DE69714976T2

DE69714976T2 - Verwendung von arabinogalaktan für die reinigung eines spermienproduktes

Info

Publication number: DE69714976T2
Application number: DE69714976T
Authority: DE
Inventors: E. Ellington; Adams Oliver
Original assignee: BIO ORIGYN SPOKANE LLC
Current assignee: BIO ORIGYN SPOKANE LLC
Priority date: 1996-02-09
Filing date: 1997-02-06
Publication date: 2003-05-08
Anticipated expiration: 2017-02-07
Also published as: US6171778B1; JP2000507920A; US5879877A; DE69714976D1; EP0888117B1; EP0888117A1; WO1997028811A1

Description

Die vorliegende Erfindung liegt allgemein auf dem Gebiet von Lösungen, die Arabinogalactan enthalten, zum Waschen und Trennen von Spermien.
Spermien müssen vor ihrer Verwendung in den meisten Diagnose- oder Forschungsprotokollen, wie etwa Unfruchtbarkeitstests, in-vitro-Befruchtung und Einfrieren, gewaschen werden. Das Waschen wird durchgeführt, um den Schaden an der Spermienzelle durch Bestandteile von Samenplasma, wie etwa Antikörper, weißen Blutkörperchen, roten Blutkörperchen und Bakterien, zu begrenzen. Das Waschen entfernt auch sterbende oder tote Spermien, die Enzyme und andere Produkte freisetzen, die gegenüber gesunden Spermien toxisch sind.
Im allgemeinen werden Spermien getrennt, indem man die beweglichen Spermien von den Zelltrümmern wegschwimmen läßt (Spermien-Aufschwemmen), durch Zentrifugieren der Spermien durch einen Gradienten und Einsammeln eines Pellets an lebenden Spermien (Waschen), oder durch Passieren der Spermien durch eine Säule, die die toten oder nicht- gesunden Spermien bindet. Jede dieser aktuellen Techniken hat ihre eigenen Nachteile. Das Aufschwemmen führt nur zu einer geringen Anzahl der normalen Spermien. Säulenverfahren haben eine schlechte Selektivität für die normalen Spermien im Ejakulat. Die Zentrifugation durch einen Dichtegradienten führt zu einer hohen Spermienwiedergewinnung, kann aber ebenso Produkte erzeugen, die für Spermien toxisch sind, so daß ein zusätzlicher Waschschritt erforderlich ist, um die Produkte zu entfernen. Die Zentrifugation kann ebenso Spermien mit verringerter Beweglichkeit und Fruchtbarkeit während einer in-vitro-Befruchtung erzeugen. Parrish et al., Theriogenology, 44: 859-869 (1995); und Tanphaichitr et al., Gamete Research, 20: 67-81 (1988).
Verfahren und Zusammensetzungen zum Waschen und Trennen von Spermien sind der Gegenstand vieler Studien gewesen. Trounson und Gardner, Handbook of in Vitro Fertilization, CRC Press, Boca Raton, 1994, Seiten 46-50. Bongso et al., Fertility and Sterility, 51: 850-854 (1989) offenbart eine Studie der Verbesserung der Konzentration und Beweglichkeit von Spermien nach einer Trennung in Ficoll, einem synthetischen Polymer von Saccharose. US- Patent Nr. 4,007,087 an Ericsson offenbart das Fraktionieren von Spermien in einem Medium, das lösliche Materialien, wie etwa Proteine, Peptide und Dextran einschließt. US-Patent Nr. 4,327,177 an Shrimpton offenbart die Trennung von Spermien aufgrund ihrer Dichte in einem Nährmedium, das aus Säugermilch stammt. US-Patent Nr. 4,605,558 an Shrimpton offenbart ein Verfahren zum Trennen von X- und Y-Spermien in einem Dichtegradienten und einem Osmolalitätgradienten in einem Medium, das aus Milch stammt. Platov et al., Ovtsevodstvo, 10 38-39 (1980) (Zusammenfassung) offenbart die Vewendung von Gummi-Arabicum; Kirschharz und Aprikosenharz in einem Medium zum Gefrieren von Schafsamen.
Arabinogalactan ist ein wasserlösliches Polysaccharid, das aus den Bäumen des Genus Larix, insbesondere Larix occidentalis Nuttall (western larch), isoliert werden kann. Verfahren zur Herstellung von hochraffiniertem Arabinogalactan werden in US-Patent Nr. 5,116,969 offenbart. Hill et al., J. Lab. Clin. Med., 111 : 73-83 (1988) offenbart die Verbindung von Arabinogalactan, um gewaschene murine Blutplättchen mittels Zentrifugation zw erhalten. Die Herstellung von Arabinogalactanderivaten und- Fragmenten wird in Prescott, et al., Carbohydrate Research, 278: 113-128 (1995); und US-Patent Nr. 5,478,576 an Jung, et al. beschrieben.
Es gibt einen Bedarf zur Entwicklung von verbesserten Produkten zum Waschen und Trennen von Spermien für Protokolle, wie etwa Unfruchtbarkeitstests, in-vitro-Befruchtung und Einfrieren.
Es ist deshalb eine Aufgabe der Erfindung, Lösungen zum Waschen und Trennen von Spermien bereitzustellen, um Spermienproben mit einer optimalen Beweglichkeit und Lebensfähigkeit zu erzeugen, und die in einer Vielzahl von Diagnose- und Forschungsanwendungen, wie etwa Fruchtbarkeitstests und in-vitro-Befruchtung verwendet werden können.

Zusammenfassung der Erfindung

Zusammensetzungen, die Arabinogalactan umfassen, sowie Verfahren zu ihrer Verwendung beim Waschen und Trennen von Spermien werden bereitgestellt. Die Verwendung von Lösungen, die Arabinogalactan umfassen, erzeugt bewegliche Spermienproben, die zur Verwendung in einer Vielzahl von Diagnose- und Forschungsanwendungen geeignet sind. In einer Ausführungsform wird die Waschlösung mit einer wirksamen Menge an Arabinogalactan versehen, um ein Waschen oder Trennen der Spermien zu ermöglichen, während die Spermienlebensfähigkeitseigenschaften während der Wasch- oder Trennungsprozedur aufrechterhalten werden. Unter Verwendung der verbesserten Spermienwaschlösung werden Nicht- Spermiensubstanzen, die in der Lage sind, einen schädlichen Effekt auf die Spermienlebensfähigkeit zu haben, wie etwa Samenplasma, weiße Blutkörperchen, rote Blutkörperchen, Gefrier-Extender-Mittel, Spermientrümmer und Medienbestandteile, von der Spermienprobe entfernt. Der Einschluß von Arabinogalactan in der Waschlösung ermöglicht es, daß die beweglichen Spermien abgetrennt werden ohne eine Beschädigung an diesen Spermien. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Arabinogalactan hochraffiniert.
Das verbesserte Spermienwaschprodukt ist mit Spermienproben kompatibel, die aus einer Vielzahl unterschiedlicher Säugetiere, einschließlich menschlichen, bovinen und Pferde- Spermienproben, erhalten werden. Die Spermienwaschlösung, die Arabinogalactan einschließt, kann verwendet werden, um bewegliche Spermien abzutrennen, wobei gleichzeitig ein großer Bereich der Lebensfähigkeitseigenschaften der Spermien optimiert wird, einschließlich der Spermienbeweglichkeit, Spermienanzahl, des prozentualen Anteils der gewonnenen lebenden Spermien, der Spermienmembranfunktion, der Spermienpenetrationsrate, der Spermienbefruchtungsrate und/oder der Oocytenentwicklung nach der Befruchtung. Die gewaschenen Spermien können in einer Vielzahl von Diagnose- oder Forschungsprotokollen verwendet werden, einschließlich Unfruchtbarkeitstests, Spermientoxikologietests und in- vitro-Befruchtung.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Eine Spermienwaschlösung, umfassend 15% bis 50% Gewicht/Volumen Arabinogalactan, die mit Spermien hochkompatibel ist, wird zur Verwendung als eine Spermienproben- Waschlösung bereitgestellt, sowie Verfahren zum Verwenden der Waschlösung zum Waschen oder Trennen von Spermien, um Spermien zu erzeugen, die in einer Vielzahl von Diagnose- oder Forschungsanwendungen verwendet werden können. Die Anwesenheit von Arabinogalactan in der Lösung hat einen Schutzeffekt auf die Spermien in einer Probe während deren Verarbeitung. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Arabinogalactan hochraffiniert. Die Konzentration an Arabinogalactan in der Lösung für eine individuelle Spermienprobe optimiert werden. Die Spermien, die in einer Lösung, umfassend Arabinogalactan, gewaschen worden sind, haben verbesserte Eigenschaften im Vergleich mit Spermien, die in existierenden Spermienwaschprodukten verarbeitet worden sind, einschließlich verbesserter Spermienbeweglichkeit, Spermienanzahl, prozentualer Anteil an lebenden Spermien, Spermienmembranfunktion, Spermienpenetrationsrate, Spermienbefruchtungsrate und Oocytenentwicklung nach der Befruchtung.

Arabinogalactan

Arabinogalactan ("AG") ist ein wasserlösliches Polysaccharid, das aus den Bäumen des Genus Larix, insbesondere Larix occidentalis Nuttall (western larch), isoliert werden kann. Arabinogalactan kann bis zu 35% des gesamten Kernholzes einiger Spezies ausmachen. Stout, "Larch Arabinogalactan" in Industrial Gums, R. L. Whistle Ed., Academic Press, New York, Seiten 307-310, 1959. Es ist sehr wasserlöslich und kann aus Lärchenspänen aufgereinigt werden.
Wie hierin verwendet, beinhaltet der Begriff "Arabinogalactan", sofern nicht andersartig spezifiziert, natürlich vorkommendes oder synthetisches Arabinogalactan, Teile von Arabinogalactan, wie etwa Abbauprodukte, und chemisch oder biochemisch modifiziertes Arabinogalactan oder Teile davon, die unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet zur Vefügung stehen, modifiziert worden sind, die bei einer Spermienlösung während des Waschens oder Trennens von Spermien wirksam sind, um die Spermienbeweglichkeit zu schützen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird hochraffiniertes Arabinogalactan in der Spermien-Waschlösung verwendet. Verfahren zur Herstellung von hochraffiniertem Arabinogalactan werden in US-Patent Nr. 5,116,969 offenbart. Hochraffiniertes Arabinogalactan mit einer Reinheit größer als 95% oder fakultativ größer als 99,9% (Larex UFTM) ist von Larex, International, St. Paul, Minnesota, erhältlich. Wie hierin definiert, bezieht sich "hochraffiniertes Arabinogalactan" auf Arabinogalactan, das aus einem pflanzlichen Ursprung, wie etwa den Bäumen des Genus Larix isoliert worden ist, mit einer Reinheit größer als 95%. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Molekulargewicht von hochraffiniertem Arabinogalactan zwischen ungefähr 10.000 und 30.000 Daltons (mittels Größenausschluß- Chromatographie mit einem Pullulan-Bezug).
Arabinogalactan stellt eine nützliche preiswerte Alternative zur Verwendung von anderen Zusammensetzungen bereit, die gewöhnlich in Spermien-Waschlösungsprodukten verwendet werden, wie etwa PercollTM, kolloidales Polyvinylpyrrolidon-beschichtetes Kieselgel, erhältlich z. B. von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO. Die Verwendung von Percoll- Gradienten bei der Zentrifugation zum Waschen von Spermien wird z. B. in Parrish et al., Theriogenology, 44: 859-869 (1995); Tanphaichitr et al., Gamete Research, 20: 67-81 (1988); Trounson und Gardner, Handbook of In Vitro Fertilization, CRC Press, Boca Raton, 1994, Seiten 46-50; und Swanson et ab, J Assisted Reproduction and Genetics, 12: 48-54 (1995) beschrieben.
Arabinogalactan aus Larix-Bäumen ist nützlich, da es extrem wasserlöslich ist, in der Natur in einer sehr engen Molekulargewichtsverteilung vorkommt und stark verzweigt ist und daher nicht Viskositätsproblemen unterliegt. Eine Spermien-Waschlösung, die Arabinogalactan umfaßt, ist leicht zu verwenden, und es sind keine komplizierten Prozeduren erforderlich, um die gewaschene oder getrennte Spermienprobe zu erzeugen. Bei herkömmlichen Spermien- Waschprozeduren, nach einer Zentrifugation in einem PercollTM-Gradienten, müssen Bestandteile, die gegenüber Spermien in der Spermienprobe toxisch sind, vor einer weiteren Verwendung gewaschen werden. Dies kompliziert die Prozedur und beschädigt die Spermienmembranen weiter. Im Gegensatz dazu ist eine solche zweite Waschung nicht erforderlich für Spermien, die in einem Produkt, das Arabinogalactan umfaßt, gewaschen worden sind.
Die Anwesenheit von Arabinogalactan in einer Spermien-Waschlösung hat im wesentlichen keinen offensichtlich negativen Effekt auf Spermien und hat in der Tat einen Schutzeffekt auf die Spermienfunktion. Im Gegensatz zu Zusammensetzungen nach dem Stand der Technik schützt die Verwendung von Arabinogalactan in einer Spermien-Waschlösung die Spermien- Beweglichkeit, die darauffolgende Spermien-Lebensspanne in vitro und ist nicht toxisch.

Spermienlösungen

In einer Ausführungsform wird die Spermienlösung gebildet durch Zugabe von hochraffiniertem Arabinogalactanpulver, wie etwa Larex UFTM, erhältlich von Larex, International, St. Paul, Minnesota, zu einer Spermienlösung mit ausgeglichenem Salzgehalt. Solche Lösungen schließen im allgemeinen ausgewählte Salze, Zucker und Wasser und andere Zusammensetzungen ein, die für das jeweilige Tier, aus dem die Spermienprobe stammt, ausgewählt worden sind. Verfahren zur Herstellung von Standard-Spermienlösungen, zu denen AG zugegeben werden kann, werden z. B. in Trounson and Gardner, Handbook of In Vitro Fertilization, CRC Press, Boca Raton, 1994, beschrieben. Arabinogalactan kann ebenso zu Lösungen, wie etwa menschlicher Eileiterflüssigkeit oder zu Tyrode's Lactat, Albumin und Pyruvat ("TALP") zugegeben werden, das in Tabelle 1 beschrieben wird.
Die Konzentration an hochraffiniertem Arabinogalactan in der Waschlösung liegt im allgemeinen zwischen 15-50% Gewicht/Volumen ("w/v"). Die Konzentration an Arabinogalactan in der Lösung kann für die jeweilige Spermienprobe modifiziert und optimiert werden. In einer Ausführungsform liegt die Konzentration an Arabinogalactan zwischen 20 und 40% w/v, z. B. 20 bis 30% w/v in der wäßrigen Lösung. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Konzentration von 25 bis 30% w/v in der Lösung für Säugerspermien verwendet. Zum Beispiel wird für Haustierspermienproben, wie etwa bovine und Pferde- Spermienproben, eine Konzentration von 22% w/v AG in TALP in einer bevorzugten Ausführungsform verwendet, während für menschliche Spermien eine Konzentration von 30% w/v AG in menschlicher Eileiterflüssigkeit bevorzugt wird.
Wie hierin verwendet, schließt der Begriff Arabinogalactan-"Lösungen" sowohl Lösungen als auch Suspensionen von Arabinogalactan ein. Für die Spermientrennung oder -Wasch- Verarbeitung wird das Spermienmedium, das Arabinogalactan enthält, und die Spermienprobe im allgemeinen bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 30ºC gehalten. Die Lösung kann fakultativ zur Lagerung der Spermienprobe z. B. nach dem Waschen der Spermien, gekühlt oder eingefroren werden. Der pH kann für eine individuelle Spermienprobe oder - anwendung ausgewählt werden und liegt im allgemeinen im Bereich von 7,4 bis 7, 8, bevorzugt pH 7,4.

Spermien-Verarbeitung

Die Arabinogalactan-enthaltende Spermienlösung kann verwendet werden, um die Spermien in einer Spermienprobe in einer Vielzahl von Protokollen, einschließlich der Waschung von Spermien, verwendet werden, um Nicht-Spermien-Substanzen zu entfernen, oder dem Trennen von Spermien auf der Grundlage von Spermienbeweglichkeit, z. B. durch Zentrifugation oder mittels einer Säulenfiltration.
In einer Ausführungsform wird eine Waschlösung für Spermien bereitgestellt, die eine effektive Menge an Arabinogalactan enthält, um Nicht-Spermien-Substanzen oder nicht- bewegliche Spermien oder Spermienfragmente aus der Probe zu entfernen, während man auch die Spermienlebensfähigkeitseigenschaften während des Waschens aufrechterhält. Die Spermien werden vor ihrer Vewendung in Diagnose- oder Forschungsprotokollen gewaschen, um eine Schädigung der Spermienzelle durch andere Substanzen in der Spermienprobe zu beschränken. Bestandteile, die aus einer Spermienprobe durch Waschen in einer Lösung, umfassend Arabinogalactan, entfernt werden können, schließen Samenplasma, Proteine, Antikörper, weiße Blutkörperchen, rote Blutkörperchen, Gefrier-Extender-Mittel wie etwa Eidotter, Spermienbruchtstücke, wie etwa nichtbewegliche oder nicht-lebende Spermien oder Spermienfragmente, sowie Kulturmedien und Medienzusatzstoffe ein. In einer anderen Ausführungsform können bewegliche Spermien von anderen weniger beweglichen Spermien in einer Spermienprobe getrennt werden, in einer Lösung, die mit einer effektiven Menge an Arabinogalactan versehen ist, um die Lebensfähigkeitseigenschaften, wie etwa Spermienbeweglichkeit der Spermien in der Probe während des Trennungsprozesses aufrechtzuerhalten und/oder zu schützen. Das Waschen oder das Trennen von Spermien in einer Spermienlösung, die Arabinogalactan enthält, erzeugt Spermienproben mit verbesserten Lebensfähigkeitseigenschaften im Vergleich mit Spermien, die unter Verwendung von Standardspermien- Waschformulierungen, die auf dem Gebiet erhältlich sind, erhalten werden.
In einer beispielhaften Prozedur werden Spermien in einer Probe auf der Basis ihrer Beweglichkeit mittels Zentrifugation in einer Lösung, die hochraffiniertes Arabinogalactan umfaßt, gewaschen oder getrennt. Die AG-enthaltende Waschlösung wird mit einem 0,2-Micron- Filter gefiltert und wird in sterile Zentrifugenröhrchen gebracht. Spermienproben werden über eine 4-5 ml kontinuierliche Säule der AG-Lösung gebracht und zentrifugiert (gewaschen). Das Verhältnis der Spermienprobe zur Waschlösung ist z. B. 1 : 2. Die Spermien werden dann unter Kräfteeinfluß durch den AG-Gradienten mittels Zentrifugation bei 300 · g für ungefähr 20-30 min gewaschen. Nach dem Waschen wird das Waschprodukt entfernt und verworfen, und das Pellet von Spermienzellen am Boden des Röhrchens ist zur Verwendung bei Diagnose- oder Forschungsprotokollen bereit. Die Spermien, die durch den AG-Gradienten gewaschen oder getrennt werden, schwimmen signifikant schneller, haben weniger Membranschäden und sind in der Lage, mehr Oocyten zu befruchten als Spermien, die durch Standardlösungen wie etwa PercollTM-Systeme gewaschen worden sind. Die gewaschene Spermienprobe kann ebenso gefroren und in dem Arabinogalactan-enthaltenden Medium gelagert werden.

Testen von Spermien

Eine Spermienlösung wird zum Verarbeiten einer Spermienprobe zum Isolieren der beweglichen Spermien mit einer wirksamen Menge an Arabinogalactan versehen, um eine Waschung durchzuführen und die Lebensfähigkeitseigenschaften der Spermienprobe nach Verarbeitung in Prozeduren, wie etwa dem Waschen von Spermien oder der Trennung, aufrechtzuerhalten. Die Verwendung von Arabinogalactan in der Lösung schützt die Spermienlebensfähigkeit während der Verarbeitung im Vergleich mit Standard-Spermienwaschungslösungen. Die Spermienlebensfähigkeitseigenschaften, die geschützt werden können, im Vergleich mit Ergebnissen, die unter Verwendung von Standard-Spermienwaschlösungen erhalten werden, schließen Spermienbeweglichkeit, Spermienanzahl, prozentualer Anteil an lebenden Spermien, die wiedergewonnen werden, Spermienmembranfunktion, Spermienpenetrationsrate, Spermien-in-vitro-Befruchtungsrate und/oder Oocytenentwicklung nach der Befruchtung ein.
Die Spermienproben, die in einer Waschlösung, die Arabinogalactan umfaßt, verarbeitet werden, können auf unterschiedliche Spermienlebensfähigkeitseigenschaften getestet werden oder in Diagnose- oder Forschungsanwendungen unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet zur Verfügung stehen, verwendet werden. Die Spermienanzahl in einer Suspension kann mittels manueller oder computerisierter Verfahren bestimmt werden. Bei der Verwendung von computerisierten Verfahren wird eine Spermiensuspension in eine Zählkammer gebracht, die auf dem Gebiet erhältlich ist, wie etwa eine MaklerTM (Fertility Technology, Natick, MA)-Zählkammer, und die Anzahl an Spermien wird gezählt, die gleich der Anzahl der Spermien/ml in der ursprünglichen Suspension ist.
Die Spermienmorphologie oder -form wird bestimmt z. B. mittels Ausstreichens von 10 ul einer Spermienprobe auf einem Objektträger und Färben mit einem Differentialfarbstoff, wie etwa Wright Giemsa mit 0,1% (w/v) für 30 min. Die Spermien werden dann unter einem Mikroskop beobachtet und als mit normalem oder anomalen Formen kategorisiert (Morphologie), wie beschrieben in Kruger et al., Urology 30: 248 (1987).
Die Beweglichkeit der Spermien wird als der gesamte prozentuale Anteil an beweglichen Spermien oder als die Geschwindigkeit der Spermien, die beweglich sind, ausgedrückt und kann unter Verwendung von auf dem Gebiet zur Verfügung stehenden Verfahren bestimmt werden, wie etwa mittels subjektiver visueller Bestimmung unter Verwendung eines Phasenkontrast-Mikroskops oder unter Verwendung eines Computer-automatisierten Samenanalysators. Bei der Verwendung eines Phasenkontrast-Mikroskops wird die Probe visuell analysiert, um Spermien in einen gesamtprozentualen Anteil an beweglichen (schwimmenden) und einem gesamtprozentualen Anteil an progressiv beweglichen (vorwärtsschwimmenden) zu gruppieren, oder der Geschwindigkeit der Spermien, die progressiv beweglich sind, d. h. schnell, mittel oder langsam. Unter Verwendung eines Computers wird die Geschwindigkeit des jeweiligen Spermium auf seinem Weg analysiert. Die Daten werden dann als der prozentuale Anteil an beweglichen, sowie der mittleren Weglängengeschwindigkeit und der Geschwindigkeit der Spermien in der Probe auf ihrem Weg ausgedrückt.
Die Spermienlebensfähigkeit als ein Maß für den prozentualen Anteil an lebenden Spermien wird mittels Membranausschlußfarbstoffen bestimmt, die auf dem Gebiet zur Verfügung stehen. Die Spermienmembranfunktion von lebenden Spermien wird getestet durch Einbringen von Spermien in eine Lösung mit niedrigem Salzgehalt (hypo-osmotisch). Dies bewirkt, daß Spermien mit gesunden Membranen Salz aus der Zelle auspumpen, und bewirkt, daß die Membranen der Spermien schrumpfen, während die Zelle kleiner wird. Der Spermienschwanz ringelt sich innerhalb dieser engeren Membran auf. Spermien mit einem aufgeringelten Schwanz sind die Spermien, die gesund sind und funktionelle Membranen haben. Die Anzahl an Spermien mit einem aufgeringelten Schwanz wird dann als ein prozentualer Anteil der Anzahl der vorhandenen Spermien ausgedrückt.
Um die Spermienpenetration zu testen, wird die Fähigkeit von kapazitierten Spermien, ein totes Hamsterei ohne Zona zu penetrieren, gemessen. Die Spermien-in-vitro- Befruchtungsraten werden bestimmt durch Messen des prozentualen Anteils an Oocyten, die in-vitro unter Verwendung von auf dem Gebiet zur Verfügung stehenden Verfahren befruchtet worden sind. Die kapazitierte Spermienprobe wird mit Oocyten inkubiert, und am Ende der Inkubation wird der prozentuale Anteil an befruchteten Oocyten bestimmt, oder die befruchteten Oocyten werden in Kultur gelassen, eine Teilung findet statt und die Anzahl an sich spaltenden Embryos wird bestimmt.

Spermien-Zelltyp

Eine Arabinogalactan-enthaltende Lösung ist mit Spermienzellen aus einer Vielzahl unterschiedlicher Tiere kompatibel. Die Lösung kann mit einer Konzentration an Arabinogalactan und anderen Bestandteilen in der Lösung formuliert werden, die für den jeweils verarbeiteten Typ Spermienzellen geeignet sind. Zum Beispiel kann die Lösung zur Verwendung mit bovinen, Pferde-, Schwein-, Mensch-, murinen, Nagetier-, Hunde-, Vogel- oder Kaninchen- Spermienproben formuliert werden. Die Lösung kann verwendet werden, um Spermienproben aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Säugetieren zu waschen, und dann kann die Probe direkt in einem großen Bereich an Diagnose- oder Forschungsprotokollen verwendet werden, wie etwa Spermien-Toxikologie und -Fruchtbarkeitstests.
Die Verarbeitung von Spermienproben aus einer Vielzahl unterschiedlicher Tiere in der Lösung, die Arabinogalactan enthält, führt zu einem signifikant verbesserten Schutz der Spermienfunktion, wie etwa eine höhere Wiedergewinnung an beweglichen Spermien, verbesserter Beweglichkeit der Spermien, längere Lebensspanne der Spermien in der darauffolgenden Kultur, erhöhte Oocytenbefruchtung und verbesserte Fähigkeit der Zygoten, normale Blastocysten zu bilden, im Vergleich mit Verfahren nach dem Stand der Technik.

Anwendungen

Eine Arabinogalactan-enthaltende Spermienlösung kann in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden. Die Spermien können in Arabinogalactan-enthaltenden Lösungen gewaschen werden, um die Auswahl und Trennung der am meisten beweglichen Spermien in der Probe zur Verwendung in unterschiedlichen Diagnose- und Forschungsprotokollen zu ermöglichen. Die Spermienproben können z. B. durch Trennung oder Waschen in einer Lösung, die Arabinogalactan enthält, verarbeitet werden und können dann in einer Vielzahl von Diagnose- oder Forschungsprotokollen verwendet werden, einschließlich Unfruchtbarkeitstests und Tests auf Spermientoxikologie. Beispiele für Unfruchtbarkeitstests schließen Tests der Spermienbeweglichkeit, des prozentualen Anteils an lebenden Spermien, Spermienanzahl, Membranfunktion, Penetrationsrate und in-vitro-Befruchtungsrate ein. Protokolle, die auf dem Gebiet zur Verfügung stehen, können verwendet werden, die für den jeweiligen Spermienzelltyp und die jeweilige Diagnose- oder Forschungsanwendung geeignet sind.
In einer Ausführungsform werden Spermienlösungen, die Arabinogalactan in einer vorher gewählten Konzentration für die jeweilige Spermienprobe enthalten, in vorher gefüllten Röhrchen bereitgestellt. Das Produkt kann ebenso in Lösung in einer Abgabevorrichtung für die jeweilige Anwendung bereitgestellt werden. In einer Ausführungsform werden Zentrifugenröhrchen zur Verwendung mit bovinen und Pferde-Spermien bereitgestellt, die eine sterilisierte 22% w/v-Lösung von hochraffiniertem Arabinogalactan in TALP enthalten. Die Röhrchen können bis zu ihrer Verwendung gekühlt gehalten werden. Während ihrer Verwendung werden die Spermienproben auf den Arabinogalactangradienten geschichtet und das Röhrchen wird für 25 min bei 300 · g zentrifugiert.
Daher ist die Arabinogalactan-enthaltende Waschlösung zum Waschen und Trennen von Spermien nützlich. Die Arabinogalactan-enthaltende Lösung kann verwendet werden, um Spermienproben zu verarbeiten, um bewegliche Spermienproben zur Verwendung in einer Vielzahl unterschiedlicher Diagnose- und Forschungsanwendungen zu erzeugen.
Die vorliegende Erfindung wird in Bezug auf die folgenden Beispiele besser verstanden werden.

Methoden und Materialien

Bei den folgenden Beispielen werden Spermienzellen männlichen Ursprungs entweder aus einem frischen Ejakulat als roher Samen oder von einer gelagerten Probe, die durch Wäschen oder Verdünnen verarbeitet worden ist, erhalten und gekühlt oder eingefroren. Alle Vorräte und Ausstattungen stammten von Gibco oder Fertility Technologies, Natick, MA.
In Beispiel 1 wurden Spermien-Test-Assays, die auf dem Gebiet zur Verfügung stehen, verwendet. Die Anzahl der in einer Suspension von Spermienmedium vorhandenen Spermien wurde manuell bestimmt. Zum Beispiel werden 6 ul einer Spermiensuspension in eine MaklerTM-Zellkammer aufgetragen, und die Anzahl an Spermien, die in 10 Quadraten gezählt wurde, wird bestimmt, die gleich der Anzahl an Spermien/ml in der ursprünglichen Suspension ist.
Die Spermienbeweglichkeit wurde unter der Verwendung von computerisierten Verfahren unter Verwendung eines Hamilton Thorn, Beverly, MA Sämenanalysators bestimmt, bei dem die Geschwindigkeit eines einzelnen Spermiums auf seinem Weg analysiert wird (Davis, Infertility & Reproductive Medicine Clinics 3: 341, 1992). Eine 7 ul Spermienprobe wird auf einen Objektträger oder eine für die computer-automatisierte Samenanalyse ("CASA") angelegte Kammer gebracht, und der Computer verfolgt individuelle Spermienzellen und bestimmt ihre Beweglichkeit als Geschwindigkeit über Distanz. Die Daten werden dann als prozentualer Anteil an beweglichen Spermien ausgedrückt, und spezifische Messungen werden für Parameter angegeben, wie etwa mittlere Weggeschwindigkeit und Geschwindigkeit auf dem Weg.
Der prozentuale Anteil an lebenden Spermien in einer Probe wurde bestimmt unter Verwendung von Membranausschlußfarbstoffen. Proben von Spermien werden mit Lebendfarbstoffen, wie etwa Hoechst 33258, inkubiert (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) oder Eosin- Nigrosin. Tote Spermien haben zerstörte Membranen, die es dem Farbstoff ermöglichen, in das Innere der Zelle einzudringen, was ein Färbungsmuster verursacht. Zum Beispiel wird ein 10 ul-Aliquot von Eosin-Nigrosin-Farbstoff (Society for Theriogenelogy, Hastings, NE) mit 10 ul einer Spermienprobe gemischt. Die Mischung wird dann auf einem Objektträger ausgestrichen und die Anzahl an toten (rosa) und weißen (lebenden) Spermien wird gezählt. Die Anzahl an nicht-gefärbten Zellen (lebend), geteilt durch die Gesamtanzahl an Spermien, ergibt den prozentualen Anteil an lebenden Spermien, die vorhanden sind.
Die Membranfunktionsgesundheit einer Spermienzelle wurde mittels des hypo-osmotischen Schwelltest ("HOS") bestimmt. Bei diesem Test wird eine hypo-osmotische Lösung, einschließlich 75 mmol/l Fructose und 25 mmol/l Natriumcitrat, hergestellt. 1 ml dieser Lösung wird zu 100 ul Spermienprobe zugegeben. Nach Inkubation für 30 min wird ein 10-ul- Aliquot dieser Mischung auf einen Objektträger gebracht, und der prozentuale Anteil an Spermien mit aufgeringelten Schwänzen gezählt (Jeyendran et al., J Reprod. Fert. 70: 219, 1984).
Die Spermienpenetrationstests wurden durchgeführt, wie in Rogers et al., Fert Ster., 32: 664, 1979) beschrieben. Ein totes Hamsterei ohne Zona (kommerziell erhältlich, Fertility Technologies, Natick, MA) wird für alle Spezies verwendet. Die Spermien werden mittels Inkubation in 10 IU Heparin kapazitiert. Die kapazitierten Spermien (100.000 in 100 ul BWW-Medium, Fertility Technologies) werden dann mit Hamster-Oocyten für drei Stunden inkubiert, die Oocyten werden mit 1% Acetolacmoid gefärbt, und die Anzahl an Spermien, die jedes einzelne penetrieren, wird gezählt.
In-vitro-Befruchtungsraten wurden mittels reifender Oocyten in-vitro unter Verwendung von M199 (Gibco) mit 50 ug Luteinisierungshormon für 22 Stunden bestimmt, wie beschrieben in Brackett and Zuelke, Therio., 39: 43, 1993. Die Spermien werden chemisch kapazitiert entweder durch Inkubation mit 10 IU von Heparin (Bullenspermien) oder mittels einer 18-stündigen Inkubation mit bovinem Serumalbumin ("BSA") (menschliche Spermien) und dann mit Oocyten für 24 Stunden inkubiert. Oocyten werden dann mit einem 1% Aceto-Orcein- Farbstoff gefärbt, um den prozentualen Anteil an befruchteten Oocyten zu bestimmen, oder in Kultur gelassen, um sich zu teilen und Embryos zu bilden.

Beispiel 1: Spermientests

Bovine, menschliche und Pferde-Spermienproben wurden mittels Zentrifugation in einer Spermien-Waschlösung, die entweder Arabinogalactan oder PercollTM, den Industriestandard, enthielt, gewaschen, wurden dann auf Spermienlebensfähigkeitseigenschaften, einschließlich Spermienbeweglichkeit, prozentualem Anteil an lebenden Spermien, Anzahl, Membranfunktion, Penetration und Befruchtung getestet.

Spermien-Waschung

Ein kontinuierlicher Gradient einer Spermien-Waschlösung wurde hergestellt, einschließlich einer Lösung mit ausgeglichenem Salzgehalt, zusammen mit hochraffiniertem Arabinogalactan. Die Spermien-Waschlösungen wurden für die Spermien von verschiedenen Tieren, wie folgt, hergestellt: Glucose-freies Tyrode's Lactat, Albumin und Pyruvat-enthaltendes Medium ("TALP", siehe Tabelle 1) für bovine Spermien, Glucose-enthaltendes TALP (5 mM Glucose) für Spermien von anderen Tierarten, und HTF (menschliche Eileiterflüssigkeit, erhalten von Irvine Scientific, La Jolla, CA, oder Fertility Technologies, Natick, MA) für menschliche Spermien. Das TALP wurde in Wasser mit den in Tabelle 1 gezeigten Konzentrationen angesetzt.

Tabelle 1: Glucose-freies TALP-Medium

Inhaltsstoff / pro 500 ml
NaCl 2,922 g
KCl 0,1156 g
NaHCO&sub3; 1,0500 g
NaH&sub2;PO&sub4;H&sub2;O 0,0200 g
Na-Lactat-Sirup (60%) 1841 ul
CaCl&sub2; 0,1546 g
MgCl 0,0407 g
Phenol-Rot 0,0050 g
Hepes 1,1915 g
BSA-Fraktion V 3,000 g
Gentamycinsulfat S00 ul
Na-Pyruvat 25 ml
Hochraffiniertes Arabinogalactan (UF, erhältlich von Larex International, Inc., St. Paul, Minnesota) wurde zur Lösung zugegeben ("die AG-Waschlösung"). Die Konzentration an Arabinogalactan ("AG") war ungefähr 22% w/v für Tierspermien und ungefähr 30% für menschliche Spermienproben. Bei der Kontrolle wurde eine doppelte Dichte von 45% w/v über 90% w/v PercollTM verwendet ("die Percoll-Waschlösung"). Die Mischung wurde durch einen 0,2- Micron-Filter in ein Zentrifugenröhrchen vor der Verwendung gefiltert. Der pH der Arabinogalactan-enthaltenden Waschlösung wurde auf ungefähr pH 7,4 vor der Zugabe der Spermienprobe eingestellt.

Spermienzentrifugation

Eine Samenprobe wurde über das Waschprodukt in einem Verhältnis von 1 Teil Samen auf 2 Teile Waschlösung gebracht. Das Gesamtvolumen der Samenprobe und der Waschlösung war typischerweise ungefähr 9 ml für Menschen und 4 ml für Bovine. Die Probe wurde dann bei 300 · g für 20-30 min zentrifugiert. Die AG-Waschlösung oder Percoll-Waschlösung wurde dann aspiriert. Das nach dem Waschen erhaltene Spermien-Pellet wurde dann in einer Lösung mit ausgeglichenen Salzgehalt resuspendiert und, wie oben beschrieben, getestet. Die Spermien-Waschlösung, die Arabinogalactan enthielt, war stabil und blieb für die Spermienwaschung sogar nach Lagerung für 2 Monate wirksam, was daher auf die langfristige Stabilität der Lösung hinweist.
Bei der Spermien-Wasch-Zentrifugationsprozedur unter Verwendung von PercollTM (die PercollTM-Prozedur) ist es nach der Zentrifugation notwendig und auf dem Gebiet üblich, das Spermien-Pellet wieder in einer Lösung ohne PercollTM zu waschen, um das PercollTM, das für Spermien toxisch ist, zu entfernen. Vorteilhafterweise gab es kein solches Erfordernis bei der Spermien-Waschprozedur unter Verwendung von AG ("die AG-Prozedur"), und in der Tat wurden verbesserte Resultate ohne eine zweite Waschung erhalten. Bei den folgenden Experimenten wurde deshalb eine zweite Waschung (Zentrifugation) nach der PercollTM- Prozedur durchgeführt, aber nicht bei der AG-Prozedur.

Assay von bovinen Spermien

Gefrorene Spermien von 4 Bullen wurden mittels Zentrifugation in den AG- oder PercollTM- Produkten, wie oben beschrieben, gewaschen. Jedes Experiment wurde wenigstens zweimal doppelt durchgeführt. Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt.
Die AG-Prozedur führt zu einer höheren prozentualen Wiedergewinnung von Spermien beim Verwenden von manuellem Zählen (p = 0,1) als die PercollTM-Prozedur (61 ± 9% gg. 53 ±5%). Die AG-Prozedur führte ebenso zu einem höheren prozentualen Anteil (p = 0,08) an beweglichen (schwimmenden) Spermien aus der ursprünglichen Probe bei Verwendung des computerisierten Beweglichkeitstest, als dies die PercollTM-Prozedur tat (88 ± 9% gg. 73 ± 6%).
Die Spermien, die aus der AG-Waschlösung wiedergewonnen wurden, unterschieden sich nicht stark (p = 0,18) in ihrem prozentualen Anteil an Beweglichkeit unter Verwendung des computerisierten Beweglichkeitstests gegenüber demjenigen in PercollTM (95 ± 0,25% gg. 90 ± 3%). Jedoch war die Varibilität der Spermienbeweglichkeit nach der Waschung durch die AG-Prozedur sehr niedrig (0,25%), was nahelegt, daß die AG-Waschung konsistenter eine höhere Spermienbeweglichkeit unterstützte.
Die Überlebensrate der Spermien unter Routinekulturbedingungen nach dem Waschen wurde ebenso getestet. Nach der Inkubation für 30 Minuten war die Beweglichkeit größer (p = 0,08) für die Spermien, die ursprünglich in der AG-Waschlösung gewaschen worden waren, als in PercollTM (94 ± 2% gg. 88 ± 9%). Nach 4 h unterschied sich die Beweglichkeit nicht signifikant (p = 0,5) für Spermien aus beiden Behandlungen (74 ± 14% gg. 70 ± 18%). Nach 8 h gab es keinen wesentlichen Unterschied. Nach 24 h gab es sichtbar mehr Spermien, die beweglich und lebend unter einem Umkehr-Mikroskop waren, für diejenigen, die mittels der AG- Waschlösung getrennt worden waren (p = 0,03), als bei der PercollTM-Waschung. In der Tat waren wenige Spermien, wenn überhaupt noch irgendwelche aus der PercollTM-Waschgruppe lebend, während die Spermien aus der AG-Waschlösung konsistent bis wenigstens 36 h in der Kultur lebten.
Die Spermien-Schnelligkeitseigenschaften wurden ebenso bestimmt. Die Spermien schwammen schneller nach einem Waschen in der AG-Waschlösung (p ± 0,05) gegen die PercollTM- Waschung. Nach dem Waschen wurden die folgenden Eigenschaften bei der Verwendung der AG-Prozedur gg. die PercollTM-Prozedur beobachtet: Die Weggeschwindigkeit war 84 ± 4 gegen 71 ± 3 un/s; die mittlere Weggeschwindigkeit war 118 + 4 gegen 97 ± 5 un/s; und die vorwärts gerichtete Geschwindigkeit betrug 71 ± 4 gegen 60 ± 5 un/s.
In-vitro-Befruchtungsdaten wurden ebenso erhalten. In-vitro gereifte bovine Oocyten wurden mit gefrorenen Bullenspermien in 3 Läufen befruchtet. Insgesamt waren bei der Studie 1094 Oocyten beteiligt, 550 wurden mit AG-gewaschenen Spermien und 545 mit PercollTM- gewaschenen Spermien verwendet. Die Spaltungsraten für die Oocyten waren signifikant besser nach dem Waschen der Spermien durch die AG-Waschlösung gegenüber dem Waschen durch PercollTM (p = 0,001), wie unten in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: Oocyten-Spaltungsraten
Der prozentuelle Anteil an fertilen Oocyten, die in der Lage sind, sich normal in Kultur zu entwickeln, um Blastocysten nach einer Woche zu bilden, war signifikant besser nach einem Waschen der Spermien durch die AG-Waschlösung gegenüber PercollTM (p = 0,009), wie unten in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3: Oocyten-Entwicklung
Die Gesamtproduktion an Blastocysten (normal entwickelte Embryos), als ein prozentualer Anteil an Gesamtoocyten, die in das System eingeführt worden waren, war signifikant besser nach einem Waschen der Spermien durch die AG-Waschlösung gegenüber PercollTM (p = 0,004), wie in Tabelle 4 veranschaulicht. Tabelle 4: Blastocytenproduktion
(a) Gesamtzellzahlen für Blastocysten, die nach der Befruchtung mit entweder AG- Waschlösung- oder PercollTM-behandelten Spermien gebildet wurden, unterschieden sich nicht (p = 0,25). Tabelle 5: Zellzahlen
Dies legt nahe, daß, obwohl sich mehr Oocyten zu Blastocysten nach einer Spermienbehandlung mit der AG-Waschlösung entwickelten, die grundlegenden Mechanismen der Embryoentwicklung nicht verändert sind.
Daher hatten gefrorene Bullenspermien, die durch eine AG-Waschlösung ohne eine weitere Waschung gewaschen worden waren, signifikant bessere Eigenschaften im Vergleich mit Spermien, die durch ein Standard-PercollTM-System gewaschen worden waren, und zwar dahingehend, daß mehr Spermien wiedergewonnen wurden; die Spermien schwimmen schneller; die Spermien leben länger in Kultur; mehr Spermien sind in der Lage, ein Ei zu befruchten; und mehr befruchtete Eier entwickeln sich weiter.

Pferdespermien-Test

Spermien von 4 Hengsten wurden verdünnt und über Nacht gekühlt und durch eine AG- Waschlösung oder PercollTM-Medium mittels Zentrifugation, wie oben beschrieben; gewaschen. Hengstspermien werden gewöhnlich nicht mittels PercollTM verarbeitet, da es vorzeitig die Spermien kapazitiert. Der prozentuale Anteil an beweglichen Spermien war nach einer Behandlung in einer AG-Waschlösung größer als in der PercollTM-Waschlösung (p = 0,04; 60 ± 8% gegen 30 ± 10%). Der prozentuale Anteil an Spermien mit normaler Membranfunktion unter Verwendung des hypo-osmotischen Schwelltest war größer nach einem Waschen in AG (p = 0,02) als in PercollTM (70 ± 5% gegen 32 ± 12%). Es wurde beobachtet, daß zwei Hengste mit einer schlechten Anfangsqualität von Spermien beinahe eine Verdopplung des prozentualen Anteils an beweglichen Spermien und des prozentualen Anteils an normalen Membranen nach einem Waschen durch die AG-Lösung hatten.

Test von menschlichen Spermien

Frisch ejakulierter Samen von 12 Männern wurde verwendet. Es wurde gefunden, daß die optimale Konzentration von AG für die Spermien-Waschlösung (Zentrifugation) ungefähr 30% w/v in einem 4 ml-Gradienten war. Die Spender hatten sowohl normale als auch anomale Samenqualität, und die anfängliche mittlere Beweglichkeit war 48 ± 12%. Der prozentuale Anteil an beweglichen Spermien, der unter Verwendung der AG-Waschlösung oder der PercollTM-Waschlösung erhalten wurde, unterschied sich nicht sehr. Die Spermienpenetrationsrate, die unter Verwendung des Test mit Hamstereiern ohne Zona getestet wurde, zeigte, daß es keinen wesentlichen Unterschied bei dem prozentualen Anteil an Eiern gab, die penetriert worden waren, oder der Anzahl an Spermien, die in der Lage waren, zu penetrieren, unter Verwendung der AG- oder PercollTM-Prozeduren, obwohl die Probe eines Spenders eine 30%-ige Verbesserung hinsichtlich der Spermienpenetration nach dem Waschen bei Verwendung der AG-Waschlösung gegenüber der PercollTM-Waschlösung hatte. Der prozentuale Anteil an Spermien mit normaler Membranfunktion unter Verwendung des hypo-osmotischen Schwelltest war höher (p = 0,06) nach einem Waschen mit der AG-Waschlösung als bei Verwendung von PercollTM (70 + 13% gegen 46 + 10%). Daher wird bei menschlichen Spermienproben eine Membranschädigung verringert.

Schlußfolgerung

Spermien, die mittels Zentrifugation, wie oben beschrieben, in einer Waschlösung, enthaltend Arabinogalactan, gewaschen wurden, hatten verbesserte Eigenschaften im Vergleich mit Spermien, die in einer Lösung, enthaltend einen PercollTM-Gradienten, gewaschen wurden. Es wurden mehr bewegliche Spermien wiedergewonnen, die wiedergewonnenen Spermien hatten eine bessere Beweglichkeit (schwimmen schneller), hatten weniger Membranfunktionsschäden und hatten höhere Befruchtungsraten bei einer in-vitro-Befruchtung.

Claims

1. Lösung, umfassend 15% bis 50% Gewicht/Volumen Arabinogalactan zur Verwendung als eine Spermienproben-Waschlösung.

2. Lösung nach einem vorangehenden Anspruch, wobei die Spermienzell-Waschlösung verwendet wird, um Spermien zu zentrifugieren.

3. Lösung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verwendung in einem Spermienbeweglichkeitstest, in einem Test des prozentualen Anteils an lebenden Spermien, zur Spermienzählung, in einem Spermienmembranfunktionstest, in einem Spermienpenetrationsratentest oder in einem Spermien-in-vitro-Befruchtungsraten-Test.

4. Lösung, umfassend 15% bis 50% Gewicht/Volumen Arabinogalactan, zum Trennen von beweglichen Spermien von anderen Spermien in einer Spermienprobe.

5. Lösung nach Anspruch 4, wobei die Lösung verwendet wird, um Spermien auf Grundlage der Beweglichkeit unter Verwendung von Zentrifugation oder Säulenfiltration zu trennen.

6. Lösung nach einem der vorangehenden Ansprüche zum Trennen von beweglichen bovinen, Pferde-, Schweine-, menschlichen, murinen, Nagetier-, hundeartigen-, Vogel- oder Kaninchen-Spermien von anderen Spermien in einer Probe.

7. Lösung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verwendung in einem diagnostischen oder Forschungstest-Protokoll.

8. Zusammensetzung zum Waschen oder Trennen von Spermien in einer Spermienprobe, umfassend eine Lösung, die mit einer wirksamen Menge von Arabinogalactan versehen ist, um den Schutz von einer oder mehreren der Spermienlebensfähigkeitseigenschaften während des Waschens oder der Trennung von Spermien zu ermöglichen, wobei die Konzentration von Arabinogalactan in der Lösung zwischen 15% und 50% Gewicht/Volumen beträgt.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, weiterhin umfassend Spermien.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Spermien bovine, Pferde-, Schweine-, menschliche, murine, Nagetier-, hundeartige-, Vogel- oder Kaninchen-Spermien sind.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 8, 9 oder 10 zur Verarbeitung einer bovinen oder Pferde-Spermienprobe, wobei die Lösung weiterhin Lactat, Albumin und Pyruvat umfaßt.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 8 zum Verarbeiten einer menschlichen Spermienprobe, wobei die Lösung weiterhin menschliche Eileiterflüssigkeit umfaßt.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, wobei der pH der Lösung 7,4 beträgt.

14. Zusammensetzung oder Lösung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Arabinogalactan hochraffiniert ist.

15. Zusammensetzung oder Lösung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Konzentration von Arabinogalactan in der Lösung zwischen 20% und 30% Gewicht/Volumen beträgt.

16. Zusammensetzung oder Lösung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Arabinogalactan natürlich vorkommendes oder synthetisches Arabinogalactan ist.

17. Verfahren zum Waschen einer Spermienprobe, umfassend: Waschen der Spermienprobe in einer Spermienlösung, umfassend eine wirksame Menge an Arabinogalactan, um die Entfernung von Substanzen, die nicht Spermien sind, aus der Probe zu ermöglichen und um eine oder mehrere der Spermienlebensfähigkeitseigenschaften während des Waschens zu schützen.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Substanzen, die nicht Spermienzellen sind, ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Samenplasma, weißen Blutkörperchen, roten Blutkörperchen, Gefrier-Extender-Mitteln, Spermienbruchstücken, Kulturmedien und Medienzusatzstoffen.

19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Spermienlebensfähigkeitseigenschaft ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Spermienbeweglichkeit, Spermienanzahl, prozentualem Anteil an lebenden Spermien, Spermienmembranfunktion, Spermienpenetrationsrate, Spermienbefruchtungsrate und Oocytenentwicklung nach der Befruchtung.

20. Verfahren zum Trennen von beweglichen Spermien von anderen Spermien in einer Spermienprobe, wobei das Verfahren umfaßt: Trennen der Spermien in der Probe in einer Lösung, umfassend Arabinogalactan, wobei das Arabinogalactan eine oder mehrere der Spermienlebensfähigkeitseigenschaften während der Trennung schützt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die getrennten Spermien eine verbesserte Fähigkeit haben, eine Oocyte im Vergleich mit den anderen Spermien zu befruchten, nach der Trennung.

22. Verfahren nach Anspruch 17 oder 20, wobei das Arabinogalactan hochraffiniert ist.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Konzentration von Arabinogalactan in der Lösung zwischen 15-50% Gewicht/Volumen beträgt.

24. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Konzentration von Arabinogalactan in der Lösung zwischen 20% und 30% Gewicht/Volumen beträgt.

25. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Spermien auf Grundlage der Beweglichkeit unter Verwendung eines Verfahrens getrennt werden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Zentrifugation und Säulenfiltration in der Lösung, umfassend Arabinogalactan.

26. Verfahren nach Anspruch 17 oder 20, weiterhin umfassend das Bereitstellen in der Lösung von einer Konzentration an Arabinogalactan, die für die Art der zu trennenden Spermien geeignet ist.

27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Spermienprobe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus bovinen, Pferde-, Schweine-, menschlichen, murinen, Nagetier-, hundeartigen-, Vogel- und Kaninchen-Spermienproben.

28. Verfahren nach Anspruch 22, weiterhin umfassend die Verwendung der getrennten Spermien in einem Protokoll, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus diagnostischen oder Forschungs-Testprozeduren.

29. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Lösung eine wirksame Menge an Arabinogalactan umfaßt, um eine oder mehrere der Spermienlebensfähigkeitseigenschaften von Spermien in der Probe während der Trennung zu schützen.

30. Verfahren nach Anspruch 17 oder 20, wobei das Arabinogalactan ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus natürlich vorkommendem oder synthetischem Arabinogalactan, Teilen von Arabinogalactan und chemisch oder biochemisch modifiziertem Arabinogalactan oder Teilen davon.

31. Verfahren nach Anspruch 22, sofern abhängig von Anspruch 17, wobei die Spermienprobe mittels Zentrifugation der Spermienprobe in der Lösung, umfassend Arabinogalactan, aufgereinigt wird.

32. Verfahren nach Anspruch 22, sofern abhängig von Anspruch 17, weiterhin umfassend die Verwendung der gewaschenen Spermien in einem Spermientestprotokoll, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Spermienbeweglichkeitstest, einem Test des prozentualen Anteils an lebenden Spermien, einer Spermienzählung, einem Spermienmembranfunktionstest, einem Spermienpenetrationsratentest und einem Spermien-in-vitro- Befruchtungsratentest.