CN114732007B - 精子处理方法、装置和有关介质组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及精子处理方法、装置和有关介质组合物。本发明的实施方案一般涉及可用于操纵至少一个精子群体中带有活的X染色体的精子与带有活的Y染色体的精子的比率并且可用于保藏所得操纵的精子群体的方法、系统和组合物。在一些实施方案中，可将冷冻保护剂可并入用于操纵所述精子样品的各种介质中，例如并入染色介质、鞘液和收集介质中。
Description
本申请是申请号为201880007247.2(国际申请号PCT/US2018/014474)、国际申请日为2018年01月19日、发明名称为“精子处理方法、装置和有关介质组合物”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
通常，本公开涉及处理精子，并且更特别地涉及可用于操纵至少一个精子群体中带有活的X染色体的精子与带有活的Y染色体的精子的比率并且可用于保藏所得操纵的精子群体的方法、系统和组合物。
背景技术
雄性单倍体配偶子的染色体含量决定哺乳动物后代的性别。更特定来说，用带有Y染色体的精子对卵母细胞进行受精产生雄性后代，并且用带有X染色体的精子受精产生雌性后代。虽然已经研究了许多技术用于预先确定哺乳动物后代的性别，但仅流式细胞术分选得到广泛的商业认可。
修改用于精子分选的流式细胞计数器检测带有X染色体的精子与带有Y染色体的精子的DNA含量的相对差异。为了测量精子的DNA含量，通常用结合至核DNA的DNA选择性荧光染料对精子群体进行染色。一种所述DNA选择性荧光染料Hoechst 33342(有时称为Hoechst双苯甲亚胺33342)可以足够的量使用以区分核DNA中的小变化而不展现其他染料的毒性。
带有X染色体的精子与带有Y染色体的精子之间的这些相对差异通常是小的变化。例如，在牛中，荷斯坦公牛的DNA含量差异约为3.8％，而泽西公牛的差异约为4.1％。由于化学计量DNA染色的不精确性质，这些小的差异难以确定。精子样品、即使是单一品种内的样品，其浓度、pH值、运动率和形态也会有很大变化。因此，在一种情况下运作良好的染色条件可能会对其他精子样品、甚至从同一品种或甚至从同一动物收集的精子样品染色不足或染色过度。精子的形状在区分带有X染色体和Y染色体的细胞方面产生了额外的困难。具体来说，含有核DNA的精子头在大多数物种中大致呈桨状。该几何学通过以不同角度产生不同水平的荧光发射而呈现额外的混淆效应，并且这些差异超过带有X染色体的精子和Y染色体中的可检测差异。大多数精子分选流式细胞计数器包括侧面检测器来确定精子定向，和定向喷嘴以便为精子提供更均匀的定向。
尽管存在这些困难，但Hoechst 33342可以无毒浓度使用。不幸的是，染色过程对非再生的、时间关键的细胞是有害的。用Hoechst 33342均匀染色需要在升高的温度和升高的pH值下培育，并且升高精子温度和升高精子pH值都会导致精子损害。一旦染色，精子在流式细胞计数器中所经受的压力可能对精子造成额外的损害，并且相关的剪切力可能造成更多的损害。
精子的有限寿命经常需要冷冻进行储存和运输。在此过程中从细胞中去除细胞内液体(包括水)，以减少冷冻的细胞内流体的体积。否则，细胞内流体将结晶并从其液体体积增量。这种增量导致对精子的细胞内应力和机械损害，并降低精子生育力。许多冷冻保护剂可能适用于此目的，其中最常见的是甘油。然而，即使甘油也存在许多缺点。举例来说，甘油对精子有一定程度的毒性，其效应可能会随着更大量的甘油而变得更加明显。此外，甘油可能对精子高渗，这可能会对已添加甘油的精子造成一定程度的冲击。由于跨精子细胞膜的溶质浓度的差异，所述高渗性质可能导致精子与甘油接触而迅速收缩或增量。所述迅速收缩和增量可能会对精子造成损害。这种毒性和损害特别是对于已经遭受有害染色和分选步骤的分选精子来说可能具有复合效应。
然而，在大多数商业环境中，冷冻分选的精子的益处通常超过了所造成的损害的负面影响，并且已经开发了某些程序来最小化甘油对精子的不良效应。作为一个实例，甘油可以在降低的温度下与精子组合以减轻甘油对精子的毒性效应。出于此目的，增量剂或其他并入甘油的介质可以涉及两个或更多个增量剂级分的多步骤方法制备。具体来说，精子增量剂可包括无甘油的“A”级分和具有甘油的“B”级分。“A”和“B”级分允许在两个或更多个步骤中引入精子增量剂，例如第一步骤，其中将A级分添加到精子(例如性别选择精子)，所述步骤可以在室温下；接着是第二步骤，其中将精子和A级分冷却到较低的温度，并且含有甘油的B级分于所述较低的温度下添加。此外，为了减少甘油对精子细胞的高渗效应，可以在多个步骤中添加B级分，可能通过在每一添加的甘油步骤中使精子细胞经受降低量的甘油来减少对精子细胞的冲击。例如，如国际申请WO/200137655中所述，增量的精子可通过离心和悬浮在冷冻增量剂中再浓缩，所述冷冻增量剂有时称为“AB”增量剂，其具有“B”级分的一半甘油含量。
发明内容
所要求保护的发明的某些实施方案概述如下。这些实施方案并非旨在限制所要求保护的发明的范围，而是用作本发明的可能形式的简要描述。本发明可以包括与这些概述不同的各种形式。
本文所述的一个广泛的实施方案涉及精子染色介质的组合物，其包括缓冲剂、DNA选择性染料和冷冻保护剂。冷冻保护剂可为糖醇，例如乙二醇；甘油；赤藓糖醇；苏糖醇；阿拉伯糖醇；核糖醇；木糖醇；山梨糖醇；半乳糖醇；艾杜糖醇；倭勒米糖醇；岩藻糖醇；肌醇；甘胺酰基葡萄糖醇，或糖醇的任何组合。或者，冷冻保护剂可为二醇，例如丙二醇、丁三醇或它们的组合。染色介质中的冷冻保护剂的体积/体积(vol./vol.)浓度可介于约0.1％与约1％之间、介于约1％与约2％之间、介于约2％与约3％之间、介于约3％与约4％之间、介于约2％与约4％之间或介于约1.5％与约3％之间。缓冲剂可为以下中的任一者：HEPES((4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸))、碳酸氢钠、MOPS((3-(N-吗啉基)丙磺酸))、TRIS(三(羟基甲基)氨基甲烷)、TES(2-[[l,3-二羟基-2-(羟基甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸)、TALP(台氏白蛋白乳酸丙酮酸盐(Tyrode’s Albumen Lactate Pyruvate))、TCA(三氯乙酸)、PBS(磷酸盐缓冲盐水)、乳、它们的衍生物或它们的组合。DNA选择性染料可为DNA选择性荧光染料，例如Hoechest 33342，其可以介于约10μM与约200μM之间、介于约20μM与约100μM之间、介于约30μM与约70μM之间之浓度供应。精子染色介质可包括在介于约30℃与约39℃之间、介于约32℃与约37℃之间的温度下或在约34℃下培育的被培育的精子介质组合物。
本文所述的本发明的另一广泛的实施方案涉及一种处理精子的方法，其中冷冻保护剂在比先前预期更早的阶段引入。将具有带有活的X染色体的精子与带有活的Y染色体的精子的精子样品用染色介质染色并在流路中与鞘液接触。染色介质和/或鞘液包括冷冻保护剂。该方法可以通过在精子样品中操纵带有活的X染色体的精子与带有活的Y染色体的精子的精子的比率来形成至少一个操纵的精子群体来继续。某些实施方案还可包括在收集介质(有时称为捕获流体或收集流体)中收集操纵的精子群体的步骤。在一些实施方案中，染色介质、鞘液和收集介质中的每一者包括一定量的冷冻保护剂。某些实施方案还可包括冷冻保藏/冷冻操纵的精子样品的步骤。冷冻保护剂可为多元醇、低分子量酰胺或甲基酰胺；在一个实施方案中，多元醇是糖醇，例如乙二醇；甘油；赤藓糖醇；苏糖醇；阿拉伯糖醇；核糖醇；木糖醇；山梨糖醇；半乳糖醇；艾杜糖醇；倭勒米糖醇；岩藻糖醇；肌醇；甘胺酰基葡萄糖醇，或糖醇的任何组合。在另一实施方案中，多元醇可为二醇，例如丙二醇、丁三醇或它们的组合。
在存在于染色介质中时，冷冻保护剂的vol./vol.或重量/体积(wt./vol.)浓度可介于约0.1％与约1％之间、介于约1％与约2％之间、介于约2％与约3％之间、介于约4％与约5％之间、介于约2％与约4％之间；为约1％、2％、3％、4％、5％；或介于约1.5％与约3％之间。
在存在于鞘液中时，冷冻保护剂的vol./vol.或wt./vol.浓度可介于约0.1％与约6％之间、介于约0.1％与约2％之间、介于约2％与约4％之间、介于约4％与约6％之间、介于约1％与约2％之间、介于约2％与约3％之间、约3％、介于约3％与约4％之间、介于约4％与约5％之间、介于约5％与约6％之间、介于约2％与约6％；约1％、2％、3％、4％、5％；或介于约3％与约5％之间。在存在于收集介质中时，冷冻保护剂的vol./vol.或wt./vol.浓度可介于约1体积％与约2体积％的冷冻保护剂之间、介于约2体积％与约4体积％的冷冻保护剂之间、介于约4体积％与约6体积％的冷冻保护剂之间、介于约3体积％与约5体积％的冷冻保护剂之间；约1体积％、2体积％、3体积％、4体积％或5体积％的冷冻保护剂，介于约3.5体积％与约5.5体积％的冷冻保护剂之间，或约4.5体积％的浓度。
在广泛方法的某些实施方案中，冷冻保护剂可以添加于染色介质、鞘液、收集介质中的一者以上中。冷冻保护剂在染色介质、鞘液、收集介质中的每一者中可以不同的量存在。在一个实施方案中，冷冻保护剂的浓度(如果存在的话)在其中存在冷冻保护剂的每一后续步骤中增加。类似地，在其中使操纵的精子样品在冷冻增量剂中增量用于冷冻并且冷冻保护剂已经添加于染色介质、鞘液、收集介质中的一者以上中的实施方案中，冷冻保护剂可以小于6％的vol./vol.或wt./vol.浓度存在于冷冻增量剂中。在所述实施方案中，冷冻保护剂可以介于约1％与约6％之间、介于约3％与约5％之间、介于约3.5％与约5.5％之间、约3.5％、介于约4％与约5％之间的vol./vol.或wt./vol.浓度或以约4.5％的浓度存在于冷冻增量剂中。
本文所述的一个广泛的实施方案涉及一种用于在冷冻保护剂存在下操纵精子样品的系统。所述系统包括含有精子样品的样品源和含有具有冷冻保护剂添加剂的鞘液的鞘源。流体递送结构形成由来自鞘液源的鞘液包围的来自样品源的精子样品的同轴流，并引导同轴流过讯问位置。电磁辐射源在讯问位置照射精子，并且至少一个检测器产生响应所述照射的信号。分析仪基于由至少一个检测器产生的信号确定精子特征。
在用于操纵精子样品的系统的一些实施方案中，流体递送结构包括喷嘴，例如定向喷嘴。而在其他实施方案中，流体递送结构包括例如在比色管或微流体芯片中的流动通道。系统的一些实施方案包括形成小滴、对小滴充电以及使小滴与同轴流偏转的必要组件，而在其他实施方案中，光损害(即消融)激光损害同轴流中选定的精子。
如果所述系统，鞘液中存在的冷冻保护剂可为糖醇，例如乙二醇；甘油；赤藓糖醇；苏糖醇；阿拉伯糖醇；核糖醇；木糖醇；山梨糖醇；半乳糖醇；艾杜糖醇；倭勒米糖醇；岩藻糖醇；肌醇；甘胺酰基葡萄糖醇，或糖醇的任何组合。或者，冷冻保护剂可为二醇，例如丙二醇、丁三醇或它们的组合。冷冻保护剂可以介于约0.1％与约6％之间、介于约0.1％与约2％之间、介于约2％与约4％之间、介于约4％与约6％之间、介于约1％与约2％之间、介于约2％与约3％之间、介于约3％与约4％之间、介于约4％与约5％之间、介于约5％与约6％之间、介于约2％与约6％之间或介于约3％与约5％之间的vol./vol.或wt./vol.浓度存在于鞘液中。
本文所述的另一广泛的实施方案涉及一种处理精子的方法，其中冷冻保护剂在比先前预期更早的阶段引入。将具有带有活的X染色体的精子与带有活的Y染色体的精子的精子样品用具有DNA选择染料的染色介质染色并注入鞘液流中。然后将精子样品中的染色精子暴露于电磁辐射源，所述电磁辐射源在DNA选择性染料中引起可检测反应。然后检测DNA选择性染料的可检测反应，并操纵带有活的X染色体的精子与带有活的Y染色体的精子的比率，以形成至少一个操纵的精子群体。将至少一个操纵的精子群体收集在一个或多个其中具有收集介质的收集容器中。在这种广泛的方法中，染色介质、鞘液和收集介质中的一者或多者包括冷冻保护剂。
冷冻保护剂可为糖醇，例如乙二醇；甘油；赤藓糖醇；苏糖醇；阿拉伯糖醇；核糖醇；木糖醇；山梨糖醇；半乳糖醇；艾杜糖醇；倭勒米糖醇；岩藻糖醇；肌醇；甘胺酰基葡萄糖醇，或糖醇的任何组合。或者，冷冻保护剂可为二醇，例如丙二醇、丁三醇或它们的组合。
在存在于染色介质中时，冷冻保护剂的vol./vol.或wt./vol.浓度可介于约0.1％与约1％之间、介于约1％与约2％之间、介于约2％与约3％之间、介于约4％与约5％之间、介于约2％与约4％之间，或介于约1.5％与约3％之间。
在存在于鞘液中时，冷冻保护剂的vol./vol.或wt./vol.浓度可小于6％、小于5％、小于4％；小于3％、小于2％、小于1％、介于约0.1％与约6％之间、介于约0.1％与约2％之间、介于约2％与约4％之间、介于约4％与约6％之间、介于约1％与约2％之间、介于约2％与约3％之间、介于约3％与约4％之间、介于约4％与约5％之间、介于约5％与约6％之间、介于约2％与约6％之间，或介于约3％与约5％之间。
类似地，在存在于收集介质中时，冷冻保护剂的vol./vol.或wt./vol.浓度可介于约1％与约2％之间、介于约2％与约4％之间、介于约4％与约6％之间、介于约3％与约5％之间、介于约3.5％与约5.5％之间，或浓度是约4.5。
冷冻保护剂在染色介质、鞘液、收集介质中的每一者中可以不同的量存在。在一个实施方案中，冷冻保护剂的浓度(如果存在的话)在其中存在冷冻保护剂的每一后续步骤中增加。
在其中使操纵的精子样品在冷冻增量剂中增量用于冷冻并且冷冻保护剂已经添加于染色介质、鞘液、收集介质中的一者以上中的实施方案中，冷冻保护剂可以小于6％的vol./vol.或wt./vol.浓度存在于冷冻增量剂中。在所述实施方案中，冷冻保护剂可以介于1％与6％之间、介于3.5％与5.5％之间、介于4％与5％之间的浓度或约4.5％的浓度存在。
本文所述的另一广泛的实施方案涉及一种冷冻/冷冻保藏作为混合物收集的操纵的精子群体的方法，所述混合物包括冷冻保护剂。一个所述实施方案包括使染色的精子样品与鞘液在流路中接触；操纵带有活的X染色体的精子与带有活的Y染色体的精子的比率，以形成至少一个操纵的精子群体；在冷冻保护剂存在下收集操纵的精子样品；浓缩收集的精子样品；将浓缩的精子样品重新悬浮在冷冻增量剂中；并冷冻重新悬浮的精子样品。所述方法还可包括冷却精子达小于90分钟的时段的步骤。另外，收集混合物的步骤还包括：将混合物收集在含有介于约5ml与约50ml之间的收集介质的容器中。在某些实施方案中，收集混合物的步骤还包括从流式细胞计数器收集分选的精子样品直到容器被填充到容器容量的约60％至约90％之间。在其他实施方案中，浓缩收集的混合物的步骤是在容器中进行。在又一实施方案中，在冷冻保护剂存在下收集操纵的精子样品的步骤之后立即进行浓缩所收集的精子样品的步骤，而在步骤之间不发生任何进一步的稀释。在此实施方案中，冷冻增量剂可包含小于6％vol./vol.或wt./vol.的冷冻保护剂、介于3.5与5.5％vol./vol.或wt./vol.之间的冷冻保护剂、或介于4与5％vol./vol.或wt./vol.之间的冷冻保护剂。在又一实施方案中，操纵带有活的X染色体的精子与带有活的Y染色体的精子的比率以形成至少一个操纵的精子群体的步骤可包括形成预计含有所选精子的小滴和偏转那些小滴以在流路中收集或光学损害选定的精子。
本发明的另一方面包括使用使用本文公开的任何方法处理的精子来使卵母细胞受精。这种受精可以通过使处理的精子与卵母细胞接触来实现。本发明的该实施方案包括使用本领域已知的任何活体外受精(IVF)技术，或任何为业内已知的人工授精技术来实现受精。
关于本文公开的本发明的任何和所有实施方案，包括上文所提到的实施方案，鞘液、染色介质或收集介质可包含vol./vol.或wt./vol.浓度小于8％、小于7％、为6％、小于6％、小于5％、为4.5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的任何上文所提到的冷冻保护剂。
另外，关于本文公开的本发明的任何和所有实施方案，包括上文所提到的实施方案，鞘液、染色介质或收集介质可包含以下浓度中的任一者的任何上文所提到的冷冻保护剂：10mM至1000mM；10mM至500mM；10mM至300mM；10mM至200mM；10mM至150mM；小于1000mM；小于900mM；小于800mM；小于700mM；小于600mM；小于500mM；小于400mM；小于300mM；小于200mM；小于150mM；小于100mM；小于50mM；或小于25mM。
在本发明的另一实施方案中，用于任何上文所提到的实施方案，包括用于染色介质中、用于鞘液中、用于捕获流体中或用于冷冻介质中的冷冻保护剂可包括赤藓糖醇。在另一实施方案中，赤藓糖醇的浓度为约10至300mM、约15至250mM、约25至125mM、约40至80mM、约0.01至1000mM、约0.01至400mM、约35mM、约65mM、约135mM、约270mM、约400mM、约400至1000mM、约400至500mM或约400至600mM。
附图说明
图1示出了根据本文所述的某些实施方案用于操纵精子样品的流式细胞计数器的示意图。
图2示出了根据本文所述的各种实施方案在操纵精子样品的同时在流式细胞计数器中获取的参数的图形表示。
图3示出了根据本文所述的各种实施方案在操作精子样品时在流式细胞计数器中获取的参数的图形表示。
图4示出了根据本文所述的各种实施方案在分选精子的同时在流式细胞计数器中获取的分选参数的图形表示。
图5-图7示出了在精子样品处理的各个阶段使用冷冻保护剂的替代实施方案。
图8示出了涉及冷冻精子样品的实施方案。
图9显示了当使用含有不同量的甘油的鞘液时获得的峰谷比。
图10显示了在鞘液中使用不同量的甘油分选的精子的解冻后运动率。
图11显示了在鞘液中使用不同量的甘油分选的精子的解冻后存活率和完整顶体百分比(PIA)。
图12显示了当使用含有不同量的甘油的鞘液时获得的PVR。
图13显示了在鞘液中使用不同量的甘油分选的精子的解冻后运动率、存活率和PIA。
图14显示了在鞘液中使用不同量的甘油分选的精子的解冻后运动率、存活率和PIA的集合。
图15显示了在鞘液中使用不同量的甘油分选的精子的解冻后运动率、存活率和PIA。
图16显示了在鞘液中使用不同量的甘油分选的精子的解冻后运动率、存活率和PIA的集合。
图17显示了在鞘液中使用不同的二醇分选的精子的解冻后运动率、存活率和PIA。
图18显示了在鞘液中使用不同的二醇分选的精子的解冻后运动率、存活率和PIA的集合。
图19显示了在鞘液中使用不同量的甘油分选的精子的解冻后运动率。
图20显示了在鞘液中使用不同量的甘油分选的精子的解冻后存活率和PIA。
图21显示了在鞘液中使用不同的二醇分选的精子的解冻后运动率。
图22显示了在鞘液中使用不同的二醇分选的精子的解冻后存活率和PIA。
图23显示了在鞘液中使用3％甘油分选并且在具有不同浓度的甘油的介质中冷冻保藏的精子的0h解冻后运动率。
图24显示了在鞘液中使用3％甘油分选并且在具有不同浓度的甘油的介质中冷冻保藏的精子的0h解冻后存活率和PIA。
图25显示了在鞘液中使用3％甘油分选并且在具有不同浓度的甘油的介质中冷冻保藏的精子的3h解冻后运动率。
图26显示了在鞘液中使用3％甘油分选并且在具有不同浓度的甘油的介质中冷冻保藏的精子的3h解冻后存活率和PIA。
图27显示了在鞘液中使用3％甘油分选并且在具有不同浓度的甘油的介质中冷冻保藏的精子的解冻后运动率的集合。
图28显示了在鞘液中使用3％甘油分选并且在具有不同浓度的甘油的介质中冷冻保藏的精子的解冻后存活率和PIA的集合。
图29显示了在鞘液中使用不同量的甘油分选并且在具有不同浓度的甘油的介质中冷冻保藏的精子的0h解冻后运动率、存活率和PIA。
图30显示了在鞘液中使用不同量的甘油分选并且在具有不同浓度的甘油的介质中冷冻保藏的精子的3h解冻后运动率、存活率和PIA。
图31显示了在鞘液中使用不同量的甘油分选并且在具有不同浓度的甘油的介质中冷冻保藏的精子的解冻后运动率、存活率和PIA的集合。
图32显示了利用鞘液中的甘油分选的或鞘液中不存在甘油分选的精子的IVF的结果。
图33显示了利用鞘液中的甘油分选的或鞘液中不存在甘油分选的精子的解冻后运动率、PIA和存活率的集合。
图34显示了利用鞘液中的甘油或鞘液中不存在甘油分选的精子的受孕率。
图35显示了用经冷冻剂制备的AB或用经100vol./vol.％甘油制备的AB冷冻的分选的精子的解冻后运动率、存活率和PIA。
图36显示了利用捕获流体和鞘液中的甘油或捕获流体和鞘液中不存在甘油分选的精子的解冻后运动率、存活率和PIA。
图37显示了在具有甘油的Caprogen和具有不同浓度的赤藓糖醇的Caprogen中保持的精子的运动率。
具体实施方式
精子可以通过获得含有精虫的精子样品或精子溶液获得或提供。如全文所用，术语“精子”是指单个或多个男性生殖细胞，而“精子样品”是指载体流体以及其中所含有的精子。精子样品的实例包括在另一溶液(例如增量剂或缓冲剂)中增量的净精液或精子，并包括冻融的精子。精子样品可以在执行剩余步骤的相同位置获得，或者可以在适当的精子增量剂中增量以运输到分选设施。一旦获得，精子可以维持于室温下，冷藏，或甚至冷冻于适当的增量剂中以供稍后使用。用于染色和分选的精子可以从哺乳动物获得，或者可以从储存中获得精子，例如从储存中获得的冷冻或冷藏的吸管。或者，可以汇集冷冻或增量的精子。
精子样品可以源自哺乳动物，例如Wilson,D.E.和Reeder,D.M.,Mammal Species of the World,Smithsonian Institution Press,(1993)列出的非人类哺乳动物，其全部内容通过引用并入本文。在收集或解冻或甚至汇集时，可以检查精子的浓度、pH值、运动率和/或形态。另外，可在进一步处理步骤之前添加抗生素。
一旦获得，精子可任选地标准化为预定浓度和/或朝向预定pH值。如本文所用的“标准化”可以理解为为了将射精的各种特征带入预定范围或接近所述预定范围而执行的动作。当牛射精(例如)可能在pH值和精子浓度方面有很大变化时，标准化精子浓度或pH值的步骤可以包括添加高能力缓冲剂，其用于针对射精随时间变得酸性更大的趋势标准化pH值和缓冲剂二者。
预定浓度和pH值中的每一者可以对不同物种特异，或甚至对物种内不同品种的动物特异。在一个实施方案中，精子可以与高能力缓冲剂形式的初始增量剂或具有大pH缓冲能力的增量剂组合。适宜的增量剂可包括TRIS柠檬酸盐、柠檬酸钠、碳酸氢钠、HEPES、TRIS、TEST、MOPS、KMT、TALP、它们的衍生物和它们的组合。也可以采用用于缓冲pH值的高能力的缓冲剂的任何增量剂，并且可以与提高精子存活率的其他组分组合使用。作为添加剂的实例，蛋白质可以蛋黄、乳、脂蛋白、卵磷脂、酪蛋白或白蛋白或其他蛋白质来源的形式并入。能源也可以单糖(例如果糖、葡萄糖或甘露糖)或甚至二糖或三糖的形式并入。另外，抗氧化剂和抗生素可用于初始增量剂中以提高精子存活率。
初始增量剂可以设定在预定的pH值，以使标准化所有获得的精子样品的pH值，例如pH值介于约6.8与7.4之间。在一个实施方案中，将增量剂调节至pH 7.2。另外，精液可能随时间逐渐变得酸性更大，这可能是由于精液中的蛋白质，或者由于代谢的酸性产物或死亡或濒死细胞的副产物。初始增量剂引入足够的游离质子(即H+)结合位点以维持pH值接近预定目标。甚至考虑到精子随时间变得酸性更大的自然趋势，初始增量剂提供在整个额外的处理步骤中稳定pH值的方法。
出于维持精子健康的目的，初始增量剂可含有添加剂。初始增量剂可包括抗生素以防止细菌增殖。作为非限制性实例，初始增量剂中可并入泰乐菌素(tylosin)、庆大霉素(gentamicin)、林可霉素(lincomycin)、林可-观霉素(linco-spectin)、大观霉素(spectinomycin)、青霉素(penicillin)、链霉素(streptomycin)和它们的组合。
抗氧化剂也可以并入初始增量剂中以减少自由基和氧化压力。虽然本讨论涉及在初始增量剂中使用抗氧化剂，但应该理解，如全部内容通过引用并入本文中的国际专利申请WO2012167151中所述，抗氧化剂可以独立地或组合并入入精子分选过程的多个阶段。可以并入的抗氧化剂的非限制性列表包括：过氧化氢酶、SOD、SOD模拟物、谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化酶、丙酮酸盐、己酸、巯基乙醇、BHT、硫辛酸、黄素类、奎宁、维生素K(和有关拟维生素)、维生素B12、维生素B12拟维生素、维生素E(和有关拟维生素)、生育酚、生育三烯酚、α-生育酚、α酮戊二酸(AKG)、丙二醛(MDA)、不对称二甲基精氨酸(ADMA)和它们的生物活性衍生物和它们的组合。
抗氧化剂的浓度可在0.01mg/ml至0.5mg/ml的范围内，并且作为非限制性实例，上文列示的抗氧化剂可以如下浓度提供：0.01mg/ml至5.0mg/ml、0.01mg/ml至0.25mg/ml、0.01mg/ml至0.5mg/ml、0.01mg/ml至1mg/ml、0.01mg/ml至2.5mg/ml、0.01mg/ml至5mg/ml、0.05mg/ml至0.1mg/ml、0.05mg/ml至1.0mg/ml、0.05mg/ml至2.5mg/ml、0.1mg/ml至0.25mg/ml、0.1mg/ml至0.5mg/ml、0.1mg/ml至1mg/ml、0.1mg/ml至2.5mg/ml、0.1mg/ml至5mg/ml、0.15mg/ml至0.45mg/ml、0.15mg/ml至0.5mg/ml、0.25mg/ml至0.35mg/ml、0.25mg/ml至0.5mg/ml、0.25mg/ml至1mg/ml、0.25mg/ml至2.5mg/ml、0.25mg/ml至5mg/ml、0.35mg/ml至0.5mg/ml、0.35mg/ml至1mg/ml、0.35mg/ml至2.5mg/ml、0.35mg/ml至5mg/ml、0.5mg/ml至1mg/ml、0.5mg/ml至2.5mg/ml、0.5mg/ml至5mg/ml、1mg/ml至2.5mg/ml以及1mg/ml至5mg/ml。
作为一个实例，精子样品可以在高能力缓冲剂中以约1:1至约1:10的比率稀释。所得混合物的精子浓度比特定物种的天然精子浓度低许多倍。可离心增量的精子以重新浓缩精子。离心精子并去除上清液可使精子再浓缩成预定浓度。可以基于额外的精子处理步骤来选择预定浓度。举例来说，在性别分选牛的情况下，精子可以重新浓缩介于约24亿精子/ml与约5亿精子/ml之间，以模拟自然浓度范围，同时用增量剂替代精浆组分。也可以实现其他浓度(例如介于约14亿精子/ml与约21亿精子/ml之间，或介于约17亿精子/ml与约21亿精子/ml之间)用于进一步处理。
在一个实施方案中，精子浓度和pH值可以为进一步处理提供均匀的起始点。举例来说，相对一致的pH值和浓度可以提供例如用DNA选择性染料染色精子的更大可预测性。如果将每一样品调节至相同的预定pH值和浓度，则在每次新的收集时可能需要更少的试验以确保对性别分选的充分染色。
精子的群体将包括带有X染色体的精子和带有Y染色体的精子。另外，带有X染色体的精子和带有Y染色体的精子各自将包括活的精子和无活力的精子。活的精子可以被认为是具有完整膜的精子，而无活力的精子可以被认为是具有受损膜的精子。常规精子分选中活的精子与无活力的精子之间的区别是通过包含渗透膜受损的精子的淬灭染料来确定的。倾向于死亡或濒死的精子吸收淬灭染料并产生与其余精子群体不同的荧光信号，而具有完整膜的精子倾向于具有活力并且将阻止淬灭染料的摄取。适当剂量的活的精子通常能够在人工授精中实现受精，而无活力的精子或膜受损的精子可能无法在人工授精中实现受精或在人工授精中受精的能力大大降低。然而，一些能够受精的精子可能具有的受损膜，而一些具有完整膜的精子可能无法受精。
无论是否标准化，精子都可以用染色介质染色以引入DNA选择性染料。在染色步骤中，精子群体的至少一部分与染色介质和DNA选择性荧光染料一起培育，以便化学计量地染色精子群体中每一细胞的DNA含量。Hoechst 33342的毒性往往低于其他DNA选择性染料。用于递送该染料的媒剂可以是调节至约7.4的pH值的改性的TALP缓冲剂的形式。Hoechest33342描述于美国专利5,135,759中并且通常用于此目的。然而，也可以使用其他UV可激发染料，以及可见光可激发染料、荧光聚酰胺、荧光核苷酸序列和性别特异性抗体。
自然状态下的精子通常不易透过所述染料。为了产生均匀的染色，染色的第一步骤可包括在升高的pH值下在升高的温度下在染色介质(有时称作染色缓冲剂)中除了染料外也培育精子群体的至少一部分。适当的染色溶液的实例可为TALP、TES-TRIS、TRIS柠檬酸盐、柠檬酸钠或基于HEPES的介质，其各自在WO2005/095960中描述，所述案件通过引用并入本文。表1中示出了通过引用并入本文的WO2001/37655中描述的改性的TALP的非限制性实例。
表1-改性的TALP缓冲剂
作为一个实例，精子的群体或精子群体的一部分可以在缓冲液中用染色介质稀释到介于640×106与40×106精子/ml之间，介于约320×106与80×106精子/ml之间，或约160×106精子/ml。DNA选择性荧光染料可以介于约10μM与200μM之间、介于约20μM与100μM之间或介于约30μM与70μM之间的浓度添加到悬浮于缓冲剂中的精子中。缓冲剂的pH值可以介于约6.8与7.9之间、约7.1与7.6之间或约7.4，以帮助确保核DNA的均匀染色。本领域普通技术人员将理解，可以通过添加NaOH来提高pH值，并且通过添加HCl使pH值下降。任选地，可以将先前描述的抗氧化剂和浓缩物并入染色溶液中。
精子的群体可以在30-39℃之间、约32-37℃之间或约34℃下培育。培育时间可在介于约20分钟与约3小时之间、介于约30分钟与约90分钟之间或约45分钟至约60分钟的范围内。作为一个实例，精子的群体可以在34℃下培育约45分钟。即使在单一物种中，精子浓度和pH值以及影响可染性的其他因素也可能因动物而异。本领域普通技术人员可以理解在物种之间并且甚至在不同品种或同一品种的动物之间培育精子的微小变化，以实现均匀染色而不会使精子群体过度染色。
除了DNA选择性荧光染料外，还可以施加淬灭染料，以渗透膜受损的精子并淬灭它们产生的信号。淬灭染料可以理解为包括与膜受损的精子差异结合的染料。由于膜破裂或者以其他方式越来越多孔，可能所述染料更容易进入膜受损的精子。也可能淬灭染料容易进入所有精子膜，并且健康的精子比膜受损的精子更快地主动泵出淬灭染料。在任一情况下，与淬灭染料结合的精子包括大部分死亡和濒死的精子，尽管不一定都是死亡和濒死的精子。由与淬灭染料结合的膜受损的精子产生的淬灭信号与健康精子的信号足够不同，所述淬灭信号可以从进一步的分析中去除并且分选应用于活的精子。
在一个实施方案中，执行第二染色步骤，其进一步降低精子的浓度并引入淬灭染料。可以靶向第二染色介质的pH值以实现最终精子样品中的目标pH值。两步染色方法的非限制性实例描述于公开的PCT国际申请WO 2011/123166和国际申请PCT/US12/58008中，两者的全部公开内容通过引用并入本文。
在另一实施方案中，淬灭染料和DNA选择性染料一起以单一稀释施加。在该实施方案中，淬灭染料与DNA选择性染料一起在染色溶液中于升高的温度下培育。例如，染色介质可以是pH值为7.4的改性的TALP。然而，可以采用其他染色剂，包括TES-TRIS、TRIS柠檬酸盐、柠檬酸钠或具有DNA选择性染料和淬灭染料的基于HEPES的介质，并且pH值可以在约7.0与7.8之间的范围内。在一个实施方案中，当在7.4的pH值下染色之前，精子在约7.2的升高的pH值下标准化时可能存在协同作用。以此方式，精子所暴露的pH值保持在恒定范围内，且变化最小。因为染色介质和初始增量剂都具有高缓冲能力，所以认为精子随时间变得酸性更大的自然趋势将被避免。
在一个实施方案中，不管是采用一步还是两步染色方案，都可以将冷冻保护剂并入一个或多个染色步骤中。应该理解，如本文所用术语“冷冻保护剂”是指保护细胞或生物组织免受冷冻损害的物质。冷冻保护剂可包括那些用于去除细胞内水的物质，以防止与细胞内冰的形成和增量有关的损害。可以通过增加细胞内的溶质浓度来诱导这种作用。保护细胞和组织免受其他类型损害(例如渗透压冲击和致冷，而非冷冻)的物质不被认为是冷冻保护剂。仅举几个实例，脂蛋白、磷脂、卵磷脂和诸如此类，例如蛋黄、蛋黄提取物、乳、乳提取物、酪蛋白、白蛋白、卵磷脂和胆固醇的来源不是冷冻保护剂，如本文所用的术语。另外，能源(例如单糖、二糖和三糖)不是如本文所用的冷冻保护剂。
可以在染色步骤并入的冷冻保护剂包括许多糖醇和二醇。作为非限制性实例，可能包括糖醇(例如乙二醇)、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、木糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇、艾杜糖醇、倭勒米糖醇、岩藻糖醇、肌醇、甘胺酰基葡萄糖醇和它们的组合作为在染色时引入的冷冻保护剂。整个内容以引用方式并入本文的美国专利3,185,623描述可为本发明中可用的适宜冷冻保护剂的许多碳水化合物醇(即糖醇或醛糖醇)。另外，可以包括乙二醇(例如丙二醇、丁三醇)作为冷冻保护剂。许多所述冷冻保护剂在某些浓度和温度下对精子有毒。例如，由于这种毒性，尤其将精子致冷到5℃的温度后，通常会向精子中添加(例如)甘油。意外的是，如实施例中更详细地描述，已显示在染色步骤期间冷冻保护剂的存在改善了随后冷冻的精子的解冻后运动率并改善了精子分选分辨率。鉴于用于性别分选的精子染色通常在超过34℃的温度下进行，这是一个特别令人惊讶和意外的结果。
冷冻保护剂可以在染色步骤期间介于约0.1％与约5％之间的vol/.vol.或wt./vol.浓度提供于例如染色介质中。举例来说，经历进一步处理(例如在流式细胞计数器中分选)的染色的精子样品可包含介于约0.1％与约1％之间、介于约1％与约2％之间、介于约2％与约3％之间、介于约3％与约4％之间、介于约2％与约4％或介于约1.5％与约3％之间的vol./vol.或wt./vol.浓度的冷冻保护剂。
可以用前述浓度范围的抗氧化剂补充染色剂。在一些实施方案中，升高的压力可能会增加被染色的精子所承受的自由基和氧化压力。因此，抗氧化剂可用于中和自由基，并降低被染色的精子所承受的氧化压力。可以在染色过程中并入的抗氧化剂的非限制性列表包括：过氧化氢酶、SOD、SOD模拟物、谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化酶、丙酮酸盐、己酸、巯基乙醇、BHT、硫辛酸、黄素类、奎宁、维生素K(和有关拟维生素)、维生素B12、维生素B12拟维生素、维生素E(和有关拟维生素)、生育酚、生育三烯酚、α-生育酚、α酮戊二酸(AKG)、丙二醛(MDA)、不对称二甲基精氨酸(ADMA)和它们的生物活性衍生物和它们的组合。可以使用任何前述浓度。
一个或多个染色步骤可任选地包括用于在染色期间减少精子的运动率或呼吸的组分。仅举几个实例，一个或多个染色步骤可以通过包括添加剂，或通过减少和/或减少精子暴露于某些物质来减少精子呼吸。具体来说，可以利用低糖染色剂，其中仅存在残留水平的果糖、蔗糖、葡萄糖或另一种糖。类似地，精子呼吸可以通过在氮气或二氧化碳的分压下染色来置换染色剂中的氧而减少。或者，可以向染色剂中添加具有一定钾和钠比率的物质，其往往减少精子呼吸。作为另一种选择，可以向一个或多个染色步骤中添加氟化物或氟化钠，以减少精子呼吸。
无论是否标准化以及在单个步骤或在两个步骤中染色，精子群体都可以通过粒子分选仪器(例如流式细胞计数器，包括但不限于喷射气流式细胞计数器、具有比色管的流式细胞计数器或微流体芯片)进行分选。参考图1，示出了空气中喷射流式细胞计数器(10)，尽管可以用微流体芯片或其他类型的流式细胞计数器(包括具有封闭腔室和细胞计数器的流式细胞计数器和并入消融激光的细胞计数器)执行分选。流式细胞计数器(10)包括用于产生精子样品流、例如染色的精子样品流的细胞源(12)用于分选。精子样品递送到喷嘴(14)的速率可以被认为是样品流速，并且可以通过样品压力来决定。染色的精子样品流沉积在喷嘴(14)内，并引入或流入鞘液(18)的流体流(16)中。鞘液(18)可由鞘液源(20)供应，使得当细胞源(12)将精子供应到鞘液(18)中时，它们同时通过喷嘴(14)进料。鞘液(18)可以以由鞘液压力决定的鞘流速度供应。
而流式细胞术中利用的先前鞘液通常包括可能补充有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，精子分选已并入柠檬酸钠、TRIS柠檬酸盐或柠檬酸作为鞘液以保持精子在分选过程中健康。如全部内容通过引用并入本文的国际专利申请WO99/33956中所述，适宜缓冲剂可以作为鞘液并入。在本发明的某些实施方案中，先前鞘液补充有冷冻保护剂。如上所述，冷冻保护剂是指保护细胞或生物组织免受冷冻损害的物质，并且可包括那些用于去除细胞内水的物质，以防止与细胞内冰的形成和增量相关的损害。可以通过增加细胞内的溶质浓度来诱导这种作用。保护细胞和组织免受其他类型损害(例如渗透压冲击和致冷，而非冷冻)的物质不被认为是冷冻保护剂。
冷冻保护剂包括许多上述糖醇和二醇。作为非限制性实例，糖醇(例如乙二醇)、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、木糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇、艾杜糖醇、倭勒米糖醇、岩藻糖醇、肌醇、甘胺酰基葡萄糖醇和它们的组合可作为冷冻保护剂包括于鞘液中。另外，乙二醇(例如丙二醇、丁三醇)可作为冷冻保护剂包括于鞘液中。意外的是，如实施例中更详细地描述，已显示鞘液中的冷冻保护剂的存在改善了随后冷冻的精子的解冻后运动率并改善了精子分选分辨率。令人惊讶的是，如实施例1中所见，根据本发明的某些实施方案通过在鞘液中并入冷冻保护剂来改良分选仪器，改善了分选分辨率，意味着生产力、通量和纯度可以同时提高到不同程度。
在一些实施方案中，在染色步骤和鞘液期间可以使用相同的冷冻保护剂。作为所述实施方案的非限制性实例，甘油可在染色步骤期间以第一vol./vol.或wt./vol.浓度提供且在鞘液中以第二vol./vol.或wt./vol.浓度提供。在一个实施方案中，染色期间提供的第一vol./vol.或wt./vol.浓度可能低于鞘液中提供的第二vol./vol.或wt./vol.浓度。以此方式，经历精子分选过程的精子细胞可暴露于相对浓度逐渐增加的鞘液。或者，可以协调染色介质和鞘液中存在的冷冻保护剂的量，以便在操作精子样品的任何过程中，在所述操纵结束时达到预定浓度的冷冻保护剂。在替代实施方案中，冷冻保护剂可仅并入鞘液和染色介质中的一者中。
在一些实施方案中，冷冻保护剂可以介于约0.1％vol/.vol.或wt./vol.与约6％vol./vol.或wt./vol之间的浓度提供于鞘液中。举例来说，经历进一步处理(例如在流式细胞计数器中分选)的染色的精子样品可包含介于约0.1％与约2％之间、介于约2％与约4％之间、介于约4％与约6％之间、介于约1％与约2％之间、介于约2％与约3％之间、介于约3％与约4％之间、介于约4％与约5％之间、介于约5％与约6％之间、介于约2％与约6％或介于约3％与约5％之间的vol./vol.或wt./vol.浓度的冷冻保护剂。
本领域技术人员能理解，所描述的实施方案涉及小滴形成空气中喷射流式细胞计数器，但具有冷冻保护剂添加剂的鞘液在其他分选系统中，例如在利用流体转换的系统、利用光损害激光的系统以及微流体芯片中提供相同的益处。
在操作分选精子的操作期间，鞘液(18)形成同轴地围绕具有染色精子的精子样品的流体流，所述流体流在喷嘴孔(22)处离开喷嘴(14)。通过提供可以用振荡器控制器(26)精确控制的振荡器(24)，可以在喷嘴(14)内建立压力波并将其传递到在喷嘴孔(22)处离开喷嘴(14)的流体。响应压力波，离开喷嘴孔(22)的流体流(16)最终以精确的间隔形成规则的小滴(28)。形成的小滴的频率以及在某种程度上的形状可以通过供应给振荡器(24)或振荡器控制器(26)的下降驱动频率和下降驱动幅度来控制。
如此形成的每个小滴保留先前形成一部分流体流(16)的鞘液和精子样品。因为染色的精子被流体流(16)或鞘液环境包围，所以小滴(28)理想地含有个别分离的精子。然而，样品浓度、样品压力和其他仪器参数决定多个细胞经常占据单个小滴的频率，以及含有精子的小滴的百分比。
流式细胞计数器(10)用于基于预测包含在小滴内的精子特征分选小滴。这可以通过与分析仪(36)连通的细胞传感系统(30)来实现。细胞传感系统(30)包括至少一个传感器(32)，其响应于包含在流体流(16)内的细胞。作为一个实例，可以将两个正交光倍增管(PMT)并入精子分选流式细胞计数器中，用于检测0度和90度的荧光，但可以容易地采用其他传感器构造，例如通过引用并入本文的WO2010/021627中所述的那些传感器构造。
细胞传感系统(30)向分析仪(36)提供数据，这可以根据流体流(16)中细胞的特征的相对存在或相对不存在而引起动作。某些特征(例如精子的相对DNA含量)可以通过用电磁辐射源(34)(例如产生染色的精子有响应的辐射束的激光)激发进行检测。电磁辐射源(34)可以是在UV波长下、例如在约355nm下操作的激光。所述激光的实例可以是Vanguard350(可从Spectra-Physics获得)，其以350mW操作。可以采用各种光学器件来对激光的光束轮廓进行定形，将光束分成多于一个的流，或者降低流的光束功率。所述光学器件的非限制性实例可参见WO/2004/104178和WO/2001/85913，其各自通过引用并入本文。
个体精子的特征、特别地X染色体或Y染色体的存在可以从响应电磁辐射源(34)产生的检测的荧光确定。具体来说，细胞传感系统(30)的构造可以与分析仪(36)连通以提供形成的各种荧光，例如事件的前方荧光、事件的侧荧光，或者与事件相关的分散量。分析仪(36)可包括用于分析由细胞传感系统(30)中的一个或多个传感器(32)产生的信号的书面指令。DNA选择性荧光染料化学计量地结合至精子DNA。因为带有X染色体的精子含有比带有Y染色体的精子更多的DNA，所以带有X染色体的精子可以比带有Y染色体的精子结合更大量的DNA选择性荧光染料。因此，通过测量激发时结合染料发射的荧光，可以区分带有X染色体的精子与带有Y染色体的精子。除了定向和未定向的精子之外，分析仪(36)可以根据分选逻辑并入的门控区域来区分不同，例如精子有活力或无活力。
一旦分析仪基于精子特征区分精子，夹带带有X染色体的精子的小滴可带正电荷并且因此在在一个方向上偏转，而夹带带有Y染色体的精子的小滴可带负电荷并且因此偏转其他方向，并且废流(即不夹带粒子或细胞或夹带不需要或不可分选的细胞的小滴)可以不带电荷并且因此从无偏转流收集到流入管或诸如此类中。或者，可以收集带有X染色体的精子或带有Y染色体的精子中的一者，而另一者作为废物丢弃。
因此，流式细胞计数器(10)通过使含有精子的小滴(28)被引导到一个或多个收集容器(40)而用于分离染色的精子。收集容器(40)可以是收集管，例如离心管或Falcon管。在一个实施方案中，一个或多个收集容器包含50ml离心管。一个或多个收集容器可包括收集介质，所述收集介质用于缓冲偏转的小滴中的细胞与容器的底部的冲击，并且包括用于保持分选的精子细胞的健康的组分。举例来说，Tris-柠檬酸盐和蛋黄捕获流体可以与本发明的某些实施方案一起使用。可用于某些实施方案的其他捕获流体包括TRIS柠檬酸盐、柠檬酸钠、碳酸氢钠、HEPES、TRIS、TEST、MOPS、KMT、TALP、它们的衍生物和它们的组合。然而，也可以采用具有用于缓冲pH值的缓冲剂的其它增量剂，并且可以与在分选器后提高精子存活率的其他组分组合使用。作为添加剂的实例，蛋白质通常以蛋黄的形式并入捕获流体中。然而，可以替代地使用其他形式的蛋白质，例如乳、脂蛋白、卵磷脂、酪蛋白或白蛋白或其他蛋白质来源，或甚至与蛋黄组合使用。在一个实施方案中，蛋黄替代物(例如可从大豆卵磷脂获得的磷脂)可用于替代蛋黄。能源也可以单糖(例如果糖、葡萄糖或甘露糖)或甚至二糖或三糖的形式并入。另外，抗氧化剂和抗生素可用于初始增量剂中以提高精子存活率。
在一个实施方案中，收集介质包括冷冻保护剂。适于添加到收集介质中的冷冻保护剂包括上述许多糖醇和二醇。作为非限制性实例，捕获流体中可包括糖醇(例如乙二醇)、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、木糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇、艾杜糖醇、倭勒米糖醇、岩藻糖醇、肌醇、甘胺酰基葡萄糖醇和它们的组合作为冷冻保护剂。另外，捕获流体中可包括二醇(例如丙二醇、丁三醇)作为冷冻保护剂。
在一些实施方案中，收集介质中的操纵的精子样品的集合可能是精子第一次与冷冻保护剂接触。在一些实施方案中，除了收集介质之外，染色介质和/或鞘液还包括冷冻保护剂。在其他实施方案中，染色介质和/或鞘液含有冷冻保护剂，而收集介质不含冷冻保护剂。在每所述实施方案中的每一者中，由于收集介质中存在冷冻保护剂，或者由于染色介质或鞘液中存在任何量的冷冻保护剂(所述染色介质或鞘液自身均与操纵或收集的精子一起收集)，将收集介质中收集的精子收集在混合物中，所述混合物包括精子和冷冻保护剂二者。
在其中冷冻保护剂存在于收集介质和至少一种其他流体中的实施方案中，收集介质中所用的冷冻保护剂可与染色介质和/或鞘液中所用相同。作为所述实施方案的非限制性实例，甘油可在染色步骤期间以第一vol./vol.或wt./vol.浓度提供且在鞘液中以第二vol./vol.或wt./vol.浓度提供。在一个实施方案中，染色期间提供的第一vol./vol.或wt./vol.浓度可能低于鞘液中提供的第二vol./vol.或wt./vol.浓度。以此方式，经历精子分选过程的精子细胞可暴露于相对浓度逐渐增加的鞘液。或者，可以协调收集介质中存在的冷冻保护剂的量可与染色介质中和/或鞘液中存在的冷冻保护剂的量，以便在操作精子样品的任何过程中，在所述操纵结束时达到预定浓度的冷冻保护剂。在替代实施方案中，冷冻保护剂可仅并入鞘液、染色介质和收集介质中的一者中。
在一些实施方案中，冷冻保护剂可以介于约1％与约2％之间、介于约2％与约4％之间、介于约4％与约6％之间、介于约3％与约5％之间、介于约3.5％与约5.5％之间或约4.5％的vol./vol.或wt./vol.浓度提供于收集介质中。
在一个实施方案中，将冷冻保护剂添加到捕获流体中，但不添加到鞘液或染色步骤中。在另一实施方案中，将冷冻保护剂添加到捕获流体、鞘液和染色步骤中的任两者中。在另一实施方案中，将冷冻保护剂添加到捕获流体、鞘液和染色剂中的每一者中。作为其中冷冻保护剂以一个以上处理步骤添加的实施方案的非限制性实例，甘油可在染色步骤期间以第一vol./vol.或wt./vol.浓度提供且在鞘液中以第二vol./vol.或wt./vol.浓度提供。在一个实施方案中，染色期间提供的第一vol./vol.或wt./vol.浓度可能低于鞘液中提供的第二vol./vol.或wt./vol.浓度。以此方式，经历精子分选过程的精子细胞可暴露于相对浓度逐渐增加的鞘液。作为其中在捕获流体、鞘液和染色步骤中的每一者中添加冷冻保护剂的实施方案的非限制性实例，甘油在染色步骤中可以第一vol./vol.或wt./vol.浓度提供，在鞘液中以第二vol./vol.或wt./vol.浓度提供，并且在捕获流体中以第三vol./vol.或wt./vol.浓度提供。在一个实施方案中，冷冻保护剂的vol./vol或wt./vol.浓度可以在引入其的每个连续步骤中增加。举例来说，冷冻保护剂在染色步骤中的第一浓度可为比鞘液中冷冻保护剂的第二浓度和捕获流体中冷冻保护剂的第三浓度低的浓度。冷冻保护剂的逐渐引入可能特别地有益于精子最终能够在最终冷冻和解冻中存活，或者可以改善最终冷冻和解冻的活的精子的健康。
在替代实施方案中，偏转板a(38)和形成小滴的所需的其他组件(例如振荡器(24)或振荡器控制器(26))可以用光损害激光代替，有时还称为激光剥蚀。在所述实施方案中，分析仪(36)和控制器(42)可以协作以基于细胞的分类触发在电磁辐射源下游的第二位置处定时撞击流体流(16)中的细胞的光损害激光(34)。与电磁辐射源(34)相比，所述激光可以在不同的波长下操作，或者以更高的功率操作，以确保精子细胞被消融、失活或使得不能受精。并入所述光损害激光的实施方案仍然利用染色介质和鞘液，并且可以选择利用收集介质。根据本发明的某些实施方案，染色介质、鞘液和收集介质中的任一者当存在时可包括冷冻保护剂。
在另一选择中，本发明的某些方面可同样适用于微流体芯片。仅作为一个实例，微流体芯片(例如各自通过引用并入本文的国际申请WO 2011/097032和WO2011/097032中描述的那些)同样可以受益于包括含有冷冻保护剂的鞘液。类似地，在微流体芯片上并入流动通道的实施方案仍然利用染色介质并可任选地利用鞘液和收集介质。根据本发明的某些实施方案，染色介质、鞘液和收集介质中的任一者当存在时可包括冷冻保护剂。
图2示出了来自染色精子的空气中喷射流式细胞计数器的侧荧光和前方荧光的代表性双变量图，其可由分析仪(36)产生。操作员可以使用数据的可视表示来接收与经历分选的样品有关的反馈，并以图形方式展现当前分选逻辑的某些方面。例如，R1可以被视为门控区域，其可以应用于流式细胞计数器的分选逻辑。可以在分析仪(36)的显示器中提供额外数字输出。所述数字输出可以呈测量的分选参数(例如事件率、中止率、分选率、分选效率，或任何区域或闸门中的粒子的百分比)的形式。因为R1的边界包括两个密集的细胞群体，其反映了密切相关的带有X染色体的精子群体和带有Y染色体的精子群体，所以R1示为可以被认为是活的定向区域的区域。R2是围绕无活力的精子或其荧光被淬灭染料淬灭的膜受损的精子设置的门控区域。虽然可以采用各种分选逻辑，但是与R1和R2相关的两个策略可能是分选逻辑中的第一步骤，分选逻辑，其中落在R1中的所有事件都被接受用于进一步的处理或门控。或者，所有落在R2之外的事件都被接受进一步用于处理或门控。
图3示出了可以由分析仪(36)产生并为操作员产生图形表示的呈直方图形式的单变量图。图3中示出的数据可以表示在一定时期内从侧面或前方发荧光出现峰信号强度的次数。在精子的情况下，带有X染色体的精子和带有Y染色体的精子倾向于根据物种具有介于2与5％之间的变化的峰强度，并且这种差异反映在图2中所见的峰强度的双模态分布中。因为带有X染色体的精子和带有Y染色体的精子倾向于具有不同的荧光值，所以每个峰代表带有X染色体的精子或带有Y染色体的精子。基于分析仪(36)中应用的分选逻辑，直方图中的细胞群可能只是那些被确定为活的定向细胞的细胞，例如那些落入图2中的R1中的细胞，或者它们可表示未被确定为死亡或不合需要的细胞，例如除了落入R2的那些事件之外的每一事件。可以从该直方图中包含的信息导出各种分选参数。举例来说，两个峰之间的区别性水平可以提供分选纯度可能看起来像什么的指示。图3进一步示出了在两组之间的最低点处的相对强度测量，其可以被认为是在P的直方图的一个或多个峰值处的值V和第二相对强度。直方图的可视检查可以为操作者提供如何执行流式细胞计数器的主意，但用于确定P值、V值和V与P的比率的计算机执行的指令还没有在商业精子分选器中实现。谷值与峰值比率可以在分选过程中周期性地确定为测量的分选参数。谷值与峰值比率虽然不一定完全决定分选纯度，但可以提供快速估算纯度值的方法，可以通过执行分析仪(36)中的书面指令自动实现，也可以通过可视检查操作器手动完成。或者，反比关系，即峰值与谷值比，提供与相反值类似的信息。
参见图4，可以通过响应细胞传感系统(30)获取的信号由分析仪(36)生成第二双模态图。双模态图可以表示第一轴，其示出了前方荧光信号的峰值强度值或侧荧光信号的峰值强度。与图3类似，图4中所示的数据可经门控。使得仅包括落在图2中的R1内的事件。或者，在精子的情况下，也可以显示不落入死亡闸门R2中的所有事件。
R3可以代表用于收集带有X染色体的精子的X分选闸门。术语X分选闸门在本文中可与术语X闸门互换使用。参考图4，它可以展现改变门控区域的尺寸可如何影响效率、纯度和生产力。如果要扩展R3区域，可以看出每秒钟更多的精子将被分选为带有X染色体的精子，从而导致更高的分选效率和更高的生产力。然而，R3闸门或区域的扩增将开始以包括具有作为带有Y染色体的精子的增加可能性的事件。为了增加精子的分选纯度，可以使R3区域更小和/或移动远离Y染色体区域。由于较少的事件属于X分选闸门，因此在带有X染色体的精子群体中分选的精子较少，而那些具有更大的机率实际上为带有X染色体的精子，这意味着收集的纯度可能会增加。然而，因为较少事件落在R3区域内并且中止更多的偶合事件，所以效率(在收集的细胞方面)和生产力(在每秒分选方面)都将减少。另外，随着修改其他仪器参数，图2、图3和图4所示的图形可以在形状和性质上改变。举例来说，增加样品压力或样品流速可能会导致谷值与峰值比率减小，或者可能会减轻带有X染色体的精子与带有Y染色体的精子之间的双模态区别。
然后可以根据针对常规或性别选择的精子的已知方法汇集和冷冻经处理的精子。仅作为一个实例，通过引用整体并入本文的国际专利申请WO/200137655中描述的冷冻方法可以特别地受益于所述发明的某些实施方案，其中在较早的步骤、例如当在鞘液中或甚至在捕获流体中染色时将冷冻保护剂引入精子分选过程中。或者，在一个或多个较早的步骤中包括冷冻保护剂可并入新的冷冻方法中。
在一个实施方案中，收集的分选的精子可以冷却到约5℃的温度，或者基于特定物种精子冷却到另一适宜的冷却温度。或者，精子可以收集在已经冷却的收集容器中。根据收集容器的大小，可以利用其他收集容器汇集收集的精子。可以使汇集的收集容器离心并且上清液流出。根据一些先前的方法，将分离的精子重新悬浮在增量剂的A级分(或无冷冻保护剂的级分)中，并且将以与A级分相等的体积添加具有两倍所需浓度的细胞保护剂的B级分(或含有冷冻保护剂的级分)。一些先前的方法将B部分分成两个相等的体积相隔约15分钟添加，而其他方法通过稳定的滴注引入B级分。
在本发明的一些实施方案中，在整个染色、分选和收集步骤中在各种介质中包括冷冻保护剂，这可以减少或甚至消除在重新浓缩之前冷却操纵的精子样品的需要。此外，在各种染色和分选步骤中包括冷冻保护剂可以消除使用“A”和“B”级分范例的需要。
参见图5，本发明的所示实施方案涉及一种方法，其中在精子处理期间将冷冻保护剂添加到多种介质中、例如在染色介质、鞘液中和收集介质中。在步骤(510)，该方法以在染色介质中染色精子样品的步骤开始。精子样品可以是净精液或在另一溶液中增量的精子，例如如前文所述的那些精子。例如，精子样品可以通过以先前所述方式增量和重新浓缩来标准化。或者，精子样品可采取净精液的形式或用缓冲剂增量和/或添加抗生素的净精液形式。
无论是否标准化，DNA选择性荧光染料可以是在改性的TALP缓冲液中提供的Hoechst 33342(表1)。染色步骤本身可以单一稀释执行，其另外包括淬灭染料。或者，步骤510可以两次稀释执行，例如以用具有DNA选择性荧光染料的改性的TALP的第一次稀释，然后以具有淬灭染料的改性的TALP中的第二次稀释。可以理解，根据该实施例可以使用其他DNA选择性荧光染料和其他淬灭染料。出于该实施方案的目的，每一者都将被称为染色介质。
无论是以一次稀释或两次稀释实现，精子样品可以在染色介质中稀释到介于640×106与40×106精子/ml之间，稀释到介于约320×106与80×106精子/ml之间，稀释到约160×106精子/ml或约120×106精子/ml。DNA选择性荧光染料可以介于约10μM与200μM之间、介于约20μM与100μM之间或介于约30μM与70μM之间的浓度添加到悬浮于染色介质中的精子中。染色介质的pH值可以介于约6.8与7.9之间、介于约7.1与7.6之间，或为约7.4。在两次稀释的情况下，第二次稀释可以在与第一次稀释相同的pH值或接近所述pH值下进行，或者在低pH值(例如介于5.0与6.0之间，或为约5.5)下进行。任选地，可以将先前描述的抗氧化剂和浓缩物并入染色介质中。精子样品可在30-39℃之间、约32-37℃之间或约34℃下培育。培育时间可在介于约20分钟与约三小时之间、介于约30分钟与约90分钟之间或约45分钟至约60分钟的范围内。
在步骤512，可以看出步骤510中利用的染色介质包括第一量的冷冻保护剂。冷冻保护剂可以是适宜糖醇，例如乙二醇；甘油；赤藓糖醇；苏糖醇；阿拉伯糖醇；核糖醇；木糖醇；山梨糖醇；半乳糖醇；艾杜糖醇；倭勒米糖醇；岩藻糖醇；肌醇；甘胺酰基葡萄糖醇，或它们的组合。冷冻保护剂也可以是适宜二醇，例如丙二醇、丁三醇或它们的组合。可以理解，所选择的冷冻保护剂可以特异于动物物种，或者甚至特异于品种。例如，在牛精子的情况下可以选择甘油，并且通过执行图5中所示的步骤，可以减轻甘油的毒性。可以理解，如果适用于保藏精子样品，可以使用其他适宜冷冻保护剂，并且图5的步骤也可以类似地减轻那些冷冻保护剂的毒性作用。
冷冻保护剂的第一量可以是介于约0.1％与约5％之间、介于约0.1％与约1％之间、介于约1％与约2％之间、介于约2％与约3％之间、介于约3％与约4％之间、介于约2％与约4％之间或介于约1.5％与约3％之间的冷冻保护剂在染色介质中的vol./vol.或wt./vol.浓度。
一旦染色，在步骤520中，精子样品可以与鞘液接触。接触精子样品的步骤可以通过例如流式细胞术通过空气中喷射流式细胞计数器或者在微流体芯片中的类似过程中易于处理精子样品。在一个实施方案中，如关于图1所述，使精子样品与鞘液接触的步骤发生在空气中喷射流式细胞计数器中。可以理解，然而，步骤520不限于在空气中喷射流式细胞计数器中的处理，而是包括其中使含有精子的精子样品与鞘液接触的处理精子的任何方法。作为非限制性实例，在微流体芯片上分选通常需要建立样品和鞘液穿过流动通道的同轴流。在精子的情况下，精子样品将以层流流动穿过一个或多个流动通道，同时被鞘液包围以聚焦精子细胞的位置并防止其接触流动通道的内部。每一通道中精子样品和鞘液的层流将防止或至少最小化精子样品和鞘液的任何混合，同时保持流体接触。
在步骤522，可以看到，步骤520中所利用的鞘液包括第二量的冷冻保护剂。冷冻保护剂可以与染色介质中的冷冻保护剂相同。或者，冷冻保护剂可为另一冷冻保护剂，例如适宜糖醇，包括乙二醇；甘油；赤藓糖醇；苏糖醇；阿拉伯糖醇；核糖醇；木糖醇；山梨糖醇；半乳糖醇；艾杜糖醇；倭勒米糖醇；岩藻糖醇；肌醇；甘胺酰基葡萄糖醇，或它们的组合；或适宜二醇，例如丙二醇、丁三醇或它们的组合。鞘液可包括以vol./vol.或wt./vol.计介于约0.1％与约2％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约2％与约4％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约4％与约6％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约1％与约2％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约2％与约3％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约3％与约4％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约4％与约5％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约5％与约6％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约2％与约6％之间的冷冻保护剂或以vol./vol.或wt./vol.计介于约3％与约5％之间的冷冻保护剂的第二量的冷冻保护剂。在一个实施方案中，鞘液中冷冻保护剂的第二量与染色介质中发现的冷冻保护剂的第一量大约相同。在替代实施方案中，与染色介质中冷冻保护剂的第一量相比，鞘液中冷冻保护剂的第二量的vol./vol.或wt./vol.浓度较大。在另一实施方案中，可以协调染色介质和鞘液二者中冷冻保护剂的vol./vol.或wt./vol.浓度以达成冷冻保护剂的所需浓度。
在步骤530，操纵精子样品。在一个实施方案中，操纵精子样品以产生具有带有活的X染色体的精子与带有活的Y染色体的精子的操纵的比率的操纵的精子样品。操纵步骤可以通过细胞子集的物理分离来执行，例如在上文参考图1描述的小滴形成实施方案中的情况。但是操纵步骤并不如此受限，而是包括在微流体芯片的流动通道中流体切换或转向流动。或者，光损害激光可以与空气中喷射流式细胞计数器或微流体芯片结合使用，以使精子样品中选定的精子细胞失效，从而留下具有带有活的X染色体的精子与带有活的Y染色体的精子的操纵的比率的操纵的精子样品。或者，可以基于其他特征操纵精子样品。仅作为一个实例，精子样品可以流过流式细胞计数器，以分离可能活的精子与具有受损膜的精子。
图5中绘示的方法的一个实施方案结束于步骤530的操纵的精子样品的产生，而该方法的其他实施方案继续收集操纵的精子样品的步骤540和/或冷冻操纵的精子样品的步骤550。在一个实施方案中，图5的方法任选地进行到步骤540，其中将操纵的精子样品收集在收集介质中。在流式细胞术的情况下，收集介质可描述为位于选择的精子放入其中的收集容器或收集管中的捕获流体。从步骤542可以理解，该实施方案中的收集介质还任选地含有一定量的冷冻保护剂，其可以被认为是冷冻保护剂的第三量。同样，冷冻保护剂可以与染色介质和/或鞘液中的冷冻保护剂相同。或者，冷冻保护剂可为另一冷冻保护剂，例如适宜糖醇，包括乙二醇；甘油；赤藓糖醇；苏糖醇；阿拉伯糖醇；核糖醇；木糖醇；山梨糖醇；半乳糖醇；艾杜糖醇；倭勒米糖醇；岩藻糖醇；肌醇；甘胺酰基葡萄糖醇，或它们的组合；或适宜二醇，例如丙二醇、丁三醇或它们的组合。收集介质可包括以vol./vol.或wt./vol.计介于约1％与约2％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约2％与约4％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约4％与约6％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约6％与约8％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约3％与约7％之间的冷冻保护剂或以vol./vol.或wt./vol.计介于约3.5％与约5.5％之间的冷冻保护剂的第三量的冷冻保护剂。
在本发明的某些实施方案中，冷冻保护剂仅包括在鞘液中，并且不存在于染色介质或收集介质中。在本发明的另一实施方案中，冷冻保护剂包括在鞘液、染色介质和冷冻介质中，但不包括在收集介质中。
在一个实施方案中，该方法从操纵精子样品的步骤530直接进行到冷冻操纵的精子样品的步骤550。举例来说，在用微流体芯片操纵精子样品的情况下，因为没有形成需要缓冲收集介质的小滴，所以收集介质可能不是必需的。然而，设想实施方案，其中收集介质结合在微流体芯片上操纵精子样品使用。
对于图5所体现的方法，步骤550的冷冻可以通过常规技术(例如WO/200137655中描述的那些技术)实现。仅举例来说，一种所述方法可以通过增量待在A级分中冷冻的操纵的精子样品来开始。或者，操纵的精子样品可以收集在收集介质中，包括收集步骤540中的A级分增量剂。仅举例来说，A级分可包含具有20％蛋黄的TRIS柠檬酸盐增量剂。其他适宜增量剂可包括柠檬酸钠、三[羟基甲基]氨基甲烷和TES(N-三[羟基甲基]甲基-2-氨基乙磺酸)和谷氨酸单钠缓冲剂；乳；HEPES缓冲介质；和其任何组合。
冷冻步骤550可以继续冷却操纵的精子样品。操纵的精子样品可以冷却到介于约8℃与4℃之间的温度。在一个具体的实例，操纵的精子样品可以冷却到约5℃。冷却后，可以在一个或多个步骤中添加B级分，然后可以重新浓缩操纵的精子样品。重新浓缩可包括将操纵的精子样品离心成团粒并将精子重新悬浮在最终增量剂(有时称为AB增量剂)中。作为一个实例，AB增量剂所具有的冷冻保护剂的浓度可为B级分中冷冻保护剂浓度的一半。作为非限制性实例，在甘油的情况下，该浓度可以是约6％。其他冷冻方法预计根据图5中绘示的实施方案使用。具体来说，下面描述的某些冷冻方法可以提供与图5中绘示的处理方法的协同作用。
图6中绘示的方法在很大程度上反映了图5中绘示的方法，只是染色介质没有提供冷冻保护剂。在步骤(610)，该方法以在染色介质中染色精子样品的步骤开始。精子样品可以是净精液或在另一溶液中增量的精子，例如如前文所述的那些精子。例如，精子样品可以通过以先前所述方式增量和重新浓缩来标准化。或者，精子样品可采取净精液的形式或用缓冲剂增量和/或添加抗生素的净精液形式。
无论是否标准化，DNA选择性荧光染料可以是在改性的TALP缓冲液中提供的Hoechst 33342(表1)。染色步骤本身可以单一稀释执行，其另外包括淬灭染料。或者，步骤510可以两次稀释执行，例如以用具有DNA选择性荧光染料的改性的TALP的第一次稀释，然后以具有淬灭染料的改性的TALP中的第二次稀释。可以理解，根据该实施例可以使用其他DNA选择性荧光染料和其他淬灭染料。出于该实施方案的目的，每一者都将被称为染色介质。
无论是以一次稀释或两次稀释实现，精子样品可以在染色介质中稀释到介于640×106与40×106精子/ml之间，稀释到介于约320×106与80×106精子/ml之间，稀释到约160×106精子/ml或约120×106精子/ml。DNA选择性荧光染料可以介于约10μM与200μM之间、介于约20μM与100μM之间或介于约30μM与70μM之间的浓度添加到悬浮于染色介质中的精子中。染色介质的pH值可以介于约6.8与7.9之间、介于约7.1与7.6之间，或为约7.4。在两次稀释的情况下，第二次稀释可以在与第一次稀释相同的pH值或接近所述pH值下进行，或者在低pH值(例如介于5.0与6.0之间，或为约5.5)下进行。
任选地，可以将先前描述的抗氧化剂和浓缩物并入染色介质中。精子样品可在30-39℃之间、约32-37℃之间或约34℃下培育。培育时间可在介于约20分钟与约三小时之间、介于约30分钟与约90分钟之间或约45分钟至约60分钟的范围内。
一旦染色，在步骤620中，精子样品可以与鞘液接触。接触精子样品的步骤可以通过例如流式细胞术通过空气中喷射流式细胞计数器或者在微流体芯片中的类似过程中易于处理精子样品。在一个实施方案中，如关于图1所述，使精子样品与鞘液接触的步骤发生在空气中喷射流式细胞计数器中。可以理解，然而，步骤620不限于在空气中喷射流式细胞计数器中的处理，而是包括其中使含有精子的精子样品与鞘液接触的处理精子的任何方法。作为非限制性实例，在微流体芯片上分选通常需要建立样品和鞘液穿过流动通道的同轴流。在精子的情况下，精子样品将以层流流动穿过一个或多个流动通道，同时被鞘液包围以聚焦精子细胞的位置并防止其接触流动通道的内部。每一通道中精子样品和鞘液的层流将防止或至少最小化精子样品和鞘液的任何混合，同时保持流体接触。
在步骤622，可看到，步骤620中利用的鞘液包括第一量的冷冻保护剂，所述冷冻保护剂可为适宜糖醇，包括乙二醇；甘油；赤藓糖醇；苏糖醇；阿拉伯糖醇；核糖醇；木糖醇；山梨糖醇；半乳糖醇；艾杜糖醇；倭勒米糖醇；岩藻糖醇；肌醇；甘胺酰基葡萄糖醇，或它们的组合；或适宜二醇，例如丙二醇、丁三醇或它们的组合。鞘液中冷冻保护剂的第一量可为以vol./vol.或wt./vol.计介于约0.1％与约2％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约2％与约4％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约4％与约6％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约1％与约2％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约2％与约3％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约3％与约4％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约4％与约5％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约5％与约6％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约2％与约6％之间的冷冻保护剂或以vol./vol.或wt./vol.计介于约3％与约5％之间的冷冻保护剂。在一个实施方案中，鞘液中冷冻保护剂的第二量与染色介质中发现的冷冻保护剂的第一量大约相同。在替代实施方案中，与染色介质中冷冻保护剂的第一量相比，鞘液中冷冻保护剂的第二量的vol./vol.或wt./vol.浓度较大。
在步骤630，操纵精子样品。在一个实施方案中，操纵精子样品以产生具有带有活的X染色体的精子与带有活的Y染色体的精子的操纵的比率的操纵的精子样品。操纵步骤可以通过细胞子集的物理分离来执行，例如在上文参考图1描述的小滴形成实施方案中的情况。但是操纵步骤并不如此受限，而是包括在微流体芯片的流动通道中流体切换或转向流动。或者，光损害激光可以与空气中喷射流式细胞计数器或微流体芯片结合使用，以使精子样品中选定的精子细胞失效，从而留下具有带有活的X染色体的精子与带有活的Y染色体的精子的操纵的比率的操纵的精子样品。或者，可以基于其他特征操纵精子样品。仅作为一个实例，精子样品可以流过流式细胞计数器，以分离可能活的精子与具有受损膜的精子。
图6中绘示的方法的一个实施方案结束于步骤630的操纵的精子样品的产生，而该方法的其他实施方案继续收集操纵的精子样品的步骤640和/或冷冻操纵的精子样品的步骤650。在一个实施方案中，图6的方法任选地进行到步骤640，其中将操纵的精子样品收集在收集介质中。在流式细胞术的情况下，收集介质可描述为位于选择的精子放入其中的收集容器或收集管中的捕获流体。从步骤642可以理解，收集介质还任选地含有一定量的冷冻保护剂，其可以被认为是冷冻保护剂的第二量。冷冻保护剂可以与鞘液中的冷冻保护剂相同。或者，冷冻保护剂可为另一冷冻保护剂，例如适宜糖醇，包括乙二醇；甘油；赤藓糖醇；苏糖醇；阿拉伯糖醇；核糖醇；木糖醇；山梨糖醇；半乳糖醇；艾杜糖醇；倭勒米糖醇；岩藻糖醇；肌醇；甘胺酰基葡萄糖醇，或它们的组合；或适宜二醇，例如丙二醇、丁三醇或它们的组合。收集介质可包括以vol./vol.或wt./vol.计介于约1％与约2％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约2％与约4％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约4％与约6％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约6％与约8％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约3％与约7％之间的冷冻保护剂或以vol./vol.或wt./vol.计介于约3.5％与约5.5％之间的冷冻保护剂的第二量的冷冻保护剂。
在一个实施方案中，该方法从操纵精子样品的步骤630直接进行到冷冻操纵的精子样品的步骤650。举例来说，在用微流体芯片操纵精子样品的情况下，因为没有形成需要缓冲收集介质的小滴，所以收集介质可能不是必需的。然而，设想实施方案，其中收集介质结合在微流体芯片上操纵精子样品使用。
对于图6所体现的方法，步骤650的冷冻可以通过常规技术(例如WO/200137655中描述的那些技术)实现。仅举例来说，一种所述方法可以通过增量待在A级分中冷冻的操纵的精子样品来开始。或者，操纵的精子样品可以收集在收集介质中，包括收集步骤540中的A级分增量剂。仅举例来说，A级分可包含具有20％蛋黄的TRIS柠檬酸盐增量剂。其他适宜增量剂可包括柠檬酸钠、三[羟基甲基]氨基甲烷和TES(N-三[羟基甲基]甲基-2-氨基乙磺酸)和谷氨酸单钠缓冲剂；乳；HEPES缓冲介质；和其任何组合。
冷冻步骤650可以继续冷却操纵的精子样品。操纵的精子样品可以冷却到介于约8℃与4℃之间的温度。在一个具体的实例，操纵的精子样品可以冷却到约5℃。冷却后，可以在一个或多个步骤中添加B级分，然后可以重新浓缩操纵的精子样品。重新浓缩可包括将操纵的精子样品离心成团粒并将精子重新悬浮在最终增量剂(有时称为AB增量剂)中。作为一个实例，AB增量剂所具有的冷冻保护剂的浓度可为B级分中冷冻保护剂浓度的一半。作为非限制性实例，在甘油的情况下，该浓度可以是约6％vol./vol.或wt./vol.。其他冷冻方法预计根据图6中绘示的实施方案使用。具体来说，下面描述的某些冷冻方法可以提供与图6中绘示的处理方法的协同作用。
图7中绘示的方法与图5中绘示的方法的不同之处在于鞘液不补充有冷冻保护剂。在步骤(710)，该方法以在染色介质中染色精子样品的步骤开始。精子样品可以是净精液或在另一溶液中增量的精子，例如如前文所述的那些精子。例如，精子样品可以通过以先前所述方式增量和重新浓缩来标准化。或者，精子样品可采取净精液的形式或用缓冲剂增量和/或添加抗生素的净精液形式。
无论是否标准化，DNA选择性荧光染料可以是在改性的TALP缓冲液中提供的Hoechst 33342(表1)。染色步骤本身可以单一稀释执行，其另外包括淬灭染料。或者，步骤510可以两次稀释执行，例如以用具有DNA选择性荧光染料的改性的TALP的第一次稀释，然后以具有淬灭染料的改性的TALP中的第二次稀释。可以理解，根据该实施例可以使用其他DNA选择性荧光染料和其他淬灭染料。出于该实施方案的目的，每一者都将被称为染色介质。
无论是以一次稀释或两次稀释实现，精子样品可以在染色介质中稀释到介于640×106与40×106精子/ml之间，稀释到介于约320×106与80×106精子/ml之间，稀释到约160×106精子/ml或约120×106精子/ml。DNA选择性荧光染料可以介于约10μM与200μM之间、介于约20μM与100μM之间或介于约30μM与70μM之间的浓度添加到悬浮于染色介质中的精子中。染色介质的pH值可以介于约6.8与7.9之间、介于约7.1与7.6之间，或为约7.4。在两次稀释的情况下，第二次稀释可以在与第一次稀释相同的pH值或接近所述pH值下进行，或者在低pH值(例如介于5.0与6.0之间，或为约5.5)下进行。任选地，可以将先前描述的抗氧化剂和浓缩物并入染色介质中。精子样品可在30-39℃之间、约32-37℃之间或约34℃下培育。培育时间可在介于约20分钟与约三小时之间、介于约30分钟与约90分钟之间或约45分钟至约60分钟的范围内。
在步骤712，可以看出步骤710中利用的染色介质包括第一量的冷冻保护剂。冷冻保护剂可以是适宜糖醇，例如乙二醇；甘油；赤藓糖醇；苏糖醇；阿拉伯糖醇；核糖醇；木糖醇；山梨糖醇；半乳糖醇；艾杜糖醇；倭勒米糖醇；岩藻糖醇；肌醇；甘胺酰基葡萄糖醇，或它们的组合。冷冻保护剂也可以是适宜二醇，例如丙二醇、丁三醇或它们的组合。可以理解，所选择的冷冻保护剂可以特异于动物物种，或者甚至特异于品种。例如，在牛精子的情况下可以选择甘油，并且通过执行图7中所示的步骤，可以减轻甘油的毒性。可以理解，如果适用于保藏精子样品，可以使用其他适宜冷冻保护剂，并且图7的步骤也可以类似地减轻那些冷冻保护剂的毒性作用。
冷冻保护剂的第一量可以是介于约0.1％与约5％之间、介于约0.1％与约1％之间、介于约1％与约2％之间、介于约2％与约3％之间、介于约3％与约4％之间、介于约2％与约4％之间或介于约1.5％与约3％之间的冷冻保护剂在染色介质中的vol./vol.或wt./vol.浓度。
一旦染色，在步骤720中，精子样品可以与鞘液接触。接触精子样品的步骤可以通过例如流式细胞术通过空气中喷射流式细胞计数器或者在微流体芯片中的类似过程中易于处理精子样品。在一个实施方案中，如关于图1所述，使精子样品与鞘液接触的步骤发生在空气中喷射流式细胞计数器中。可以理解，然而，步骤720不限于在空气中喷射流式细胞计数器中的处理，而是包括其中使含有精子的精子样品与鞘液接触的处理精子的任何方法。作为非限制性实例，在微流体芯片上分选通常需要建立样品和鞘液穿过流动通道的同轴流。在精子的情况下，精子样品将以层流流动穿过一个或多个流动通道，同时被鞘液包围以聚焦精子细胞的位置并防止其接触流动通道的内部。每一通道中精子样品和鞘液的层流将防止或至少最小化精子样品和鞘液的任何混合，同时保持流体接触。
在步骤730，操纵精子样品。在一个实施方案中，操纵精子样品以产生具有带有活的X染色体的精子与带有活的Y染色体的精子的操纵的比率的操纵的精子样品。操纵步骤可以通过细胞子集的物理分离来执行，例如在上文参考图1描述的小滴形成实施方案中的情况。但是操纵步骤并不如此受限，而是包括在微流体芯片的流动通道中流体切换或转向流动。或者，光损害激光可以与空气中喷射流式细胞计数器或微流体芯片结合使用，以使精子样品中选定的精子细胞失效，从而留下具有带有活的X染色体的精子与带有活的Y染色体的精子的操纵的比率的操纵的精子样品。或者，可以基于其他特征操纵精子样品。仅作为一个实例，精子样品可以流过流式细胞计数器，以分离可能活的精子与具有受损膜的精子。
图7中绘示的方法的一个实施方案结束于步骤730的操纵的精子样品的产生，而该方法的其他实施方案继续收集操纵的精子样品的步骤740和/或冷冻操纵的精子样品的步骤750。在一个实施方案中，图7的方法任选地进行到步骤740，其中将操纵的精子样品收集在收集介质中。在流式细胞术的情况下，收集介质可描述为位于选择的精子放入其中的收集容器或收集管中的捕获流体。从步骤742可以理解，收集介质还含有一定量的冷冻保护剂，其可以被认为是冷冻保护剂的第三量。同样，冷冻保护剂可以与染色介质和/或鞘液中的冷冻保护剂相同。或者，冷冻保护剂可为另一冷冻保护剂，例如适宜糖醇，包括乙二醇；甘油；赤藓糖醇；苏糖醇；阿拉伯糖醇；核糖醇；木糖醇；山梨糖醇；半乳糖醇；艾杜糖醇；倭勒米糖醇；岩藻糖醇；肌醇；甘胺酰基葡萄糖醇，或它们的组合；或适宜二醇，例如丙二醇、丁三醇或它们的组合。收集介质可包括以vol./vol.或wt./vol.计介于约1％与约2％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约2％与约4％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约4％与约6％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约3％与约7％之间的冷冻保护剂、以vol./vol.或wt./vol.计介于约3.5％与约5.5％之间的冷冻保护剂或以vol./vol.或wt./vol.计约4.5％的冷冻保护剂的第三量的冷冻保护剂。
在一个实施方案中，该方法从操纵精子样品的步骤530直接进行到冷冻操纵的精子样品的步骤750。举例来说，在用微流体芯片操纵精子样品的情况下，因为没有形成需要缓冲收集介质的小滴，所以收集介质可能不是必需的。然而，设想实施方案，其中收集介质结合在微流体芯片上操纵精子样品使用。
对于图7所体现的方法，步骤750的冷冻可以通过常规技术(例如WO/200137655中描述的那些技术)实现。仅举例来说，一种所述方法可以通过增量待在A级分中冷冻的操纵的精子样品来开始。或者，操纵的精子样品可以收集在收集介质中，包括收集步骤540中的A级分增量剂。仅举例来说，A级分可包含具有20％蛋黄的TRIS柠檬酸盐增量剂。其他适宜增量剂可包括柠檬酸钠、三[羟基甲基]氨基甲烷和TES(N-三[羟基甲基]甲基-2-氨基乙磺酸)和谷氨酸单钠缓冲剂；乳；HEPES缓冲介质；和其任何组合。
冷冻步骤750可以继续冷却操纵的精子样品。操纵的精子样品可以冷却到介于约8℃与4℃之间的温度。在一个具体的实例，操纵的精子样品可以冷却到约5℃。冷却后，可以在一个或多个步骤中添加B级分，然后可以重新浓缩操纵的精子样品。重新浓缩可包括将操纵的精子样品离心成团粒并将精子重新悬浮在最终增量剂(有时称为AB增量剂)中。作为一个实例，AB增量剂所具有的冷冻保护剂的浓度可为B级分中冷冻保护剂浓度的一半。作为非限制性实例，在甘油的情况下，该浓度可以是约6％vol./vol.或wt./vol.。其他冷冻方法预计根据图7中绘示的实施方案使用。具体来说，下面描述的某些冷冻方法可以提供与图7中绘示的处理方法的协同作用。
图8示出了用于冷冻精子的新方法，其可以与上述分选方法或系统中的任一者结合使用，其中将冷冻保护剂引入用于操纵精子群体的过程中。作为非限制性实例，可以用空气中喷射流式细胞计数器或用微流体芯片操纵精子样品以改变带有活的X染色体的精子与带有活的Y染色体的精子的比率。操纵精子样品的机制可以是小滴偏离、流体切换、用激光进行光损害或其他方式。
无论采用何种方式操纵精子样品，步骤810都从将操纵的精子样品收集在包括冷冻保护剂的混合物中开始。在接收操纵的精子样品之前，冷冻保护剂可以存在于容器中，在操纵之前，冷冻保护剂可以存在于精子样品中。
如前所述，在一个实施方案中，在包括冷冻保护剂的染色介质中染色精子。类似地，在精子样品的操纵期间，可使精子与具有冷冻保护剂的鞘液接触。无论在包括冷冻保护剂的染色介质中染色或在包括具有冷冻保护剂的鞘液的系统中分选或两种情况，冷冻保护剂都保留在精子样品中并且在步骤810与操纵的精子细胞一起收集。
在其中用足够浓度的冷冻保护剂收集精子的实施方案中，可以简化冷冻过程以省略或修改实现冷冻保护剂逐渐引入精子先前所需的步骤。举例来说，与含甘油的染色介质、鞘液或捕获流体接触的操纵的精子可直接从分选器中取出，通过离心浓缩，重新悬浮于冷冻保护剂中，然后冷冻保藏。在另一实施方案中，在重新悬浮于冷冻保护剂中后，在冷冻保藏之前，将精子保持小于24小时、小于8小时、小于4小时、2小时、小于2小时或小于1小时的保持时间。在另一实施方案中，在保持时间期间冷却精子。在本发明的具体实施方案中，使精子与包含3％甘油(vol./vol.或wt./vol.)的鞘液接触，通过离心浓缩，重新悬浮于包含4.5％甘油(vol./vol.或wt./vol.)的冷冻保护剂中，然后冷冻保藏。因此，上述所提到的实施方案不包括在浓缩精子的步骤之前冷却精子和向冷却的精子中添加冷冻保护剂的步骤。
实施例1-10的设置和条件
分选器设置-所有分选分析和分选均是在改进的MoFlo-SX(Beckman Coulter，Brea California)精子分拣机上使用Genesis数字处理硬件升级(可从CytonomeST,Boston,Massachusetts获得)和精子分选特定软件执行。Genesis分选软件包括参数登记功能，其记录各种参数的平均值，所述参数是例如事件率(以KHz为单位)、分选率(以KHz为单位)、中止率(以KHz为单位)、死精子量(表示为死精子事件率除以事件率(以％表示))、活的定向量(表示为活的定向精子事件除以事件率(以％表示))、X门控量(表示为选择收集的活的定向精子的百分比)和峰值与谷值比率(PVR)。批量分选是指使用X闸门量来包括带有X染色体的精子和带有Y染色体的精子以提供精子，基于分选和冻结后的精子质量不受精子性别的影响并且批量分选比性别分选快约两倍的经验，所述精子通过分选方法处理但未经性别选择。从带有空气头的加压罐内的无菌鞘液袋或从供应SheathMasterTM(CytonomeST)精密度流体递送系统的鞘液袋或开口烧杯提供加压鞘液，其中压力施加于小体积加压充满物质的空间。在这两种情况下，通过由MoFlo样品站控制的气压精确控制鞘液流速。用于商业生产有性精液的基于TRIS的鞘液用于所有分选。
鞘液改变的不连续方法-将多个各自含有特定量甘油的基于TRIS的鞘液放入无菌袋或开口烧杯中，并且用于分别从加压罐或SheathMasterTM流体递送系统供应分选器。每一鞘液的甘油浓度通过其组成已知。
精子染色-将每毫升1.6亿新鲜射精的牛精子用改性的TALP中的65.0mMHoechst33342在34℃下染色60分钟，冷却至室温，并用1/3体积的补充8％v/v澄清蛋黄的相同改性的TALP稀释，以产生1.2亿精子/毫升的最终精子浓度和2％v/v的蛋黄浓度，然后通过Partee 50微米过滤器过滤。
比对精子以建立/测量PVR-PVR(峰值与谷值比率)是在运行分选器的Genesis计算机的图形使用者界面上以图形方式绘示的单变量图的客观测量。图3的单变量图示出了在向前方向上具有不同荧光强度的事件的频率。精确比对的染色的精子样品中的表示对应于两条重叠曲线，其中在两个不同峰值强度(两个最大值)处具有相似数量的事件，以及两条曲线开始重叠的位置，并且来自两条曲线中的每一者的样品的数量大约相等(两个最大值之间的单一局部最小值约等距)。局部最小值可称为谷值(V)，而两个局部最大值可称为峰值(P)，该实施例中利用的值P是两个峰值强度值的平均值。在软件中测定P和V的序数值，根据其用以下方程计算PVR：((P-V)/P)*100。在分析之前，由训练有素的操作员在精子分选器上执行比对，以校正光学器件、精子分选喷嘴和尖端以及前方荧光检测器(FAF)和侧荧光检测器(SAF)的定位。另外，必须对FAF和SAF应用适当的信号增益。
PVR的登记数据分析-Genesis分选器操作软件提供PVR的即时计算。对于每25,000个事件，将PVR计算并缓冲为原始值，而平均化100个连续发生的PVR原始值测量。可以根据操作员的要求记录(登记)平均PVR值。通常，由于由更窄的核心样品流横截面引起的个别事件(精子)测量值的精密度得到改善，以较低的事件率操作流细胞计数器会产生改善的PVR比率。首先优化比对用于以40,000个事件/秒分选，然后应用分选闸门(其实例如在图4中视为R1、R3和R4)以同时收集活的X群体和活的Y群体(批量分选)并且在未进行任何进一步修饰的情况下在平均值需求之前在对应于500,000至700,000个分选细胞的时间量内操作分选器，从而确保登记的参数是代表性平均值。在以40,000个事件/秒的平均值需求之后，操作员降低染色的精子样品压力以适应建立约30,000的事件率的新压力，分选门同时应用于活的X群体和活的Y群体(批量分类)并且在未进行任何进一步修饰的情况下在平均值需求之前在对应于500,000至700,000个分选细胞的时间量内操作分选器。对于以20,000个事件/秒运行的样品重复相同的操作。然后增加样品压力以建立40,000/秒的平均事件率，然后进行比对(如果需要)和如上所述的三次连续测量。这是随着时间的推移连续完成的，然后分析登记的数据。
实施例1
表2总结实施例1的处理。
表2.
1.从公牛获得一次射精。
2.针对运动率和形态对射精进行质量检查(QC)并且估计精子细胞浓度。
3.通过将射精与保持介质(生理盐水盐和具有蛋黄和营养素的缓冲液)分别以1:3比率组合来标准化射精，并且然后根据上述参考染色程序染色。
4.将对照鞘液(SF)连接到流动细胞计数器，并将废液收集在预称重管中3分钟。
5.称重管中的流体以测定每一特定鞘液的流速。
6.将染色的样品放在分选器上并验证液滴延迟。
7.收集以30,000、20,000和40,000eps性别分选的100万精子的登记的流式细胞计数器数据。
8.收集登记的数据后，对高达20mL的1个捕获管进行批量分选。
9.对于处理组，使用上面表2中描述的每一处理鞘液重复步骤7和8。
10.收集登记的数据后，对每次处理高达40mL的1个捕获管进行批量分选。
11.将所有捕获管在冷室中放置90分钟。
12.向对照中添加20mL冷冻介质(12％vol./vol.甘油)(两步添加)。
13.将所有捕获管离心并倾析上清液。
14.向每一捕集管中添加适当体积的AB(6vol./vol.％甘油)，以使每1/4cc AI吸管的精子浓度达到4百万个细胞/吸管。
15.将稀释的精子在冷室中保持过夜。
16.将精子放在吸管中并冷冻保藏。
17.使用来自同一头公牛的射精，将步骤1-16再重复两次。
18.对于对照和每一治疗，评价PVR。结果示于图9中。也在解冻后0和3小时评价精子运动率(IVOS II)、存活率(PI)和PIA(PNA)。结果分别示于图10和图11中。
实施例2
代替上述鞘液变化的不连续方法，实施例2利用如下鞘液变化的梯度鞘液方法。
鞘液变化的梯度鞘液方法-通过磁力搅拌棒搅拌烧杯1，所述烧杯向SheathMasterTM流体递送系统提供鞘液并且含有具0％甘油的牛鞘液。利用蠕动泵将烧杯2中含有6％vol./vol.甘油的牛鞘液(820mM)缓慢泵入烧杯1，从而在约3小时的时间内在烧杯1中提供连续增加的甘油浓度，其中最终甘油浓度是约5.5％vol./vol.(750mM)。通过测量离开喷嘴的鞘液的渗透压并将测量值与适当的标准曲线进行比较来确定时间间隔的甘油浓度。鞘液中甘油的典型曲线是甘油(G)百分比＝(测量的mOsm(X)-300)/161，或者换种说法，161mOsm的每一增加对应于甘油浓度的1％(vol./vol)增加。
1.从三头公牛获得新鲜射精。
2.按照实施例1中描述的方法对射精进行QC、标准化和染色。
3.将含有0％甘油鞘液的烧杯连接到流式细胞计数器的流体递送系统。用磁力搅拌棒连续混合流体。
4.将染色的精子样品放在流细胞计数器上并验证液滴延迟。
5.以20,000eps、然后30,000eps并且最后40,000eps对100万精子前向别分选。
6.将6.0vol./vol.％甘油鞘液以204g/h的平均速率用蠕动泵泵入0％甘油鞘液中。
7.以不同的事件率连续收集登记的流式细胞计数器数据，直至仅6.0vol./vol.％甘油鞘液可用。
8.计算每一对照和处理样品的PVR。结果示于图12中。
实施例3
表3总结了实施例3的处理。
表3.
1.从十头公牛获得射精。
2.按照实施例1中描述的方法对射精进行QC、标准化和染色。
3.对高达20mL的1个捕获管进行批量分选。
对照-将管在冷室中放置90分钟。
向对照中添加20mL冷冻介质(12％vol./vol.甘油)(两步添加)。
4.重复步骤3。使用3.5vol./vol.％甘油鞘液(SF)对高达40mL的4个捕获管进行批量分选。
处理1-将管在冷室中放置90分钟。
处理2-将管在冷室中放置30分钟。
处理3-保持在室温下直至准备离心
处理4-保持在室温下直至准备离心
5.将所有捕获管离心并倾析上清液。
6.向每一捕集管中添加适当体积的冷的AB(6％甘油vol./vol.)，以使每1/4cc AI吸管的精子浓度达到4百万个细胞/吸管，只是向处理4中添加室温的AB。
7.将稀释的精子在冷室中保持过夜。
8.将精子细胞放在吸管中并冷冻保藏(每次处理3个吸管，4百万个细胞/吸管)。
9.解冻后0和3hr评价运动率(IVOS)、存活率(PI)和PIA(PNA)。结果示于图13中。运动率、存活率和PIA的集合(3hr/0hr)示于图14中。
实施例4
表4总结了实施例4的处理。
表4.
1.从五头公牛获得射精。
2.按照实施例1中描述的方法对射精进行QC、标准化和染色。
3.对高达20mL的1个捕获管进行批量分选。
对照-将捕获管在冷室中放置90分钟。
向对照中添加20mL冷冻介质(12％vol./vol.甘油)(两步添加)。
将所有捕获管离心并倾析上清液。
向每一捕集管中添加适当体积的AB(6％甘油vol./vol.)，以使每1/4cc AI吸管的精子浓度达到4百万个细胞/吸管。
4.连接3.0％甘油鞘液(SF)并加压罐。
5.对高达40mL的2个捕获管进行批量分选：
处理1-将捕获管在冷室中放置90分钟。
处理2-将捕获管在冷室中放置0分钟。
6.连接5.0vol./vol.％甘油鞘液并加压罐。
7.对高达40mL的4个捕获管进行批量分选：
处理3-将捕获管在冷室中放置90分钟。
处理4-将捕获管在冷室中放置0分钟。
将所有管离心并倾析上清液。
向每一管中添加AB(5vol./vol.％甘油)，达到最终每个吸管4百万个精子。
8.将稀释的精子在冷室中保持过夜。
9.将精子细胞放在吸管中并冷冻保藏。
10.解冻后0和3hr评价运动率(IVOS)、存活率(PI)和PIA(PNA)。结果示于图15中。运动率、存活率和PIA的集合(3hr/0hr)示于图16中。
实施例5
表5总结了实施例5的处理。
表5.
1.从四头公牛获得射精。
2.按照实施例1中描述的方法对射精进行QC、标准化和染色。
3.收集鞘液对照并且加压鞘液罐。
4.将染色的样品放在流细胞计数器上并验证液滴延迟。
5.使用3.5vol./vol.％甘油鞘液(SF)对高达40mL的1个捕获管进行批量分选。
6.使用3.5vol./vol.％乙二醇SF对高达40mL的1个捕获管进行批量分选。
7.使用3.5vol./vol.％丙二醇SF对高达40mL的1个捕获管进行批量分选。
8.使用3.5vol./vol.％赤藓糖醇SF对高达40mL的1个捕获管进行批量分选
9.使用5.0vol./vol.％赤藓糖醇SF对高达40mL的1个捕获管进行批量分选。
10.对所有管进行离心和倾析。
11.以能够产生400万精子/吸管的量向每一管中添加AB 5％甘油vol./vol.。
12.将稀释的精子在冷室中保持过夜。
13.将精子细胞放在吸管中并冷冻保藏。
14.评价解冻后0和3hr的运动率(IVOS)、存活率(PI)和PIA(PNA)。结果示于图17中。运动率、存活率和PIA的集合(3hr/0hr)示于图18中。
实施例6
表6总结了实施例6的处理。
表6.
1.从四头公牛获得新鲜射精。
2.按照实施例1中描述的方法对射精进行QC、标准化和染色。
3.收集鞘液对照并且加压鞘液罐。
4.使用0.0％甘油鞘液(SF)批量分选高达40mL的1个捕获管(对照)
5.使用1.0％vol./vol.甘油SF批量分选高达40mL的1个捕获管(T1)
6.使用3.0％vol./vol.甘油SF批量分选高达40mL的1个捕获管(对照2)
7.使用3.0％vol./vol.甘油SF批量分选高达40mL的1个捕获管(T2)
8.使用5.0％vol./vol.甘油SF批量分选高达40mL的1个捕获管(T3)
9.使用7.0％vol./vol.甘油SF批量分选高达40mL的1个捕获管(T4)
10.将对照管在冷室中放置90分钟并且添加20mL冷冻介质(12％v/v甘油)(两步添加)。
11.对所有管进行离心和倾析。
12.向每一管中添加足够AB以产生400万精子/吸管：
AB 6.0％甘油vol./vol.(对照)
AB 1.0％甘油vol./vol.(T1)
AB 3.0％甘油vol./vol.(T2)
AB 5.0％甘油vol./vol.(T3和对照2)
AB 7.0％甘油vol./vol.(T4)
13.然后将稀释的精子在冷室中保持过夜。
14.将精子细胞放在吸管中并冷冻保藏。
15. 0和3hr解冻后运动率(IVOS II)示于图19中。0和3hr解冻后存活率(PI)和PIA(PNA)示于图20中。
实施例7
表7总结了实施例7的处理。
表7.
1.从四头公牛获得新鲜射精。
2.按照实施例1中描述的方法对射精进行QC、标准化和染色。
3.收集鞘液对照并且加压鞘液罐。
4.使用0.0％vol./vol.甘油鞘液(SF)批量分选高达20mL的1个捕获管(对照)
5.使用3.0％vol./vol.甘油SF批量分选高达40mL的1个捕获管(对照2)
6.使用1.0％vol./vol.甘油SF批量分选高达40mL的1个捕获管(T1)
7.使用3.0％vol./vol.甘油SF批量分选高达40mL的1个捕获管(T2)
8.使用5.0％vol./vol.甘油SF批量分选高达40mL的1个捕获管(T3)
9.使用7.0％vol./vol.甘油SF批量分选高达40mL的1个捕获管(T4)
10.将对照管在冷室中放置90分钟并且添加20mL冷冻介质(12％vol./vol.甘油)(两步添加)。
11.对所有管进行离心和倾析。
12.向每一管中添加足够AB以产生400万精子/吸管：
AB 6.0％甘油vol./vol.(对照)
AB 5.0％甘油vol./vol.(对照2)
AB 1.0％丙二醇vol./vol.(T1)
AB 3.0％丙二醇vol./vol.(T2)
AB 5.0％丙二醇vol./vol.(T3)
AB 7.0％丙二醇vol./vol.(T4)
13.然后将稀释的精子在冷室中保持过夜。
14.将精子细胞放在吸管中并冷冻保藏。
15. 0和3hr解冻后运动率(IVOS II)示于图21中。0和3hr解冻后存活率(PI)和PIA(PNA)示于图22中。
实施例8
表8总结了实施例8的处理。
表8.
1.从四头公牛获得新鲜射精。
2.按照实施例1中描述的方法对射精进行QC、标准化和染色。
3.收集鞘液对照并且加压鞘液罐。
4.将染色的样品放在流细胞计数器上并验证液滴延迟。
5.使用3.0％甘油鞘液(SF)对高达40mL的7个捕获管进行批量分选。
6.对所有管进行离心和倾析。
7.向每一管中添加足够AB以产生400万精子/吸管：
AB 3.0％甘油vol./vol.(T1)
AB 3.5％甘油vol./vol.(T2)
AB 4.0％甘油vol./vol.(T3)
AB 4.5％甘油vol./vol.(T4)
AB 5.0％甘油vol./vol.(T5)
AB 5.5％甘油vol./vol.(T6)
AB 6.0％甘油vol./vol.(T7)
8.然后将稀释的精子在冷室中保持过夜。
9.将精子细胞放在吸管中并冷冻保藏。
10. 0hr和3hr运动率(可视和IVOS)示于图23和图25中。0hr和3hr存活率(PI)和PIA(PNA)示于图24和图26中。运动率的集合(3hr/0hr)示于图27中。存活率和PIA的集合示于图28中。
实施例9
表9总结了实施例9的处理。
表9.
1.从十头公牛获得新鲜射精。
2.按照实施例1中描述的方法对射精进行QC、标准化和染色。
3.收集鞘液对照并且加压鞘液罐。
4.使用0.0vol./vol.％甘油鞘液(SF)对高达20mL(或1500万精子)的2个捕获管进行批量分选。
5.将管在冷室中放置90分钟并且添加20mL冷冻介质(12％vol./vol.甘油)(两步添加)。
6.连接处理鞘液并且加压鞘液罐。
7.将染色的样品放在流细胞计数器上并验证液滴延迟。
8.使用3.0％vol./vol.甘油SF+α-酮戊二酸(AKG)对高达40mL(或3000万精子)的1个捕获管进行批量分选。
9.对所有管进行离心和倾析。
10.向每一管中添加AB：
1200uL AB 6.0％甘油vol./vol.(对照1和对照2)
1200uL AB 4.5％甘油vol./vol.(T1和T2)
11.将对照1和T1精子在AB中保持2小时并且然后冷冻保藏在AI吸管中(每次处理2个吸管，400万精子/吸管)。
12.将对照2和T2在AB中保持过夜并且然后冷冻保藏在AI吸管中(每次处理2个吸管，400万精子/吸管)。
13.评价解冻后0和3hr的运动率(可视和IVOS)、存活率(PI)、PIA(PNA)和集合(0hr/3hr)。0hr运动率(可视和IVOS)、存活率和PIA示于图29中。3hr运动率(可视和IVOS)、存活率和PIA示于图30中。运动率、存活率和PIA的集合(3hr/0hr)示于图31中。
实施例10
表10总结了实施例10的处理。
表10.
1.从三头公牛获得新鲜射精。
2.按照实施例1中描述的方法对射精进行QC、标准化和染色。
3.收集处理1(对照)鞘液(无甘油)并且加压鞘液罐。
4.对高达20mL(或1500万精子)的4个对照捕获管进行批量分选。
5.将管在冷室中放置90分钟并且添加20mL冷冻介质(12％vol./vol.甘油)(两步添加)。
6.连接处理2(3％vol./vol.甘油与AKG)鞘液并且加压罐。
7.对高达40mL(或3000万精子)的2个捕获管进行批量分选。
8.然后对所有管进行离心和倾析。使T1的团粒(4个管)固结。使T2的团粒(2个管)固结。
9.向每一管中添加AB：
向处理1中添加AB 6.0％甘油vol./vol.
向处理2中添加AB 4.5％甘油vol./vol.
10.将稀释的精子在AB中保持2小时并且然后冷冻保藏在AI吸管中(400万精子/吸管)。
11.然后通过IVF受精200个卵母细胞/处理。IVF的结果示于图32中。
实施例11
实施例11包括现场试验以测试使用包含3vol./vol.％甘油和0.0875mg/mL的α-酮戊二酸的鞘液分选的有性精液实现的受孕率。利用接受1至3次用90％雌性性别分选的精液的AI授精的5只种畜和超过3000只小母牛(直至第3次泌乳期)。
实施例11的结果示于图33和图34中。图33显示现场试验中所用的精子的解冻后运动率、PIA、集合和存活率。图34显示所达成的受孕率。
实施例12
实施例12测试了稀释的甘油溶液(“冷冻剂”)的效能，所述甘油溶液当与计算量的TRIS A(TRIS+20％蛋黄)混合时变为AB，从而在精子分选实验室中不需要纯甘油。
表11总结了实施例12的处理。
表11.
1.从公牛获得五次射精。
2.按照实施例1中描述的方法对射精进行QC、标准化和染色。
3.使用含有甘油3.0％vol./vol.+α-酮戊二酸(AKG)的鞘液对4个捕获管进行批量分选。
4.将管在冷室中放置15分钟。
5.将所有管离心并倾析并且使团粒固结。
6.将团粒分到含有如下获得的AB 4.5％甘油的5个管中：
对照-利用纯甘油(100％v/v)制备
处理1-利用20％冷冻剂制备
处理2-利用45％冷冻剂制备
处理3-利用65％冷冻剂制备
7.将精子保持过夜并冷冻。
8.执行0和3h运动率(可视和IVOS)、存活率(PI)和PIA(PNA)。
实施例12的结果示于图35中，其显示当AB是利用冷冻剂(稀释的甘油)代替100％甘油vol./vol.制备时的有益作用。
实施例13
表12总结了实施例13的处理。
表12.
1.从8头公牛获得射精。
2.按照实施例1中描述的方法对射精进行QC、标准化和染色。
3.对照-在分选器A上对于公牛1-4并且在分选器B上对于公牛5-8使用鞘液(0.0％甘油)。
将每头公牛高达20mL(或1500万)的1个捕获管批量分选到Tris A(0.0％甘油，无AKG)中。
将管在冷室中放置90分钟。冷却下来后添加冷冻介质(12％vol./vol.甘油)。
4.处理-在分选器B上对于公牛1-4并且在分选器A上对于公牛5-8使用包含3.0％甘油和0.0875mg/mL AKG的鞘液。
将每头公牛高达40mL(或3000万)的1个捕获管批量分选到包含2.4vol./vol.％甘油的捕获流体中。
将管在冷室中放置15分钟。
5.对所有管进行离心和倾析。
6.分别向对照管和处理管中添加以下物质：
向对照管中添加AB 6.0％甘油
向处理管中添加AB 4.5％甘油
7.将精子在AB中保持12小时(过夜)并且然后冷冻。
8.执行0和3h可视和IVOS运动率、存活率(PI)和PIA(PNA)。计算每一参数的集合。
实施例13的结果示于图36中。
实施例14
实施例14表明，在新鲜的牛增量剂中可以使用多达400毫摩尔的赤藓糖醇，并且在4天的时间内具有良好的牛精子运动支持。这是利用用Hoechst 33342染色的“常规”(未分选)精子(以使用荧光促进CASA)。
新鲜增量剂是类似于Caprogen的介质，其含有5％(v/v)蛋黄并在稀释精子之前用氮气鼓泡。
含甘油的Caprogen是本实施例中比较的介质之一并且包括以下组分：
柠檬酸三钠二水合物，20.0克；柠檬酸一水合物，0.25克；甘氨酸，10.0克；D-(+)-葡萄糖，3.0克；无水磷酸氢二钾，0.609克；正己酸(己酸)，0.231mL；氰基钴胺素，0.250克；α酮戊二酸二钠二水合物，0.35克；海藻糖二水合物，0.750克；甘油，10.0mL；硫酸链霉素，0.150克，庆大霉素，0.500克；泰乐菌素，0.100克；林可霉素，0.300克；大观霉素，0.500克；鸡蛋黄，5.0mL。
含赤藓糖醇的Caprogen是本实施例中比较的另一种物质并且包括以下组分：
柠檬酸三钠二水合物，20.0克；柠檬酸一水合物，0.225克；甘氨酸，8.653克；D-(+)-葡萄糖，2.50克；无水磷酸氢二钾，0.609克；正己酸钠盐(己酸)，0.276mL；氰基钴胺素，0.250克；α酮戊二酸二钠二水合物、海藻糖二水合物，0.750克、0.35克；赤藓糖醇，14.64克；硫酸链霉素，0.150克，庆大霉素，0.500克；泰乐菌素，0.100克；林可霉素，0.300克；大观霉素，0.500克；鸡蛋黄，5.0mL。
在含甘油的Caprogen中，甘氨酸的浓度为135毫摩尔，并且甘油的浓度为135毫摩尔。对照介质1是用这些相同的浓度制得，而用如表13中所示的以下浓度平衡测试介质(介质2-7)：
表13.
将5只公牛的新鲜的牛射精稀释到每毫升1.6亿精子进入染色TALP，与Hoechst33342DNA染色剂组合，在34℃下培育60分钟(作为XY精子分选的标准染色)。一旦染色，将TALP中的精子在相关介质中稀释到每毫升1500万精子的新浓度，并且置于0.25cc吸管中，密封并在18℃下水平保持4天。在每一天，将一吸管精子在34℃加热15分钟，并且将来自吸管的约200微升的内容物与100微升与用于容纳精子的指定测试介质相同的新鲜介质组合。使用UV照射在荧光CASA(Hamilton Thorne IVOS II)上分析精子。表14和图37中总结了5头公牛的平均总运动率和前向运动率。
表14.
该试验显示，135毫摩尔甘油有利于支持高达4天的精子运动，并且在Caprogen新鲜介质中用赤藓糖醇替代甘油提供类似的精子运动支持，赤藓糖醇的益处出现在更长的4天时间中。
实施例15
实施例15表明，当比较可视和CASA运动率时，在17℃下储存长达9天的分选的牛精子增量的标准Caprogen配方中的甘油可以用赤藓糖醇完全替换以产生更长时间的精子储存。标准Caprogen(含甘油)被称为“CaproGLY”，并且含有赤藓糖醇的Caprogen被称为“CaproERY”。
制备100mL体积的介质：将95mL相应介质工作溶液与5mL蛋黄组合，搅拌15分钟，在4℃下保持过夜，在50mL Falcon管中以1200G离心60分钟(澄清)。在使用当天，将氮气鼓泡通过澄清的介质15分钟。表15显示2种介质的性质。
表15.
待保持在两种新鲜增量剂中的精子的分选：按照其他专利中公开的标准专有性别分选方法批量分选3头泽西公牛的新鲜射精。简言之，将精子洗涤，浓缩并重悬浮于Hepes缓冲的TRIS柠檬酸盐增量剂中以正规化浓度至约1200精子/mL和pH值为约7.15。每1mL染色包括：0.150mL精子溶液(约1.6亿精子)、64纳摩尔Hoechst 33342(8微升)、592mL染色TALP和100纳摩尔FD&C食品染料。将样品在4mL样品管中于34℃下培育60分钟，其后0.25mL 8％(v/v)蛋黄TALP，将精子稀释到约1.2亿/mL，并为待分选的样品提供2％的最终蛋黄浓度。
以约40,000/秒的事件率批量分选新鲜染色的精子，其中批量分选意味着收集带有活的定向精子的X染色体和Y染色体，明确地，分选的精子与标准分选的精子的质量相当，但不针对性别富集。将来自3头泽西公牛中的每一者的8000万精子分选到TRIS A捕获流体中，在冷柜(典型温度4-7℃)中冷却最少90分钟，与非蛋黄TRIS B溶液以相等体积混合，通过离心浓缩并回收精子团粒并测定最终浓度(浓缩的精子)在1亿-1.15亿精子/mL的范围内。然后将3体积的CaproGLY或CaproERY与1体积的浓缩的精子组合到最终配制浓度约2000万-2400万/mL(约500万-550万精子/0.25cc吸管)。
将配制的精子装入0.25cc吸管中，密封并在17℃下水平储存最多9天。在指定的试验天，打开吸管并检查可视运动率(在加热阶段由技术人员使用显微镜分析通过眼睛计数)，使用Hamilton Thome IVOS系统检查CASA总运动率和CASA前向运动率。除吸管外，将6个样品中的每一者的0.50mL样品在17℃下储存在4mL样品管中，以便在第8天进行比较。
表16总结了三头泽西公牛在不同天的平均运动率。
表16.
上述结果显示，当遵循具有相等摩尔浓度的甘氨酸和伴随的多元醇(甘油或赤藓糖醇)的原理时，用赤藓糖醇完全取代甘油产生了与利用甘油所制得一样好或更好的相当的Caprogen新鲜精液增量剂。对于保持时间超过4天，赤藓糖醇在保持质量方面(如运动率所见)更好。也似乎管中的储存可能比吸管更好。
实施例16
实施例16显示，使用赤藓糖醇代替甘油的Caprogen介质中所储存的性别分选的精子能够产生与标准Caprogen类似的许多妊娠。
为了在CaproGLY运作良好的情况下使用CaproERY作为替代品来预评估可能的生育力结果，使少数(约145)头小母牛在四个时间段中繁殖并使用储存在CaproGLY中的性别分选的精子与来自同一个农场的相同公牛的数据进行比较。通常，利用新鲜的增量的精液，使小母牛在分选和配方日的1-2天内繁殖。
下表17总结了CaproERY研究现场测试的结果。
该研究现场测试不使用分裂处理，在每个处理中无均匀分布的吸管数量，并且在公牛与农场之间不相等地分布。因此，相对标称值(57.4％对53.1％)没有统计学差异。在40个月的时间段内，两个值都在针对CaproGLY所见的标准范围内，因此，CaproERY产生类似的生育力。
实施例17
实施例17展现，赤藓糖醇可用于(在具有或无甘氨酸的情况下)鞘液中用于精子分选或冷冻增量剂的浓度介于15-110毫摩尔之间且等于或优于无赤藓糖醇的标准对照介质。
标准牛精子分选使用包含68mM果糖、80mM柠檬酸盐和243mM TRIS的鞘液，pH值为6.80，渗透压为290-300mOsm。(对照鞘液)。将80体积的这种对照鞘液与20体积的新鲜蛋黄组合，之后澄清得到称为TRIS A的对照冷却溶液(“A级分”)。将88体积的TRIS A与12体积的纯甘油相组合，产生称为TRIS B的溶液(“B级分”)。在标准精子分选的情况下，“B级分”可以任选地不含蛋黄，并且可以被称为“无蛋B级分”，其仍含有12体积的纯甘油。
表18显示了该测试中所用的组分的毫摩尔浓度，其中对照介质不含任何甘氨酸或赤藓糖醇，并且测试样品含有不同量的赤藓糖醇，并且在一些情况下含有甘氨酸。所有介质的pH值为6.70-6.75，并且渗透压为290-305mOsm。
表18.
两个测试中的每一者使用相同的两个公牛，并且同时测量解冻后的质量。第一测试是使用类似于标准“常规冷冻”的未染色的未分选的精子进行。第二测试是使用不同的鞘液进行分选精子。
第一测试比较了对照(标准介质)与7种替代介质(A-G)，其中组合物包括不同量的赤藓糖醇并且在一些情况下包括甘氨酸。将浓度为1亿精子/毫升的每一公牛的10毫升精子在90分钟内在标准TRIS A(对照介质)中从室温冷却到约4-6℃。然后将样品分成1毫升等分试样并添加0.5mL冷的TEST-B介质，保持15分钟，然后再添加0.5mL TEST-B介质。这导致最终精子浓度为5000万/mL。将这些样品装入0.25cc冷冻保藏吸管中，并以通常用于冷冻常规精液的受控蒸汽冷冻方法冷冻。
TEST-B介质中的甘油浓度总是6.0％(vol/vol)，导致最终甘油浓度为3.0％(vol/vol)。所有TEST-B介质都具有0％蛋黄，产生10％(vol/vol)的最终蛋黄浓度。冷冻时化学组分的浓度如表中所示(对照对A-G)。这些条件在标准量的蛋黄(20％)中冷却精子，将其冷冻保藏在1/2标准量的蛋黄和甘油中。可视运动率结果显示，在所述控制条件下，所有7种含有赤藓糖醇的介质都支持冷冻保藏，与无任何赤藓糖醇的对照一样好或更好。结果显示，冷冻牛精子中可以使用高达约110mM的赤藓糖醇，用15-50mM赤藓糖醇实现最佳冷冻结果。
第二测试比较对照(标准)鞘液与三种替代鞘液(H-J)。所有鞘液的组成示于表中。分选后，以与标准精子分选相同的方式处理所有样品。将3.5mL体积的捕获流体(TRIS A)置于每一捕获管中，并将分选的精子分选到捕获管中至体积为20mL。然后将该体积的液体冷却90分钟至约4-6℃，然后添加相等体积的冷的无蛋B级分。通过离心浓缩精子细胞并弃去上清液，并将其重新悬浮在通过混合相等体积的A级分和B级分制备的蛋黄TRIS AB级分中。将细胞配制成约1800万/mL，并以通常用于冷冻常规精液的受控蒸汽冷冻方法(与上述相同)在0.25cc吸管中冷冻。
结果显示，鞘液中可存在高达60mM的赤藓糖醇，并且在用于精子的分选后处理的标准方法中有益于精子质量。
从前文可以容易地理解，本发明的基本概念可以以各种方式体现。本发明涉及多种改变的处理精子的实施方案，包括但不限于本发明的最佳模式。
因此，本说明书中所公开或在伴随本申请的图或表中所公开的本发明的特定实施方案或要素并非旨在进行限制，而是例示在属类上由本发明涵盖的多种改变的实施方案，或关于其任何特定要素涵盖的等同物。另外，本发明的单一实施方案或要素的具体描述可能未明确描述所有可能的实施方案或要素；许多替代方案由说明和图隐含地公开。
应当理解，装置的每一元件或方法的每一步骤可以由装置术语或方法术语描述。在需要时可以替换这些术语以明确本发明所赋予的隐含的广泛覆盖度。仅作为一个实例，应当理解，方法的所有步骤可以被公开为动作、采取该动作的方式，或者引起该动作的要素。类似地，装置的每一元件可以被公开为物理元件或该物理元件促进的动作。仅作为一个实例，“分选器”的公开应理解为涵盖“分选”动作的公开-无论是否明确讨论-并且相反地，有效地公开“分选”的动作，例如所述公开应理解为涵盖“分选器”的公开，并且甚至包括“用于分选的构件”。每一元件或步骤的所述替代术语应理解为明确地包括在说明中。
另外，关于每一使用的术语，应理解，除非在本申请中的使用与这种解释不一致，否则应该将常见的辞典定义理解为包括在Random House Webster的Unabridged辞典(第二版)中所含有的每一术语的描述中，每一定义以引用方式并入本文。
此外，出于本发明的目的，术语“一个”(“a”或“an”)实体是指该实体中的一者或多者。因此，术语“一个”(“a”或“an”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。
无论是否明确指出，假定本文中的所有数值均由术语“约”修饰。出于本发明的目的，范围可以表示为从“约”一个特定值到“约”另一特定值。当表示所述范围时，另一实施方案包括从一个特定值到另一特定值。通过终点包含的数值范围的引用包括该范围内包含的所有数值。数值范围为1到5包括例如数值1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等。应进一步了解，各范围的端点在与另一端点有关和与另一端点无关两种情况下都具有意义。当一值通过使用先行词“约”表示为近似值时，应理解，该特定值形成另一实施方案。
本专利申请的背景部分提供本发明所属的努力领域的声明。本部分还可以并入或含有某些美国专利、专利申请案、出版物或要求保护的发明的标的物的释义，其用于涉及关于本发明所针对的技术状态的信息、问题或关注。本文所引用或并入的任何美国专利、专利申请、出版物、声明或其他信息均不打算被解释、理解或视为被接纳为关于本发明的现有技术。
本说明书中阐述的权利要求(如果有的话)通过引用并入本文作为本发明的描述的一部分，并且申请人明确保留使用这些权利要求的所述并入的内容的全部或一部分作为附加说明的权利，以支持任何或所有权利要求或其任何要素或组分，并且申请人进一步明确保留将这些权利要求的任一部分或全部的并入内容或其任何要素或组分从说明书中移入权利要求书或从权利要求书中移入说明书的权利，在必要时定义本申请或任何后续申请或其继续、分割或部分继续申请所要求保护的事项，或遵照或遵守任何国家或条约的专利法律、规则或条例获得减少费用的任何益处，并且通过引用并入的所述内容应在本申请的整个未决期间继续有效，包括其任何后续的继续、分割或部分继续申请或其上的任何重新颁发或延期。
Claims (12)
1.一种冷冻操纵的精子样品的方法，所述方法包括：
使染色的精子样品与鞘液在流路中接触；
操纵带有活的X染色体的精子与带有活的Y染色体的精子的比率以形成至少一个操纵的精子群体；
收集所述操纵的精子样品；
浓缩所述收集的精子样品；
将所述浓缩的精子样品重新悬浮在冷冻增量剂中；以及
冷冻重新悬浮的所述精子样品，其中所述鞘液包括冷冻保护剂，所述冷冻保护剂包括多元醇，所述多元醇在所述鞘液中的vol./vol.浓度介于0.1％与6％之间并且所述多元醇选自包括以下各项的组：甘油，乙二醇，丙二醇和赤藓糖醇。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括冷却精子达120分钟的时段或小于120分钟的时段的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其中在包括冷冻保护剂的介质中收集所述操纵的精子样品的步骤之后进行浓缩所述收集的精子样品的步骤，而在所述步骤之间不进行任何进一步的稀释。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述冷冻增量剂包括vol./vol.浓度小于6％的冷冻保护剂。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述冷冻增量剂包括vol./vol.浓度介于3.5％与5.5％之间的冷冻保护剂。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述冷冻增量剂包括vol./vol.浓度介于4％与5％之间的冷冻保护剂。
7.如权利要求1所述的方法，其中重新悬浮的混合物在冷冻之前保持介于2小时与18小时之间。
8.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括以下步骤：在染色步骤期间向所述精子样品中添加冷冻保护剂。
9.如权利要求1所述的方法，其中收集所述操纵的精子样品的步骤还包括将所述操纵的精子样品收集在具有收集介质的容器中，所述收集介质包括冷冻保护剂。
10.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括以下步骤：将冷冻保护剂并入用于染色所述精子样品的染色介质中，或者在收集步骤期间并入用于收集所述精子样品的所述收集介质中。
11.如权利要求1所述的方法，其中操纵带有活的X染色体的精子与带有活的Y染色体的精子的比率以形成至少一个操纵的精子群体的步骤还包括对所述流路中的细胞进行分类以及基于其分类选择精子。
12.如权利要求1所述的方法，其中操纵带有活的X染色体的精子与带有活的Y染色体的精子的比率以形成至少一个操纵的精子群体的步骤还包括形成预计含有所选精子的小滴以及偏转那些小滴用于收集或光损害所述流路中的所选精子。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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