Propilenoglicol | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 3,5% de PG vol./vol. 3% de glicerol | 0 minuto | 5,0% de gli vol./vol. AB | |
| mM | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 3,5% de eritritol vol./vol. 3% de glicerol | 0 minuto | 5,0% de gli vol./vol. AB | |
| mM | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 5,0% de eritritol vol./vol. 3% de glicerol | 0 minuto | 5,0% de gli vol./vol. AB | |
| 1. Ejacu | ados foram obtidos de quatro touros. |
2. Ejaculados foram QCed, padronizados e corados de
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 201/278 /105 acordo com os procedimentos delineados no Exemplo 1.
3. O controle do fluido de bainha foi conectado e o tanque de fluido de bainha foi pressurizado.
4. A amostra corada foi colocada num citômetro de fluxo e o atraso da gota foi verificado.
5. 1 tubo de captura até 40 mL foi triado em massa utilizando glicerol a 3,5% vol./vol. de fluido de bainha (SF).
6. 1 tubo de captura até 40 mL foi triado em massa utilizando etilenoglicol a 3,5% vol./vol. SF.
7. 1 tubo de captura até 40 mL foi ordenado em massa utilizando propilenoglicol a 3,5% vol./vol. SF.
8. 1 tubo de captura até 40 mL foi triado em massa utilizando eritritol a 3,5% vol./vol. de glicerol.
9. 1 tubo de captura até 40 mL foi triado em massa utilizando eritritol a 5,0% vol/vol. SF.
10. Todos os tubos foram centrifugados e decantados.
11. AB a 5% de glicerol vol./vol. foi adicionado a cada tubo em uma quantidade capaz de produzir 4 milhões de espermatozóides por canudo.
12. Espermatozóides diluídos foram mantidos durante a noite em sala fria.
13. As células de espermatozóide foram colocadas em canudos e criopreservadas.
14. 0 e 3hr motilidade pós-descongelamento (IVOS), viabilidade (PI) e PIA (PNA) foram avaliados. Os resultados são mostrados na Figura 17. Convergência (3hr/0hr) para motilidade, viabilidade e PIA são mostrados na Figura 18.
EXEMPLO 6
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 202/278 /105 [000162] A Tabela 6 resume os tratamentos para o Exemplo 6.
Tabela 6.
| PADRÃO. | COLORAÇÃO | Volume de Captura | Volume de Triagem | Gli na bainha | Tempo de Arrefecimento | Crioprotetor para congelamento | |
| CONTROLE | MEIO DE RETENÇÃO (1:3) | TALP2% EY (120 Mil./mL) | TRIS A (3,5mL) | 20mL | 0,0% de gli vol./vol. 3% de glicerol | 90 minutos + MEIO DE CONGELAMENTO (12% gli vol./vol.) | 6,0% de gli vol./vol. AB |
| CONTROLE 2 | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 3,0% de gli vol./vol. 3% de glicerol | 0 minuto | 5,0% de gli vol./vol. AB | ||
| TI | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 1,0% de gli vol./vol. 3% de glicerol | 0 minuto | 1,0% de gli vol./vol. AB | ||
| T2 | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 3,0% de gli vol./vol. 3% de glicerol | 0 minuto | 3,0% de gli vol./vol. AB | ||
| T3 | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 5,0% de gli vol./vol. 3% de glicerol | 0 minuto | 5,0% de gli vol./vol. AB | ||
| T4 | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 7,0% de gli vol./vol. 3% de glicerol | 0 minuto | 7,0% de gli vol./vol. AB |
1. Ejaculados frescos foram obtidos de quatro touros.
2. Ejaculados foram QCed, padronizados e corados de acordo com os procedimentos delineados no Exemplo 1.
3. O controle do fluido de bainha foi conectado e o tanque de fluido de bainha foi pressurizado.
4. Tubo de captura de tipo 1 em massa até 40 mL usando glicerol 0,0% de fluido de bainha (SF) (Controle).
5. 1 tubo de captura até 40 mL foi triado em massa usando SF a
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 203/278 /105
1,0% de glicerol vol./vol. (Tl).
6. 1 tubo de captura até 40 mL foi triado em massa usando SF a
3,0% de glicerol vol./vol. (Controle 2)
7. 1 tubo de captura até 40 mL foi triado em massa usando SF a 3,0% de glicerol vol./vol. (T2).
8. 1 tubo de captura até 40 mL foi triado em massa usando SF a 5,0% de glicerol vol./vol. (T3).
9. 1 tubo de captura até 40 mL foi triado em massa usando SF a 7,0% de glicerol vol./vol. (T4).
10. Tubos de controle colocados em câmara fria por 90 minutos e 20mL de meio de congelamento (12% de glicerol v/v) foram adicionados (adição de duas etapas).
11. Todos os tubos foram centrifugados e decantados.
12. AB suficiente foi adicionado a cada tubo, a fim de produzir milhões de espermatozóides por canudo:
AB a 6,0% de glicerol vol./vol. (Controle)
AB a 1,0% de glicerol vol./vol. Tl
AB a 3,0% de glicerol vol./vol. (T2)
AB a 5,0% de glicerol vol./vol. (T3 e controle 2)
AB a 7,0% de glicerol vol./vol. (T4)
13. Espermatozóides diluídos foram mantidos durante a noite em câmara fria.
14. As células de espermatozóide foram colocadas em canudos e criopreservadas.
15. Motilidade 0 e 3h pós-descongelamento (IVOS II) são mostradas na Figura 19. Viabilidade (PI) e PIA (PNA) 0 e 3hr pósdescongelamento são mostradas na Figura 20.
EXEMPLO 7
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 204/278 /105 [000163] A Tabela 7 resume os tratamentos para o Exemplo 7.
Tabela 7.
| PADRÃO. | COLORAÇÃO | Volume de Captura | Volume de Triagem | Poliol no fluido de bainha | Tempo de Arrefecimento | Crioprotetor para congelamento | |
| CONTROLE | MEIO DE RETENÇÃO (1:3) | TALP2% EY (120 Mil./mL) | TRIS A (3,5mL) | 20mL | 0,0% de gli vol./vol. 3% de glicerol | 90 minutos + CONGELAMEN TO MEIO (12% de gli) | 6,0% de gli vol./vol. AB |
| CONTROLE 2 | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 3,0% de gli vol./vol. SE | 0 minuto | 5,0% de gli vol./vol. AB | ||
| TI | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 1,0% de propilenoglicol vol./vol. SE | 0 minuto | 1,0% Prop. Glicol vol./vol. AB | ||
| T2 | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 3,0% de propilenoglicol vol./vol. SE | 0 minuto | 3,0% Prop. Glicol vol./vol. AB | ||
| T3 | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 5,0% de propilenoglicol vol./vol. SE | 0 minuto | 5,0% Prop. Glicol vol./vol. AB | ||
| T4 | TRIS A (7,0mL) | 40mL | 7,0% de propilenoglicol vol./vol. SE | 0 minuto | 7,0% Prop. Glicol vol./vol. AB |
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 205/278 /105
1. Ejaculados frescos foram obtidos de quatro touros.
2. Ejaculados foram QCed, padronizados e corados de acordo com os procedimentos delineados no Exemplo 1.
3. O controle do fluido de bainha foi conectado e o tanque de fluido de bainha foi pressurizado.
4. 1 tubo de captura até 20 mL foi triado em massa utilizando glicerol a fluido de bainha (SF) a 0,0% de glicerol vol./vol. (Controle).
5. 1 tubo de captura até 40 mL foi triado em massa utilizando SF a 3,0% de glicerol vol/vol. (Controle 2).
6. 1 tubo de captura até 40 mL foi triado em massa utilizando SF a 1,0% de propilenoglicol vol./vol. (Tl).
7. 1 tubo de captura até 40 mL foi triado em massa utilizando
SF a 3,0% de propilenoglicol vol./vol. (T2)
8. 1 tubo de captura até 40 mL foi triado em massa utilizando
SF a 5,0% de propilenoglicol vol./vol. (T3)
9. 1 tubo de captura até 40 mL foi triado em massa utilizando
SF a 7,0% de propilenoglicol vol./vol. (T4)
10. Tubos de controle colocados em câmara fria por 90 minutos e 20mL de meio de congelamento (12% de glicerol vol./vol.) foram adicionados (adição de duas etapas).
11. Todos os tubos foram centrifugados e decantados.
12. AB suficiente foi adicionado a cada tubo, a fim de produzir milhões de espermatozóides por canudo:
AB a 6,0% de glicerol vol./vol. (Controle)
AB a 5,0% de glicerol vol./vol. (Controle 2)
AB a 1,0% de propilenoglicol vol./vol. Tl
AB a 3,0% de propilenoglicol vol./vol. (T2)
AB a 5,0% de propilenoglicol vol./vol. (T3)
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 206/278 /105
AB a 7,0% de propilenoglicol vol./vol. (T4)
13. Espermatozóides diluídos foram mantidos durante a noite em câmara fria.
14. As células de espermatozóide foram colocadas em canudos e criopreservadas.
15. Motilidade 0 e 3h pós-descongelamento (IVOS II) são mostradas na Figura 21. Viabilidade (PI) e PIA (PNA) 0 e 3hr pósdescongelamento são mostradas na Figura 22.
EXEMPLO 8 [000164] A Tabela 8 resume os tratamentos para o Exemplo 8.
| PADRÃO. | COLORAÇÃO | Volume de Captura | Volume de Triagem | Glicerol no fluido de bainha | Tempo de Arrefecimento | Crioprotetor para congelamento |
| MEIO DE RETENÇÃO (1:3) | TALP 2% EY (120 Mil./mL) | TRISA (7,0mL) | 40mL | 3,0% de gli vol./vol. 3% de glicerol | 0 minutos | 3,0% de gli vol./vol. AB |
| 3,5% de gli vol./vol. AB | ||||||
| 4,0% de gli vol./vol. AB | ||||||
| 4,5% de gli vol./vol. AB | ||||||
| 5,0% de gli vol./vol. AB | ||||||
| 5,5% de gli vol./vol. AB | ||||||
| 6,0% de gli vol./vol. AB |
1. Ejaculados frescos foram obtidos de quatro touros.
2. Ejaculados foram QCed, padronizados e corados de acordo com os procedimentos delineados no Exemplo 1.
3. O controle do fluido de bainha foi conectado e o tanque de
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 207/278 /105 fluido de bainha foi pressurizado.
4. Amostra corada colocada no citômetro de fluxo e atraso na gota verificado.
5. 7 tubos de captura de até 40 mL foram triado em massa utilizando fluido de bainha (SF) a 3,0% de glicerol.
6. Todos os tubos foram centrifugados e decantados.
7. AB suficiente foi adicionado a cada tubo, a fim de produzir 4 milhões de espermatozóides por canudo:
AB a 3,0% de glicerol vol./vol. TI
AB a 3,5% de glicerol vol./vol. (T2)
AB a 4,0% de glicerol vol./vol. (T3)
AB a 4,5% de glicerol vol./vol. (T4)
AB a 5,0% de glicerol vol./vol. (T5)
AB a 5,5% de glicerol vol./vol. (T6)
AB a 6,0% de glicerol vol./vol. (T7)
8. Espermatozóides diluídos foram mantidos durante a noite em câmara fria.
9. As células de espermatozóide foram colocadas em canudos e criopreservadas.
10. Motilidades às Oh e 3 h (visual e IVOS) são mostradas nas Figuras 23 e 25. Viabilidade (PI) e PIA (PNA) às Oh e 3h é mostrada nas Figuras 24 e 26. Convergências (3hr/0hr) para motilidade são mostradas na Figura 27. Convergências para viabilidade e PIA são mostradas na Figura 28.
EXEMPLO 9 [000165] A Tabela 9 resume os tratamentos para o Exemplo 9.
Tabela 9.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 208/278 /105
| Volume de Captura | Volume de Triagem | Fluido de bainha | Tempo de arrefecimento | Meio de congelamento | Crioprotetor para congelamento | Tempo de retenção antes de congelamento | |
| Controle 1 | TRIS A (3,5mL) | 20mL(15 Mil.) | 0% de gli vol./vol. 3% de glicerol | 90 minutos | Sim (12% de glicerol vol./vol.) | 6,0% de gli vol./vol. AB | 2 horas |
| Controle 2 | Durante a noite | ||||||
| TI | Não | 2 horas | |||||
| T2 | TRIS A (7,0mL) | 40mL (30 Mil.) | 3,0% de gli vol./vol. SF + AKG (0,0875 mg/mL) | 0 minuto | 4,5% de gli vol./vol. AB | Durante a noite |
1. Ejaculados frescos foram obtidos de dez touros.
2. Ejaculados foram QCed, padronizados e corados de acordo com os procedimentos delineados no Exemplo
3. O controle do fluido de bainha foi conectado e o tanque de fluido de bainha foi pressurizado.
4. 2 tubos de captura de até 20 mL (ou 15 milhões de espermatozóides) foram triados em massa utilizando fluido de bainha (SF) a 0,0% de glicerol vol/vol.
5. Os tubos foram colocados em câmara fria por 90 minutos e 20mL de meio de congelamento (12% de glicerol vol./vol.) foram adicionados (adição em duas etapas).
6. O fluido de bainha de tratamento foi conectado e o tanque de fluido de bainha foi pressurizado.
7. Amostra corada colocada no citômetro de fluxo e atraso na gota verificado.
8. Um (1) tubo de captura de até 40 mL (ou 30 milhões de espermatozóides) foi triado em massa usando SF a 3,0% de glicerol vol/vol. alfa-ceto glutarato (AKG).
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 209/278 /105
9. Todos os tubos foram centrifugados e decantados.
10. AB foi adicionado a cada tubo:
1200 uL de AB a 6,0% de glicerol vol./vol. (Controle 1 e Controle 2)
1200 ul de AB a 4,5% de glicerol vol./vol. (Tie T2)
11. Os espermatozóides de controle 1 e TI mantidos por 2 horas em AB e, em seguida, criopreservados em canudos de IA (2 canudos por tratamento a 4 Mil., espermatozoide/canudo).
12. Controle 2 e T2 mantidos durante a noite em AB e, em seguida, criopreservados em canudos de IA (2 canudos por tratamento a 4 Mil., espermatozoide/canudo).
13. Motilidade às 0 e 3h (visual e IVOS), viabilidade (PI), PIA (PNA) e convergência (0h/3h) foram avaliados após o descongelamento. A motilidade em Ohr (visual e IVOS), a viabilidade e os PIAs são mostrados na Figura 29. Motilidade em 3h (visual e IVOS), viabilidade e PIAs são mostrados na Figura 30. Convergência (3hr/0hr) para motilidade, viabilidade e PIA são mostrados na Figura 31.
EXEMPLO 10 [000166] A Tabela 10 resume os tratamentos para o Exemplo 10.
Tabela 10.
| PADRÃO. | COLORAÇÃ O | Volume de captura | Volume de triagem | Gli. em SF | AKG | Tempo de arrefecimento | Meio de congelamento | Crioprotetor para congelamento | Tempo de retenção antes do | |
| Tl- Control e | MEIO DE RETENÇÃO (1:3) | TALP 2% EY (120 Mil./mL) | TRIS A (3,5mL) | 20mL (15 Mil, espermatozóide) | 0% vol./vol | Não | 90 minutos | Sim (12% de glicerol vol./vol.) | 6,0% de gli vol./vol. AB | 2 horas |
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 210/278 /105
| T2-SF a 3% de glicerol | TRIS A (7,0mL) | 40mL (30 Mil., espermatozóide) | 3% vol./vol | Sim (0,0875 mg/mL) | 0 minutos | Não | 4,5% de gli vol./vol. AB | 2 horas |
1. Ejaculados frescos foram obtidos de três touros.
2. Ejaculados foram QCed, padronizados e corados de acordo com os procedimentos delineados no Exemplo 1.
3. Fluido de bainha (sem glicerol) do Tratamento 1 (controle) foi conectado e o tanque do fluido de bainha foi pressurizado.
4. 4 tubos de captura de controle de até 20 mL (ou 15 milhões de espermatozóides) foram triados em massa.
5. Os tubos foram colocados em câmara fria por 90 minutos e 20mL de meio de congelamento (12% de glicerol vol./vol.) foram adicionados (adição em duas etapas).
6. O fluido de bainha de tratamento 2 (3% de glicerol vol./vol. com AKG) foi conectado e o tanque foi pressurizado.
7. 2 tubos de captura de até 40 mL (ou 30 milhões de espermatozóides) foram triados em massa.
8. Todos os tubos foram então centrifugados e decantados. Péletes para TI (4 tubos) foram consolidados. Péletes para T2 (2 tubos) foram consolidados.
9. AB foi adicionado a cada tubo:
AB a 6,0% de glicerol vol./vol. ao tratamento 1
AB a 4,5% de glicerol vol./vol. ao tratamento 2
10. Espermatozóides diluídos mantidos por 2 horas em AB e criopreservados em canudos de IA (4 Mil. de espermatozoide/canudo)
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 211/278 /105
11. 200 oócitos por tratamento foram então fertilizados via
FIV. Os resultados da FIV são mostrados na Figura 32.
EXEMPLO 11 [000167] O Exemplo 11 consiste num ensaio de campo para testar a taxa de concepção alcançada com o sêmen sexado, triado utilizando fluido de bainha compreendendo 3% de glicerol vol./vol. e 0,0875mg/mL de alfacetoglutarato. Foram utilizados 5 touros, e mais que 3000 novilhas (até a 3a lactação) que receberam de 1 a 3 inseminações IA com 90% de sêmen feminino triado por sexo.
[000168] Os resultados do Exemplo 11 são mostrados nas Figuras 33 e 34. A Figura 33 mostra a motilidade pós-descongelamento, a PIA, a convergência e a viabilidade dos espermatozóides utilizados no ensaio de campo. A Figura 34 mostra as taxas de concepção alcançadas.
EXEMPLO 12 [000169] O Exemplo 12 testou a eficácia de uma solução de glicerol diluído (criolizador) que, quando misturada com uma quantidade calculada de TRIS A (TRIS + 20% gema de ovo) torna-se AB, eliminando a necessidade de glicerol puro em laboratórios de separação de espermatozóide.
[000170] A Tabela 11 resume os tratamentos para o Exemplo 12.
Tabela 11.
| Glicerol (v/v) | ESTOQUE | EY % | mOsm | ||
| TRIS A EM GRAMAS | DE GLICEROL | TOTAL DE AB | |||
| 20% | 32,761 | 9,959 | 42,720 | 13.9 | 1077mOsm |
| 45% | 40,183 | 4,937 | 45,120 | 17,5 | 1084mOsm |
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 212/278 /105
| 65% | 43,325 | 3,715 | 47,040 | 18,3 | 1085mOsm |
| 100% | 47,628 | 2,772 | 50,400 | 19,1 | 1090m0sm |
1. Cinco ejaculados foram obtidos de um touro.
2. Ejaculados foram QCed, padronizados e corados de acordo com os procedimentos delineados no Exemplo 1.
3. 4 tubos de captura foram triados em massa utilizando fluido de bainha contendo 3,0% de glicerol vol./vol. + alfa-cetoglutarato (AKG).
4. Os tubos foram colocados em uma câmara fria por 15 minutos.
5. Todos os tubos foram centrifugados e decantados e os grânulos consolidados.
6. Os grânulos foram separados em 5 tubos contendo AB 4,5% de glicerol obtidos da seguinte forma:
CONTROLE - preparado com glicerol puro (100% v/v)
TRATAMENTO 1 - preparado com criolizador a 20%
TRATAMENTO 2 - preparado com criolizador a 45%
TRATAMENTO 3 - preparado com criolizador a 65%
7. Os espermatozóides foram mantidos durante a noite e congelados.
8. Executar motilidade em 0 e 3 h (visual e IVOS), viabilidade (PI) e PIA (PNA).
[000171] Os resultados do Exemplo 12 são mostrados na Figura 35, que mostram um efeito benéfico quando AB é preparado com criolizador (glicerol diluído) em vez de 100% de glicerol vol./vol.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 213/278 /105
EXEMPLO 13 [000172] A Tabela 12 resume os tratamentos para o Exemplo 13.
Tabela 12.
| Glicerol em Captura vol./vol. | Volume de Triagem | Glicerol em SF voL/vol. | Tempo de Arrefecimento | Meio de Congelamento | Crioprotetor | |
| Controle | 0% | 20mL(15 Mil.) | 0% | 90 minutos | Sim (12% de glicerol vol./vol.) | 6,0% de gli AB |
| Glicerol em Captura | 2,4% | 40mL (30 Mil.) | 3% | 15 minutos | Não | 4,5% de gli AB |
1. Ejaculados foram obtidos de 8 touros.
2. Ejaculados foram QCed, padronizados e corados de acordo com os procedimentos delineados no Exemplo 1.
3. CONTROLE - Fluido de Bainha (0,0% de Glicerol) foi usado no Triador A para os touros 1-4, e no triador B para os touros 5-8.
tubo de captura por touro até 20 mL (ou 15 milhões) foi triado em massa em Tris A (0,0% de Glicerol, Sem AKG).
Tubos foram colocados em uma câmara fria por 90 minutos. Meios de congelamento (12% de glicerol vol./vol.) foram adicionados após o arrefecimento.
4. TRATAMENTO - O fluido de bainha compreendendo 3,0% de glicerol e 0,0875mg/mL de AKG foi usado no Triador B para os touros 1-4, e no Triador A para os touros 5-8.
tubo de captura por touro até 40 mL (ou 30 milhões) foi triado em massa em fluido de captura compreendendo 2,4% de glicerol vol./vol.
Tubo foi colocado em uma câmara fria por 15 minutos.
5. Todos os tubos foram centrifugados e decantados.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 214/278 /105
6. Os seguintes foram adicionados aos tubos de controle e tubos de tratamento respectivamente:
AB a 6,0% de glicerol para tubos de CONTROLE
AB a 4,5% de glicerol em tubos de TRATAMENTO
7. Os espermatozóides foram mantidos por 12 horas (no período noturno) em AB e depois congelados.
8. Motilidade visual e IVOS às 0 e 3 horas, viabilidade (PI) e PIA (PNA) foram realizadas. Convergência foi calculada para cada parâmetro.
[000173] Os resultados do Exemplo 13 são mostrados na Figura 36.
EXEMPLO 14 [000174] O Exemplo 14 demonstra que tanto quanto 400 milimolar de Eritritol pode ser utilizado num diluente bovino fresco com bom suporte da motilidade do espermatozóide bovino ao longo de um período de 4 dias. Isto é com espermatozóide “convencional” (não triado) corados com Hoechst 33342 (para facilitar CASA usando fluorescência).
[000175] O diluente fresco é um meio similar a Caprogen, que contém 5% (v/v) de gema de ovo e é borbulhado com gás nitrogênio antes da diluição do espermatozóide.
[000176] O Caprogen com glicerol é um dos meios comparados neste Exemplo e é composto pelos seguintes componentes:
[000177] Citrato de Sódio Tribásico Dihidratado, 20,0 gramas, Ácido Cítrico Monohidratado, 0,25 gramas, Glicina, 10,0 gramas, D- (+)-Glicose, 3,0 gramas, Fosfato de Potássio Anidro Dibásico, 0,609 gramas, Ácido nHexanoico (ácido caproico), 0,231 mL, Cianocobalamina, 0,250 gramas,
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 215/278 /105 alfa-hidroglutarato di-hidratado dissódico, 0,35 gramas, Di-hidrato de Trealose, 0,750 gramas, Glicerol, 10,0 ml, Sulfato de Estreptomicina, 0,150 gramas, Gentamicina, 0,500 gramas, Tilosina, 0,100 gramas, Lincomicina, 0,300 gramas, Espectinomicina, 0,500 gramas, Gema de Ovo de Galinha, 5,0 mL.
[000178] O Caprogen com eritritol é outro meio comparado neste exemplo e é composto pelos seguintes componentes:
[000179] Citrato de Sódio Tribásico Dihidratado, 20,0 gramas, Ácido Cítrico Monohidratado, 0,225 gramas, Glicina, 8,653 gramas, D-(+)Glicose, 2,50 gramas, Fosfato de Potássio Dibásico Anidro, 0,609 gramas, Sal de Sódio e Ácido Hexanoico (ácido caproico), 0,276 gramas, Cianocobalamina, 0,250 gramas, Di-hidrato dissódico de alfa-cetoglutarato, Di-Hidrato de Trealose, 0,750 gramas, 0,35 gramas, Eritritol, 14,64 gramas, Sulfato de Estreptomicina, 0,150 gramas, Gentamicina, 0,500 gramas, Tilosina, 0,100 gramas, Lincomicina, 0,300 gramas, Espectinomicina, 0,500 gramas, Gema de Ovo de Galinha, 5,0mL.
[000180] Em Caprogen com glicerol, a concentração de glicina é de 135 milimolar e a concentração de glicerol é de 135 milimolar. O Meio de Controle 1 foi feito com estas mesmas concentrações, enquanto o equilíbrio dos meios de teste (Meios 2-7) foram feitos com as seguintes concentrações, como mostrado na Tabela 13.
Tabela 13.
| Concentração de A | Componentes de Meio Adicionados | ||
| Glicerol | Glicina | niM | |
| Meio | mMolar | mMolar | mMolar |
| 1 | 135 | 135 | 0 |
| 2 | 0 | 135 | 0 |
| 3 | 0 | 135 | 35 |
| 4 | 0 | 135 | 65 |
| 5 | 0 | 135 | 135 |
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 216/278 /105
| 6 | 0 | 135 | 270 |
| 7 | 0 | 135 | 400 |
[000181] Ejaculados bovinos frescos de 5 touros foram diluídos para 160 milhões de espermatozóides por mL em Coloração TALP, combinado com coloração de DNA Hoechst 33342, incubados 60 minutos a 34°C (como coloração padrão para classificação de espermatozóide XY). Uma vez corados, os espermatozóides em TALP foram diluídos no meio relacionado a uma nova concentração de 15 milhões de espermatozóides por mL e colocados em canudos de 0,25 cc, vedados e mantidos horizontalmente a 18°C por 4 dias. Em cada dia, um canudo de espermatozóide foi aquecido por 15 minutos a 34°C e o conteúdo de cerca de 200 microlitros do canudo foi combinado com 100 microlitros de meio fresco idêntico ao meio de teste especificado usado para manter o espermatozóide. Os espermatozóides foram analisados em CASA fluorescente (Hamilton Thome IVOS II) usando iluminação UV. A Motilidade Total e Progressiva média para os 5 touros está resumida na Tabela 14 e na Figura 37.
Tabela 14.
| DIAS DE RETENÇÃO | ||||||||
| NÚMERO DO | 2 | 3 | 4 | |||||
| MEIO | ||||||||
| Motilidade | Motilidade | Motilidade | Motilidade | Motilidade | Motilidade | Motilidade | Motilidade | |
| Total | Progressiva | Progressiva | Progressiva | Progressiva | Progressiva | Total | Progressiva | |
| 1 | 89% | 75% | 66% | 47% | 62% | 47% | 37% | 25% |
| 2 | 74% | 68% | 68% | 53% | 56% | 45% | 46% | 37% |
| 3 | 73% | 65% | 65% | 57% | 59% | 48% | 42% | 31% |
| 4 | 73% | 65% | 69% | 55% | 52% | 41% | 33% | 26% |
| 5 | 68% | 61% | 73% | 56% | 45% | 38% | 38% | 27% |
| 6 | 78% | 70% | 63% | 52% | 50% | 42% | 43% | 29% |
| 7 | 69% | 57% | 65% | 44% | 44% | 29% | 53% | 34% |
[000182] Este teste mostra que glicerol a 135 milimolar é benéfico para apoiar a motilidade dos espermatozóides por até 4 dias e que a substituição de glicerol por eritritol em meio fresco de Caprogen fornece suporte similar
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 217/278 /105 de motilidade espermática, com um benefício de eritritol aparecendo no período mais longo de 4 dias.
EXEMPLO 15 [000183] O Exemplo 15 demonstra que o glicerol na receita padrão de Caprogen para extensão de espermatozóide bovino triado armazenado durante até nove dias a 17°C pode ser substituído completamente por eritritol para criar armazenamento de espermatozóide com maior tempo quando são comparadas as motilidades visuais e de CASA. O Caprogen Padrão (com glicerol) é referido como “Caprogli” e o Caprogen contendo eritritol é referido como “CaproERY”.
[000184] Preparação do meio em volume de 100 mL: 95 mL da solução de trabalho do respectivo meio é combinada com 5 mL de gema de ovo, agitada por 15 minutos, mantida durante a noite a 4 °C, centrifugada por 60 minutos a 1200 G em Tubos Falcon de 50 mL (clarificados). No dia do uso, o gás nitrogênio é borbulhado através do meio clarificado por 15 minutos. A Tabela 15 mostra as propriedades das duas mídias.
Tabela 15.
| pH | mOsm | Glicina mM | Glicerol mM | Eritritol mM | |
| Caprogli | 7,01 | 512 | 133 | 133 | |
| CaproERY | 7,03 | 482 | 120 | 120 |
[000185] Triagem dos espermatozóides a serem mantidos nos dois diluentes frescos: Os Ejaculados Frescos de 3 touros Jersey são triados em massa de acordo com os métodos de triagem de sexo proprietários padrão divulgados em outras patentes. Em resumo, os espermatozóides são lavados, concentrados e ressuspensos em um diluente de Citrato TRIS tamponado com Hepes para normalizar a concentração para cerca de 1200 espermatozóides por mL e pH cerca de 7,15. Cada 1 mL de coloração
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 218/278 /105 compreende: 0,150 mL de solução espermática (cerca de 160 milhões de espermatozóides), 64 nanomoles de Hoechst 33342 em 8 microlitros, 592 mL de TALP de coloração e 100 nanomoles de corante alimentar FD&C. A amostra é incubada em um tubo de amostra de 4 mL a 34°C por 60 minutos após o qual 0,25 mL de 8% (v/v) de gema de ovo TALP, que dilui o espermatozóide para cerca de 120 milhões por mL e fornece uma concentração final de gema de ovo de 2% para a amostra a ser tríada.
[000186] Os espermatozóides recém-corados são triados em massa em taxas de eventos de cerca de 40.000 por segundo, em que a coleta seletiva significa coletar espermatozóides vivos com ambos os cromossomos X e Y, explicitamente, os espermatozóides triados são de qualidade equivalente aos espermatozóides padrão, mas não enriquecidos para sexo. 80 milhões de espermatozóides de cada um dos três touros Jersey são triados em um fluido de captura TRIS A, arrefecido por um mínimo de 90 minutos em um gabinete frio (temperatura típica 4-7°C), misturado em volumes iguais com uma solução de TRIS B que não é de gema de ovo, concentrado por centrifugação e recuperação de grânulos de espermatozóide e determinação da concentração final (espermatozóide concentrado) no intervalo de 100-115 milhões de espermatozóides por mL. 3 volumes de Caprogli ou CaproERY são então combinados com 1 volume de espermatozóide concentrado para uma concentração final formulada de cerca de 20-24 milhões por mL (cerca de 5,0-5,5 milhões de espermatozóides por canudo de 0,25 cc).
[000187] Os espermatozóides formulados são preenchidos em canudos de 0,25 cc, vedados e armazenados horizontalmente a 17°C por até nove dias. Nos dias de teste especificados, um canudo é aberto e verificado quanto à motilidade visual (contada a olho pelo técnico usando análise microscópica no estágio aquecido), motilidade total de CASA e motilidade progressiva de
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 219/278 /105
CASA usando um sistema Hamilton Thome IVOS. Além dos canudos, uma amostra de 0,50 mL de cada uma das seis amostras é armazenada em um tubo de amostra de 4 mL a 17°C para comparação no oitavo dia.
[000188] A Tabela 16 resume as médias de motilidade dos três touros Jersey em dias diferentes.
Tabela 16.
| Tratamento | DIA | Retido em | MOTILIDADE VISUAL | MOTILIDADE TOTAL DE CASA | MOTILIDADE PROG. DE CASA | PROG/TOT DE CASA |
| CaproERY | 1 | Canudo | 68% | 76% | 55% | 72% |
| Caprogli | 1 | Canudo | 68% | 73% | 53% | 73% |
| CaproERY | 2 | Canudo | 61% | 66% | 51% | 77% |
| Caprogli | 2 | Canudo | 58% | 61% | 44% | 72% |
| CaproERY | 3 | Canudo | 71% | 73% | 48% | 65% |
| Caprogli | 3 | Canudo | 68% | 64% | 45% | 69% |
| CaproERY | 4 | Canudo | 67% | 68% | 48% | 71% |
| Caprogli | 4 | Canudo | 51% | 51% | 35% | 68% |
| CaproERY | 7 | Canudo | 63% | 59% | 45% | 76% |
| Caprogli | 7 | Canudo | 33% | 39% | 29% | 74% |
| CaproERY | 8 | Canudo | 55% | 52% | 35% | 68% |
| Caprogli | 8 | Canudo | 23% | 16% | 4% | 28% |
| CaproERY | 8 | Tubo | 65% | 61% | 55% | 89% |
| Caprogli | 8 | Tubo | 31% | 30% | 11% | 38% |
| CaproERY | 9 | Canudo | 47% | 42% | 34% | 81% |
| Caprogli | 9 | Canudo | 20% | 9% | 2% | 23% |
[000189] Os resultados acima mostram que quando o princípio de ter molaridade igual de glicina e o poliol acompanhante (glicerol ou eritritol) é seguido, a substituição completa de glicerol por eritritol cria um diluente de sêmen fresco semelhante ao Caprogen que é tão bom ou melhor do que o produzido com glicerol. Para tempos de retenção superiores a 4 dias, o eritritol é melhor na preservação da qualidade, como visto na motilidade.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 220/278 /105
Parece também que o armazenamento em tubos pode ser melhor que canudos.
EXEMPLO 16 [000190] O Exemplo 16 demonstra que o espermatozóide triado por sexo armazenado num meio de Caprogen utilizando eritritol em vez de glicerol são capazes de criar várias gravidezes semelhantes às do Caprogen padrão.
[000191] A fim de pré-avaliar os possíveis resultados de fertilidade usando CaproERY como um substituto neste cenário onde Caprogli tem funcionado bem, um pequeno número (cerca de 145) novilhas foram criadas em quatro segmentos de tempo e comparadas com os dados dos mesmos touros nas mesmas fazendas usando espermatozóide triado por sexo armazenado em Caprogli. Tipicamente, com o sêmen fresco diluído, as novilhas são criadas dentro de 1-2 dias do dia de triagem e formulação.
[000192] A Tabela 17 abaixo resume os resultados para o teste de campo de pesquisa CaproERY.
| Total de Novilhas | Grávidas Totais | Percentual Grávida | |
| Caprogli | 277 | 159 | 57,4 |
| CaproERY | 145 | 77 | 53,1% |
[000193] Este teste de campo de pesquisa não utilizou um processamento dividido, não possui um número de canudos distribuídos uniformemente em cada tratamento e não é igualmente distribuído entre touros e fazendas. Assim, os valores nominais relativos (57,4% vs 53,1%) não são estatisticamente diferentes. Ambos os valores estão dentro do intervalo padrão visto para Caprogli durante o período de 40 meses e, consequentemente, o CaproERY dá fertilidade semelhante.
EXEMPLO 17
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 221/278 /105 [000194] O Exemplo 17 demonstra que o eritritol pode ser utilizado (com ou sem glicina) no fluido de bainha para os de diluentes de congelamento ou de triagem de espermatozóide em concentrações entre 15-110 mMolar e ser igual ou melhor ao meio de controle padrão sem eritritol.
[000195] A triagem de espermatozóide bovina padrão utiliza fluido de bainha compreendendo Frutose a 68 mM, Citrato a 80 mM e TRIS a 243 mM a pH 6,80 e osmolaridade de 290-300 mOsm. (Fluido de Bainha de CONTROLE). A combinação de 80 volumes desse fluido de bainha de controle com 20 volumes de gema de ovo fresco, seguido por resultados de clarificação, resulta em uma solução de arrefecimento de CONTROLE chamada TRIS A (a Fração A). Combinar 88 volumes de TRIS A com 12 volumes de glicerol puro cria uma solução chamada TRIS B (a Fração B). No caso da triagem padrão de espermatozóide, a Fração B pode conter opcionalmente gema de ovo e pode ser chamada de Fração B Sem Ovo ainda contendo 12 volumes de glicerol puro.
[000196] A Tabela 18 mostra as concentrações milimolares dos componentes utilizados neste teste, em que o meio de controle não contém qualquer glicina ou eritritol e as amostras de teste contêm várias quantidades de eritritol e, em alguns casos, glicina. O pH de todos os meios foi de 6,706,75 e a osmolaridade foi de 290-305 mOsm.
Tabela 18.
| Motilidade Visual | Concentrações em mM no congelamento. | ||||||
| Oh | 3h | mM | Glicina | Frutose | Citrato | TRIS | |
| CONTROLE | 36% | 27% | 0 | 0 | 54 | 64 | 194 |
| A | 42% | 34% | 51 | 50 | 30 | 35 | 106 |
| B | 40% | 24% | 108 | 0 | 30 | 36 | 109 |
| C | 42% | 31% | 53 | 46 | 30 | 35 | 105 |
| D | 42% | 36% | 35 | 34 | 30 | 43 | 130 |
| E | 54% | 35% | 25 | 0 | 51 | 45 | 138 |
| F | 37% | 31% | 14 | 14 | 30 | 63 | 190 |
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 222/278
100 /105
| G | 41% | 40% | 25 | 0 | 30 | 61 | 186 |
| Motilidade Visual | Concentração (mM) no fluido de bainha | ||||||
| Oh | 3h | mM | Glicina | Frutose | Citrato | TRIS | |
| CONTROLE | 35% | 23% | 0 | 0 | 68 | 80 | 243 |
| H | 35% | 28% | 62 | 0 | 61 | 33 | 102 |
| I | 47% | 28% | 35 | 35 | 8 | 75 | 235 |
| J | 47% | 37% | 65 | 0 | 8 | 72 | 223 |
[000197] Os mesmos dois touros foram usados para cada um dos dois testes e foram medidos para a qualidade pós-descongelamento ao mesmo tempo. O primeiro teste foi feito com espermatozóide não triado, não corado, similares ao padrão “congelamento convencional”. O segundo teste foi feito usando diferentes fluidos da bainha para triar espermatozóide.
[000198] O primeiro teste comparou o controle (meio padrão) a 7 meios alternativos (A-G) com composições incluindo várias quantidades de eritritol e, em alguns casos, glicina. 10 mililitros de espermatozóide de cada touro a uma concentração de 100 milhões de espermatozóides por mililitro foram arrefecidos em TRIS A padrão (meio de controle) ao longo de 90 minutos desde a temperatura ambiente até cerca de 4-6°C. As amostras foram então divididas em alíquotas de 1 mililitro e foram adicionados 0,5 mL de meio TEST-B frio, mantidos durante 15 minutos antes de ser adicionado mais 0,5 mL de meio TEST-B. Isso resultou em concentrações finais de espermatozóides de 50 milhões por mL. Essas amostras foram carregadas em canudos de criopreservação de 0,25 cc e congeladas em um método de congelamento de vapor controlado normalmente usado para congelar o sêmen convencional.
[000199] As concentrações de glicerol nos meios TEST-B foram sempre 6,0% (vol/vol) resultando em concentrações finais de glicerol de 3,0% (vol/vol). Todos os meios TEST-B apresentaram 0% de gema de ovo,
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 223/278
101 /105 resultando em concentrações finais de 10% de gema de ovo (vol/vol). As concentrações dos componentes químicos, no momento do congelamento, são mostradas na tabela (CONTROLE vs A-G). Essas condições arrefeciam os espermatozóides na quantidade padrão de gema de ovo (20%), criopreservando-os em x/i da quantidade padrão de gema de ovo e glicerol. Os resultados da motilidade visual mostram que, sob tais condições de controle, todos os 7 meios contendo eritritol suportavam a criopreservação, tão como ou melhor do que o controle sem qualquer eritritol. Os resultados mostram que até cerca de 110 mM de eritritol podem ser usados no congelamento de espermatozóides bovinos, com resultados ideais de congelamento sendo alcançados com 15-50 mM de eritritol.
[000200] O segundo teste comparou um fluido de bainha de CONTROLE (padrão) a três fluidos alternativos (H-J). As composições de todos os fluidos da bainha são mostradas na tabela. Após a triagem, todas as amostras foram manuseadas de maneira idêntica à triagem padrão de espermatozóides. Um volume de 3,5 mL de fluido de captura (TRIS A) é colocado em cada tubo de captura e os espermatozóides separados são classificados no tubo de captura para um volume de 20 mL. Aquele volume de fluido é então arrefecido durante 90 minutos a cerca de 4-6°C e depois é adicionado um volume igual de Fração sem Ovos B fria. As células de espermatozóide são concentradas por centrifugação e disposição do sobrenadante e ressuspensas em uma Fração AB de TRIS de gema de ovo preparada pela mistura de volumes iguais de Fração A e Fração B. As células foram formuladas para cerca de 18 milhões por mL e congeladas em canudos de 0,25 cc em um método de congelamento de vapor controlado normalmente usado para congelar o sêmen convencional (o mesmo que acima).
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 224/278
102 /105 [000201] Os resultados mostram que eritritol de até 60 mM pode estar presente no fluido de bainha e ser benéfico para a qualidade espermática no método padrão para tratamento pós-triagem de espermatozóide.
[000202] Como pode ser facilmente entendido do que precede, os conceitos básicos da presente invenção podem ser incorporados de uma variedade de diferentes maneiras. A invenção envolve numerosas e variadas modalidades de processamento de espermatozóide incluindo, mas não limitado ao melhor modo da invenção.
[000203] Assim, as modalidades ou elementos particulares da invenção divulgadas nesta descrição ou mostradas nas figuras ou tabelas que acompanham este pedido não tem a intenção de serem limitantes, mas sim exemplares de diversos e variadas modalidades englobadas genericamente pela invenção, ou equivalentes englobados no que diz respeito a qualquer elemento particular do mesmo. Além disso, a descrição específica de uma única modalidade ou elemento da invenção pode não explicitamente descrever todas as modalidades ou elementos possíveis; muitas alternativas são implicitamente divulgadas pela descrição e figuras.
[000204] Deve ser entendido que cada elemento de um aparelho, ou cada etapa de um método pode ser descrito por um termo de aparelho ou método de aparelho. Tais termos podem ser substituídos onde desejado para tornar explícito a cobertura vasta implícita para a qual esta invenção é intitulada. Apenas como um exemplo, deve ser entendido que todas as etapas de um método podem ser divulgadas como uma ação, um meio para executar aquela ação, ou como um elemento que causa aquela ação. De forma parecida, cada elemento de um aparelho pode ser divulgado como o elemento físico ou a ação que aquele elemento físico facilita. Apenas como um exemplo, a divulgação de classificador pode ser entendido como englobando a
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 225/278
103 /105 divulgação do ato de classificador — explicitamente discutido ou não — e, por outro lado, caso houve a divulgação efetiva do ato de classificar, tal divulgação deve ser entendida como englobando a divulgação de classificador, e até meios de classificação. Tais termos alternativos para cada elemento ou etapa devem ser entendidos para serem explicitamente incluídos na descrição.
[000205] Além disso, para cada termo usado deve ser entendido que, ao menos que sua utilização neste pedido seja inconsistente com tal aplicação, definições comuns de dicionários devem ser entendidas como sendo incluídas na descrição de cada termo, como contidos no Random House Webster's Unabridged Dictionary, segunda edição, com cada definição aqui incorporada por referência.
[000206] Além disso, para os fins da presente invenção, o termo a ou uma entidade refere-se a uma ou mais dessa entidade. Como tal, os termos um ou uma, um ou mais e pelo menos um podem ser usados de forma permutável neste documento.
[000207] Todos os valores numéricos neste documento são assumidos como sendo modificados pelo termo cerca de , sendo ou não sendo explicitamente indicado. Para os fins da presente invenção, os intervalos podem ser expressos a partir de cerca de um valor particular até cerca de outro valor particular. Quando um tal intervalo é expresso, uma outra modalidade inclui do valor determinado a outro valor determinado. A recitação dos intervalos numéricos por pontos de extremidade inclui todos os valores numéricos incluídos dentro desse intervalo. Um intervalo numérico de um a cinco inclui, por exemplo, os valores numéricos 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5 e assim por diante. Deverá ser compreendido ainda que os pontos finais de cada um dos intervalos são significativamente em relação
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 226/278
104 /105 ao outro final e independentemente do outro ponto final. Quando um valor é expresso como uma aproximação através do uso do antecedente cerca de, será entendido que o valor particular forma outra modalidade.
[000208] A seção de fundo deste pedido de patente fornece uma declaração do campo de atuação a qual a invenção pertence. Esta seção também pode incorporar ou conter a paráfrase de certas patentes, pedidos de patente, publicações, ou assuntos dos Estados Unidos da invenção reivindicada, úteis para relatar informação, problemas, ou preocupações acerca do estado da tecnologia para o qual a invenção é direcionada. Não se intende que qualquer patente, pedido de patente, publicação, declaração ou informação dos Estados Unidos citado ou incorporado neste documento seja interpretada, construída, ou considerada como técnica prévia no que diz respeito a invenção.
[000209] As reivindicações estabelecidas nesta especificação, se for o caso, são aqui incorporadas por referência como parte da descrição da invenção, e o requerente expressamente reserva o direito de usar todos ou uma parte do conteúdo incorporado de tais reivindicações como descrições adicionais para apoiar qualquer ou todas as reivindicações ou elementos ou componentes dos mesmos, e o requerente ainda expressamente reserva o direito de mover qualquer parte ou todo o conteúdo incorporado para tais reivindicações ou qualquer elemento ou componente do mesmo, da descrição às reivindicações, ou vice versa, como necessário para definir a matéria a qual a proteção é buscada por esta aplicação, ou qualquer pedido ou continuação subsequente, divisão, ou continuação parcial de um pedido do mesmo, ou para obter qualquer benefício de, a redução em taxas nos termos de, ou em conformidade com as leis, regras ou regulamentos de patentes de qualquer país ou tratado, e tal conteúdo
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 227/278
105 /105 incorporado por referência deve sobreviver durante toda a pendência deste pedido, incluindo qualquer continuação, divisão ou continuação de pedido da mesma, ou qualquer reedição ou extensão nos mesmos.
Claims (76)
1. Meio de coloração de espermatozóide caracterizado pelo fato de que compreende:
um tampão;
um corante seletivo para DNA; e um crioprotetor.
2. Meio de coloração de espermatozóide, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o crioprotetor compreende um poliálcool, amida de peso molecular baixo ou metilamida.
3. Meio de coloração de espermatozóide, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o crioprotetor compreende um poliálcool.
4. Meio de coloração de espermatozóide, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o poliálcool compreende um álcool de açúcar selecionado do grupo que consiste em: etilenoglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galatitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; um glicilglicitol e suas combinações.
5. Meio de coloração de espermatozóide, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o poliálcool compreende um glicol selecionado do grupo que consiste em: propilenoglicol, butano triol e combinações respectivas.
6. Meio de coloração de espermatozóide, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um antioxidante selecionado do grupo consistindo em: vitamina BI2; vitâmeros de vitamina B12; vitamina E; vitâmeros de vitamina E; tocoferol; tocotrienol; a-tocoferil; alfa-cetoglutarato; seus derivados e suas combinações.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 229/278
2/15
7. Meio de coloração de espermatozóide, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais componentes selecionados do grupo consistindo em: HEPES, Bicarbonato de Sódio, BSA, gema de ovo, MOPS, TRIS, TES, TALP, TCA, PBS, leite, seus derivados e combinações dos mesmos.
8. Meio de coloração de espermatozóide, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o corante seletivo para DNA compreende Hoechst 33342.
9. Meio de coloração de espermatozóide, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que Hoechst 33342 está presente no meio de coloração a uma concentração de: entre cerca de 10 pM e cerca de 200 pM; entre cerca de 20 pM e cerca de 100 pM; ou entre cerca de 30 pM e cerca de 70 pM.
10. Meio de coloração de espermatozóide, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreende ainda um meio de coloração de espermatozóide incubado a uma temperatura de: entre cerca de 30°C e cerca de 39°C; entre cerca de 32°C e cerca de 37°C; ou a cerca de 34°C.
11. Meio de coloração de espermatozóide, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de coloração compreende o crioprotetor a uma concentração vol./vol. ou peso/vol. entre cerca de 0,1% e cerca de 1%; entre cerca de 1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 3%; entre cerca de 3% e cerca de 4%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; ou entre cerca de 1,5% e cerca de 3%.
12. Método de processamento de espermatozóide caracterizado pelo fato de que compreende:
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 230/278
3/15 coloração de uma amostra de espermatozóide que tem espermatozóide com cromossomo X viável e espermatozóide com cromossomo Y viável com um meio de coloração;
contato da amostra de espermatozóide corada com um fluido de cobertura em um caminho de fluxo; e manipular uma razão de espermatozóide com cromossomo X viável para espermatozóide com cromossomo Y viável para formar pelo menos uma população de espermatozóide manipulada;
em que um ou mais do fluido de bainha e o meio de coloração compreendem um crioprotetor.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de coletar a população de espermatozóide manipulada em um meio de coleta.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o meio de coleta compreende uma quantidade de crioprotetor.
15. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que cada um dos meios de coloração, o fluido de revestimento e o meio de coleta incluem uma quantidade de crioprotetor.
16. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a etapa de manipulação de uma razão de espermatozóide com cromossomo X viável para espermatozóide com cromossomo Y viável para formar pelo menos uma população de espermatozóide manipulada compreende ainda selecionar espermatozóide para separação e coleta ou para fotodano e coleta.
17. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de congelar a amostra de espermatozóide manipulada.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 231/278
4/15
18. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ou mais das seguintes etapas de processamento: reter; transportar; tamponar; refrigerar; aquecer; diluir; concentrar; excitar com um laser; carregar; defletir; ablar; coletar; agitar; oscilar; separar magneticamente; oxigenar; marcar; precipitar; centrifugar; ressuspender; misturar; diálise; criostabilizar; fazer processamento de microchip; e fazer processamento de citometria de fluxo.
19. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a etapa de processamento e a etapa de colocar a amostra de espermatozóide corada em contato com um fluido de bainha compreende ainda:
injetar a amostra de espermatozóide corada em um fluxo de fluido de bainha;
expor a amostra de espermatozóide corada no fluxo do fluido de bainha a uma fonte de radiação eletromagnética que provoca uma resposta detectável no corante seletivo para DNA;
detectar a resposta do corante seletivo para DNA à exposição à radiação eletromagnética;
analisar a resposta detectada;
classificar o espermatozóide na amostra de espermatozóide com base na análise da resposta detectada; e coletar uma ou mais subpopulações viáveis de espermatozóide da amostra de espermatozóide em um ou mais meios de coleta com base na classificação do espermatozóide.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de defletir eletromagneticamente gotículas contendo espermatozóide com base na classificação.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 232/278
5/15
21. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o crioprotetor compreende um poliálcool selecionado do grupo que consiste em: etilenoglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galatitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; um glicilglicitol e suas combinações.
22. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o crioprotector compreende um poliálcool selecionado do grupo consistindo em: propilenoglicol, butanotriol e combinações destes.
23. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que, pelo menos, um dos fluidos de bainha e meio de coloração compreende ainda um antioxidante.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o antioxidante compreende ainda um antioxidante selecionado do grupo consistindo em: piruvato; vitamina B12; vitâmeros de vitamina BI2; vitamina E; vitâmeros de vitamina E; tocoferol; tocotrienol; a-tocoferil; alfa-cetoglutarato; seus derivados e suas combinações.
25. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o fluido de bainha compreende o agente crioprotetor a uma concentração vol./vol. ou peso/vol. entre cerca de 0,1% e cerca de 6%.
26. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o fluido de bainha compreende um crioprotetor a uma concentração de vol./ vol. ou peso/vol. concentração entre cerca de 0,1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; entre cerca de 4% e cerca de 6%; entre cerca de 1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 3%; entre cerca de 3% e cerca de 4%; entre cerca de 4% e cerca de
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 233/278
6/15
5%; entre cerca de 5% e cerca de 6%; entre cerca de 2% e cerca de 6%; ou entre cerca de 3% e cerca de 5%.
27. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o fluido de bainha compreende uma solução salina tamponada com fosfatos, citrato TRIS ou HEPES.
28. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o crioprotetor é adicionado ao meio de coloração numa primeira quantidade e adicionado ao fluido de bainha numa segunda quantidade e em que a segunda quantidade é maior do que a primeira quantidade.
29. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o meio de coloração compreende o agente crioprotetor a uma concentração vol./vol. ou peso/vol. entre cerca de 0,1% e cerca de 5%.
30. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o meio de coloração compreende o crioprotetor a uma concentração vol./vol. ou peso/vol. entre cerca de 0,1% e cerca de 1%; entre cerca de 1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 3%; entre cerca de 3% e cerca de 4%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; ou entre cerca de 1,5% e cerca de 3%.
31. Sistema caracterizado pelo fato de que compreende:
uma fonte de amostra contendo uma amostra de espermatozóide;
uma fonte de bainha contendo fluido de bainha tendo um crioprotector;
uma estrutura de distribuição de fluido que gera um fluxo coaxial de amostra de espermatozóide da fonte de amostra cercada por fluido de revestimento da fonte de fluido de revestimento, em que o referido
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 234/278
7/15 sistema de distribuição de fluido direciona o fluxo coaxial através de um local de interrogação;
uma fonte de radiação eletromagnética que ilumina o espermatozóide no local de interrogação;
pelo menos um detector que gera sinais em resposta à iluminação do espermatozóide no local de interrogação;
um analisador que determina as características do espermatozóide com base nos sinais produzidos pelo detector pelo menos.
32. Sistema, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a estrutura de distribuição de fluido compreende um bocal.
33. Sistema, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a estrutura de distribuição de fluido compreende um canal de fluxo.
34. Sistema, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um seletor para selecionar espermatozóide com base nas características de espermatozóide determinadas.
35. Sistema, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o seletor compreende:
um oscilador para perturbar o fluxo coaxial em gotículas;
um pino de carga para carregar, formando gotículas contendo espermatozóide com base nas características determinadas de espermatozóide;
placas de deflexão carregadas e posicionadas para desviar gotículas de acordo com a carga transmitida nas gotas pelo pino de carga.
36. Sistema, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o seletor compreende: um laser de ablação
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 235/278
8/15 que seleciona espermatozóide com base nas características de espermatozóide determinadas.
37. Sistema, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o crioprotetor compreende um poliálcool selecionado do grupo que consiste em: etilenoglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galatitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; um glicilglicitol e suas combinações.
38. Sistema, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o crioprotetor compreende um poliálcool selecionado do grupo consistindo em: propilenoglicol, butanotriol e combinações destes.
39. Sistema, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o fluido de bainha compreende um antioxidante.
40. Sistema, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o antioxidante compreende ainda um antioxidante selecionado do grupo consistindo em: vitamina BI2; vitâmeros de vitamina B12; vitamina E; vitâmeros de vitamina E; tocoferol; tocotrienol; a-tocoferil; alfa-cetoglutarato; seus derivados e suas combinações.
41. Fluido de bainha, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que compreende ainda citrato TRIS, citrato, ácido cítrico, ácido cítrico monohidratado ou citrato de sódio.
42. Sistema, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o fluido de bainha compreende o agente crioprotetor a uma concentração vol./vol. ou peso/vol. entre cerca de 0,1% e cerca de 6%.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 236/278
9/15
43. Sistema, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o fluido de bainha compreende um crioprotetor a uma concentração de vol./ vol. ou peso/vol. concentração entre cerca de 0,1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; entre cerca de 4% e cerca de 6%; entre cerca de 1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 3%; entre cerca de 3% e cerca de 4%; entre cerca de 4% e cerca de 5%; entre cerca de 5% e cerca de 6%; entre cerca de 2% e cerca de 6%; ou entre cerca de 3% e cerca de 5%.
44. Sistema, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o fluido de bainha compreende uma solução salina tamponada com fosfatos, TRIS citrato ou HEPES.
45. Método de processar espermatozóide caracterizado pelo fato de que compreende:
corar uma amostra de espermatozóide com um meio de coloração com um corante seletivo para DNA;
injetar a amostra de espermatozóide corada em um fluxo de fluido de bainha;
expor a amostra de espermatozóide corada no fluxo do fluido de bainha a uma fonte de radiação eletromagnética que provoca uma resposta detectável no corante seletivo para DNA;
detectar a resposta do corante seletivo para DNA à exposição à radiação eletromagnética;
manipulação de uma razão de espermatozóide com cromossomo X viável para espermatozóide com cromossomo Y viável para formar pelo menos uma população de espermatozóide manipulada; e coletar pelo menos uma população de espermatozóide manipulada em um ou mais recipientes de coleta possuindo meios de coleta;
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 237/278
10/15 em que um ou mais dos meios de coloração, fluido de bainha e meio de coleta incluem um crioprotetor.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que cada um dos meios de coloração, fluido de bainha e meio de coleta inclui um crioprotetor.
47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o meio de coloração compreende uma primeira quantidade de crioprotetor, o fluido de bainha compreende uma segunda quantidade de crioprotetor e o meio de coleta compreende uma terceira quantidade de crioprotetor.
48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a primeira quantidade de crioprotetor é menor do que a segunda quantidade de crioprotetor e a terceira quantidade de crioprotetor.
49. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a terceira quantidade de crioprotetor é superior à primeira quantidade de crioprotetor e à segunda quantidade de crioprotetor.
50. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o crioprotetor compreende um poliálcool selecionado do grupo que consiste em: etilenoglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galatitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; um glicilglicitol e suas combinações.
51. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o crioprotector compreende um poliálcool selecionado do grupo consistindo em: propilenoglicol, butanotriol e combinações destes.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 238/278
11/15
52. Método, de acordo com a reivindicação45, caracterizado pelo fato de que, pelo menos, um dos fluidos de bainha, meio de coloração e meio de coleta compreende ainda um antioxidante.
53. Método, de acordo com a reivindicação52, caracterizado pelo fato de que o antioxidante compreende aindaum antioxidante selecionado do grupo consistindo em: vitamina BI2; vitâmeros de vitamina B12; vitamina E; vitâmeros de vitamina E; tocoferol; tocotrienol; a-tocoferil; alfa-cetoglutarato; seus derivados e suas combinações.
54. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos fluidos da bainha, meio de coloração e meios de coleta compreendem ainda citrato, ácido cítrico, ácido cítrico monohidratado ou citrato de sódio.
55. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o fluido de bainha compreende o agente crioprotetor a uma concentração vol./vol. ou peso/vol. entre cerca de 0,1% e cerca de 6%.
56. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o fluido de bainha compreende um crioprotetor a uma concentração de vol./ vol. ou peso/vol. entre cerca de 0,1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; entre cerca de 4% e cerca de 6%; entre cerca de 1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 3%; entre cerca de 3% e cerca de 4%; entre cerca de 4% e cerca de 5%; entre cerca de 5% e cerca de 6%; entre cerca de 2% e cerca de 6%; ou entre cerca de 3% e cerca de 5%.
5 7. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o meio de coloração compreende o crioprotetor a uma concentração vol./vol. ou peso/vol. entre cerca de 0,1% e cerca de 1%; entre
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 239/278
12/15 cerca de 1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 3%; entre cerca de 3% e cerca de 4%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; ou entre cerca de 1,5% e cerca de 3%.
58. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o meio de coleta compreende o crioprotetor em uma concentração vol./vol. ou peso/vol. entre cerca de 1% e cerca de 2%; entre cerca de 2% e cerca de 4%; entre cerca de 4% e cerca de 6%; entre cerca de 3% e cerca de 5%; ou entre cerca de 3,5% e cerca de 5,5%; ou a cerca de 4,5%.
59. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o fluido de bainha compreende uma solução salina tamponada com fosfatos, citrato TRIS ou HEPES.
60. Método de congelamento de uma amostra de espermatozóide manipulada caracterizado pelo fato de que compreende:
colocar uma amostra de espermatozóide corada em contato com um fluido de bainha num caminho de fluxo;
manipular a razão de espermatozóide com cromossomo X viável para espermatozóide com cromossomo Y viável para formar pelo menos uma população de espermatozóide manipulada;
coletar a amostra de espermatozóide manipulada na presença de um crioprotetor;
concentrar a amostra de espermatozóide coletada;
ressuspender a amostra de espermatozóide concentrada em um diluente de congelamento; e congelar a amostra de espermatozóide ressuspensa.
61. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de congelar
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 240/278
13/15 espermatozóide por um período de 120 minutos ou um período de menos de 120 minutos.
62. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a etapa de coleta de uma mistura compreende ainda: coletar a mistura num recipiente.
63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que etapa de coletar uma mistura compreende ainda: coletar a mistura num recipiente que tem entre cerca de 5 ml e cerca de 50 ml de meio de coleta.
64. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que a etapa de coletar uma mistura compreende ainda a coleta de uma amostra de espermatozóide separada de um citômetro de fluxo até o recipiente ser enchido com entre cerca de 60% e cerca de 90% da capacidade dos recipientes.
65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a etapa de concentrar a mistura coletada é realizada num recipiente.
66. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a etapa de concentração da amostra de espermatozóide coletada segue a etapa de coleta da amostra de espermatozóide manipulada na presença de um crioprotetor sem que ocorra qualquer outra diluição entre as etapas.
67. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o diluente de congelamento compreende menos de 6% de crioprotector vol./vol. ou peso/vol.
68. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o diluente de congelamento compreende entre 3,5% e 5,5% de crioprotetor vol./vol. ou peso/vol.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 241/278
14/15
69. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o diluente de congelamento compreende entre 4% e 5% de crioprotector vol./vol. ou peso/vol.
70. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a mistura ressuspensa é retida entre 2 horas e 18 horas antes do recongelamento.
71. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a etapa de coletar a amostra de espermatozóide manipulada na presença de um crioprotetor compreende ainda adicionar crioprotetor à amostra de espermatozóide durante a etapa de coloração.
72. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a etapa de coleta da amostra de espermatozóide manipulada na presença de crioprotetor ainda compreende adicionar crioprotetor ao fluido de bainha que é coletado junto à amostra de espermatozóide na etapa de coleta.
73. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que etapa de coleta da amostra de espermatozóide manipulada na presença de um crioprotector compreende ainda a coleta da amostra de espermatozóide manipulada num recipiente tendo um meio de coleta, compreendendo o meio de coleta um crioprotector.
74. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a etapa de coleta da amostra de espermatozóide manipulada na presença de um crioprotector compreende ainda a incorporação de crioprotetor em um ou mais de: um meio de coloração usado para corar uma amostra de espermatozóide, o fluido de bainha e o meio de coleção.
Petição 870190066007, de 12/07/2019, pág. 242/278
15/15
75. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a etapa de manipular uma razão de espermatozóide com cromossomo X viável para cromossomo Y viável para formar pelo menos uma população de espermatozóide manipulada compreende ainda a classificação de células no caminho de fluxo e a seleção de espermatozóide com base na sua classificação.
76. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pela etapa de manipulação de uma razão de espermatozóide com cromossomo X viável para espermatozóide com cromossomo Y viável para formar pelo menos uma população de espermatozóide manipulada compreende ainda formar gotículas que se espera contenham espermatozóide selecionado e defletir essas gotículas para coleta ou espermatozóide fotodanificante selecionado no caminho de fluxo.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762448829P | 2017-01-20 | 2017-01-20 | |
| US62/448,829 | 2017-01-20 | ||
| US201762584557P | 2017-11-10 | 2017-11-10 | |
| US62/584,557 | 2017-11-10 | ||
| PCT/US2018/014474 WO2018136772A1 (en) | 2017-01-20 | 2018-01-19 | Sperm processing method, apparatus and related media compositions |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112019014499A2 true BR112019014499A2 (pt) | 2020-02-11 |
Family
ID=62905933
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR112019014499-4A BR112019014499A2 (pt) | 2017-01-20 | 2018-01-19 | Meio de coloração de espermatozoide, método de processamento de espermatozoide, método de congelamento de uma amostra de espermatozoide manipulada, e, sistema. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11279913B2 (pt) |
| EP (2) | EP3570853B1 (pt) |
| CN (2) | CN114732007B (pt) |
| BR (1) | BR112019014499A2 (pt) |
| CA (2) | CA3049264C (pt) |
| NZ (1) | NZ755215A (pt) |
| WO (1) | WO2018136772A1 (pt) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109329272B (zh) * | 2018-11-23 | 2020-03-03 | 北京太东生物科技有限公司 | 一种精子冻存液及其制备方法和应用 |
| US20200291351A1 (en) * | 2019-03-12 | 2020-09-17 | Inguran, Llc | Methods for sex-sorting sperm |
| CN111781128B (zh) * | 2020-06-15 | 2023-07-07 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | 一种尿分析仪用鞘液及其制备方法 |
Family Cites Families (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3185623A (en) | 1960-05-31 | 1965-05-25 | Smith Fred | Preservation of animal semen |
| DE69028526T2 (de) | 1989-05-10 | 1997-02-06 | The United States of America, represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, Washington, D.C. | Verfahren zur vorwahl des geschlechts der nachkommenschaft |
| CA2248981C (en) * | 1996-03-15 | 2009-11-24 | The Penn State Research Foundation | Detection of extracellular tumor-associated nucleic acid in blood plasma or serum using nucleic acid amplification assays |
| US6071689A (en) | 1997-12-31 | 2000-06-06 | Xy, Inc. | System for improving yield of sexed embryos in mammals |
| US6149867A (en) * | 1997-12-31 | 2000-11-21 | Xy, Inc. | Sheath fluids and collection systems for sex-specific cytometer sorting of sperm |
| US7208265B1 (en) | 1999-11-24 | 2007-04-24 | Xy, Inc. | Method of cryopreserving selected sperm cells |
| IL152714A (en) | 2000-05-09 | 2014-03-31 | Xy Llc | High-purity spermatozoa populations carrying chromosome-x and chromosome-y |
| US20050064383A1 (en) * | 2000-11-22 | 2005-03-24 | Bashkin James K. | Methods and apparatus for producing gender enriched sperm |
| EP1545203B1 (en) * | 2002-08-01 | 2016-10-19 | Xy, Llc | Low pressure sperm cell separation system |
| US8486618B2 (en) * | 2002-08-01 | 2013-07-16 | Xy, Llc | Heterogeneous inseminate system |
| EP3511693B1 (en) * | 2003-03-28 | 2022-08-24 | Inguran, LLC | Apparatus for detecting the breakoff point of a droplet generation system |
| AU2004242121B2 (en) | 2003-05-15 | 2010-06-24 | Xy, Llc. | Efficient haploid cell sorting for flow cytometer systems |
| WO2005095960A1 (en) | 2004-03-29 | 2005-10-13 | Monsanto Technology Llc | Use of a composition which regulates regulates oxidation/reduction reactions intracellularly and/or extracellularly in a staining or sorting process of spermatozoa |
| CN101014350A (zh) * | 2004-03-29 | 2007-08-08 | 孟山都技术公司 | 用于授精的精子悬浮液 |
| BRPI0823085B8 (pt) | 2008-08-21 | 2021-07-27 | Xy Llc | aparelho de análise de célula e método de retroassentamento de citômetro de fluxo |
| WO2011097032A1 (en) | 2010-02-05 | 2011-08-11 | Cytonome/St, Llc | Multiple flow channel particle analysis system |
| US20130011825A1 (en) | 2010-04-01 | 2013-01-10 | Inguran, Llc | Methods and systems for reducing dna fragmentation in a processed sperm sample |
| CA2837340C (en) * | 2011-06-01 | 2019-08-06 | Inguran, Llc | Compositions and methods for improving the quality of processed sperm |
| WO2013049631A1 (en) | 2011-09-30 | 2013-04-04 | Inguran, Llc | Sperm staining and sorting methods |
| EP2903432B1 (en) * | 2012-10-05 | 2019-05-08 | Inguran, LLC | Methods of processing sperm for sex sorting |
| CA2905670A1 (en) * | 2014-09-26 | 2016-03-26 | Inguran, Llc | Sex sorted sperm demonstrating a dose response and methods of producing sex sorted sperm demonstrating a dose response |
| CA2968414C (en) * | 2014-11-20 | 2023-10-03 | Inguran, Llc | Low sugar sperm media and compositions |
| RU2605616C1 (ru) | 2015-11-27 | 2016-12-27 | Закрытое акционерное общество "Институт экспериментальной фармакологии" | Липосомальное средство на основе убихинола и способ его получения |
-
2018
- 2018-01-19 US US15/875,679 patent/US11279913B2/en active Active
- 2018-01-19 CA CA3049264A patent/CA3049264C/en active Active
- 2018-01-19 CN CN202210527737.3A patent/CN114732007B/zh active Active
- 2018-01-19 WO PCT/US2018/014474 patent/WO2018136772A1/en unknown
- 2018-01-19 EP EP18742360.3A patent/EP3570853B1/en active Active
- 2018-01-19 EP EP24190465.5A patent/EP4445731A2/en active Pending
- 2018-01-19 NZ NZ755215A patent/NZ755215A/en unknown
- 2018-01-19 CA CA3210334A patent/CA3210334A1/en active Pending
- 2018-01-19 CN CN201880007247.2A patent/CN110177461B/zh active Active
- 2018-01-19 BR BR112019014499-4A patent/BR112019014499A2/pt unknown
-
2022
- 2022-02-07 US US17/666,325 patent/US20220186182A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2019125565A3 (pt) | 2021-02-20 |
| NZ755215A (en) | 2022-02-25 |
| US20220186182A1 (en) | 2022-06-16 |
| EP3570853A1 (en) | 2019-11-27 |
| US11279913B2 (en) | 2022-03-22 |
| CA3049264C (en) | 2023-09-26 |
| US20180208894A1 (en) | 2018-07-26 |
| CN114732007B (zh) | 2024-04-12 |
| CN110177461B (zh) | 2022-05-31 |
| CN114732007A (zh) | 2022-07-12 |
| RU2019125565A (ru) | 2021-02-20 |
| CN110177461A (zh) | 2019-08-27 |
| EP3570853A4 (en) | 2020-09-09 |
| CA3049264A1 (en) | 2018-07-26 |
| EP3570853B1 (en) | 2024-07-24 |
| CA3210334A1 (en) | 2018-07-26 |
| WO2018136772A1 (en) | 2018-07-26 |
| EP4445731A2 (en) | 2024-10-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2316080C (en) | Sex-specific insemination of mammals with low number of sperm cells | |
| US7195920B2 (en) | Collection systems for cytometer sorting of sperm | |
| US20220186182A1 (en) | Sperm processing method, apparatus and related media compositions | |
| ES2927721T3 (es) | Procedimientos de tratamiento del esperma para la clasificación del sexo | |
| US20230097054A1 (en) | Low sugar sperm media and compositions | |
| RU2775530C2 (ru) | Способ обработки спермы, аппарат и связанные композиции сред | |
| AU2003213537B2 (en) | Sex-specific insemination of mammals with low number of sperm cells | |
| BR132015024816E2 (pt) | dose de inseminação de sexo selecionado e método de produção de espermatozoides selecionados quanto ao sexo | |
| GB2381005A (en) | An improved flow cytometer system for isolating desired cells | |
| AU2007200700A1 (en) | Sex-specific insemination of mammals with low number of sperm cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B350 | Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette] |