DE3686584T2 - Stabilisierung von leukozyten. - Google Patents
Stabilisierung von leukozyten.Info
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Description
- Die Erfindung hat die Stabilisierung oder Konservierung von menschlichen Leukozyten, insbesondere Granulozyten, zum Gegenstand, und betrifft insbesondere das Lagern von derartigen Zellen bei Temperaturen oberhalb des Gefrierpunktes in einem nicht-toxischen, physiologisch verträglichen Medium, das Plasma und Gelatine als wesentliche Bestandteile enthält. Nach der Aufbewahrung in einem solchen Medium zeigen die Zellen im wesentlichen die meisten ihrer ursprünglichen physiologischen Eigenschaften und können bei der Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die durch einen qualitativen oder quantitativen Mangel an solchen Zellen gekennzeichnet sind.
- Obwohl es eine umfangreiche Entwicklung der Blutbanken zum Sammeln von menschlichem Blut und Auftrennen desselben in verschiedene unterschiedliche Komponenten wie rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen einschließlich Neutrophilen, Plättchen und Serum gab, kann der maximale physiologische oder therapeutische Gebrauch von diesen Komponenten nur gemacht werden, wenn sie bis zum Gebrauch und/oder Transport an den Verwendungsort aufbewahrt werden können. Bestimmte Komponenten wie rote Blutkörperchen und Serum können nach dem Gefrieren unter bestimmten Bedingungen für lange Zeit aufbewahrt und dann zur Verwendung konditioniert werden. Eine begrenzte Aufbewahrung von Plättchen ist möglich, jedoch verlieren sie ihre Funktionsfähigkeit nach höchstens fünf Tagen der Lagerung bei Temperaturen oberhalb des Gefrierpunktes und das Gefrieren der Plättchen zum Aufbewahren ist, obwohl einfach durchzuführen (Kotelba-Witkowska et al., Transfusion, Vol. 22, 121 ff. (1982)) eine teuere und wenig verwendete Technik. Andererseits unterliegen Neutrophile der Agglutination oder Verklumpung bereits nach einer Aufbewahrungszeit von 48 Stunden bei Temperaturen oberhalb des Gefrierpunktes und müssen somit innerhalb von zwei Tagen nach der Aufbereitung verwendet werden; die Aufbewahrung von Neutrophilen durch Gefrieren brachte keinen Erfolg.
- Von Tullis, wurde in Blood, Vol. 6, 772-773 (1951) vorgeschlagenen, einen isotonen Puffer zu verwenden, der Gelatine zusammen mit EDTA, Ascorbinsäure, Natriumacetat sowie Phenolrot als Aufbewahrungsmedium für Leukozyten enthält. Crowley et al. beschreiben in Transfusion, Vol. 14, 574-580 (1974) das Dekantieren von leukozytenreichem Plasma von Vollblut, das in Puffer mit 0,4% Gelatine, bezogen auf die gesamte Blut-Puffermenge gezogen und bei 4ºC mit oder ohne dem Zusatz unterschiedlicher Zugaben gelagert wurde, wobei jedoch die Wirksamkeit der Granulozyten nach einer Lagerzeit von einer Woche deutlich abgenommen hat. Contreras et al. beschreiben in Cryobiology, Vol. 17, 243-251 (1980) das Aufbewahren von Granulozyten in unterschiedlichen, Plasma enthaltenden Speichermedien bei 40ºC, wobei jedoch eine unbefriedigende Abnahme der Funktionsfähigkeit nach vier Tagen auftrat. In Transfusion, Vol. 18, 46-53 (1978) erläutern Contreras et al. das Aufbewahren von Granulozyten in Medien, die entweder Plasma oder säuremodifizierte Gelatine enthalten, bei 4ºC oder 22ºC, wobei ein extensiver Verlust an Zellen nach drei Tagen auftrat. Price et al. beschreiben in Transfusion, Vol. 25, 238-241 (1985) die Verwendung von säuremodifizierter flüssiger Gelatine als Agens zum Sedimentieren von roten Blutkörperchen beim Sammeln von Granulozyten, jedoch erfolgte keine Lagerung der Granulozyten vor dem Test. Sher et al. erläutern in Immunology, Vol. 31, 337-341 (1976) die Verwendung von Gelatine als Sedimentationshilfe von roten Blutkörperchen beim Sammeln von Granulozyten, wobei jedoch die Gelatine von den Granulozyten ausgewaschen wurde, ehe sie ohne verlängerte Aufbewahrungszeit in einem Inkubationsmedium suspendiert wurden.
- Es wurde nun herausgefunden, daß Granulozyten wirksam stabilisiert werden können, um sie bei Temperaturen unter 25ºC, vorzugsweise unter 8ºC, für eine lange Zeitspanne von wenigstens 5 oder 7 Tagen oder mehr aufbewahrt werden können, vorausgesetzt sie werden in einem Gelatineund darin gelöstes menschliches Plasma enthaltenden geeigneten Puffer suspendiert, der nicht toxisch und physiologisch verträglich ist. Nach dem Aufbewahren können die Granulozyten transfusiert werden, und zwar, abgesehen von einem Aufwärmen auf eine Temperatur von nicht mehr als 40ºC, um alles vorhandene Gel zu verflüssigen, ohne weitere Bearbeitung; oder die Granulozyten können zur Verwendung wiedergewonnen werden, indem einfach die Gelatine und das Plasma mit Pufferlösung ausgewaschen werden, die dieselbe oder eine an der Pufferlösung ist wie die, die zum Aufbewahren verwendet wurde oder indem der die Gelatine enthaltende Puffer durch Zentrifugieren, gefolgt von einem erneuten Suspendieren der Granulozyten, in einer geeigneten Pufferlösung oder einem Medium entfernt wird.
- Der verwendete Puffer kann jeder übliche, nicht-toxische Puffer sein, der einen pH-Wert in dem gewünschten Bereich aufweist. Der pH-Wert des Puffers kann in einem weiten Bereich von pH 6,1 bis pH 8,5 variieren; vorzugsweise wird der pH-Wert in der Nähe des neutralen Punktes, beispielsweise zwischen 6,5 bis 7,5 gehalten, um die Funktionsfähigkeit optimal zu bewahren. Um die besten Ergebnisse zu erhalten, sollten die Granulozyten und Plättchen in dem Plasma und Gelatine enthaltenden Puffer bei niedrigen Temperaturen, beispielsweise unterhalb von 8ºC, gelagert werden, obwohl sie auch bei höheren Temperaturen bis zu 25ºC wenigstens 12 Stunden lang mit befriedigendem Resultat aufbewahrt werden können.
- Um die vorliegende Erfindung auszuführen, kann die Gelatine von allen üblichen Handelsquellen verwendet werden. Die Gelatinemenge kann in einem weiten Bereich variieren und ist zum Teil von der gewünschten Aufbewahrungsdauer abhängig. Etwa nur 0,1 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gesamtgewicht der gesamten Puffer-Plasmamenge, ist für kurzzeitige Lagerung wirksam; es gibt keine kritische obere Grenze für die verwendete Menge, abgesehen davon, daß sie klein genug sein muß, damit das Gemenge bei Temperaturen, die nicht höher als 40ºC liegen, bereits flüssig ist und nicht gelförmig, um die Beseitigung der Gelatine nach der Lagerung zu erleichtern.
- Die Konzentration oder Anzahl der Granulozyten in dem Puffer kann in einem begrenzten Bereich von 10&sup7; bis 10&sup9; pro ml, vorzugsweise zwischen 1·10&sup8; bis 5·10&sup8; pro ml variieren.
- Das verwendete Plasma kann ein normales menschlisches Plasma oder ein autologes Plasma sein. Die Plasmamenge kann zwischen 25 Gewichtsprozent, bezogen auf die Gesamtmenge, bis hin zu 90 Gewichtsprozent variieren.
- Ein Lokalanästeticum, wie beispielsweise Lidocain, stellt ein mögliches Additiv dar, das dabei hilft, die Anzahl der Zellen auf einem hohen Wert zu halten. Andere Lokalanästetica, die verwendet werden können, sind Procain, Mepivacain oder Bupivacain.
- Tests haben gezeigt, daß Granulozyten, die fünf sieben Tage oder sogar länger erfindungsgemäß aufbewahrt und sodann mittels einer 25-fachen Verdünnung der Gelatine und des Plasmas rekonstituiert wurden, weitgehend alle gewünschten physiologischen Eigenschaften behalten und im wesentlichen keine Agglutination oder Klumpenbildung zeigen. Insbesondere sind sie in der Lage, Opsonin modifizierte Mikroorganismen sich einzuverleiben und zu töten.
- Die nachfolgenden speziellen Beispiele sollen ausführlicher das Wesen der Erfindung erläutern.
- Bei jedem der nachfolgenden Beispiele wurden die Granulozyten aus frisch abgezogenem menschlichem Blut bereitet, das durch Zugabe von 15 bis 18 Volumenprozent eines sauren und hypertonen Puffers, einer wäßrigen Lösung mit Natriumcitrat und Zitronensäure (0,38 M in Citrat und Zitronensäure und 20 mg/ml Glukose bei einem pH-Wert von 8,4) (ACD) anticoaggulierend eingestellt wurde. Die Granulozyten wurden durch Dextransedimentation und Zentrifugieren separiert, wie dies von Curnutte et al. in J. Clin. Invest., Vol 53, Seiten 1662-1672 (1974) beschrieben wurde. Sie wurden sodann in Dulbecco's Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung ohne Kalzium oder Magnesium (PBS) und ohne Entfernen der roten Blutkörperchen durch hypotone Lyse gewaschen.
- Die Granulozyten wurden sodann in dem neutralen Histidinpuffer suspendiert, der als Aufbewahrungsmedium diente und 0,1 M Natriumcitrat, 0,05 M Histidin, 0,1 M Glukose, 0,05 M Natriumpyruvat und 1 uM Lidocain, eingestellt auf einen pH-Wert von 7,4 (HCP) enthielt.
- Autologes menschliches Plasma wurde in denselben HCP-Puffer gezogen, wobei 10 ml Blut mit 1,4 ml Puffer gemischt und 10 Minuten lang aufeinanderfolgend mit 1500 bzw. 2000 U/min zentrifugiert wurde und der Plasmaanteil nach jedem Zentrifugieren weggenommen wurde.
- Die folgenden Zusammensetzungen wurden sodann bereitet, wobei die Anteile von Gelatine und Plasma in Gewichtsprozent, bezogen auf die Gesamtmenge angegeben sind: Zusammensetzung Nr. Gelatine % Plasma % Lidocain (uM)
- In jedem Falle betrug die Konzentration der Granulozyten 2·10&sup8; pro ml und der pH-Wert lag bei 7,4 bei Raumtemperatur.
- Von jeder Zusammensetzung bzw. jedem Ansatz wurden fünf Proben in einem Kühlschrank bei 4ºC gelagert.
- Nach einer Lagerungszeit von 7 Tagen bei 4ºC ließ man jede Probe sich auf Raumtemperatur erwärmen; jene Proben, die bei 4ºC gelförmig waren, haben sich beim Erwärmen verflüssigt. Die Proben wurden dann zehnfach mit Dulbecco's Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung ohne Kalzium und Magnesium verdünnt. Die Granulozytenfunktion wurde anschließend bestimmt. Das Überleben der Granulozyten wurde mittels der Zellenanzahl gemessen, und zwar ausgedrückt als Prozentanteil der ursprüngliche Zellenanzahl vor der Lagerung. Die Lebensfähigkeit wurde über den Prozentanteil von Zellen bestimmt, die Trypanblau abgaben, als sie mit 0,4 Gewichtsprozente in PBS-Puffer ohne Kalzium und Magnesium suspendiert wurden. Gegen S. Aureus wurde die Fähigkeit, Bakterien zu töten, ermittelt, wobei im wesentlichen dasselbe Verfahren verwendet wurde, wie es von Babior et al. in Leukocyte Function, Cline ed., Seiten 1-38 (NY 1981) beschrieben wurde.
- Die Ergebnisse waren wie folgt (Mittelwert von fünf Proben): Zusammensetzung Nr. Prozentwert der Zellenzahl bezogen auf den Beginn Lebensfähigkeit % Abtöten von Bakterien in %
- Aus den obigen Ergebnissen ergibt sich klar, daß die Zellenzahl, Lebensfähigkeit und die Fähigkeit, Bakterien zu töten, bei solchen Zusammensetzungen in weit größerem Maße erhalten blieben, die Gelatine und Plasma zusammen enthalten haben, während zwei oder sogar alle drei Funktionswerte erheblich vermindert waren, sobald eine oder beide dieser Bestandteile weggelassen wurden.
- Beansprucht ist:
Claims (10)
1. Verfahren zum Stabilisieren von aus Blut erhaltenen
menschlichen Granulozyten zum Zwecke des
Aufbewahrens ohne Gefrieren, bei dem die Granulozyten in
einem nicht-toxischen Puffer, der Gelatine und
Plasma enthält, suspendiert werden, wobei die Menge der
Gelatine wenigstens 1 Gewichtsprozent der gesamten
Mischung ausmacht und kleiner ist als die Menge,
bei der die Mischung bei höchstens 40ºC zum Gel
wird, und wobei die Menge des Plasmas zwischen
20 und 90%, bezogen auf das Gewicht der gesamten
Mischung, ausmacht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der zusätzliche
Schritt vorgesehen ist, die Suspension ohne
Gefrieren bei einer Temperatur unterhalb von 25ºC für
eine Dauer von wenigstens fünf Tagen zu lagern.
3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Lagern bei
einer Temperatur unterhalb von 8ºC ausgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der pH-Wert des
Puffers zwischen 6,1 und 8,0 liegt, das Lagern bei
einer Temperatur unterhalb von 8ºC ausgeführt wird
und die Anzahl der Granulozyten in der Suspension
zwischen 1·10&sup7; bis 2·10&sup8; pro Milliliter liegt.
5. Von roten Blutkörperchenzellen freie Mischung, die
Granzlozyten enthält, die in einem nicht toxischen
Gelatine und Plasma enthaltenden Puffer mit einem
pH-Wert von 6,1 bis 8,0 suspendiert sind, wobei die
Menge der Gelatine wenigstens 1%, bezogen auf das
Gewicht der gesamten Mischung, beträgt und geringer
ist als die Menge, bei der die Mischung bei
höchstens 40ºC zum Gel wird, und die Menge des Plasmas
zwischen 25 und 90%, bezogen auf das Gewicht der
gesamten Mischung, liegt.
6. Verfahren zum Stabilisieren von aus Blut erhaltenen
menschlichen Leukozyten zum Zwecke des
Aufbewahrens ohne Gefrieren, bei dem die Leukozyten in
einem nicht-toxischen Puffer, der Gelatine und
Plasma enthält, suspendiert werden, wobei die Menge der
Gelatine wenigstens 1 Gewichtsprozent der gesamten
Mischung ausmacht und kleiner ist als die Menge,
bei der die Mischung bei höchstens 40ºC zum Gel
wird, und wobei die Menge des Plasmas zwischen
20 und 90%, bezogen auf das Gewicht der gesamten
Mischung, ausmacht.
7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der zusätzliche
Schritt vorgesehen ist, die Suspension ohne
Gefrieren bei einer Temperatur unterhalb von 25ºC für
eine Dauer von wenigstens fünf Tagen zu lagern.
8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Lagern bei
einer Temperatur unterhalb von 8ºC ausgeführt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem der pH-Wert des
Puffers zwischen 6,1 und 8,0 liegt, das Lagern bei
einer Temperatur unterhalb von 8ºC ausgeführt wird
und die Anzahl der Granulozyten in der Suspension
zwischen 1·10&sup7; bis 2·10&sup8; pro Milliliter liegt.
10. Von roten Blutkörperchenzellen freie Mischung, die
Leukozyten enthält, die in einem nicht toxischen
Gelatine und Plasma enthaltenden Puffer mit einem
pH-Wert von 6,1 bis 8,0 suspendiert sind, wobei die
Menge der Gelatine wenigstens 1%, bezogen auf das
Gewicht der gesamten Mischung, beträgt und geringer
ist als die Menge, bei der die Mischung bei
höchstens 40ºC zum Gel wird, und die Menge des Plasmas
zwischen 25 und 90%, bezogen auf das Gewicht der
gesamten Mischung, liegt.
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