DE69133125T2

DE69133125T2 - Konservierungslösung für Zellen

Info

Publication number: DE69133125T2
Application number: DE69133125T
Authority: DE
Inventors: Anne A. Hurley; Daniel C. Lapen; Peter S. Oud
Original assignee: Cytyc Corp
Current assignee: Cytyc Corp
Priority date: 1991-05-01
Filing date: 1991-07-02
Publication date: 2003-06-05
Anticipated expiration: 2011-07-03
Also published as: DE69127888T2; DE69133125D1; JP3294299B2; EP0511430B1; EP0511430A2; EP0772972A1; JPH0523179A; DK0772972T3; JP3723494B2; EP0511430A3; JP2002168858A; DE69127888D1; EP0772972B1; JP2003153688A; US5256571A; ATE158918T1

Description

Diese Erfindung betrifft eine Lösung und ein Verfahren zur Konservierung von Zellen bei Umgebungstemperaturen. Die Lösung und das Verfahren stellen eine schnelle Fixierung lebender Zellen für eine nachfolgende Analyse bereit.
Im Bereich der Klinik und der Forschung ist es bekannt, dass eine Konservierung von Zellproben für eine nachfolgende Analyse erwünscht ist. Vom diagnostischen Standpunkt aus ist eine Probe am wertvollsten, wenn sie frisch ist. Je mehr Zeit zwischen der Entnahme einer Probe und deren Fixierung auf einem Objektträger oder einer anderen Matrix vergeht, desto geringer ist die beibehaltene Unversehrtheit. Dadurch, dass die Zellen den physiologischen Bedingungen ihrer Spender für einen langen Zeitraum, d. h. Minuten, entzogen werden, kann eine Autolyse einsetzen.
Im klinischen Umfeld ist es häufig erforderlich, Proben von einem Patienten zu entnehmen, z. B. Vaginalzellen oder Muskelzellen, die später für eine histologische Analyse gefärbt werden. Eine solche histochemische Färbung hat einen unbestrittenen Wert bei der Interpretation und dem Studium der Zellphysiologie und -pathologie. Die Färbung kann jedoch gewöhnlich nicht gleichzeitig mit der Probeentnahme durchgeführt werden. Es ist häufig erwünscht, zu einem Zeitpunkt bei einem Patienten eine Biopsie durchzuführen und zu einem anderen Zeitpunkt eine cytologische oder histologische Analyse der entnommenen Zellen oder des entnommenen Gewebes durchzuführen. Zellen verlieren während des dazwischenliegenden Zeitraums häufig ihre Unversehrtheit und vermindern folglich den Wert der nachfolgenden Analyse.
Es sind verschiedene Arten von Kochsalzlösungen oder ausgewogener (balanced) Salzlösungen zur Konservierung von Zellproben in der Zeit zwischen der Probeentnahme und der Fixierung und/oder Analyse käuflich. Beispiele dieser Lösungen umfassen Hanks' Balanced Salt Solution, ein minimal essentielles Gewebekulturmedium (MEM), Polysal® und normale Kochsalzlösung. Die hohen Kosten einiger dieser Medien, wie z. B. Hanks' und MEM verhindern deren routinemäßige Verwendung.
Polysal®, das von Cutter Biologicals, Emeryville, Kalifornien, erhältlich ist, ist eine ausgewogene polyionische Elektrolytlösung, die Natriumchlorid, Calcium und Magnesium in einer gegenüber normalen Blutplasma physiologisch äquivalenten Konzentration enthält. Obwohl es sich dabei um eine angemessene Kochsalzlösung für eine relativ kurzzeitige Lagerung handelt, hemmt sie weder das bakterielle Wachstum noch ermöglicht sie eine ausgedehnte Lagerung bei Umgebungsbedingungen.
Hanks' BSS ist eine modifizierte Ringer-Lösung. Sie ist so aufgebaut, dass sie den osmotischen Druck innerhalb physiologischer Grenzen aufrechterhält, einen optimalen pH-Bereich dadurch aufrechterhält, dass sie Puffersysteme enthält, und eine angemessene Konzentration anorganischer Ionen für den normalen Zellstoffwechsel bereitstellt. Diese Lösung umfasst eine Glucoseenergiequelle. Zellen verlieren jedoch nach einem Kontakt von mehr als 20 min ihre Lebensfähigkeit, was die cytopathologische Analyse beeinflusst.
Viele Arten klinischer Gewebe- und Zellproben enthalten fremde Proteine, welche die nachfolgende Färbung und Analyse stören. Das Einbringen von Probenzellen in eine Kochsalzlösung berücksichtigt auch einige weitere Probleme bezüglich der Unversehrtheit der Probe nicht.
Eine ausgedehnte Konservierung von Proben führt häufig zu einem Bakterienwachstum, das auch durch die Bestandteile normaler oder ergänzter Kochsalzlösungen des Standes der Technik gefördert wird.
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zellfixierlösung und ein Verfahren zur Konservierung von Zellen und Gewebe für eine nachfolgende cytologische oder histologische Analyse bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch eine Lösung nach Anspruch 1 und ein Verfahren nach Anspruch 13 gelöst.
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen eine Lösung und ein Verfahren zur Konservierung von Zellen und Gewebe bei Umgebungstemperaturen. Die Lösung ist eine Alkohol- Pufferlösung für die Konservierung der Zellkernmorphologie von Säugerzellen in-vitro bei Umgebungstemperaturen nach einer Biopsie und vor der Färbung oder anderen Formen der Analyse. In einer Ausführungsform stellt die Konservierungslösung ein Medium für eine relativ lang andauernde Konservierung unter Umgebungsbedingungen bereit. In einer anderen Ausführungsform stellt die Konservierungslösung ein Medium für den Transport und die Entfernung von unerwünschtem Protein aus der Probenlösung bereit.
Insbesondere weist eine erfindungsgemäße Konservierungslösung einen mit Wasser mischbaren Alkohol in Kombination mit einem Puffermittel auf. Der Alkoholbestandteil liegt in einer Menge vor, die ausreichend ist, Probenzellen oder -gewebe zu fixieren. Bei dem Puffermittel handelt es sich um ein Mittel, das den pH-Wert der Lösung während der Dauer der Konservierung innerhalb eines Bereichs zwischen etwa 4 bis etwa 7 hält.
In eine bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Alkohol aus der Gruppe bestehend aus Ethanol und Methanol ausgewählt. In einer Ausführungsform umfasst die Lösung Methanol, Magnesiumacetat, Calciumacetat, Kaliumchlorid und Natriumchlorid. Der Alkohol liegt in einem Anteil von etwa 20% der Lösung vor, die etwa 0,1% Natriumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid, 2 mM Calciumacetat und 1 mM Magnesiumacetat aufweist.
In einer veranschaulichenden Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Säugerzellenprobe bereitgestellt und innerhalb eines vorbestimmten oder spezifizierten Zeitrahmens nach der Biopsie werden die Zellen in einer Konservierungslösung der vorstehend beschriebenen Art suspendiert. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform können die suspendierten Zellen bei einer Umgebungstemperatur im Bereich von etwa 4ºC bis etwa 38ºC für einen Zeitraum von mindestens etwa drei Wochen konserviert werden. Während dieser Zeit bewahren die Zellen in ausreichender Weise ihre Struktur, so dass eine Färbung ohne einen signifikanten Verlust an Unversehrtheit möglich ist.
In einer anderen veranschaulichenden Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Säugerzellenprobe bereitgestellt und innerhalb eines spezifizierten Zeitrahmens nach der Biopsie werden die Zellen in einer erfindungsgemäßen Konservierungslösung suspendiert. In dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Probe zur Entfernung unerwünschter Proteine aus der Zellprobe in die Konservierungslösung eingebracht. Die saubere Probe kann dann in der erfindungsgemäßen Lösung für eine nachfolgende Analyse und/oder Lagerung transportiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen eine Alkohol-Pufferlösung zur Konservierung von Säugerzellen in Suspension bei Umgebungstemperatur. Die Lösung verstärkt die Aufrechterhaltung der Kernstruktur der Zellen dadurch, dass sie die Zellmembranen für eine nachfolgende cytologische Färbung intakt hält. Die Lösung zerstört auch effektiv mikrobielle Pathogene in einer Probe und hemmt die retrovirale Aktivität. In einer Form entfernt die Lösung unerwünschtes Proteinmaterial von der Probe.
Insbesondere umfasst die erfindungsgemäße Zellkonservierungslösung eine Kombination aus einem Alkohol und einem Puffer, der die Lösung für die Dauer der Konservierung bei einem pH-Wert zwischen etwa 4 und 7 hält.
In einer Ausführungsform beträgt die Konservierungszeit für Zellen in der vorliegenden Lösung bei Umgebungstemperatur (etwa 37ºC) etwa 3 Wochen. Diese Dauer kann sowohl von der Lagerdauer der Lösung vor der Suspendierung der Zellen bei Umgebungsbedingungen, der Zeit zwischen der Zellprobeentnahme und der Suspendierung der Zellen und dem Alkoholgehalt verändert werden. Wenn die Lösung beispielsweise für eine signifikante Zeit gelagert worden ist, und zwar entweder im gekühlten Zustand oder bei Umgebungsbedingungen, kann das verbleibende Zellkonservierungsvermögen der Lösung beschränkt sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Alkohol Methanol. Andere Alkohole, die verwendet werden können, umfassen unter anderem Isopropanol und Ethanol. Dieser Alkoholbestandteil bewahrt die Unversehrtheit der Zell-DNA und die Details des Zellkerns für eine nachfolgende cytologische Färbung und Analyse.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform liegt der Alkohol in einer Menge von etwa 45% bis 55% bezogen auf die Lösung vor. Lösungen, die 60% oder mehr des Alkoholbestandteils enthalten, neigen zum Verklumpen oder zur Koagulation, was die Fähigkeit zur nachfolgenden effektiven Färbung der Probenzellen beeinträchtigt. Wenn die Konzentration des Alkohols in dieser Ausführungsform im Gegensatz dazu bei 40% oder darunter liegt, werden die Zellen für eine relativ lang andauernde Konservierung nicht ausreichend fixiert, wodurch die Zellen mit der Zeit abgebaut werden. In dieser Ausführungsform enthält die Lösung etwa 50% Methanol bezogen auf die Lösung.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform liegt der Alkohol in einer Menge von etwa 20% bezogen auf die Lösung vor. Während diese Konzentration des Alkohols, wie vorstehend erwähnt, keine Langzeitkonservierung ermöglicht (d. h. für zwei Tage), reicht sie für eine ausreichende Fixierung von Zellen für eine nachfolgende Analyse aus. Alternativ können die Zellen für eine nachfolgende Langzeitkonservierung vor der Analyse von der Ausführungsform mit der 20%igen Lösung in die Ausführungsform mit der 50%igen Lösung überführt werden.
Der in der erfindungsgemäßen Lösung verwendete Puffer weist einen großen Pufferbereich auf, um die Änderung des pH-Werts, die sich aus den autolytischen Nebenprodukten von den in der Lösung suspendierten Probenzellen ergibt, auszugleichen. Beispielsweise setzen Zervixzellen, wenn sie altern, autolytische Nebenprodukte frei, die das pH-Gleichgewicht der Suspensionslösung verändern. Darüber hinaus kann die Konservierung verschiedener Zellarten Lösungen mit unterschiedlicher Azidität und mit verschiedenen pH-Wert-Bereichen erfordern. Demgemäß kann eine Lösung mit einem breiten Pufferbereich für einen weiten Bereich von Zellarten verwendet werden und ist als erfindungsgemäße Lösung ideal. Beispiele für Zellen, für welche diese Lösung verwendet werden kann, umfassen unter anderem Zervixzellen, weiße Blutzellen, Bronchialzellen und Sputum.
Demgemäß ist ein bevorzugter Puffer ein Acetatpuffer, wie z. B. Natriumacetat, Magnesiumacetat, Calciumacetat und Kombinationen davon. Während andere Puffer, wie z. B. Phosphat- oder Tris-Puffer in der vorliegenden Lösung verwendet werden können, wird angenommen, dass der effektive Pufferbereich dieser Puffer bei dem gewünschten pH-Wert nicht so breit ist, wie der von Acetat.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Zellprobe von einem Patienten oder einer anderen Zellquelle erhalten. Eine Konservierungslösung der vorstehend beschriebenen Art wird entweder in ein Gefäß eingebracht, auf einem Objektträger mit Vertiefungen oder auf einer geeigneten Membran platziert. Die entnommenen Zellen werden dann in die Lösung eingebracht, vorzugsweise innerhalb einer Minute nach der Entnahme. Je früher die entnommenen Zellen in die Konservierungslösung eingebracht werden, desto länger können die Zellen bei Umgebungstemperatur suspendiert in der Lösung konserviert werden, da das Trauma für die Zellen minimiert wird.
Nach der Konservierung und/oder der Proteinentfernung kann dann, wenn die Zellen gefärbt oder auf eine andere Weise analysiert werden sollen, eine Vorrichtung zur Entfernung suspendierter Zellen zusammen mit dem Suspensionskonservierungsmedium verwendet werden, und die Zellen können zur weiteren Verarbeitung auf einem Objektträger oder auf einer anderen geeigneten Oberfläche platziert werden.
Die Erfindung wird weiter in dem nachstehenden Beispiel beschrieben.

Beispiel 1

Eine erfindungsgemäße Ausführungsform umfasst die nachstehende Formulierung:
1 mM Magnesiumacetat
2 mM Calciumacetat
10 mM Kaliumchlorid
0,1% Natriumchlorid
20% Methanol
In dieser Formulierung liegt die Funktion der Calcium- und Magnesiumionen in der Konservierung der Kernmorphologie cytologisch signifikanter Zellen. Das Acetat ist als Puffer vorhanden, der den pH-Wert der Lösung stabilisiert und keine Niederschläge von Calcium und Magnesium bildet. Eine solche Ausfällung würde bei einem Phosphatpuffer stattfinden. Die Natrium- und Kaliumsalze sind vorhanden, um bei der Stabilisierung der Zellen zu unterstützen und eine Ausfällung und Koagulation von Hämoglobin und anderen Serumproteinen zu verhindern. Das Methanol liegt vor, um bei der Lyse roter Blutzellen zu unterstützen, um als Konservierungsmittel gegen bakterielles Wachstum zu wirken und bei der Konservierung cytologisch signifikanter Zellen zu unterstützen.

Claims

1. Eine wässrige Alkohol-Pufferlösung zur Konservierung der Zellkernmorphologie von Säugerzellen in einer Zell-enthaltenden Probe in vitro, wobei die Lösung umfasst:

einen mit Wasser mischbaren Alkohol, der aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol und Isopropanol ausgewählt ist, wobei der Alkohol in einem Anteil von 20% bis nicht mehr als 60% in der Lösung enthalten ist;

Magnesium- und Calciumionen in einer Menge, die ausreichend ist, um die Zellkernmorphologie von Säugerzellen in der Probe zu konservieren;

ein Puffermittel, das die Lösung bei einem pH-Wert in einem Bereich von 4 bis 7 hält.

2. Lösung nach Anspruch 1, bei welcher der Alkohol in einem Anteil von 20% in der Lösung enthalten ist.

3. Lösung nach Anspruch 1 oder 2, bei der das Puffermittel ein Acetatpuffer ist.

4. Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die Magnesiumacetat und Calciumacetat zur Bereitstellung der Magnesium- und Calciumionen und das Puffermittel umfasst,

5. Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die 2 mM Calciumacetat umfasst.

6. Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die 1 mM Magnesiumacetat umfasst.

7. Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die Kaliumionen in einer Menge umfasst, die ausreichend ist, um die Ausfällung oder Koagulation von Hämoglobin, falls dieses vorliegt, in der Probe zu vermindern.

8. Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die Natriumionen in einer Menge umfasst, die ausreichend ist, um die Ausfällung oder Koagulation von Hämoglobin, falls dieses vorliegt, in der Probe zu vermindern.

9. Lösung nach Anspruch 7 oder 8, die Methanol als mit Wasser mischbaren Alkohol und Natriumchlorid und Kaliumchlorid zur Bereitstellung der Kalium- und Natriumionen umfasst.

10. Lösung nach Anspruch 9, die 0,1% Natriumchlorid umfasst.

11. Lösung nach Anspruch 9 oder 10, die 10 mM Kaliumchlorid umfasst.

12. Ein Verfahren zur Konservierung der Zellkernmorphologie von Säugerzellen in vitro, wobei das Verfahren das Zusammenbringen der Zellen mit einer Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 umfasst.

13. Verfahren nach Anspruch 12, das ferner den Schritt des Haltens der Zellenthaltenden Lösung bei einer Temperatur im Bereich von 4ºC bis 38ºC umfasst.