DE60017945T2

DE60017945T2 - Verfahren zur kryokonservierung von samenzellen

Info

Publication number: DE60017945T2
Application number: DE60017945T
Authority: DE
Inventors: John Schenk
Original assignee: XY LLC
Current assignee: XY LLC
Priority date: 1999-11-24
Filing date: 2000-11-22
Publication date: 2006-06-08
Anticipated expiration: 2020-11-23
Also published as: DK1557087T3; MXPA02005134A; EP1257168B1; IL149802A0; EP1557087A1; US20130137081A1; AR026572A1; CN1424873A; AU782919B2; BR0016049A; WO2001037655A1; EP1257168A1; US20070092860A1; US7208265B1; PL355853A1; CA2391370A1; PL211512B1; ATE288197T1; NZ530441A; CN100367849C

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einfrieren von Sperma, das in bezug auf eine spezielle Eigenschaft ausgewählt worden ist, sowie eine gefrorene ausgewählte Spermaprobe und Verfahren zur Verwendung einer derartigen Probe. Die Erfindung eignet sich insbesondere zur Konservierung von in bezug auf das Geschlecht ausgewähltem Sperma.
Hintergrund der Erfindung
Vor mehr als einem halben Jahrhundert wurde in den Vereinigten Staaten die künstliche Besamung als gewerbliche Maßnahme beim Züchten einer Vielzahl von Säugetierspezies eingeführt. Obgleich eine künstliche Besamung zunächst auf Regionen begrenzt war, die relativ nahe an der Stelle der Spermagewinnung lagen, haben Fortschritte in der Kryokonservierung und Lagerung von Sperma eine weite Verbreitung und Vermarktung von Sperma, das für die künstliche Insemination oder in vitro-Fertilisation vorgesehen ist, erleichtert.
Weitere Verbesserungen der Techniken beim Gewinnen, Auswählen, Kryokonservieren, Lagern und Handhaben von Säugetiersperma haben für die Züchter die Möglichkeit verbessert, Tiere mit angestrebten Merkmalen zu erzeugen. Beispielsweise haben es Fortschritte in der Auswahl von Säugetiersperma auf der Basis geringfügiger Unterschiede von physikalischen Eigenschaften ermöglicht, Sperma auf der Grundlage des Geschlechts zu trennen, d. h. Zellen, die entweder das X- oder Y-Chromosom enthalten, auszuwählen. Diese Technik ermöglicht es dem Züchter, den relativen prozentualen Anteil von Sperma vom X- oder vom Y-Typ in einer Probe zu manipulieren und dadurch das Geschlecht der Nachkommen festzulegen. Die Möglichkeit zur Auswahl von Sperma auf der Basis des Geschlechts oder beliebiger anderer erstrebenswerter Merkmale bietet ein wichtiges Werkzeug zur Beschleunigung des genetischen Fortschritts zur Steigerung des Produktionswirkungsgrads und zur Erzielung einer größeren Flexibilität in der Viehzucht. Eine vollständige Ausnützung dieses Werkzeugs hängt jedoch von der Fähigkeit ab, ausgewähltes Sperma einzufrieren und zu lagern.
Es stehen eine Vielzahl von Verfahren zur Auswahl von Zellen zur Verfügung. Jedoch treten bei der Auswahl und der anschließenden Verarbeitung von Sperma besondere Probleme auf, und zwar aufgrund der Tatsache, dass Sperma nicht zur DNA-Reparatur befähigt ist und aufgrund der Sperma-Morphologie. Spermien weisen jeweils ein über dem Kopf liegendes Akrosom und einen Schwanz auf. Diese Bestandteile sind für die Fruchtbarkeit von Bedeutung und gegenüber physikalischen Beschädigungen relativ empfindlich. Ferner nimmt die Spermienfruchtbarkeit mit dem zeitlichen Abstand zwischen der Gewinnung und der Verwendung ab. Da die meisten verfügbaren Auswahlverfahren physikalische Beanspruchungen beinhalten und zeitlich aufwändig sind, ist das ausgewählte Sperma typischerweise im Vergleich zu nicht-selektierten Zellen in gewissem Umfang beeinträchtigt. Die Fruchtbarkeit kann ferner vermindert werden, wenn die Auswahltechnik eine erhebliche Verdünnung beinhaltet. Es wurde die Auffassung vertreten, dass dieser "Verdünnungseffekt" möglicherweise auf den Verlust an Schutzkomponenten im Samenplasma zurückzuführen ist.
Die Fließzytometrie stellt ein besonders wirksames Auswahlverfahren dar, das zum Sortieren von Spermien nach dem Geschlecht eingesetzt wird. Jedoch unterliegen die sortierten Spermien Beanspruchungen, die über das normale Maß, das bei einer üblichen künstlichen Insemination oder bei in vitro-Fertilisationsverfahren auftritt, hinausgehen. Insbesondere ist die Fließzytometrie zeitaufwändig und das Sperma muss aufgrund der physikalischen Zwänge zum Sortieren auf Konzentrationen verdünnt werden, die für eine Lagerung nicht optimal sind (üblicherweise auf eine Größenordnung von 10⁵–10⁶/ml). Ferner muss sortiertes Sperma, das für eine künstliche Besamung vorgesehen ist, eingeengt werden, so dass man sich nicht herkömmlicher Verpackungs- und Abgabeeinrichtungen bedienen kann. Die Notwendigkeit einer Konzentrationsstufe setzt somit das bereits etwas beeinträchtigte Sperma weiteren physikalischen Beanspruchungen aus.
Das US-Patent 4 474 875 beschreibt ein Verfahren zur Steuerung des Geschlechts von Säugetiernachkommen durch Auftrennen des Spermas in Fraktionen mit den gewünschten Geschlechtsmerkmalen und durch künstliche Besamung der weiblichen Säugetiere, um Nachkommen mit dem gewünschten Geschlecht zu erzeugten. Das Sperma wird aufgetrennt, indem man ein Gemisch von Sperma in Nährmedium Auftriebskräften aussetzt, so dass eine Trennung entsprechend der Dichte des Spermas erfolgt. BR-9704313 beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur Geschlechtsfestlegung von Säugetiersperma, wobei das Sperma anschließend kryokonserviert werden kann.
Das Einfrieren von Sperma verringert ferner in unabänderlicher Weise die Fruchtbarkeit, Beweglichkeit und/oder Lebensfähigkeit. Obgleich Techniken zum Einfrieren von nicht-selektiertem Sperma bekannt sind, wurde bisher keine Technik zur Kryokonservierung von ausgewähltem Sperma beschrieben.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Kryokonservierung von Sperma, das einer Selektion in bezug auf eine bestimmte Eigenschaft unterzogen worden ist, bereitgestellt. Insbesondere wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Kryokonservierung von Sperma bereitgestellt, das folgendes umfasst:

(a) das Gewinnen einer Spermaprobe;
(b) das Zugeben eines anfänglichen Streckmittels und das Auswählen von Sperma durch Fließzytometrie, wobei das Zugeben und das Auswählen in einer beliebigen Reihenfolge vorgenommen werden;
(c) das Abkühlen der ausgewählten Spermaprobe;
(d) das Isolieren von Sperma aus der ausgewählten kühlen Spermaprobe zur Erzeugung von isoliertem kühlen Sperma;
(e) das Zugeben von endgültigem oder abschließendem Streckmittel zum kühlen isolierten Sperma zur Erzeugung einer kühlen Spermasuspension; und
(f) das Einfrieren der Spermasuspension.

Das Verfahren eignet sich insbesondere zur Kryokonservierung von Sperma, das durch ein Verfahren ausgewählt worden ist, das zu einer Verdünnung des Spermas führt, da das Verfahren für die Isolierung von Sperma aus einer ausgewählten Spermaprobe sorgt, wonach die Zugabe eines abschließenden Streckmittels zum isolierten Sperma zur Erzeugung einer Suspension mit einer angestrebten Spermakonzentration folgt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren auf gefrorenes, in bezug auf das Geschlecht ausgewähltes Sperma angewandt.
Erfindungsgemäß wird ferner eine gefrorene Spermaprobe bereitgestellt, die durch Fließzytometrie einer Auswahl in bezug auf eine bestimmte Eigenschaft, z. B. in bezug auf das Geschlecht, unterzogen worden ist. Bei bevorzugten Ausführungsformen umfasst die gefrorene Spermaprobe Säugetiersperma, z. B. humanes Sperma, Rindersperma, Pferdesperma, Schweinesperma, Schafsperma, Elchsperma oder Bisonsperma.
Die gefrorene, ausgewählte Spermaprobe kann für eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten eingesetzt werden. Insbesondere kann die Probe aufgetaut und zur Befruchtung eingesetzt werden. Demzufolge umfasst die Erfindung auch ein Verfahren zur Verwendung einer gefrorenen, ausgewählten Spermaprobe zur künstlichen Besamung oder zur in vitro-Fertilisation.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Kryokonservierung von Sperma, das in bezug auf eine bestimmte Eigenschaft einer Auswahl unterworfen worden ist, wobei die Lagerung und/oder der Transport von ausgewählten Spermaproben zu Orten, die vom Gewinnungsort weit entfernt sind, erleichtert wird. Durch Auftauen erhält man lebensfähiges Sperma, das bei Verfahren, wie der künstlichen Insemination ("AI") und der in vitro-Fertilisation ("IVF") eingesetzt werden kann. Dieses Ergebnis war aufgrund der gut belegten Unbeständigkeit von Sperma überraschend. Frühere Forschungsgruppen hatten gezeigt, dass die Beanspruchungen, die mit verschiedenen Auswahlverfahren oder mit der Kryokonservierung verbunden sind, zu erheblichen Verlusten an Fertilität und/oder Lebensfähigkeit führen. Die vorliegenden Erfinder haben erstmals nachgewiesen, dass eine Trächtigkeit mit Sperma erreicht werden kann, das durch Fließzytometrie ausgewählt und anschließend eingefroren worden ist.
Die Erfindung stellt einen wichtigen Fortschritt in der Viehzucht dar, wo eine Auswahl von Sperma zur Anwendung bei derartigen Verfahren dazu herangezogen werden kann, die Erzeugung einer Nachkommenschaft mit erwünschten Eigenschaften zu verstärken. Beispielsweise ermöglicht die Gewinnung von Sperma, dass entweder das X- oder das Y-Chromosom trägt, eine Steuerung des Geschlechts der Nachkommen, was für die Erzeuger von Tieren, wie Milchkühen oder Mastbullen, vorteilhaft ist. Die Auswahl in bezug auf das Geschlecht findet auch Anwendung bei der Zucht von wertvollen Tieren (z. B, bei Spring- oder Rassepferden) oder bei gefährdeten Tierarten. Die Möglichkeit zum Einfrieren von ausgewähltem Sperma, die erfindungsgemäß bereitgestellt wird, ermöglicht eine weit gefächerte Anwendung derartiger Auswahlverfahren, beispielsweise zur Erhöhung von Wirkungsgrad und Qualität in der Viehzucht.
Definitionen
Die Ausdrücke "Akrosom" oder "akrosomale Kappe" bezieht sich auf die Kappe, die die vordere Hälfte des Spermakopfes bedeckt und die Enzyme enthält, die für die Penetration in das Ei erforderlich sind.
Der Ausdruck "Geschlechtstyp" bezieht sich auf den Typ des im Sperma enthaltenen Geschlechtschromosoms (d. h. X- oder Y-Chromosom).
Der Ausdruck "Kapazitation" bezieht sich auf spezielle Veränderungen, denen eine Spermie unterliegt, um die Fähigkeit zur Befruchtung von Eiern zu entwickeln, z. B. auf enzymatische Veränderungen auf der Oberfläche des Akrosoms, die zu einer Freisetzung von akrosomalen Enzymen führen, die die Penetration des Spermas in das Ei erleichtern.
Unter Bezugnahme auf Sperma bedeutet der Ausdruck "Kryoschutzmittel" ein Molekül, das das Sperma während eines Einfrier-Auftau-Zyklus schützt und dabei das Überleben und den Erhalt des Befruchtungsvermögens fördert.
Der Ausdruck "Verdünnungseffekt" bezieht sich auf die rasche Abnahme der Beweglichkeit und/oder der Lebensfähigkeit von Sperma bei starker Verdünnung.
Der hier verwendete Ausdruck "Auswahl" bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem eine Probe auf der Grundlage der Anwesenheit oder Abwesenheit von speziellen Eigenschaften unterteilt wird (sofern nicht aus dem Zusammenhang etwas anderes hervorgeht). Somit handelt es sich bei einer "ausgewählten Spermaprobe" um eine Probe, die erhalten wird, indem man eine Quellenprobe einer Auswahl in bezug auf die spezifischen Eigenschaften unterzieht. Eine ausgewählte Spermaprobe ist daher relativ zur Quellenprobe in bezug auf Spermien, die die spezielle Eigenschaft aufweisen, angereichert.
Der Ausdruck "Sortieren" wird hier verwendet, um ein Auswahlverfahren zu beschreiben, das unter Verwendung eines fluoreszenzaktivierten Zellsortiergeräts (FACS) durchgeführt wird.
Der Ausdruck "Streckmittel" bezieht sich auf ein beliebiges Medium, das tendenziell die Konservierung der Lebensfähigkeit von Sperma bewirkt. Der Ausdruck "Strecken" bezieht sich auf die Verdünnung von Sperma mit einem Streckmittel.
Der Ausdruck "anfängliches Streckmittel" bezieht sich auf ein Medium, das zum Strecken von Sperma vor der Isolierungsstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird.
Der Ausdruck "abschließendes Streckmittel" bezieht sich auf ein Medium, das zum Strecken von Sperma vor der Einfrierstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird.
Bei einer "organischen Substanz" in einem hier beschriebenen Streckmittel handelt es sich um eine beliebige organische Substanz, die tendenziell den Kälteschock verringert und die Fruchtbarkeit von Sperma aufrechterhält.
Bei einer "Energiequelle" in einem hier beschriebenen Streckmittel handelt es sich um beliebige Substanzen oder Substrate, die vom Sperma für die Aufrechterhaltung und/oder für die Beweglichkeit von Zellen verwendet werden können.
Bei dem hier verwendeten Ausdruck "Osmolalität" handelt es sich um ein Maß für den osmotischen Druck von Teilchen eines gelösten Stoffes in einer wässrigen Lösung (z. B. einem Streckmittel). Die Teilchen des gelösten Stoffes umfassen sowohl Ionen als auch nicht-ionisierte Moleküle. Die Osmolalität wird als Konzentration der osmotisch aktiven Teilchen (d. h. Osmol), die in 1 kg Wasser gelöst sind, angegeben.
Kryokonservierungsverfahren
Gewinnung einer ausgewählten Spermaprobe
Die erste Stufe des erfindungsgemäßen Kryokonservierungsverfahrens umfasst die Gewinnung einer vorher ausgewählten Spermaprobe sowie die Tatsache, dass eine Quellenprobe einem beliebigen geeigneten Auswahlverfahren unterworfen wird. Sperma von beliebigen Spezies kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgewählt und eingefroren werden. Das Verfahren kann mit Sperma von Haustieren, insbesondere Vieh, sowie mit Sperma von Wildtieren (z. B. gefährdeten Spezies) durchgeführt werden. Vorzugsweise enthält die ausgewählte Spermaprobe Säugetiersperma. Humanes Sperma, Rindersperma, Pferdesperma, Schweinesperma, Schafsperma, Elchsperma und Bisonsperma werden besonders bevorzugt.
Im allgemeinen enthält die ausgewählte Spermaprobe normale, lebensfähige Spermien. Zu diesem Zweck weist das Ejakulat, aus dem das Sperma erhalten wird, typischerweise mindestens 50 % und vorzugsweise mindestens etwa 75 % morphologisch normale Spermien auf. Bei diesen Ausführungsformen weisen im allgemeinen mindestens etwa 40 % und vorzugsweise mindestens etwa 60 % der Spermien im Ejakulat eine progressive Beweglichkeit auf.
Bei der Fließzytometrie handelt es sich um ein Verfahren zum Auftrennen von Zellen aus gemischten Populationen auf der Grundlage der unterschiedlichen Färbung mit fluoreszierenden Farbstoffen oder der unterschiedlichen Bindung an fluoreszierend markierte Moleküle, wie Antikörper oder Nucleinsäuren. Bei der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung ("FACS") werden Zellen auf der Grundlage der Fluoreszenzintensität bei Bestrahlung zu verschiedenen Populationen "sortiert". FACS kann zur Auswahl von Sperma in bezug auf das Geschlecht herangezogen werden, da das X-Chromosom geringfügig mehr DNA als das Y-Chromosom enthält. Wenn Sperma mit einem fluoreszierenden, DNA-bindenden Farbstoff gefärbt wird, absorbieren Spermien mit dem X-Chromosom mehr Farbstoff als Spermien mit dem Y-Chromosom. Somit können die beiden Populationen durch FACS aufgetrennt werden. Diese Strategie ist im US-Patent 4 362 246 erörtert und wird im US-Patent 5 135 759 (Johnson) erheblich erweitert. Die Auftrennung wurde durch Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Fließzytometern, z. B. dem MoFlo^®-Fließzytometer der Firma Cytomation, Inc. (Ft. Collins, CO), die in den US-Patenten 5 150 313, 5 602 039, 5 602 349 und 5 643 796 sowie in der PCT-Veröffentlichung WO-96/12171 beschrieben sind, verstärkt.
Das zur Gewinnung der ausgewählten Spermaprobe herangezogene Auswahlverfahren führt zur Beibehaltung der Lebensfähigkeit von Sperma. Aufgrund der relativen Unbeständigkeit von Sperma sollten normale fließzytometrische Techniken im allgemeinen zur Sortierung von Sperma modifiziert werden. Insbesondere werden bei der Fließzytometrie Zellen gefärbt, verdünnt und mit Licht abgefragt. Alle diese Stufen stellen Belastungen dar, die die Lebensfähigkeit von Sperma vermindern können. Die Empfindlichkeit von Sperma gegenüber diesen Beanspruchungen kann zwischen einzelnen Spezies und sogar zwischen einzelnen Individuen innerhalb von Spezies variieren. Derartige Empfindlichkeiten sind entweder beschrieben oder lassen sich durch empirische Studien, wie sie beispielsweise in den Beispielen 1 bis 5 beschrieben sind, leicht bestimmen.
Verfahren, die die Lebensfähigkeit erhöhen, sind in den vorstehend erörterten Patentveröffentlichungen beschrieben. Beispielsweise sind Verfahren, die verbesserte Ummantelungs- und Sammelsysteme zum Sortieren von Sperma bereitstellen, in der PCT-Veröffentlichung WO-99/33956 (PCT-Anmeldung US-98/27909) beschrieben. Ferner beschreiben die Beispiele 1 bis 7 beispielhafte Verfahren zum Färben und Sortieren von Spermien. Beispiel 3 beschreibt eine Studie über die Einflüsse der Laser-Intensität und der Farbstoffkonzentration auf die Beweglichkeit von sortierten, eingefrorenen Spermien nach dem Auftauen. Diese Studie zeigt, dass die Verwendung von geringeren Laser-Intensitäten während des Sortierens die Beweglichkeit nach dem Auftauen erhöhen kann.
Die ausgewählte Spermaprobe kann neben Sperma verschiedene Komponenten enthalten und enthält häufig Komponenten, die zugesetzt worden sind, um das Sperma während des Auswahlverfahrens zu schützen. Im Fall von FACS kann die ausgewählte Spermaprobe eine oder mehrere Komponenten der zum Färben und Sortieren verwendeten Lösungen (z. B. die Ummantelungsflüssigkeit und den Abfangpuffer), enthalten.
Ferner enthält die ausgewählte Spermaprobe typischerweise ein Streckmittel oder eine Streckmittelfraktion. Beispielsweise sind "zweistufige" Streckmittel bekannt, die eine "A-Fraktion" ohne Glycerin und eine "B-Fraktion" mit Glycerin umfassen. Die A-Fraktion wird zuerst dem Sperma zugesetzt, wonach sich die Zugabe eines gleichen Volumens der B-Fraktion anschließt. Für diese Stufe wird die B-Fraktion häufig in mindestens zwei Aliquotanteile aufgeteilt und nacheinander zugegeben; z. B. wird der zweite Aliquotanteil der B-Fraktion 15 Minuten nach dem ersten Anteil zugegeben.
Wenn keine Streckmittelkomponenten vorhanden sind, werden ein Streckmittel oder eine Streckmittelfraktion typischerweise der ausgewählten Spermaprobe vor der Isolation des Spermas aus der Probe zugesetzt. Wenn nur einige Streckmittelkomponenten vorhanden sind, können weitere Komponenten gegebenenfalls zugesetzt werden, so dass die ausgewählte Spermaprobe ein vollständiges Streckmittel oder eine Streckmittelfraktion vor der Isolierungsstufe umfasst. Bei beispielhaften Ausführungsformen wird Rindersperma einer Fließ-Sortierung unterzogen, um eine ausgewählte Spermaprobe zu erzeugen, die die A-Fraktion eines Streckmittels umfasst (vergl. die Beispiele 2, 3 und 4). Gegebenenfalls kann die B-Fraktion der ausgewählten Spermaprobe vor der Isolierungsstufe zugesetzt werden (vergl. Beispiel 5). Das Streckmittel (oder die Streckmittelfraktion), das vor der Isolierungsstufe zugesetzt wird, wird als "das anfängliche Streckmittel" bezeichnet, um es vom "abschließenden Streckmittel" zu unterscheiden, das zum Strecken des isolierten Spermas vor dem Einfrieren verwendet wird. Da die Auswahl der Spermaprobe unter Verwendung von FACS erfolgt, kann das anfängliche Streckmittel auf die für den Sortiervorgang verwendete Ummantelungsflüssigkeit angepasst werden. Beispiele für angepasste Ummantelungsflüssigkeiten und Streckmittel sind ausführlich in Beispiel 4 beschrieben.
Ein zur Verwendung in einer ausgewählten Spermaprobe geeignetes Streckmittel umfasst einen physiologisch verträglichen Träger. Beim physiologisch verträglichen Träger handelt es sich typischerweise um einen wässrigen Träger, der bei bevorzugten Ausführungsformen entionisiertes Wasser umfasst. Geeignete Streckmittel umfassen üblicherweise eine oder mehrere der folgenden zusätzlichen Komponenten: ein Kryoschutzmittel, eine Komponente, die die Osmolalität aufrechterhält und den pH-Wert puffert, eine organische Substanz, die den Kälteschock verhindert und die Fertilität von Sperma aufrechterhält, ein Detergens, das synergistisch mit bestimmten organischen Substanzen zusammenwirkt, um die Konservierung von Sperma zu verstärken, eine Energiequelle, die vom Sperma leicht verwertet werden kann, ein Antioxidationsmittel, das das Sperma gegen Kälteschock schützt, eine Substanz, die die Sperma-Kapazitation erleichtert und ein oder mehr Antibiotika.
Obgleich die erfindungsgemäß geeigneten Kryoschutzmittel nicht auf solche Mittel beschränkt sind, die aufgrund eines bestimmten Mechanismus wirken, entfalten die meisten herkömmlichen Kryoschutzmittel (zumindest teilweise) ihre Wirkung durch Verringerung der intrazellulären Dehydratisierung. Speziell ist der Einfriervorgang von einer Zunahme der Konzentration an gelösten Bestandteilen in dem Medium, das das Sperma umgibt, begleitet. Diese Erhöhung der Konzentration an gelösten Stoffen zieht Wasser aus den Zellen, was die intrazelluläre Elektrolytkonzentration erhöht. Zu Beispielen für Kryoschutzmittel gehören Glycerin, Dimethylsulfoxid, Ethylenglykol, Propylenglykol und dergl. Das zur Verwendung in einem bestimmten Streckmittel geeignete Kryoschutzmittel kann je nach der Spezies, aus dem das Sperma abgeleitet ist, variieren. Beispielsweise eignet sich Glycerin zur Verwendung bei der Kryokonservierung von menschlichem und bovinem Sperma, wird jedoch im allgemeinen nicht zur Kryokonservierung von Schweine- oder Kaninchensperma verwendet. Derartige Bevorzugungstendenzen sind für zahlreiche, gewerblich wertvolle Spermaarten bekannt und lassen sich für andere Spermatypen leicht empirisch bestimmen.
Das erfindungsgemäß geeignete Streckmittel umfasst ein oder mehr Komponenten, die dazu beitragen, die Osmolalität zu erhalten und eine Pufferkapazität bereitzustellen. Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kommt die Osmolalität des Streckmittels der Osmolalität von physiologischen Flüssigkeiten nahe. Insbesondere liegt die Osmolalität des Streckmittels im Bereich von etwa 280 mOsm bis etwa 320 mOsm. Der pH-Wert liegt ebenfalls vorzugsweise innerhalb eines physiologisch verträglichen Bereiches und insbesondere im Bereich von etwa 6,5 bis etwa 7,5.
Substanzen, die zur Aufrechterhaltung der Osmolalität und des pH-Werts innerhalb dieser Bereiche beitragen, sind aus dem Stand der Technik bekannt und können dem Streckmittel als Feststoffe oder bereits in Lösung zugesetzt werden. Ein Puffer, der ein Salz, ein Kohlenhydrat oder eine Kombination davon enthält, kann zu diesem Zweck verwendet werden. Zu speziellen Beispielen gehören Natriumcitrat, Tris-(hydroxymethyl)- aminomethan und TES (N-Tris-(hydroxymethyl)-methyl-2-aminoethansulfonsäure) sowie Mononatriumglutamat-Puffer; Milch; ein mit HEPES gepuffertes Medium; und beliebige Kombinationen davon. Die Komponente, die dazu verwendet wird, bei einer bestimmten Anwendung die Aufrechterhaltung der Osmolalität zu unterstützen und die Pufferkapazität bereitzustellen, kann je nach den übrigen Komponenten des Streckmittels und in einigen Fällen in Abhängigkeit von der Spezies, von der sich das Sperma ableitet, variieren. Die Auswahl einer derartigen Komponente zur erfindungsgemäßen Verwendung liegt jedoch im Rahmen des Wissens eines Fachmanns.
Eine oder mehrere organische Substanzen, die Sperma gegen Kälteschock schützen und zur Aufrechterhaltung der Fertilisationskapazität beitragen, können ebenfalls im Streckmittel enthalten sein. Derartige Substanzen sind bekannt und werden gelegentlich als "nicht-penetrierende Kryoschutzmittel" bezeichnet. Der Fachmann kann leicht eine organische Substanz ermitteln, die sich für eine spezielle Anwendung des hier beschriebenen Kryokonservierungsverfahrens eignet. Beispielsweise können dem Streckmittel schützende organische Substanzen (z. B. Lipoproteine, Phospholipide und Lecithin), von denen angenommen wird, dass sie die Einwirkung des Kälteschocks und den Verdünnungseffekt verringern, zugesetzt werden. Zu geeigneten organischen Substanzen gehören Disaccharide, Trisaccharide und beliebige Kombinationen davon. Zu Beispielen für organische Substanzen gehören Eigelb, Eigelbextrakt, Milch, Milchextrakt, Casein, Albumin, Lecithin, Cholesterin und beliebige Kombinationen davon.
Das Streckmittel kann auch ein Detergens enthalten. Von Detergentien auf der Basis ionischer Alkylverbindungen, wie Natriumdodecylsulfat (SDS) wurde berichtet, dass sie mit Eidotter in synergistischer Weise zur Verstärkung des Schutzes gegen Kälteschock zusammenwirken. Weitere Detergentien, die sich zur Kryokonservierung von Zellen eignen, können im Streckmittel verwendet werden. Die Auswahl eines bestimmten Detergens für eine spezielle Anwendung liegt im Wissen des Fachmanns unter Berücksichtigung der hier gegebenen Richtlinien; vergl. z. B. das Beispiel 5.
Vorzugsweise umfasst das Streckmittel eine Energiequelle, die leicht von Sperma verwertet wird. In Abwesenheit einer Energiequelle kann Sperma intrazelluläre Phospholipide und andere Zellkomponenten oxidieren. Somit schützt die Zugabe einer Energiequelle zum Streckmittel die intrazellulären Reserven und Zellkomponenten. Aus dem Stand der Technik ist es bekannt, dass Zucker, insbesondere Monosaccharide, eine zweckmäßige Energiequelle darstellen, obgleich beliebige herkömmliche Energiequellen im Streckmittel verwendet werden können. Zu beispielhaften Monosacchariden, die sich im Streckmittel eignen, gehören Glucose, Fructose und/oder Mannose.
Ein oder mehr Antioxidationsmittel können gegebenenfalls dem Streckmittel zugesetzt werden, um einen zusätzlichen Schutz gegen Kälteschock zu erzielen. Zu Beispielen für die Antioxidationsmittel gehören butyliertes Hydroxytoluol (BHT), dessen Derivate und dergl. Jedoch können auch andere Antioxidationsmittel, die bei der Kryokonservierung von Zellen geeignet sind, im Streckmittel verwendet werden. Die Auswahl eines bestimmten Antioxidationsmittels für einen speziellen Anwendungszweck liegt im Bereich des Wissens eines Fachmanns bei Zugrundelegung der hier gegebenen Richtlinien.
Das Streckmittel kann ferner eine Substanz enthalten, die die Spermakapazitation erleichtert. Eine Vielzahl von Mitteln zur Erleichterung der Kapazitation sind aus dem Stand der Technik bekannt. Beliebige derartige Mittel können im Streckmittel verwendet werden. Zu Beispielen gehören Enzyme, wie α-Amylase, β-Amylase und β-Glucuronidase, die gegebenenfalls in Kombination miteinander verwendet werden können.
Schließlich umfasst das Streckmittel vorzugsweise ein Antibiotikum, da ein erhebliches bakterielles Wachstum die Lebensfähigkeit von Sperma bedrohen und das Infektionsrisiko des Wirts bei Verfahren der künstlichen Insemination oder der in vitro-Fertilisation erhöhen kann. Aus einer Vielzahl von Antibiotika, die bei der Kryokonservierung von Zellen geeignet sind, können beliebige Mittel im Streckmittel verwendet werden. Die Auswahl eines geeigneten Antibiotikums hängt ab von der Spezies, aus der das Sperma erhalten worden ist, von den bei der Gewinnung und Handhabung der Spermaprobe angewandten Verfahren und von dem oder den speziellen Mikroorganismen, auf die abgezielt werden soll. Zu Beispielen für Antibiotika gehören Tylosin, Gentamicin, Lincomycin, Spectinomycin, Linco-spectin (eine Kombination von Lincomycin und Spectinomycin), Penicillin, Streptomycin und Ticarcillin, die allein oder in Kombination miteinander verwendet werden können. Jedoch kann der Fachmann leicht weitere Antibiotika, die sich zur Verwendung im Streckmittel eignen, ermitteln.
Beispielhafte Streckmittel werden nachstehend und in den Beispielen ausführlicher erörtert.
Die Spermakonzentration ist in der ausgewählten Spermaprobe üblicherweise niedriger als in der Quellenprobe. Wie vorstehend erwähnt, ist bei Anwendung von FACS die Verdünnung von erheblicher Bedeutung. Eine typische Sorte auf der Grundlage vom Geschlechtstyp kann eine Probe ergeben, die Spermien in einer Menge von 6 × 10⁵ Zellen/ml des Einfangpuffers enthält. Da eine derartig geringe Konzentration für die Lagerung nicht optimal ist (zumindest für die meisten getesteten Spezies), wird beim erfindungsgemäßen Kryokonservierungsverfahren im allgemeinen die ausgewählte Spermaprobe eingeengt.
Abkühlen der ausgewählten Spermaprobe
Die dritte Stufe beim Kryokonservierungsverfahren beinhaltet die Abkühlung der ausgewählten Spermaprobe, typischerweise durch Verringerung der Temperatur mit einer kontrollierten Geschwindigkeit. Eine zu rasche Abkühlung kann einen Kälteschock hervorrufen, der zu einem Verlust des Zusammenhalts der Membran und der Zellfunktion führen kann. Die Schwere dieser Effekte des Kälteschocks können von Spezies zu Spezies variieren und hängen von Faktoren, wie der Abkühlgeschwindigkeit und dem Temperaturbereich, ab. Unter geeigneten kontrollierten Abkühlbedingungen ist das Sperma dazu befähigt, sich an thermische Effekte anzupassen. Das Beispiel 2 beschreibt u. a. Zustände zum Abkühlen von Rindersperma. Die Bestimmung geeigneter Bedingungen für die Abkühlung von Sperma anderer Spezies liegt im Wissen des Fachmanns.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die ausgewählte Spermaprobe typischerweise von etwa 22 °C auf etwa 5 °C abgekühlt. Die Abkühlung wird im allgemeinen innerhalb eines Zeitraums von etwa 60 Minuten bis etwa 24 Stunden, vorzugsweise innerhalb eines Zeitraums von etwa 90 Minuten bis etwa 240 Minuten und insbesondere innerhalb eines Zeitraums von etwa 90 Minuten bis etwa 120 Minuten durchgeführt. Die Abkühlung kann nach einem beliebigen zweckmäßigen Verfahren vorgenommen werden, wozu eine einfache Platzierung der ausgewählten Spermaprobe in einer Umgebung von 5 °C gehört.
Isolierung von Spermazellen aus der ausgewählten Spermaprobe Nach anfänglicher Streckung der ausgewählten Spermaprobe wird das aus der Probe isolierte Sperma unter Anwendung eines beliebigen, ausreichend schonenden Isolierungsverfahrens isoliert, das zu einer Spermaausbeute von mindestens 50 %, vorzugsweise von etwa 75 bis etwa 90 % und insbesondere von etwa 80 bis etwa 90 % führt. Während der Isolierungsstufe soll das abgekühlte Sperma im allgemeinen kühl gehalten werden, d. h. zwischen etwa 1 und etwa 8 °C und vorzugsweise nahe bei 4 oder 5 °C.
Aus einer Vielzahl von Verfahren, die sich zur Gewinnung von Zellen aus einer Suspension eignen, können beliebige Verfahren zur Isolierung des Spermas herangezogen werden, einschließlich z. B. Filtration, Sedimentation und Zentrifugation. In einer beispielhaften bevorzugten Ausführungsform wird die ausgewählte Spermaprobe in Aliquotanteile auf 50 ml fassende Röhrchen in Volumina von nicht mehr als etwa 27 ml und vorzugsweise von etwa 20 bis etwa 27 ml verteilt. Eine Zentrifugation wird etwa 20 Minuten bei 4 °C mit 850 × g durchgeführt. Vorzugsweise ergibt die Zentrifugationsstufe eine Spermaausbeute von mindestens etwa 50 bis etwa 90 %, vorzugsweise von etwa 60 bis etwa 90 % und insbesondere von etwa 70 bis etwa 90 %. Nach der Isolierung wird der Überstand entfernt und das Pellet wird durch vorsichtiges Aufwirbeln suspendiert oder wiederholt bei 4 °C abgesaugt. Anschließend wird typischerweise die Spermakonzentration bestimmt (z. B. unter Verwendung eines Hämozytometers).
Abschließende Streckung von isolierten Spermazellen
Nach der Isolierung wird das Sperma gegebenenfalls abgekühlt und vor dem Einfrieren mit dem abschließenden Streckmittel auf eine geeignete Konzentration gestreckt. Die Spermakonzentration nach der abschließenden Streckung und vor dem Einfrieren liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 1 × 10⁶/ml bis etwa 300 × 10⁶/ml, insbesondere von etwa 10 × 10⁶/ml bis etwa 50 × 106/ml und ganz besonders von etwa 10 × 10⁶/ml bis etwa 20 × 10⁶/ml.
Die obigen Ausführungen über das anfängliche Streckmittel gelten auch für das abschließende Streckmittel, bei dem es sich um das gleiche Streckmittel wie beim ursprünglichen Streckmittel oder um ein davon abweichendes Streckmittel handeln kann. In speziellen Ausführungsformen ist die Zusammensetzung der Spermaprobe, die mit dem abschließenden Streckmittel versetzt ist, im wesentlichen ähnlich (wenn nicht gleich) mit der Zusammensetzung der Spermaprobe nach Zugabe des anfänglichen Streckmittels.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Eidotter-Tris-Streckmittel verwendet. Nach der Zugabe des Streckmittels umfasst die Spermasuspension Glycerin (Kryoschutzmittel); Citronensäure und Tris-(hydroxmethyl)-aminomethan (Puffer); Eidotter (organische Substanz); Fructose (Energiequelle); Tylosin, Gentamicin und Lincospectin (Antibiotika). Die typischen ungefähren Konzentrationen dieser Komponenten nach Zugabe des abschließenden Streckmittels zum isolierten Sperma sind nachstehend angegeben: Komponenten des Eidotter-Tris-Streckmittels

Glycerin:	4–8 % (Vol./Vol.)
Citronensäure:	55–75 mM
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan:	190–210 mM
Eidotter:	5–25 % (Vol./Vol.)
Fructose:	45–65 mM
Tylosin:	25–100 μg/ml
Gentamicin:	200–300 μg/ml
Linco-spectin:	100–400 μg/ml

Bei einer Abänderung dieser Ausführungsform, die sich insbesondere zum Einfrieren von Rindersperma eignet, betragen die Konzentrationen dieser Komponenten nach Zugabe des abschließenden Streckmittels zum isolierten Sperma etwa 6 % (Vol./Vol.) Glycerin, etwa 65 mM Citronensäure, etwa 200 mM Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, etwa 20 % (Vol./Vol.) Eidotter, etwa 56 mM Fructose, etwa 50 μg/ml Tylosin, etwa 250 μg/ml Gentamicin und etwa 150/300 μg/ml Linco-spectin (d. h. 150 μg/ml Lincomycin und 300 μg/ml Spectinomycin) in entionisiertem Wasser.
Bei einer alternativen Ausführungsform wird ein Eidotter-Citrat-Streckmittel verwendet. Nach Zugabe des Streckmittels umfasst die Spermasuspension Glycerin (Kryoschutzmittel); Natriumcitrat (Puffer); Eidotter (organische Substanz); Tylosin, Gentamicin und Linco-spectin (Antibiotika). Die typischen annähernden Konzentrationen dieser Komponenten nach Zugabe des abschließenden Streckmittels zum isolierten Sperma betragen: Komponenten des Eidotter-Citrat-Streckmittels

Glycerin: 4–8 % (Vol./Vol.)

Natriumcitrat: 60–80 mM

Eidotter: 5–25 % (Vol./Vol.)

Tylosin: 25–100 μg/ml

Gentamicin: 200–300 μg/ml

Linco-spectin: 100–400 μg/ml
Beispielsweise betragen zum Einfrieren von Rindersperma die bevorzugten Konzentrationen etwa 7 % (Vol./Vol.) Glycerin, etwa 72 mM Natriumcitrat, etwa 20 % (Vol./Vol.) Eidotter, etwa 50 μg/ml Tylosin, etwa 250 μg/ml Gentamicin und etwa 250/300 μg/ml Linco-spectin.

Gemäß einer weiteren alternativen Ausführungsform wird ein Eidotter-TES-Tris ("EY TEST")-Streckmittel verwendet. Nach Zugabe des Streckmittels umfasst die Spermasuspension Glycerin (Kryoschutzmittel); Eidotter; und erhitzte Milch, d. h. homogenisierte Milch mit einem Gehalt an 1,25 % Fructose mit 10 % Glycerin (organische Substanzen); Tylosin, Gentamicin und Linco-spectin (Antibiotika). Die typischen annähernden Konzentrationen dieser Komponenten nach Zugabe des abschließenden Streckmittels zum isolierten Sperma sind nachstehend angegeben. Komponenten des Eidotter-TES-Tris-Streckmittels

Glycerin:	3–7 % (Vol./Vol.)
Tris-(hydroxymethylmethyl)-2-aminoethansulfonsäure:	140–170 mM
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan:	60–80 mM
Eidotter:	5–25 % (Vol./Vol.)
Fructose:	5–12 mM
Tylosin:	50–150 μg/ml
Gentamicin:	400–600 μg/ml
Linco-spectin:	200–700 μg/ml

Beispielsweise betragen bevorzugte Konzentrationen zum Einfrieren von Rindersperma etwa 5 % (Vol./Vol.) Glycerin, etwa 158 mM Tris-(hydroxymethylmethyl)-2-aminoethansulfonsäure, etwa 72 mM Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, etwa 20 % (Vol./Vol.) Eidotter, etwa 8 mM Fructose, etwa 100 μg/ml Tylosin, etwa 500 μg/ml Gentamicin und etwa 300/600 μg/ml Linco-spectin.
Gemäß einer weiteren alternativen Ausführungsform der Erfindung wird ein Milch-Streckmittel verwendet. Nach Zugabe des Streckmittels umfasst die Spermasuspension Glycerin (Kryoschutzmittel); erwärmte homogenisierte Milch (organische Substanz); Fructose (Energiequelle); und Tylosin, Gentamicin und Linco-spectin (Antibiotika). Die typischen annähernden Konzentrationen dieser Komponenten nach Zugabe des abschließenden Streckmittels zum isolierten Sperma sind nachstehend angegeben. Komponenten des Milch-Streckmittels

homogenisierte Milch 90 % (Vol./Vol.)

Glycerin: 3–7 % (Vol./Vol.)

Fructose: 1,25 % (Gew./Vol.)

Tylosin: 50 μg/ml

Gentamicin: 250 μg/ml

Linco-spectin: 250/300 μg/ml
Bevorzugte Konzentrationen zum Einfrieren von Rindersperma betragen beispielsweise etwa 90 % Milch, etwa 10 % (Vol./Vol.) Glycerin, etwa 1,25 % Fructose (Gew./Vol.), etwa 50 μg/ml Tylosin, etwa 250 μg/ml Gentamicin und etwa 250/300 μg/ml Linco-spectin.
Weitere Streckmittel, die üblicherweise zum Einfrieren von Sperma verwendet werden, können ebenfalls als abschließende Streckmittel beim Einfrieren des ausgewählten Spermas verwendet werden. Eine Vielzahl von Streckmitteln, die in Bezug auf das Einfrieren von Sperma verschiedener Spezies optimiert sind, wurden beschrieben. Zahlreiche derartige Streckmittel sind im Handel erhältlich. Einfrierstreckmittel für Pferdesperma bestehen typischerweise aus Milch, Eidotter, verschiedenen Zuckern, Elektrolyten und einem Kryoschutzmittel. Beispielhafte Einfrierstreckmittel werden von E. L. Squires et al., Cooled and Einfrieren Stallion Semen Animal Reprod. und Biotechnology Laboratory, Bulletin, Nr. 69, Kapitel 8, "Seminal Extenders", (Juli 1999), S. 49–51, beschrieben.
Äquilibrierung und Einfrieren von Sperma
Durch Strecken der Spermaprobe entsteht eine Spermasuspension, die anschließend in die Behälter zum Einfrieren übertragen wird. Wenn das Sperma zur Verwendung bei der Fertilisation vorgesehen ist, werden die Zellen zweckmäßigerweise in einzelne Aliquotdosen, die zur Erzielung der Fertilisation ausreichen, unterteilt. Die erforderliche Dosis kann von einer Spezies zur anderen erheblich variieren und ist entweder bekannt (z. B. für Rinder und Pferde) oder kann leicht ermittelt werden. Im Fall von in Bezug auf das Geschlecht ausgewähltem Rindersperma liegen zweckmäßige Dosen im Bereich von etwa 1,0 × 10⁶ Spermien bis 3,0 × 10⁶ Spermien.
Beliebige geeignete Behälter können zum Einfrieren verwendet werden, z. B. Ampullen, Fläschchen und "Straws". Sperma, das für eine AI vorgesehen ist, wird typischerweise in Straws (z. B. 0,25 ml oder 0,50 ml fassende Straws), die zur Verwendung mit einer Inseminationspistole vorgesehen sind, eingefroren. Vorzugsweise wird ein Bolus des Streckmittels in das Straw gezogen, wonach der Reihe nach Luft, Sperma, Luft und Streckmittel folgen, so dass das Sperma auf beiden Seiten von einem Luftraum flankiert ist, der das Sperma von einem Bolus des Streckmittels an beiden Enden des Straws trennt.
Vor dem Einfrieren lässt man das Sperma im allgemeinen bei etwa 5 °C äquilibrieren. Vorzugsweise lässt man das Sperma für eine Zeitspanne im Bereich von etwa 1 Stunde bis etwa 18 Stunden, insbesondere von etwa 3 Stunden bis etwa 18 Stunden und ganz besonders von etwa 3 Stunden bis etwa 6 Stunden äquilibrieren (vergl. Beispiel 2).
Im Anschluss an die Äquilibrierung können beliebige übliche Einfrierverfahren herangezogen werden, vorausgesetzt, dass die Einfriergeschwindigkeit nicht zu schnell ist (d. h. nicht etwa 0,5 °C/Minute übersteigt). Vorzugsweise beträgt die Einfriergeschwindigkeit etwa 0,5 °C/Minute. In einer beispielhaften bevorzugten Ausführungsform wird das Sperma in einen statischen Dampf von flüssigem Stickstoff gebracht und ein Einfriervorgang wird in drei getrennten Stufen innerhalb eines Zeitraums von etwa 10 Minuten vorgenommen. In der ersten Einfrierstufe wird das Sperma von etwa 5 °C auf etwa –15 °C mit einer Geschwindigkeit von etwa 40 °C/Minute bis etwa 65 °C/Minute abgekühlt. In der zweiten Einfrierstufe wird das Sperma von etwa –15 °C auf etwa –60 °C mit einer Geschwindigkeit von etwa 25 °C/Minute bis etwa 35 °C/Minute abgekühlt. In der dritten Stufe wird das Sperma in den flüssigen Stickstoff von etwa –100 °C getaucht.
Ausgewählte Spermaproben
Zusätzlich zu einem Einfrierverfahren wird erfindungsgemäß eine gefrorene Spermaprobe bereitgestellt, die Sperma umfasst, das durch Fließzytometrie aus einer Quellenprobe in Bezug auf eine spezielle Eigenschaft ausgewählt worden ist. Beim Sperma kann es sich um Sperma beliebiger Spezies handeln, einschließlich beliebiger Spezies, die vorstehend unter Bezugnahme auf das Einfrierverfahren erörtert worden sind. Die Erfindung umfasst gefrorenes Sperma, das in Bezug auf eine beliebige Eigenschaft nach einem beliebigen geeigneten Verfahren, wie sie beispielsweise vorstehend erörtert worden sind, ausgewählt worden ist. Zu bevorzugten Ausführungsformen gehören in Bezug auf das Geschlecht ausgewählte, eingefrorene Spermaarten von Mensch, Rind, Pferd, Schwein, Schaf, Elch oder Bison. Die Auswahl in Bezug auf das Geschlecht wird vorzugsweise unter Anwendung von Fließzytometrie gemäß den vorstehend allgemein beschriebenen Angaben durchgeführt.
Ferner fällt unter den Umfang der Offenbarung ein Behälter, der eine erfindungsgemäße eingefrorene Spermaprobe enthält. Der Behälter kann aus einem beliebigen Material gebildet sein, das mit der gefrorenen Spermaprobe nicht reagiert, und er kann eine beliebige Gestalt oder andere Merkmale aufweisen, die die Verwendung der Probe für den vorgesehenen Anwendungszweck erleichtern. Beispielsweise handelt es sich bei der Verwendung für eine AI beim Behälter zweckmäßigerweise beispielsweise um ein Straw (z. B. ein 0,25 ml oder 0,5 ml fassendes Straw), das zur Verwendung mit einer Inseminationspistole vorgesehen ist. Der Behälter wird auf beliebige Weise, die zum Konservieren der Probe bei der vorgesehenen Lagertemperatur, die typischerweise unter –80 °C liegt, geeignet ist, verschlossen. 0,25 ml fassende Straws können beispielsweise mit PVC-Pulver, durch Ultraschall oder mit einem Watte-Polyvinyl-Stopfen und/oder einer Kugel aus rostfreiem Stahl (BB) verschlossen werden.
Da die erfindungsgemäße gefrorene Spermaprobe typischerweise vor der Verwendung aufgetaut wird, werden ferner eine aufgetaute, vorher eingefrorene, ausgewählte Spermaprobe und ein Behälter, der eine derartige aufgetaute Probe enthält, bereitgestellt.
Verfahren zur Verwendung der ausgewählten Spermaproben
Die erfindungsgemäße gefrorene, ausgewählte Spermaprobe eignet sich zur Verwendung bei einem beliebigen Verfahren, bei dem Sperma eingesetzt wird. Die Probe kann aufgetaut und bei einem beliebigen herkömmlichen Fertilisationsverfahren, z. B. bei der künstlichen Insemination oder der in vitro-Fertilisation, verwendet werden. Der Auftauvorgang wird auf die gleiche Weise wie bei eingefrorenem, nicht-ausgewählten Sperma durchgeführt. Kurz zusammengefasst, das das eingefrorene Sperma enthaltende Straw wird für eine Zeitspanne von etwa 20 bis 30 Sekunden in ein Wasserbad, das auf einer Temperatur von etwa 35 °C bis etwa 37 °C gehalten wird, getaucht. Nach dem Auftauen wird eine Samenabgabe (z. B. eine Insemination) gemäß üblichen Verfahren durchgeführt, wobei dafür gesorgt wird, dass das Sperma gegen Schwankungen der Umweltbedingungen geschützt wird.
Beispiele
Beispiel 1
Verdünnungseinflüsse auf Sperma
Ziel: Bestimmung des Einflusses der Spermakonzentration auf die Spermabeweglichkeit für nicht-gefrorenes, nicht-sortiertes, aber hochgradig verdünntes Sperma.
A. Verdünnungseinflüsse auf nicht-gewaschenes Sperma

1. Gewinnung einer Quellenprobe. Von Bullen wurde routinemäßig unter Verwendung einer künstlichen Vagina gemäß den Angaben von J. Schenk, Proc. 17th NAAB, (1998), S. 48–58, und R. G. Saacke, Proc. NAAB Tech. Conf. AI Reprod., Bd. 41 (1972), S. 22–27, Sperma gewonnen. Sämtliche Ejakulate enthielten mehr als 50 % progressiv bewegliche und mehr als 75 % morphologisch normale Spermien. Das rohe Ejakulat wurde innerhalb von 15 Minuten nach dem Sammeln gemäß den Angaben von S. Shin, Proc. NAAB Tech. Conf. AI Reprod., Bd. 11 (1986), S. 33–38, mit Antibiotika versetzt. Die Spermakonzentration wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers bestimmt.
2. Verfahren. Sperma von vier Bullen wurde unter Verwendung von Eidotter-Citrat-Streckmittel (EYC), das mit 20 % Eidotter (Vol./Vol.) in 72 mM Natriumcitrat, 50 Tg/ml Tylosin, 250 Tg/ml Gentamicin und 250/300 Tg/ml Linco-spectin hergestellt worden war, auf 1,25, 2,5, 5, 10, 15 und 20 × 10⁶/ml verdünnt. Die einzelnen Proben wurden im Doppelversuch (2 Röhrchen/Verdünnung/Bulle) zubereitet und umfassten 8 ml Gesamtvolumen pro Röhrchen. Sämtliche Proben wurden 60 Minuten bei 22 °C inkubiert und anschließend unter Verwendung einer Schwingbecherzentrifuge (Eppendorf, Modell #5810R) 10 Minuten mit 600 × g zentrifugiert, um das Sperma einzuengen. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand von einem Satz der im Doppelversuch angesetzten Röhrchen nicht entfernt. Das Sperma wurde im gleichen Medium und in der ursprünglichen Konzentration durch wiederholtes vorsichtiges Ansaugen unter Verwendung einer 5 ml fassenden serologischen Pipette resuspendiert (der zweite Satz der im Doppelversuch angesetzten Röhrchen wurde im Beispiel 1B verwendet). Spermaproben wurden sodann innerhalb von 90 Minuten auf 5 °C mit einer Geschwindigkeit von 0,2 °C/min abgekühlt. Dieses Sperma erhielt die Bezeichnung "ungewaschenes Sperma". Sämtliche Proben wurden nach der Gewinnung 24 oder 48 Stunden bei 5 °C inkubiert.
3. Bewertung der Beweglichkeit. Nach der Inkubation wurden die Proben unter Verwendung eines Trockenblockinkubators 10 Minuten auf 37 °C erwärmt, bevor die Beweglichkeit bestimmt wurde. Für diesen Versuch wurde für jede Probe ein einfacher, blind geschätzter prozentualer Anteil von progressiv beweglichen Spermien bestimmt. Die progressive Spermienbeweglichkeit wurde subjektiv für jede Unterklasse von einem einzigen Betrachter (× 200, Phasenkontrastmikroskop) bestimmt. Eine andere Person bereitete die Mikroskop-Objektträger in willkürlicher Weise vor, so dass der Betrachter diese Behandlungen nicht kannte.
4. Statistische Analyse. Die Daten wurden durch Varianzanalyse (SAS Institute, Cary, North Carolina) mit Faktoren für Bullen und die anfängliche Verdünnungskonzentration analysiert. Getrennte Analysen würden für jede Inkubationszeit vorgenommen. Verdünnungstrends wurden unter Verwendung von (log) linearen Kontrasten getestet.
5. Ergebnisse. Daten für ungewaschenes Sperma (Tabelle 1) ergaben (log) lineare Beziehungen (P < 0,01) für beide Inkubationszeiten. Die prozentualen Anteile von beweglichem Sperma nahmen mit einer Erhöhung der Spermienkonzentration von 1,25 × 10⁶/ml auf 10 × 10⁶/ml zu, wobei aber im Anschluss daran nur ein geringer Unterschied auftrat. Der kubische Term war für eine 24-stündige Inkubation signifikant (P < 0,05) und für eine 48-stündige Inkubation nur marginal signifikant (P < 0,1). Beide Male bestand ein Bullen-Effekt (P < 0,01).

Tabelle 1 Abkühlungseinflüsse auf die Beweglichkeit von ungewaschenem Sperma (%) nach Abkühlung auf 5 °C

^a(log) lineare (P < 0,01) und kubische Einflüsse (P < 0,05).
^b(log) lineare (P < 0,01) und kubische Einflüsse (P < 0,1).
^{c, d, e}Mittelwerte in den Spalten ohne übliche hochgestellte Indices differieren (P < 0,05).
^f√mittleres Fehlerquadrat von ANOVA + √N (SAS Institute, Cary, NC, USA)

B. Verdünnungseinflüsse auf gewaschenes Sperma

1. Gewinnung der Quellenprobe. Der zweite Satz der im Doppelversuch angesetzten Röhrchen, die die in Beispiel 1A vorbereiteten Proben enthielten, wurde in diesem Experiment verwendet.
2. Verfahren. Das Sperma wurde gemäß den Angaben in Beispiel 1A verdünnt, inkubiert und durch Zentrifugation eingeengt. Im Anschluss an die Zentrifugation wurden 7,1 ml Überstand von jedem Röhrchen abgesaugt. Der Großteil des seminalen Plasmas wurde entfernt und das Sperma blieb in einem 900 μl-Pellet zurück. Sodann wurde das Sperma mit EYC (vergl. Beispiel 1A) zur Herstellung von Spermasuspensionen mit 10 × 10⁶/ml oder 20 × 10⁶/ml Spermien verdünnt. Die Proben wurden anschließend innerhalb von 90 Minuten gemäß Beispiel 1A auf 5 °C abgekühlt.
3. Bewertung der Beweglichkeit. Die Proben wurden gemäß den Angaben in Beispiel 1A erwärmt und einer Bewertung ihrer progressiven Beweglichkeit unterzogen.
4. Statistische Analyse. Die Daten wurden wie in Beispiel 1A analysiert. Ferner wurden die Daten in Beispiel 1B für eine Inkubationseinengung bei 5 °C analysiert.
5. Ergebnisse. Die Daten für gewaschenes Sperma (Tabelle 2) ergaben keine signifikanten Behandlungseinflüsse, wenn Sperma nach 24 Stunden bewertet wurde. Jedoch ergaben sich nach 48-stündiger Lagerung Bullen-, anfängliche Verdünnungs-, Inkubationseinengungs- und Bullen-Inkubationseffekte (P < 0,05). Bei 20 × 10⁶/ml blieben mehr Spermien beweglich als bei 10 × 10⁶/ml (31 % gegenüber 20 %; P < 0,05). Anfängliche Verdünnungen von 1,25, 2,5 und 5 × 10⁶ Spermien/ml ergaben eine geringere progressive Beweglichkeit als 10 × 10⁶ Spermien/ml (P < 0,05), wobei der jeweilige Haupteffekt 19, 20, 27 bzw. 37 % bewegliche Spermien bedeutet.

Tabelle 2 Kumulative Einflüsse durch Waschen, Verdünnen, Einengen und Abkühlen auf die progressive Spermienbeweglichkeit (%)

^aEin Einengen auf 20 × 10⁶ Spermien/ml erwies sich als überlegen (P < 0,05) gegenüber 10 × 10⁶ Spermien/ml nach 48-stündiger Lagerung. Ferner erwies sich eine anfängliche Verdünnung auf 10 × 10⁶ gegenüber geringeren Verdünnungen als überlegen (P < 0,05). Vereinigte Standardfehler √mittleres Fehlerquadrat von ANOVA + √N betrugen 4,0 für eine Inkubation von 24 Stunden und 2,8 für eine Inkubation von 48 Stunden.
^bSignifikanter (log) linearer Trend (P < 0,06).

C. Schlussfolgerungen
Eine starke Verdünnung und Abkühlung von Sperma führte zu einer wesentlichen Verringerung des prozentualen Anteils an beweglichen Spermien, unabhängig von der Gegenwart oder Entfernung von seminalem Plasma. Jedoch wurde dieser Verdünnungseffekt stark abgeschwächt, indem man das verdünnte Sperma auf 10 × 10⁶/ml und noch weiter auf 20 × 10⁶/ml vor der Lagerung bei 5 °C verdünnte. Sperma von einigen Bullen vertrug die Verdünnung besser als das Sperma von anderen Bullen. Jedoch sind die festgestellten Bullen-Differenzen typisch. Extrem verdünntes Sperma könnte während des Sortiervorgangs durch Entfernung von schützenden Verbindungen im seminalen Plasma teilweise beeinträchtigt werden.
Beispiel 2
Einflüsse der Äquilibrierungszeit vor dem Einfrieren von sortiertem Sperma
Ziel: Bewertung des Einflusses von Äquilibrationszeiten (3, 6 und 18 h, 5 °C) vor dem Einfrieren auf durch Fließzytometrie sortiertes Sperma. Das folgende Experiment wurde unter Einsatz der gleichen Bullen vollständig wiederholt.

1. Gewinnung von Quellenproben. Sperma von vier Bullen wurde gemäß Beispiel 1A gewonnen und vorbereitet.
2: Verfahren
a) Färbung und Vorbereitung für die Sortierung
i) Vorbereitung einer Färbevorratslösung: Eine Vorratslösung von 8,89 mM Hoechst 33342 (Bis-benzimid H-33342; #190305, ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH) wurde in entionisiertem Wasser hergestellt.
ii) Sperma-Färbeverfahren: Sperma wurde in einem modifizierten TALP-Puffer (Tabelle 3) auf 400 × 10⁶ Spermien/ml verdünnt. Nach der Verdünnung wurde der Farbstoff Hoechst 33342 zu den Spermasuspensionen in einer Konzentration von 224 μM gegeben. Nach Zugabe des Färbemittels zu den Spermasuspensionen wurden die Proben 60 Minuten bei 34 °C inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurde das Sperma auf 100 × 10⁶/ml mit TALP verdünnt, das 2,67 % geklärten Eidotter und 0,002 % Lebensmittelfarbsotff (FD&C #40), der die Fluoreszenz von Hoechst 33342 im Sperma mit beschädigten Zellmembranen unterdrückt und ihre Ausscheidung während des Trennungsverfahren ermöglicht, enthielt. Unmittelbar vor der Fließsortierung wurden die Proben unter Schwerkraftwirkung durch ein 40 μm Nylon-Maschenfilter filtriert, um etwaige Bruchstücke und/oder verklumptes Sperma zu entfernen.
b) Sortieren.Ein bei 351 und 364 nm und 150 mW arbeitender Doppellinien-Argon-Laser wurde zur Anregung des Farbstoffes Hoechst 33342 verwendet. Beim verwendeten Fließzytometer/Zellsortiergerät handelte es sich um SX MoFlo^R (Cytomation, Inc., Fort Collins, CO, USA), das mit 50 psi arbeitete. Eine Ummantelungsflüssigkeit auf der Basis von Tris wurde verwendet. Sie bestand aus Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris; 197,0 mM; #T-1503, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), Citronensäuremonohydrat (55,4 mM; #C-7129, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) und Fructose (47,5 mM; #F-0127, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Basislinien-Antibiotika wurden ferner der Ummantelungsflüssigkeit auf der Basis von Tris zugesetzt. Sie bestanden aus 0,58 g/Liter Penicillin und 0,05 g/Liter Streptomycinsulfat. Das Sperma wurde durch ein Verfahren, das als "Massesortierung" bezeichnet wird, sortiert. Das Verfahren ermöglicht eine rasche Anreicherung einer großen Anzahl von Spermien, so dass Beispiele im Großmaßstab innerhalb einer vernünftigen Zeitspanne ausgeführt werden können. Die Spermien passierten das Fließzytometergerät unter üblichen Betriebsbedingungen, mit der Ausnahme, dass sämtliche Tröpfchen, die lebensfähige Spermien enthielten, in einem einzigen Röhrchen gesammelt wurden, anstelle einer Sortierung in zwei Röhrchen auf der Grundlage von speziellen Eigenschaften (z. B. Sortieren nach Geschlechtstyp). Das Sperma wurde auf der Grundlage der Lebensfähigkeit sortiert. Somit wurden Spermien mit beeinträchtigten Plasmamembranen während der Massesortierung aussortiert. Gefärbtes Sperma wurde während des Sortierens auf 22 ± 1 °C gehalten. Massesortiertes Sperma wurde in 50 ml fassenden Kunststoffröhrchen, die 2 ml 20 % Eidotter-Tris-Streckmittel enthielten, das mit 20 % Eidotter (Vol./Vol.) in 200 mM Tris, 65 mM Citronensäure, 56 mM Fructose, 50 μg/ml Tylosin, 250 μg/ml Gentamicin und 150/300 μg/ml Linco-spectin in entionisiertem Wasser hergestellt worden war. Das Eidotter-Tris-Streckmittel wurde als "Tris-A-Fraktion" bezeichnet, um den Mangel an Glycerin an dieser Stelle des Verfahrens auszudrücken. Das Sperma wurde in Röhrchen in einer Menge von 12 ml und etwa 6 × 10⁶ Spermien gesammelt. Anschließend wurde das Sperma 1 bis 3 Stunden bei 22 °C inkubiert, um Bedingungen einer Sortierung auf der Grundlage vom Geschlechtstyp zu simulieren.
c) Vorbereitung zum Einfrieren.Nach der Inkubation wurde das sortierte Sperma innerhalb von 70 Minuten auf 5 °C abgekühlt. Nach dem Abkühlen wurde der Inhalt der beiden Röhrchen vereinigt und in eine gekühlte, auf 5 °C eingestellte, Schwingbecherzentrifuge gebracht und 20 Minuten mit 850 × g zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstands wurde die Bearbeitung durch Zugabe von etwa 150 μl Tris-A-Fraktion-Streckmittel zu etwa 150 μl Spermapellets fortgesetzt, um die Spermakonzentration auf etwa 40 × 10⁶/ml zu bringen. Das Sperma von einzelnen Bullen wurde vereinigt und sofort mit einem gleichen Volumen an Eidotter-Tris-Streckmittel mit einem Gehalt an 12 % (Vol./Vol.) Glycerin ("Tris-B-Fraktion") verdünnt. Die Tris-B-Fraktion wurde zur Spermasuspension in Form von zwei gleichen Volumina in Abständen von 15 Minuten gegeben, um die endgültige Spermakonzentration auf 20 × 10⁶/ml einzustellen. Die endgültige Glycerinkonzentration des vollständigen Eidotter-Tris-Streckmittels, das das Sperma enthielt, betrug 6 % (Vol./Vol.).
d) Äquilibrierung und Einfrieren.Gestrecktes Sperma wurde sodann in 0,25 ml fassende Polyvinylchlorid-Straws zum Einfrieren nach üblichen Verfahren auf Gestellen in statischem Dampf von flüssigem Stickstoff abgepackt. Zwei Straws von jeweils vier Bullen wurden nach 3, 6 und 18 Stunden Gesamtäquilibrierungszeit bei 5 °C eingefroren.
3. Bewertung der Beweglichkeit nach dem Auftauen.Straws wurden in einem Wasserbad von 37 °C 30 Sekunden aufgetaut. Blindbestimmungen der progressiven Beweglichkeit wurden nach Inkubation der Proben bei 37 °C für 0, 1 und 2 Stunden nach dem Auftauen durchgeführt. Jeder der beiden Beobachter schätzte die progressive Spermabeweglichkeit von jedem der zwei Straws mit Samen ab. Diese vier Blindbestimmungen für jede Versuchseinheit stellen die Bildung von Unterproben dar.
4. Statistische Analyse. Statistisch wurden die Unterproben als ein Unterdiagramm zum Hauptdiagramm mit den kleinsten Fehlerquadraten von ANOVAs analysiert, um die Einflüsse von Beobachtern und Beobachter × Behandlungswechselwirkung zu analysieren. N bedeutet die Anzahl an Versuchseinheiten (nicht Unterproben). Standardfehler wurden auf der Grundlage der Mittelwerte der vier Unterproben aus den kleinsten Fehlerquadraten der ANOVAs und der Anzahl der Versuchseinheiten berechnet. Die Mittelwerte der kleinsten Fehlerquadrate sind angegeben. Die Behandlungswirkungen wurden durch getrennte ANOVAs für jede Inkubationszeit bewertet. Das Modell umfasste Bullen als Zufallseffekt und die Äquilibrationszeit sowie den Betrachter als feststehende Effekte. Das Unterdiagramm bestand aus dem Beobachterterm und verwandten Wechselwirkungen.
5. Ergebnisse. Die 3-stündigen oder 6-stündigen Äquilibrationszeiten waren auf der Grundlage des prozentualen Anteils an progressiv beweglichen Spermien der 18-stündigen Dauer überlegen (Tabelle 4), und zwar für eine 0- oder 1-stündige Inkubation nach dem Auftauen (P < 0,01), jedoch nicht für eine 2-stündige Inkubation. Einflüsse von Bullen waren nach Inkubationszeiten von 1 und 2 Stunden erkennbar (P < 0,05), jedoch nicht nach 0 Stunden. Es gab durch die Äquilibrationszeit-Wechselwirkung keinen signifikanten Bulleneffekt (P > 0,1) und auch keinen signifikanten Betrachtereffekt für irgendwelche Reaktionen.

Tabelle 3 Modifizierter TALP-Puffer

^a#H3375, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA
^b#US70195, Fraktion V; Amersham/Life Science, Cleveland, OH, USA

Tabelle 4 Einfluss der Äquilibrationszeit vor dem Einfrieren auf die progressive Beweglichkeit nach dem Auftauen (%)

^{a, b}Innerhalb der Spalten sind Mittelwerte ohne gemeinsame hochgestellte Indices unterschiedlich.
^cVereinigte Standardfehler, √mittleres Fehlerquadrat von ANOVA + √N

6. Schlussfolgerungen. Die Ergebnisse zeigten keine Unterschiede der Spermabeweglichkeit nach dem Auftauen bei Gesamtäquilibrationszeiten von 3 und 6 Stunden bei 5 °C, jedoch ergab sich ein signifikanter Abfall der Spermabeweglichkeit nach 18-stündiger Äquilibration bei 5 °C vor dem Einfrieren. Der Bereich von 3 bis 6 Stunden ermöglicht eine Vereinigung von zwei aufeinanderfolgenden 3-stündigen Sortierungsansätzen zum Einfrieren von Sperma ohne Verringerung der Beweglichkeit nach dem Auftauen. Da die Bullen-Äquilibrationszeit-Wechselwirkung nicht signifikant war, war eine 3- bis 6-stündige Äquilibration angemessen, mit der Vorsichtsmaßnahme, dass nur vier Bullen eingesetzt wurden. Für eine Minorität von Bullen ist eine optimale Äquilibrationszeit von > 6 Stunden zu erwarten.

Beispiel 3
Einflüsse der Farbstoffkonzentration und der Laser-Stärke auf sortiertes Sperma
Ziel: Bewertung der Einflüsse der Konzentration des Farbstoffes Hoechst 33342 in Kombination mit der Laser-Intensität auf fließsortiertes Sperma

1. Gewinnung der Quellenprobe. Sperma von sechs Bullen wurde gemäß Beispiel 1A gewonnen und vorbereitet.
2. Verfahren
a) Versuchsanordnung. Ein Ejakulat (2 Bullen) und zwei Ejakulate wurden an verschiedenen Tagen (4 Bullen) in einer 2 × 2-Anordnung plus Kontrolle verwendet.
b) Färben und Sortieren. Die Färbung, die Vorbereitung für das Sortieren und das Sortieren von Sperma wurden gemäß Beispiel 2 vorgenommen, mit der Ausnahme, dass die Spermasuspensionen mit dem Farbstoff Hoechst 33342 in einer endgültigen Konzentration von 149 TM oder 224 TM zugegeben wurde. Das Sperma wurde einer Massesortierung mit dem Laser, der mit einer Eingangsleistung von 100 mW oder 150 mW betrieben wurde, unterzogen. Massesortiertes Sperma wurde in 50 ml fassenden Kunststoffröhrchen gemäß Beispiel 2 gesammelt. 4 Röhrchen mit einem Gehalt an insgesamt etwa 15 × 10⁶ Spermien/Röhrchen wurden innerhalb von 1 Stunde für jeden Bullen gewonnen. Das sortierte Sperma wurde 1 Stunde bei 22 °C inkubiert, um eine längere Sortierungszeit zu simulieren.
c) Vorbereitung für das Einfrieren. Im Anschluss an die Inkubation wurde das Sperma gemäß Beispiel 2 gekühlt. Sodann wurde das Sperma durch 20-minütige Zentrifugation bei 5 °C mit 850 × g eingeengt. Nach dem Entfernen des Überstands wurden 150 μl Tris-A-Fraktion-Streckmittel zu jeweils 150 μl-Spermapellets bei 5 °C gegeben. Sämtliche Spermapellets wurden durch vorsichtiges, wiederholtes Ansaugen suspendiert. Das Sperma der einzelnen Bullen wurden vereinigt. Tris-B-Fraktion-Streckmittel wurde stufenweise wie in Beispiel 2 zugegeben. Eine ungefärbte, nicht-sortierte Kontrolle für jeden Bullen wurde mit 20 × 10⁶ Spermien/ml in Tris-Streckmittel mit einem Gehalt an 6 % Glycerin hergestellt und auf 5 °C gekühlt, während das massesortierte Sperma hergestellt wurde.
d) Äquilibration und Einfrieren. Das Kontrollsperma und das sortierte Sperma wurden in 0,25 ml fassende Polyvinylchlorid-Straws gemäß Beispiel 2 abgepackt, 3 Stunden bei 5 °C äquilibriert und sodann auf herkömmliche Weise eingefroren.
3. Bewertung der Beweglichkeit nach dem Auftauen. Straws wurden gemäß Beispiel 2 aufgetaut und bewertet.
4. Statistische Analyse. Eine allgemeine Beschreibung der statistischen Analysen findet sich in Beispiel 2. Speziell wurden die Behandlungseffekte durch ANOVA bewertet. Das Modell umfasste die Farbstoffkonzentration, die Laser-Intensität und die Bullen im Hauptdiagramm und die Beobachterwechselwirkungen und verwandte Wechselwirkungen im Unterdiagramm. Bullen wurden als ein Zufallseffekt angesehen, die übrigen Faktoren als feststehende Effekte.
5. Ergebnisse. Die Bulleneffekte waren für die prozentualen Anteile von progressiv beweglichem Sperma unmittelbar nach dem Auftauen (P < 0,1) und nach 1- und 2-stündiger Inkubation bei 37 °C (P < 0,05) signifikant. Bei keiner der Inkubationszeiten gab es einen Einfluss der Farbstoffkonzentration oder der Bullen × Farbstoffkonzentration auf die Spermabeweglichkeit. Sieht man die Bullen als Zufallseffekt an, ergaben 150 mW-Laser-Stärke eine geringere Beweglichkeit des Spermas nach dem Auftauen als 100 mW bei einer Inkubationszeit von 0 Stunden (P < 0,1), jedoch nicht bei den übrigen Inkubationszeiten (Tabelle 5). Wenn Bullen als feststehende Effekte angesehen werden, führte eine Leistung von 150 mW zu einer geringeren Spermabeweglichkeit als eine Leistung von 100 mW (P < 0,05) bei sämtlichen drei Inkubationszeiten. Es gab einen Einfluss von Bulle × Laser-Stärke (P < 0,05) auf die Spermabeweglichkeit bei der 1-stündigen Inkubationszeit, jedoch nicht nach Inkubationszeiten von 0 oder 2 Stunden. Ferner führte die höhere Laser-Stärke zu einer geringeren Spermabeweglichkeit als die Kontrolle (P < 0,05) bei Inkubationszeiten von 0 und 1 Stunde (Tabelle 5). Es gab einen signifikanten Betrachtereffekt bei einer Inkubationszeit von 1 Stunde, jedoch nicht bei 0 oder 2 Stunden. Es gab keine Betrachter × Behandlung-Wechselwirkung (P > 0,1).

Tabelle 5 Einflüsse der Laser-Intensität und der Farbstoffkonzentration auf die Beweglichkeit nach dem Auftauen (%)

^aSignifikanter Haupteffekt (P < 0,1); Unterschied zur Kontrolle (P < 0,05).
^bUnterschied zur Kontrolle (P < 0,05).
^cVereinigte Standardfehler, √mittleres Fehlerquadrat von ANOVA + √N

6. Schlussfolgerungen. Die prozentualen Anteile an progressiv beweglichem Sperma nach dem Auftauen verringerten sich durch das Färbe- und Sortierverfahren. Eine höhere Laser-Intensität wirkte stärker schädigend als die geringere Laser-Intensität. Es gab keinen Einfluss der Farbstoffkonzentration auf die Spermabeweglichkeit nach dem Auftauen. Somit ist eine Anregung von spermagebundenem Farbstoff Hoechst 33342 bei geringeren Laser-Intensitäten weniger schädigend. Die Färbung von Sperma mit der höheren Farbstoffkonzentration hatte keinen schädlichen Einfluss auf die Beweglichkeit nach dem Auftauen. Die beobachtete Schädigung war vermutlich auf den Sperma-Bewegungsapparat zurückzuführen.

Beispiel 4
Bewertung der Färbeverfahren vor dem Sortieren und Auswahl von Streckmitteln für die Kryokonservierung von Sperma.
Ziel: (1) Bewertung von drei Spermabehandlungen vor dem Sortieren; und (2) Bewertung der Kombinationen von Ummantelungsflüssigkeit und Streckmittel für die Kryokonservierung von fließsortiertem Sperma.
Das folgende Experiment wurde vollständig im Doppelversuch durchgeführt.

1. Gewinnung der Quellenprobe. Sperma von vier Bullen wurde gemäß Beispiel 1A gesammelt und vorbereitet.
2. Verfahren
a) Versuchsanordnung. Eine Einflussuntersuchung mit drei Vorsortierungsbehandlungen × drei Streckmitteln × zwei Ummantelungsflüssigkeiten × vier Bullen × 2 Betrachter wurde entwickelt, um das beste Verfahren zur Behandlung des Spermas vor dem Sortieren zu bestimmen und um drei Streckmittel in Bezug auf die Kryokonservierung des sortierten Spermas zu bewerten.
b) Probenvorbereitung und Färbung. Frisch gewonnenes Sperma von jedem der vier Bullen wurde auf folgende Weise behandelt:
(1) Verdünnung auf 400 × 10⁶ ml in modifiziertem TALP (vergl. Beispiel 2, Tabelle 3) und 1-stündige Färbung bei 34 °C vor der Massesortierung ("verdünnt – 0 h");
(2) 3-stündige Inkubation in unverdünntem Zustand bei 22 °C vor der Verdünnung, Färbung und Sortierung ("unverdünnt – 3 h"); oder
(3) Verdünnung und Färbung wie bei "verdünnt – 0 h" und anschließend 3-stündige Inkubation bei 22 °C vor der Massesortierung ("verdünnt – 3h").
c) Streckmittel. Die folgenden Einfrierstreckmittel wurden verglichen: EYC (vergl. Beispiel 1) mit einem Gehalt an 7 % Glycerin, Eidotter-Tris (vergl. Beispiel 2) mit einem Gehalt an 6 % Glycerin und Eidotter-TES-Tris (TEST) mit einem Gehalt an 5 % Glycerin. EYC-"A-Fraktion" bezieht sich auf das EYC-Streckmittel ohne Glycerin und EYC-"B-Fraktion" bezieht sich auf EYC-Streckmittel mit einem Gehalt an der doppelten Glycerinkonzentration, bezogen auf die endgültige, angestrebte Konzentration (d. h. 14 %). Wenn somit die EYC-A- und B-Fraktionen mit einem gleichen Volumen vereinigt werden, enthält das endgültige EYC-Streckmittel 7 % Glycerin. Tris-A- und -B-Fraktionen werden in ähnlicher Weise bezeichnet und sind in Beispiel 2 beschrieben. TEST-Streckmittel wird als vollständiges Streckmittel mit einem Gehalt an 5 % Glycerin hergestellt. Somit gibt es für TEST keine "A"- und "B"-Fraktionen.
d) Ummantelungsflüssigkeit. Bei der Ummantelungsflüssigkeit handelte es sich entweder um 98,6 mM Natriumcitrat-dihydrat (#S279-3, Fisher Scientific, Fair Lawn, NY) oder Tris gemäß den Angaben in Beispiel
2. Beide Typen der Ummantelungsflüssigkeit wurden auf den pH-Wert 6,8 eingestellt. Die Osmolalität betrug etwa 270 bis 280 mOsm/kg. Tris-Ummantelungsflüssigkeit wurde zur Gewinnung von Sperma verwendet, das später in Eidotter-Tris- und TEST-Einfrier-Streckmittel gestreckt wurde. Die Ummantelungsflüssigkeit mit einem Gehalt an 98,6 mM Natriumcitrat-dihydrat wurde zur Gewinnung von Sperma für das anschließende Strecken in EYC-Einfrierstreckmittel verwendet.
e) Sortieren. Etwa 58 × 10⁶ Spermien für jede Kombination von Vorsortierungsbehandlung, Ummantelungsflüssigkeit und Streckmittel wurden gemäß Beispiel 2 einer Massesortierung unter Anwendung einer Laser-Eingangsleistung von 150 mW unterzogen. Für jede Sortierung wurde Sperma im Verlauf von etwa 1 Stunde gewonnen. Nach der Sortierung wurden die Proben 2 Stunden bei 22 °C inkubiert, um eine 3-stündige Sortierung zu simulieren.
f) Vorbereitung für das Einfrieren. Im Anschluss an die Inkubation wurde das Sperma gemäß Beispiel 2 gekühlt. Nach dem Abkühlen wurden die Proben 20 Minuten bei 5 °C mit 850 × g zentrifugiert. Die einzelnen Proben umfassten ein Gesamtvolumen von etwa 28 ml und befanden sich in einem 50 ml fassenden Kunststoffröhrchen. Nach Entfernung des Überstands wurde das Sperma zur Streckung wieder in einen Kälteraum von 5 °C gebracht. Die Proben wurden auf 40 × 10⁶/ml gestreckt, indem man 131 μl Spermasuspension zu 69 μl A-Fraktion-EYC-, A- Fraktion-Eidotter-Tris- oder TEST-Streckmittel gab. Die Suspensionen wurden sofort durch Zugabe des passenden, Glycerin enthaltenden Streckmittels (d. h. B-Fraktion-EYC, B-Fraktion-Tris oder TEST) auf 20 × 10⁶ Spermien/ml eingestellt. B-Fraktion-Streckmittel wurden stufenweise (2X) zu den jeweiligen Proben in Abständen von 15 Minuten gemäß den Angaben in Beispiel 2 gegeben. TEST wurde stufenweise zu Sperma auf die gleiche Weise wie die B-Fraktion-EYC- und Tris-Streckmittel gegeben.
g) Äquilibrieren und Einfrieren. Sperma wurde in 0,25 ml fassende Polyvinylchlorid-Straws abgepackt, 3 Stunden bei 5 °C äquilibriert und sodann in statischem Dampf von flüssigem Stickstoff eingefroren.
3. Bewertung der Beweglichkeit nach dem Auftauen. Das Sperma wurde gemäß Beispiel 2 aufgetaut und einer Bewertung nach dem Auftauen unterzogen.
4. Statistische Analyse. Eine allgemeine Beschreibung der statistischen Analysen findet sich in Beispiel 2. Speziell wurden die Behandlungseffekte über getrennte Varianzanalysen für jede Inkubationszeit nach dem Auftauen bewertet. Das Hauptdiagramm umfasste die Behandlung vor dem Sortieren, die Streckmittel und die Bullen; das Unterdiagramm bestand aus Betrachtern und verbundenen Wechselwirkungen. Bullen wurden als Zufallseffekt angesehen, die übrigen Faktoren als feststehend. Das gesamte Experiment wurde 2-mal durchgeführt. Der Tukey-HSD-Test wurde zum Trennen der Mittelwerte verwendet.
5. Ergebnisse. Die progressive Beweglichkeit von massesortiertem Sperma nach dem Auftauen wurde durch Streckmittel und Bullen (P < 0,05) bei jeder Inkubationszeit nach dem Auftauen und durch das Verfahren vor dem Sortieren bei einer Inkubationszeit von 0 Stunden beeinflusst (Tabelle 6). Aufgrund der Ummantelungsflüssigkeiten gab es keine Unterschiede (P > 0,05). Bei einer Inkubationszeit von 0 Stunden nach dem Auftauen führte die Anwendung der Behandlung "unverdünnt – 3 h") zu einem beweglicheren Sperma nach Einfrieren und Auftauen als die Anwendung der beiden anderen Färbebehandlungen vor dem Sortieren (P < 0,05; Tabelle 6). Jedoch waren die Vorgänge vor dem Sortieren nach einer Inkubationszeit im Anschluss an das Auftauen des Spermas von 1 oder 2 Stunden statistisch nicht signifikant, wobei die Bullen als Zufallseffekt angesehen wurden. Wichtig ist, dass bei diesen zwei Inkubationszeiten signifikante Vorsortierungsbehandlungs-Bullen-Wechselwirkungen (P < 0,05) bestanden. Ferner ergab die Vorsortierungsbehandlung bei sämtlichen Inkubationszeiten nach dem Auftauen einen signifikanten Effekt, wobei die Bullen als feststehende Effekte angesehen wurden. Unmittelbar nach dem Auftauen (0 h) war TEST das beste Streckmittel, jedoch war nach 1- oder 2-stündiger Inkubation bei 37 °C Tris das beste Streckmittel. Von Bedeutung ist, dass für keine Reaktion eine Vorsortierungsbehandlung-Streckmittel-Wechselwirkung bestand. Es gab bei sämtlichen Inkubationszeiten Betrachtereffekte (P < 0,01), jedoch keine Betrachter-Behandlungs-Wechselwirkungen. Bei sämtlichen drei Inkubationszeiten gab es eine Bullen-Streckmittel-Wechselwirkung (P < 0,05).

Tabelle 6 Haupteffekte der Vorsortieruagsbehandlung und der Einfrisrstreckmittel auf die progressive Beweglichkeit nach dem Auftauen (%)

^{a, b, c}Mittelwerte innerhalb der Spalten, innerhalb der Haupteffekte, ohne übliche hochgestellte Indices differieren (P < 0,05).
^dVereinigte Standardfehler = √mittleres Fehlerquadrat von ANOVA + √N

6. Schlussfolgerungen. Diese Studie ergab, dass das 3-stündige Belassen von unverdünntem Sperma vor dem Verdünnen, Färben und Sortieren besser war als eine sofortige Verdünnung und Färbung 0 oder 3 Stunden danach. Somit ist es bis zu 3 Stunden bis zum Sortieren am günstigsten, mit einer neuen Aliquotmenge des ursprünglichen Ejakulats, das unverdünnt 3 Stunden belassen und anschließend gefärbt worden war, fortzufahren, statt mit der ursprünglichen Probe des gefärbten und auf 400 × 10⁶ Spermien/ml gehaltenen Spermas fortzufahren. Obgleich TEST-Streckmittel eine höhere Beweglichkeit nach dem Auftauen bei 0 h ergab, war Tris das überlegene Streckmittel, wenn die Spermien durch Inkubation bei 37 °C belastet wurden, Beide Ummantelungsflüssigkeiten funktionierten für jedes Streckmittel gut. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse haben wir die Verwendung von Tris- Ummantelungsflüssigkeit in Kombination mit Tris-Einfrierstreckmittel in unser übliches Bearbeitungsverfahren aufgenommen.

Beispiel 5
Einflüsse von Streckmitteladditiven auf sortiertes Sperma
Ziel: Bewertung des Einflusses der Zugabe von Natriumdodecylsulfat (SDS) zum Einfrierstreckmittel auf fließsortiertes Sperma
A. Bewertung des Einflusses der Konzentration von SDS im Einfrierstreckmittel

1. Gewinnung der Quellenprobe. Sperma von sechs Bullen wurde gemäß Beispiel 1A gewonnen und vorbereitet.
2. Verfahren. Sperma von jedem der sechs Bullen wurde auf 20 × 10⁶/ml in 20 % Vollei-Tris-WET-Streckmittel mit einem Gehalt an 0, 0,03, 0,06, 0,09 oder 0,12 % SDS gestreckt, in Straws abgepackt und eingefroren. WET-Streckmittel wurde unter Verwendung von 3,028 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 1,78 g Citronensäure-monohydrat und 1,25 g Fructose pro 100 ml bidestilliertes Wasser, das mit 20 % Vollei (Vol./Vol.) versetzt war, hergestellt. Das WET-Streckmittel wurde bei einem pH-Wert von etwa 7,0 hergestellt und wies eine endgültige Glycerinkonzentration von etwa 6 % (Vol./Vol.) auf. Das WET-Streckmittel enthielt ferner 1 000 IU Penicillin G-natrium und 100 Tg Streptomycin-sulfat/ml.
3. Ergebnisse. Die jeweiligen Mittelwerte (n = 1 Probe von jedem der 6 Bullen) betrugen 51, 51, 50, 51 und 48 % progressiv bewegliche Spermien etwa 10 Minuten nach dem Auftauen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurden in Beispiel 5B 0,06 % SDS verwendet.

B. Bewertung der Einflüsse von 0,06 % SDS in verschiedenen Einfrierstreckmitteln auf die Beweglichkeit von fließsortiertem Sperma nach dem Auftauen

1. Gewinnung der Quellenprobe. Sperma von acht Bullen wurde gemäß Beispiel 1A gewonnen und vorbereitet.
2. Verfahren. Die Beweglichkeit nach dem Auftauen wurde für Sperma, das in Eidotter-Tris-Streckmittel (vergl. Beispiel 2) und WET-Streckmittel (vergl. Beispiel 5A) eingefroren war, mit und ohne 0,06 SDS untersucht. Der endgültige Glyceringehalt für beide Streckmittel betrug 6 %.
a) Färben, Vorbereitung für das Sortieren, Sortieren. Gefärbte Spermaproben wurden aus einem Ejakulat von jeweils 8 Bullen gemäß Beispiel 2 hergestellt. Die gefärbten Spermaproben wurden unter Verwendung von Tris-Ummantelungsflüssigkeit gemäß Beispiel 2 einer Massesortierung unterworfen, mit der Ausnahme, dass die Sortierung unter Anwendung von 135 mW-Laser-Eingangsleistung vorgenommen wurde. Sortiertes Sperma wurde in einem 50 ml fassenden Kunststoffröhrchen mit einem Gehalt an 2 ml A-Fraktion-Einfrierpuffer für jedes Streckmittel gesammelt. 15 × 10⁶ sortierte Gesamtspermien (25 ml) wurden für jede Behandlung gesammelt und 1 Stunde bei 22 °C inkubiert, um ein längeres Sortieren zu simulieren.
b) Vorbereitung für das Einfrieren. Verdünntes Sperma wurde innerhalb von 90 Minuten auf 5 °C abgekühlt. Ein gleiches Volumen an entsprechendem B-Fraktion-Streckmittel wurde schrittweise (2×) in Abständen von 15 Minuten in jedes 50 ml fassende Kunststoffröhrchen mit einem Gehalt an sortiertem Sperma gegeben. Aliquotanteile von 25 ml/Streckmittelbehandlung wurden durch 20-minütige Zentrifugation mit 850 × g in einer Kühlzentrifuge eingeengt. Der Überstand wurde entfernt, wobei ein 600 TI-Spermapellet zurückblieb, das durch vorsichtiges Aufwirbeln für 15 Sekunden suspendiert wurde. Das Spermapellet wurde mit keinem zusätzlichen Streckmittel versetzt, da die das Pellet enthaltende Suspension bereits Glycerin enthielt. Die Konzentration der Spermasuspension betrug etwa 20 × 10⁶/ml. Eine ungefärbte, nicht-sortierte Kontrolle für jeden Bullen wurde mit 20 × 10⁶ Spermien/ml in Eidotter-Tris-Streckmittel mit einem Gehalt an 6 % Glycerin hergestellt. Die Kontrolle befand sich bei der Massesortierung in einem Kälteraum von 5 °C.
c) Äquilibrieren und Einfrieren. Sämtliche Kontrollspermaproben und massesortierte Spermaproben wurden gleichzeitig abgepackt und eingefroren. Das Sperma wurde in 0,25 ml fassende Polyvinylchlorid-Straws abgepackt, etwa 3 bis etwa 6 Stunden bei 5 °C äquilibriert und sodann in statischem Dampf von flüssigem Stickstoff eingefroren.
3. Bewertung der Beweglichkeit nach dem Auftauen. Das Sperma wurde gemäß Beispiel 2 aufgetaut und nach dem Auftauen bewertet, mit der Ausnahme, dass die progressive Beweglichkeit 0,5 und 2,0 Stunden nach der Inkubation bewertet wurde.
4. Statistische Analyse. Eine allgemeine Beschreibung der statistischen Analysen findet sich in Beispiel 2. Speziell wurden Behandlungseffekte durch getrennte Varianzanalysen für jede Inkubationszeit bewertet. Das Modell umfasste Bullen und Streckmittel im Hauptdiagramm und Betrachter- und verwandte Wechselwirkungen im Unterdiagramm. Differenzen der Mittelwerte wurden durch den Grenzverdünnungstest bestimmt.
5. Ergebnisse. Das Streckmittel beeinträchtigte (P < 0,05) die progressive Beweglichkeit von Sperma nach 0,5- oder 2-stündiger Inkubation nach dem Auftauen (Tabelle 7). Nach 0,5 Stunden ergab WET plus SDS eine geringere Beweglichkeit als Tris mit SDS. Nach 2 Stunden erwiesen sich sämtliche Behandlungen von massesortiertem Sperma im Vergleich zu unsortiertem Kontrollsperma als ungünstiger. Es gab signifikante Bullen- und Betrachtereinflüsse (P < 0,01) bei beiden Inkubationszeiten, aber keine Betrachter-Behandlungs-Wechselwirkungen.

Tabelle 7 Einfluss des Streckmittels auf die progressive Beweglichkeit nach dem Auftauen (%)

^a,bMittelwerte innerhalb der Spalten, ohne übliche hochgestellte Indices differieren (P < 0,05). √ mittleres Fehlerquadrat von ANOVA + √ N

6. Schlussfolgerung. Der Zusatz von SDS zu Tris- oder WET-Streckmitteln verbesserte die Spermaqualität bei Bestimmung der Beweglichkeit durch visuelle Schätzung nach dem Auftauen nicht. Ferner waren die Ergebnisse unter Verwendung von WET- und Tris-Streckmitteln ähnlich. Daher ist WET offensichtlich ebenso wirksam wie Tris für eine Kryokonservierung von sortiertem Rindersperma.

Beispiel 6
Qualität von durch Fließsortieren geschlechtsbestimmtem Sperma für Feldversuche
Ziel: Bewertung der Qualität von sortiertem Sperma nach dem Auftauen aufgrund der akrosomalen Unversehrtheit

1. Gewinnung der Quellenprobe. Sperma von 3 Bullen wurde gemäß Beispiel 1A gewonnen und vorbereitet.
2. Verfahren. Sortiertes und unsortiertes Kontrollsperma aus dem gleichen Ejakulat wurde gemäß Beispiel 2 gefärbt, verarbeitet und sortiert, mit der Ausnahme, dass das Sperma in Bezug auf den Geschlechtstyp auf eine Reinheit von 90 % sortiert wurde. Sortiertes Sperma wurde in einem Volumen von etwa 20 ml gesammelt und innerhalb von 90 Minuten auf 5 °C gekühlt (0,2 °C/min). Nach dem Abkühlen wurde ein gleiches Volumen an Eidotter-Tris-B-Streckmittel (vergl. Beispiel 2) zum sortierten Sperma in zwei gleichen Volumenanteilen in Abständen von 15 Minuten zugegeben. Das Zentrifugieren und Absaugen des Überstands wurde gemäß Beispiel 5 durchgeführt. Nach dem Zentrifugieren und Absaugen wurde das Spermapellet mit Eidotter-Tris-Streckmittel mit einem Gehalt an 6 % Glycerin (Vol./Vol.) versetzt, um eine Spermiertkonzentration von etwa 20 × 10⁶/ml zu erreichen. Das Einfrieren und Auftauen wurde gemäß Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Äquilibrierungszeit etwa 3 Stunden betrug.
3. Bewertung der Verträglichkeit nach dem Auftauen. Visuelle Schätzungen des prozentualen Anteils von progressiv beweglichen Spermien wurden etwa 10 Minuten nach dem Auftauen bei 37 °C vorgenommen. Die akrosomale Unversehrtheit der Spermien wurde durch Differenzinterferenz-Kontrastmikroskopie (×1000) nach 2-stündiger Inkubation bei 37 °C bestimmt. Sperma wurde mit 40 mM Natriumfluoride behandelt. Ein feuchter Abstrich wurde hergestellt und 100 Spermien pro Behandlung wurden untersucht. Die Akrosomen wurden folgendermaßen eingeteilt: (a) intaktes Akrosom, (b) geschwollenes oder beschädigtes Akrosom oder (c) fehlendes Akrosom (nicht-intakt).
4. Statistische Analyse. Die analysierten Daten stammten von 19 verschiedenen Einfrierdaten, die über 3 bei Feldversuchen verwendeten Bullen abgeglichen wurden. Die Behandlungseffekte (Sortierung gegen Kontrolle) wurden durch Varianzanalyse bewertet, wobei die Bullen als feststehender Effekt dienten.
5. Ergebnisse. Der prozentuale Anteil von progressiv beweglichen Spermien war signifikant höher (P < 0,05) für nicht-sortiertes Sperma (50 %) als für sortiertes Sperma (46 %; Tabelle 8), und zwar trotz der Entfernung von toten Spermien beim Sortieren. Jedoch unterschied sich der prozentuale Anteil von Spermien mit intaktem Akrosom nicht. Durch das Sortieren stieg der prozentuale Anteil von Spermien ohne Akrosom, wobei aber auch der prozentuale Anteil an Spermien mit einem geschädigten Akrosom verringert wurde, verglichen mit Kontrollsperma (P < 0,05). Es gab signifikante Unterschiede unter den Bullen in Bezug auf den prozentualen Anteil an intakten Akrosomen (P < 0,05), den prozentualen Anteil an nicht-intakten Akrosomen (P < 0,01) und die progressive Beweglichkeit nach dem Auftauen (P < 0,01). Es gab einen Bullen-Sortier-Effekt für die Beweglichkeit nach dem Auftauen (p < 0,01), jedoch nicht für die übrigen Reaktionen. Bei den Bullen A und B waren die Unterschiede in der Beweglichkeit nach dem Auftauen zwischen sortiertem und unsortiertem Sperma nahezu Null. Für den Bullen C zeigte das sortierte Sperma eine im Vergleich zum Kontrollsperma um 10 Prozentpunkte (19 %) verringerte Beweglichkeit.

Tabelle 8 Einfluss des Sortierens auf die Beweglichkeit (%) nach dem Auftauen und den akrosomalen Status (%)

^{a, b}Die Spalten-Mittelwerte mit verschiedenen hochgestellten Indices sind unterschiedlich (P < 0,05)

6. Schlussfolgerungen. Die visuellen Beurteilungen der progressiven Beweglichkeit für sortiertes, gefrorenes Sperma waren durchschnittlich geringfügig niedriger (4 Prozentpunkte; 8 %) als beim Kontrollsperma, obgleich dieser Unterschied für einen Bullen größer war. Diese Bewertungen wurden etwa 10 Minuten nach dem Auftauen vorgenommen. Die geringe durchschnittliche Differenz stimmt mit dem Wert für nicht-intakte Akrosomen nach 2-stündiger Inkubation überein. Es ist wahrscheinlich, dass Spermien mit geschädigtem oder fehlendem Akrosom unbeweglich sind. Der erhöhte prozentuale Anteil von Spermien mit einem nicht-intakten Akrosom bei den sortierten Proben zeigt eine Schädigung in Verbindung mit dem Sortiervorgang oder mit der Kryokonservierung vor oder nach der tatsächlichen Sortierung. Vermutlich bewirkte die Sortierung eine Umwandlung von geschädigten Akrosomen zu fehlenden Akrosomen. Auf der Grundlage üblicher Bewertungsverfahren der Spermaqualität besteht kein Grund zur Annahme, dass das Fertilisationspotential dieser fließsortierten Spermien bei den meisten Bullen ernsthaft beeinträchtigt ist.

Beispiel 7
Geschlechtsauswahl und Kryokonservierung von Bullensperma unter Verwendung von 20 %-Eidotter-Tris-Streckmittel
Ziel: Bereitstellung eines Verfahrens für die Kryokonservierung von fließsortiertem Bullensperma.

1. Gewinnung und Bewertung von Ejakulat. Die Gewinnung und Vorbereitung von Ejakulaten erfolgt gemäß Beispiel 1A. Ejakulate von Bullen mit > 75 % morphologisch normalen Spermien werden ausgewählt. Eine visuelle Beurteilung des prozentualen Anteils von progressiv beweglichen Spermien wird vorgenommen (Ejakulate, die eine progressive Beweglichkeit von > 60 % aufweisen, sind für die Sortierung am besten geeignet). Antibiotika werden zu rohem Samen folgendermaßen zugegeben: Tylosin in einer Endkonzentration von 100 μg/ml, Gentamicin in einer Endkonzentration von 500 μg/ml und Linco-spectin in einer Endkonzentration von 300/600 μg/ml.
2. Färbung und Vorbereitung für die Sortierung. Im Anschluss an die Zugabe der Antibiotika zur rohen Samenprobe wartet man vor dem Färben 15 bis 20 Minuten. Die Proben werden gemäß Beispiel 2 gefärbt.
3. Sortierung. Eine Sortierung in Bezug sowohl auf X- als auch Y-Typ Sperma wird durchgeführt, wobei die Sortierungsgrenzen auf 90 % Reinheit eingestellt werden. Sperma wird in 50 ml Falcon-Röhrchen mit einem Gehalt an 2 ml 20 %-Eidotter-Tris-A-Fraktion-Streckmittel (vergl. Beispiel 2) sortiert, bis jedes Röhrchen maximal 20 ml Gesamtvolumen enthält (oder maximal 2 Stunden pro Sortierung). Am Schluss der Sortierung beträgt die Spermienkonzentration 6 × 10⁵/ml. Es ist darauf hinzuweisen, dass weiterer 20 %-Eidotter-Tris-A-Fraktion-Abfangpuffer nach dem Sortieren und vor dem Abkühlen zugegeben werden muss, so dass der endgültige prozentuale Anteil an Eidotter mindestens 3 % beträgt.
4. Vorbereitung zum Einfrieren. Nach dem Sortieren werden die sortierten Proben innerhalb von 90 Minuten auf 5 °C abgekühlt. Nach dem Abkühlen wird 20 %-Eidotter-Tris-B-Fraktion-Streckmittel (vergl. Beispiel 2) stufenweise (2X) in Abständen von 15 Minuten zugegeben. Das endgültige Volumen des der Spermaprobe zugesetzten Tris-B-Fraktion-Streckmittels soll dem Volumen des Tris-A-Fraktion-Streckmittels entsprechen. Das Gesamtvolumen der Spermaprobe nach Zugabe des Tris-B-Fraktion-Streckmittels soll 27 ml nicht übersteigen. Nach der Zugabe des Tris-B-Fraktion-Streckmittels zur Spermaprobe wird die Probe durch 20-minütige Zentrifugation mit 850 × g eingeengt. Nach Absaugen des Überstands verbleiben etwa 150 μl Spermapellet. Das Sperma wird resuspendiert und für jeden einzelnen Bullen vereinigt.
5. Einfrieren. Vollständiges Eidotter-Tris-Streckmittel (6 Glycerin) wird zur Erzielung einer endgültigen Spermakonzentration von 20 × 10⁶/ml zugegeben. Das Abpacken des gestreckten Spermas in 0,25 ml fassende Polyvinylchlorid-Straws zum Einfrieren erfolgt gemäß Beispiel 2.

Beispiel 8
Bewertung der Fertilität von fließsortiertem, gefrorenem Bullensperma in Felduntersuchungen
Materialien und Methoden
Gewinnung und Verarbeitung von Samen
Samen von jungen Bullen von unbekannter Fertilität wurde mit einer künstlichen Vagina gesammelt (vergl. Beispiel 1A). Nach Bestimmung der Spermienkonzentration mit einem Spektrophotometer und nach subjektiver Bewertung der progressiven Spermienbeweglichkeit wurde der Samen gemäß Beispiel 2 verarbeitet und sortiert, mit der Ausnahme, dass das Sperma unter Verwendung einer Laser-Eingangsleistung von etwa 135 bis etwa 150 mW gemäß dem Geschlechtstyp auf eine Reinheit von 90 % sortiert wurde. Die Verarbeitung und das Einfrieren wurden gemäß Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Äquilibrationszeit etwa 3 Stunden betrug. Cornell Universal-Streckmittel (G. E. Seidel Jr., Theriogenology, Bd. 48 (1997), S. 1255–1264) wurde für flüssigen Samen in den Feldversuchen 1, 2 und 3 verwendet. Für gefrorenen Samen in den Feldversuchen 2 und 3 handelte es sich beim verwendeten Streckmittel um 2,9 % Na-citrat + 20 % Eidotter mit einer endgültigen Glycerinkonzentration von 7 % (vergl. Beispiel 1). Für die Feldversuche 4 bis 11 wurde das Sperma in einem Streckmittel auf der Basis von Tris, das aus 200 mM Tris, 65 mM Citronensäure, 56 mM Fructose und 20 % Eidotter bestand und eine endgültige Glycerinkonzentration von 6 % aufwies (vergl. Beispiel 2) eingefroren. Bei der im Fließzytometer verwendeten Ummantelungsflüssigkeit handelte es sich um 2,9 % Na-citrat (vergl. Beispiel 4) für die Versuche 1, 2 und 3 und um einen Tris-Puffer für die restlichen Versuche (vergl. Beispiel 2).
Sperma wurde in 0,25 ml fassenden French-Straws in Säulen von nur 50 μl im Zentrum des Straws abgepackt. Um Verdünnungseffekte auf ein Minimum zu begrenzen, wurden geringe Volumina verwendet, so dass mindestens 10⁷ Spermien/ml vorlagen. Bei den meisten Versuchen wurde zunächst eine Säule von Streckmittel ohne Sperma in das Straw gesaugt, um den Wattebausch zu benetzen. Sodann folgte eine geringe Luftsäule und anschließend das geschlechtsbestimmte Sperma. Wenn das Sperma eingefroren war, wurde 1 Straw von jedem Ansatz 30 Sekunden in Wasser von 35 °C für die Qualitätskontrolle aufgetaut. Ansätze mit einer unter 25 % liegenden progressiven Beweglichkeit nach dem Auftauen wurden verworfen. Eine Probe von geschlechtsbestimmtem Sperma wurde bei jedem Ansatz einer Ultraschallbehandlung unterzogen und durch Fließzytometrie analysiert, um die Genauigkeit der Geschlechtsbestimmung zu ermitteln.
Haltung und künstliche Besamung von Färsen
Die eingesetzten Färsen befanden sich in 6 weit verstreuten Erzeugungseinheiten mit verschiedenen Haltungsgewohnheiten. Saisonale und Aufzuchtschwankungen trugen ferner zur Heterogenität der Experimente bei (Tabelle 9). Soweit es möglich ist, wurden Behandlungen und Kontrollen systematisch im Rahmen von Bullen und Inseminatoren beim Eintreten der Färsen in die Inseminationsanlagen abgewechselt.
Eine Östrus-Synchronisation erfolgte gemäß einer von vier Möglichkeiten (Tabelle 9): (1) 500 mg Melengesterol-acetat (MGA) wurden täglich in 2,3 kg Kornfutter 14 Tage lang verfüttert, wonach sich eine intramuskuläre Injektion von 25 mg Prostaglandin F₂α (Lutalyse, Upjohn, Kalamazoo, MI, USA) an den Tagen 17, 18 oder 19 nach dem letzten Fütterungstag mit MGA anschloss (MGA/PG); (2) eine einzige Injektion von 25 mg Prostaglandin F₂α (PG); (3) eine intramuskuläre Injektion von 20 oder 25 mg Prostaglandin F₂α in Abständen von 12 Tagen (PG/PG) oder (4) eine intramuskuläre Injektion von 50 oder 100 Tg GnRH und 7 Tage später 25 mg Prostaglandin F₂α (GnRH/PG).
Die Färsen wurden morgens und abends einer visuellen Prüfung auf den Östrus-Zustand unterzogen, jedoch nur abends nach 16.00 Uhr etwa 1/2 oder 1 Tag nach Einsetzen des Östrus inseminiert. Die Insemination erfolgte entweder auf herkömmliche Weise in den Uteruskörper oder zur Hälfte in das Uterushorn unter Verwendung atraumatischer Embryo-Übertragungshülsen (IMV, Minneapolis, MN, USA). Im letztgenannten Fall wurde der Samen nach der großen Krümmung des UterusHorn so weit vorne, wie es ohne Verletzung möglich war, abgelegt, und zwar auf identische Weise wie bei einer nicht-chirurgischen Embryoübertragung. In den meisten Fällen wurde der Samen zwischen dem vorderen Drittel und der Hornmitte abgelegt.
Die meisten Experimente umfassten die Insemination von gefrorenem Kontrollsperma in den Uteruskörper mit 20 oder 40 × 10⁶ Spermien/Dosis der gleichen Bullen, die für das in Bezug auf den Geschlechtstyp sortierte Sperma ("geschlechtsbestimmt") verwendet wurden. Diese Kontrolle diente als Mischbewertung der natürlichen, normalen Fertilität der Färsen unter den speziellen Feldbedingungen sowie der Fertilität der eingesetzten Bullen und dem Können der Inseminatoren. Einige Versuche umfassten auch eine gering dosierte, nicht-geschlechtsbestimmte Kontrollgruppe. Gelegentlich wurden die Kontrollinseminationen auf 1/2 oder 2/3 der Anzahl der für die einzelnen Behandlung vorgesehenen Tiere festgelegt, um mehr Informationen über geschlechtsbestimmtes Sperma zu erhalten. Eingefrorenes geschlechtsbestimmtes Sperma und Kontrollsperma wurden 20 bis 30 Sekunden in einem Wasserbad von 35 bis 37 °C aufgetaut. Verschiedene weitere Einzelheiten sind in Tabelle 9 zusammengestellt.
Eine Trächtigkeit wurde durch Ultraschall 28 bis 37 Tage nach der Insemination und/oder 56 bis 92 Tage nach der Insemination diagnostiziert, wobei zu diesem Zeitpunkt bei den meisten Versuchen das Fötusgeschlecht festgestellt wurde. Die Bestimmung erfolgte gemäß S. Curran, Theriogenology, Bd. 36 (1991), S. 809–814, ohne dass der Bearbeiter über die Inseminationsbehandlungen oder Kontrollen Bescheid wusste. Das Geschlecht der geborenen Kälber stimmte mit der Fötus-Geschlechtsdiagnose nahezu überein. Die Daten wurden durch das Chi-Quadratverfahren mit einem einzigen Freiheitsgrad analysiert und auf Kontinuität korrigiert. Zweiseitige Tests wurden eingesetzt, sofern nicht ein einseitiger Test angegeben ist. Weniger als 5 % der Inseminationen wurden ausgeschlossen, und zwar aufgrund von Fehlern bei der Inseminationsbehandlung, aufgrund einer offensichtlichen Infektion des Reproduktionstrakts, aufgrund eines Misslingens beim Durchtritt durch die Zervix und dergl. Die Entscheidung, Tiere von den Experimenten auszuschließen, wurde kurz nach der Insemination getroffen und beruhte nie auf der Trächtigkeitsdiagnose.
Tabelle 9 Einzelheiten über das Vorgehen bei den Feldversuchen
Ergebnisse und Diskussion
Die vorgelegten Daten stammen aus 11 aufeinanderfolgenden, heterogenen Feldversuchen, die durch logistische Aspekte der Studien eingeschränkt waren, z. B. in Bezug auf die Abgleichung der Bullen an die genetischen Bedürfnisse der Herden, fehlende Informationen über die Fertilität der Bullen, begrenzte Anzahl von Färsen, mangelnde Verfügbarkeit der gleichen Inseminatoren bei den Versuchen, schlechtes Wetter bei einigen Versuchen, begrenzte Mengen an geschlechtsbestimmtem Samen bei frühen Versuchen, 2 Sätze von Färsen, bei denen bei einigen zum Zeitpunkt der Östrus-Synchronisation eine Trächtigkeit bis zu etwa 55 Tagen festgestellt wurde, und dergl. Bis zu 4 Bullen und 3 Inseminatoren waren bei jedem Versuch beteiligt. Dies ermöglichte uns die Erprobung von Populationen, um zu gewährleisten, dass die Ergebnisse für mehr als einen Bullen oder technischen Assistenten gelten. Jedoch reichte die Datenmenge nicht aus, um Fertilitätsunterschiede von Bulle zu Bulle streng zu bewerten.
Die meisten Gruppen von Färsen stammten aus Zuchtherden, die in einer Entfernung von 140 bis 250 km von unserem Labor standen. Bei keinem der Versuche gab es signifikante Unterschiede der Trächtigkeitsraten unter den Inseminatoren, jedoch war die Anzahl an Züchtungsvorgängen pro Inseminator gering. Bei einer größeren Anzahl von Inseminationen würden wahrscheinlich Unterschiede festgestellt werden.
Die Östrus-Synchronisationsverfahren wurden innerhalb der Versuche nicht verglichen, so dass es nicht möglich war, unter diesen Methoden einen Vergleich der Trächtigkeitsraten vorzunehmen. Die Trächtigkeitsraten waren für alle vier Synchronisationsverfahren offensichtlich zufriedenstellend.
Da die Inseminationen 1-mal täglich durchgeführt wurden, wurden die Färsen an den Östrus-Abenden etwa 24 Stunden nach Entdeckung des Östrus inseminiert. Die Trächtigkeitsrate für diese Färsen mit geschlechtsbestimmtem Sperma betrug über alle Versuche hinweg 203/414 (49,0 %), was keinen signifikanten Unterschied (P > 0,1) gegenüber den Werten von Färsen mit Östrus am Morgen, die somit einen halben Tag nach Östrus-Feststellung inseminiert wurden, bedeutete, nämlich 266/586 (45,4 %). Diese Tendenz zu einer höheren Fertilität bei späterer Insemination steht in Übereinstimmung mit den Befunden anderer Untersuchungen, wonach dann, wenn Bullen von geringerer Fertilität zum Einsatz kommen, wenn geringere Spermienzahlen eingesetzt werden oder wenn die Bedingungen anderweitig suboptimal sind, eine im Vergleich zur normalen Vorgehensweise spätere Insemination empfohlen wird.
Die Trächtigkeitsraten bei den einzelnen Behandlungen und, sofern verfügbar, das Fötus- oder Kälbergeschlecht sind in den Tabellen 10 bis 20 aufgeführt. Das Ziel bestand darin, weibliche Nachkommen zu erhalten, ausgenommen der Versuch 8. Die Genauigkeit betrug 95, 83, 90, 83, 82 bzw. 94 % bei den Versuchen 1, 3, 8, 9, 10 bzw. 11. Bei den restlichen Versuchen war das Fötus- oder Geburtsgeschlecht nicht verfügbar, und zwar aufgrund des Zeitpunkts der Trächtigkeitsdiagnose, der fehlenden Verfügbarkeit von Fachleuten für die Geschlechtsbestimmung von Föten und/oder aufgrund der Tatsache, dass die Kälber noch nicht geboren waren. Dies war aber nicht Anlass von größeren Bedenken, da das Hauptziel dieser Untersuchung darin bestand, die Fertilität von fließsortiertem Sperma bei Insemination in geringen Dosen zu bestimmen.
Die Genauigkeit der Geschlechtsbestimmung kann durch Einstellung der Sortierungsparameter auf praktisch beliebige gewünschte Werte zwischen 50 und 95 % eingestellt werden. Jedoch führt eine höhere Genauigkeit zu einer geringeren Anzahl von pro Zeiteinheit sortierten Spermien, insbesondere in Bezug auf Spermien mit dem Y-Chromosom. Eine Genauigkeit von 90 % reicht für eine routinemäßige Arbeit aus.
Die hauptsächlichen Befunde für jeden Feldversuch sind der Reihe nach zusammengestellt. Es ist darauf hinzuweisen, dass in den Tabelleneinträgen jeweils die Gesamtzahl an Spermien angegeben ist. Die Anzahl an progressiv beweglichen Spermien betrug üblicherweise 30 bis 50 % dieser Werte. Der Feldversuch 1 (Tabelle 10) bestätigte, dass die Trächtigkeitsraten bei Insemination in das Uterushorn unter Verwendung einer geringen Anzahl an nicht-geschlechtsbestimmten Spermien ähnlich wie bei Kontrollen mit normalen Spermienzahlen waren. Die Trächtigkeitsrate nach 64 bis 67 Tagen mit nicht-eingefrorenem, geschlechtsbestimmtem Sperma (42 %) lag 12 Prozentpunkte unter der nicht-geschlechtsbestimmten, flüssigen Kontrolle mit Sperma, das in identischer Weise wie sortiertes Sperma verdünnt, gefärbt und zentrifugiert worden war. Die Genauigkeit der Geschlechtsbestimmung betrug 95 %. Das Geschlecht der nach Verwendung von geschlechtsbestimmtem Sperma geborenen Kälber stimmte mit der Geschlechtsdiagnose der Föten genau überein. Bei der Geschlechtsbestimmung der Kontrollföten gab es einen einzigen Fehler. Im Zeitraum von 2 Monaten Tragezeit bis zum Ende der Tragezeit kam es zu keinen Abgängen. Sämtliche 19 Kälber aus der Behandlungsgruppe mit geschlechtsbestimmtem Sperma waren normal und überlebten. Für die mit geschlechtsbestimmtem Samen behandelte Gruppe betrugen die 2 Monate-Trächtigkeitsraten für die Bullen N1, N2 und N3 41, 44 bzw. 40 %. 39 % (13/33) der Färsen mit Östrus am Morgen und 50 % (6/12) der Färsen mit Östrus am Abend wurden trächtig.
Tabelle 10 Ergebnisse des Feldversuchs 1 – Angus-Färsen in Wyoming, 1997

^{a, b}Die Geschlechtsverhältnisse ohne gleiche hochgestellte Indices sind unterschiedlich (P < 0,02).

Der Feldversuch 2 (Tabelle 11) lieferte den ersten Beweis, dass die Ergebnisse mit geschlechtsbestimmtem, gefrorenem Sperma ähnlich den Ergebnissen von geschlechtsbestimmtem, nicht-gefrorenem Sperma waren, wenn eine Anpassung an die Anzahl der während der Kryokonservierung abgetöteten Spermien vorgenommen wurde. Es bestand auch kein Unterschied in den Trächtigkeitsraten zwischen bei 5 °C und 18 °C gelagertem, geschlechtsbestimmtem Sperma. Die Trächtigkeitsraten 2 Monate und mehr nach der Insemination betrugen für geschlechtsbestimmten Samen von einzelnen Bullen 22 bis 42 % (P > 0,05). Der Verlust an Embryonen im Tragezeitraum von 1 bis 2 Monaten war für die geschlechtsbestimmte und Kontrollträchtigkeit sehr ähnlich. Die Daten für das Kalben standen für 39 Färsen dieses Versuchs zur Verfügung. Jede dieser Färsen (30 geschlechtsbestimmte Trächtigkeiten, 9 Kontrollen), die nach 2 Monaten trächtig waren, kalbten nach einer Tragzeit von normaler Länge.
Tabelle 11 Ergebnisse des Feldversuchs 2 – gekreuzte Rinderfärsen in Colorado, 1998

^akeine signifikanten Unterschiede, χ².

Der Feldversuch 3 (Tabelle 12) bestätigte, dass geschlechtsbestimmtes, gefrorenes Sperma zu vernünftigen Trächtigkeitsraten führt. Die Genauigkeit von geschlechtsbestimmtem Sperma wurde erneut bestätigt. Jedoch traten 4 Fehler bei der Geschlechtsbestimmung der Föten im Vergleich zu den Kälbergeburten auf. Das tatsächliche Geschlecht der geborenen Kälber ist aufgeführt. Auch hier gab es keine Abgänge zwischen einer Tragezeit von 2 Monaten und dem Ende der Tragezeit. Die Trächtigkeitsraten wurden über geschlechtsbestimmtes, nicht gefrorenes und geschlechtsbestimmtes, gefrorenes Sperma für die Bullen N8, N9, AN5 und AN4 gemittelt und betrugen 24, 31, 50 bzw. 60 % (P < 0,1).
Tabelle 12 Ergebnisse des Feldversuchs 3 – Anqus-Färsen in Wyoming, 1998

^{a, b}Die Mittelwerte ohne gleiche hochgestellte Indices sind unterschiedlich (P < 0,02).
^{c, d}Der prozentuale Anteil von weiblichen Kälbern der Behandlung mit Geschlechtsbestimmung (83 %) unterschied sich vom Wert der Kontrollgruppe, P < 0,05, 1-seitig, χ².

Die Feldversuche 4, 5 und 6 (Tabellen 13, 14 und 15) wurden am gleichen Ort mit drei unterschiedlichen Gruppen von Färsen durchgeführt.
Ungünstigerweise war es nicht möglich, die einzelnen Versuche in gleicher Weise zu wiederholen, was auf Zufälligkeiten bei den Feldversuchen zurückzuführen war, z. B. auf die Personaleinteilung, die Verfügbarkeit von geschlechtsbestimmtem Samen von jedem Bullen und dergl. Die stark unterschiedlichen Trächtigkeitsraten zwischen den Versuchen 5 und 6 belegen, dass die Bedingungen unter den Versuchen sich unterschieden. Einige der Färsen beim Versuch 6 standen zur Verfügung, da sie nach Ablauf einer natürlichen Paarungszeit von 1 Monat nicht trächtig wurden. Unter den Bedingungen dieser Versuche ergaben sich sehr ähnliche Trächtigkeitsraten zwischen 1,5 und 3,0 × 10⁶ geschlechtsbestimmten, gefrorenen Spermien/Dosis. Ferner ergaben sich keine Vorteile für eine Uterushorn-Insemination. Es gab keine signifikanten Unterschiede (P > 0,05) in den Trächtigkeitsraten unter den Bullen, mit Ausnahme von Versuch 5, bei dem die Trächtigkeitsrate für J2 mit 20/28 (71 %) höher war als für J4 mit 15/39 (38 %) (P < 0,05). Dieser Unterschied ergab sich nicht übereinstimmend von Versuch zu Versuch, da J4 numerisch höhere, jedoch nicht signifikante (P > 0,1) Trächtigkeitsraten ergab als J2 in den Versuchen 4 und 6.
Tabelle 13 Ergebnisse des Feldversuchs 4 – Holstein-Färsen in Colorado, 1999

^{a, b}Die Mittelwerte ohne gleiche hochgestellte Indices sind unterschiedlich (P < 0,01).
*Sechs an den Tagen 30 bis 33 trächtige Färsen wurden vor der zweiten Trächtigkeitsdiagnose verkauft. Es wurde angenommen, dass die Trächtigkeit bestehen blieb.

Tabelle 14 Ergebnisse des Feldversuchs 5 – Holstein-Färsen in Colorado, 1999

^akeine signifikanten Unterschiede

Tabelle 15 Ergebnisse des Feldversuchs 6 – Holstein-Färsen in Colorado, 1999

^{a, b}Die Mittelwerte ohne gleiche hochgestellte Indices sind unterschiedlich (P < 0,05).

Für den Versuch 7 (Tabelle 16) stand aufgrund einer Zeitplanänderung nur ein Inseminator zur Verfügung. Dies ist der einzige Versuch, der einen überzeugenden Vorteil der Uterushorn-Insemination gegenüber der Uteruskörper-Insemination ergab. Bei diesem Inseminator wurden unter den Versuchsbedingungen 55 % mehr Färsen (22 Prozentpunkte) mit geschlechtsbestimmtem, gefrorenem Samen, der in das Uterushorn statt in den Uteruskörper inseminiert wurde, trächtig. Der echte Unterschied könnte kleiner sein, da bei diesen Mittelwerten große Vertrauensbereiche bestehen. Bei sämtlichen anderen Versuchen (5, 6, 9 und 11), bei denen die Körper- und Horn-Insemination verglichen wurde, ergaben sich sowohl bei diesem technischen Assistenten sowie bei den anderen technischen Assistenten sehr ähnliche Trächtigkeitsraten für beide Verfahren.
Samen von einem der in Versuch 7 verwendeten Bullen wurde ohne Verdünnung von Montana per Luftfracht vor dem Sortieren in einer Isolierbox mit einer Temperatur von –20 °C verschickt. Die Versandzeit betrug 6 Stunden. Die Trächtigkeitsraten für das geschlechtsbestimmte Sperma von den beiden Bullen waren praktisch identisch: 49 % für den nicht verschickten Samen und 52 % für den verschickten Samen. Der Samen wurde für den Versand nicht mit Streckmittel verdünnt und nicht gekühlt, da die Färbeeigenschaften von Sperma mit Hoechst 33342 durch Verdünnung mit Streckmitteln verändert werden. Ferner erwies sich bei anderen Studien (vergl. Beispiel 4) die Aufbewahrung von unverdünntem Samen bei Umgebungstemperatur zwischen der Gewinnung und der Fließsortierung gegenüber einer Verdünnung des Samens als überlegen.
Tabelle 16 Ergebnisse des Feldversuchs 7 – gekreuzte Rinderfärsen in Colorado, 1999

^{a, b}Die Mittelwerte ohne gleiche hochgestellte Indices sind unterschiedlich (P < 0,01).

Der Feldversuch 8 (Tabelle 17) betraf Weide-Färsen, denen keine wachstumsfördernden Mittel verabreicht worden waren. Zum Zeitpunkt der Diagnose der Trächtigkeit kam es zu einem Abgang, so dass ein Kalben nicht möglich war. Dieser Versuch zeigt, dass eine wirksame Geschlechtsbestimmung auch in männlicher Richtung vorgenommen werden kann. Die Trächtigkeitsraten betrugen für die 2 Bullen 50 bzw. 61 %.
Tabelle 17 Ergebnisse des Feldversuchs 8 – Angus-Färsen in Nebraska, 1999

^akeine signifikanten Unterschiede

Der Feldversuch 9 (Tabelle 18) war der einzige Versuch, der einen überzeugenden Vorteil einer Inseminationsdosis von 3,0 gegenüber 1,5 × 10⁶ geschlechtsbestimmten, gefrorenen Spermien zeigte. Dieser Vorteil bestand für beide Inseminatoren. Die Trächtigkeitsraten für geschlechtsbestimmtes Sperma von den beiden Bullen betrugen 62 und 75 %.
Tabelle 18 Ergebnisse des Feldversuchs 9 – Red Angus-Färsen in Nebraska, 1999

^a3,0 × 10⁶ geschlechtsbestimmtes Sperma ergab eine höhere Trächtigkeitsrate (80 %) als 1,5 × 10⁶ geschlechtsbestimmtes Sperma (55 %), P < 0,05, 1-teiliges χ².

Die Trächtigkeitsraten im Feldversuch 10 (Tabelle 19) mit geschlechtsbestimmtem, gefrorenem Samen waren ähnlich wie bei den Kontrollen. Die Genauigkeit von geschlechtsbestimmtem Sperma bei diesem Versuch betrug nur 82 %, was sich jedoch nicht signifikant von der angestrebten Genauigkeit von 90 % unterscheidet. Die Trächtigkeitsraten für den geschlechtsbestimmten Samen betrugen 54, 66 und 50 % für die Bullen AN4, AN7 bzw. AN8 (P > 0,1). Bei 18 der inseminierten Färsen bei diesem Versuch handelte es sich um Kälber, die im Feldversuch 1 durch geschlechtsbestimmtes Sperma gezeugt worden waren.
Tabelle 19 Ergebnisse des Feldversuchs 10 – Anqus-Färsen in Wyoming, 1999

^akeine signifikanten Unterschiede

Tabelle 20 Ergebnisse des Feldversuchs 11 – Holstein-Färsen in Colorado, 1999

^akeine signifikanten Unterschiede, χ²
^b16 der 17 (94 %) Föten der Behandlung mit geschlechtsbestimmtem Samen waren weiblich. 2 befanden sich für die Geschlechtsbestimmung mit Ultraschall zu tief im Körperhohlraum.

Die Daten dieses Versuchs wurden mit Daten von Versuchen kombiniert, bei denen die Behandlungen identisch waren, mit der Ausnahme, dass 1 × 10 und 1,5 × 10⁶ Spermadosen vereinigt wurden (Tabelle 21).
Tabelle 21 Meta-Zusammenfassung der Vereinigung von Versuchen mit geschlechtsbestimmtem, gefrorenem Samen und gefrorenen Kontrollen
Die Trächtigkeitsraten mit geschlechtsbestimmtem Sperma betrugen im allgemeinen 70–90 % von nicht geschlechtsbestimmten Kontrollen innerhalb von Experimenten mit 7- bis 20-fach mehr Sperma. Dieser Unterschied war in den neueren Versuchen geringer, was möglicherweise die verbesserten Verfahren zur Geschlechtsbestimmung und Spermabearbeitung widerspiegelt.
Bei einigen Versuchen wurden Färsen auf Trächtigkeit durch Ultraschall 1 und 2 Monate nach der Insemination untersucht. Die Trächtigkeitsverluste in diesem Zeitraum waren für Behandlungen mit geschlechtsbestimmtem Sperma (23/261; 8,8 %) gegenüber einer Behandlung mit Kontrollsperma (9/145; 6,2 %) ähnlich (P > 0,1), was einen Hinweis darauf darstellt, dass die genetische Schädigung aufgrund der Geschlechtsbestimmung minimal ist. Informationen über das Kalben wurden nur von einigen der trächtigen Färsen erhalten, da die meisten Rinder der früheren Versuche verkauft worden waren und die Rinder der späteren Versuche noch nicht gekalbt haben. Die bisher aus geschlechtsbestimmtem Samen erzeugte Kälberpopulation unterscheidet sich offensichtlich nicht von der Kontrollpopulation.
Schlussfolgerungen
Die Geschlechtsanteile bei Rindern können bis zu etwa 90 % für beide Geschlechter verschoben werden, indem man Sperma auf der Basis des DNA-Gehalts mit einem Fließzytometer/Zellsortiergerät sortiert, wonach sich eine Kryokonservierung und eine relativ routinemäßige künstliche Besamung anschließt. Kälber, die durch geschlechtsbestimmtes Sperma erzeugt worden sind, sind offensichtlich normal. Bei diesen Untersuchungen betrugen für die meisten Bullen die Trächtigkeitsraten mit 1,0 bis 1,5 × 10⁶ geschlechtsbestimmtem, gefrorenem Sperma 70 bis 90 % der nicht geschlechtsbestimmten Kontrollen, bei denen herkömmlicherweise 20 oder 40 × 10⁶ gefrorene Spermien inseminiert worden waren. Diese Ergebnisse gelten für gut gehaltene Färsen bei Züchtung durch gut ausgebildete Inseminatoren unter Verwendung von einwandfrei verarbeiteten Samen. Möglicherweise besteht ein geringfügiger Vorteil für eine bilaterale Insemination von geschlechtsbestimmtem Sperma in die Uterushörner, verglichen mit einer üblichen Insemination in den Uteruskörper.
Die vorliegende Erörterung der Erfindung erfolgte notwendigerweise unter Bezugnahme auf spezielle Verfahren und Materialien. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass die Erörterung dieser speziellen Methoden und Materialien in keiner Weise eine Beschränkung des Schutzumfangs der Erfindung darstellt. Vielmehr erstreckt sich der Schutzumfang der Erfindung auf beliebige und sämtliche alternativen Materialien und Verfahren, die zum Erreichen der Ziele der Erfindung geeignet sind.

Claims

Verfahren zur Kryokonservierung von Sperma, umfassend: (a) das Gewinnen einer Spermaprobe; (b) das Zugeben eines anfänglichen Streckmittels und das Auswählen von Sperma durch Fließzytometrie, wobei das Zugeben und das Auswählen in einer beliebigen Reihenfolge vorgenommen werden; (c) das Abkühlen der ausgewählten Spermaprobe; (d) das Isolieren von Sperma aus der ausgewählten kühlen Spermaprobe zur Erzeugung von isoliertem kühlen Sperma; (e) das Zugeben eines abschließenden Streckmittels zum kühlen isolierten Sperma zur Erzeugung einer kühlen Spermasuspension; und (f) das Einfrieren der Spermasuspension.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ausgewählte Spermaprobe einen Teil des in einer Quellenprobe vorhandenen Spermas umfasst, wobei der Teil des Spermas in Bezug auf eine charakteristische Eigenschaft ausgewählt ist und wobei die Spermakonzentration in der ausgewählten Spermaprobe geringer als in der Quellenprobe ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die ausgewählte Spermaprobe ein in Bezug auf das Geschlecht ausgewähltes Sperma umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die ausgewählte Spermaprobe Säugetiersperma umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die ausgewählte Spermaprobe Rindersperma umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die ausgewählte Spermaprobe Pferdesperma umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die ausgewählte Spermaprobe Schweinesperma umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Abkühlen durch Verringerung der Temperatur der ausgewählten Spermaprobe auf etwa 5 °C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Abkühlen innerhalb einer Zeitspanne von etwa 60 Minuten bis etwa 240 Minuten durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das abschließende Streckmittel, das zu der ausgewählten Spermaprobe gegeben wird, neben einem Kryoschutzmittel eine oder mehrere der folgenden Komponenten enthält: eine Komponente, die die Osmolalität aufrechterhält und den pH-Wert puffert, eine organische Substanz, die den Kälteschock verringert und die Fruchtbarkeit des Spermas bewahrt, eine Energiequelle, eine Substanz, die die Spermakapazitation erleichtert, und ein Antibiotikum.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Kryoschutzmittel aus der Gruppe Disaccharide, Trisaccharide und eine beliebige Kombination davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Kryoschutzmittel aus der Gruppe Glycerin, Dimethylsulfoxid, Ethylenglykol, Propylenglykol und eine beliebige Kombination davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Komponente, die die Osmolalität aufrechterhält und den pH-Wert puffert, aus der Gruppe Puffer mit einem Gehalt an einem Salz, Puffer mit einem Gehalt an einem Kohlenhydrat und eine beliebige Kombination davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Komponente, die die Osmolalität aufrechterhält und den pH-Wert puffert, aus der Gruppe Natriumcitrat, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, N-Tris-(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure, Mononatriumglutamat, Milch, mit HEPES gepuffertes Medium und eine beliebige Kombination davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die organische Substanz aus der Gruppe Eidotter, Eidotterextrakt, Milch, Milchextrakt, Casein, Albumin, Lecithin und eine beliebige Kombination davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich bei der Energiequelle um ein Monosaccharid handelt, das aus der Gruppe Glucose, Fructose, Mannose und eine beliebige Kombination davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Antibiotikum aus der Gruppe Tylosin, Gentamicin, Lincomycin, Linco-spectin, Spectinomycin, Penicillin, Streptomycin und eine beliebige Kombination davon ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei nach Zugabe des abschließenden Streckmittels die Spermaprobe bzw. die Spermasuspension Glycerin, Natriumcitrat, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, Eidotter, Fructose und ein oder mehrere Antibiotika umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei nach der Zugabe des abschließenden Streckmittels die Spermaprobe und die Spermasuspension jeweils Glycerin, Natriumcitrat, Eidotter und ein oder mehrere Antibiotika umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei nach der Zugabe des abschließenden Streckmittels die Spermaprobe und die Spermasuspension jeweils Glycerin, Eidotter, Milch, Fructose und ein oder mehrere Antibiotika umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das abschließende Streckmittel einen pH-Wert im Bereich von etwa 6,5 bis 7,5 aufweist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Sperma aus der ausgewählten Spermaprobe durch Zentrifugation isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Zentrifugation eine mindestens etwa 50 %-ige bis etwa 90 %-ige Gewinnung des Spermas ermöglicht.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Spermakonzentration in der Suspension vor dem Einfrieren etwa 1 × 10⁶/ml bis etwa 300 × 10⁶/ml beträgt.
Gefrorene, ausgewählte Spermaprobe, umfassend einen Teil des Spermas, der in einer Probenquelle vorhanden ist, wobei der Teil des Spermas in Bezug auf eine Eigenschaft durch Fließzytometrie ausgewählt worden ist.
Gefrorene, ausgewählte Spermaprobe nach Anspruch 25, wobei die gefrorene ausgewählte Spermaprobe ein in Bezug auf das Geschlecht ausgewähltes Sperma umfasst.
Gefrorene, ausgewählte Spermaprobe nach Anspruch 25 oder 26, wobei die gefrorene ausgewählte Spermaprobe Säugetiersperma umfasst.
Gefrorene, ausgewählte Spermaprobe nach Anspruch 27, wobei die gefrorene ausgewählte Spermaprobe Rindersperma umfasst.
Gefrorene, ausgewählte Spermaprobe nach Anspruch 27, wobei die gefrorene ausgewählte Spermaprobe Pferdesperma umfasst.
Gefrorene, ausgewählte Spermaprobe nach Anspruch 27, wobei die gefrorene ausgewählte Spermaprobe Schweinesperma umfasst.
Gefrorene, ausgewählte Spermaprobe nach einem der Ansprüche 25 bis 30, wobei die gefrorene ausgewählte Spermaprobe durch ein Verfahren hergestellt worden ist, das Folgendes umfasst: (a) das Gewinnen einer Spermaprobe; (b) das Zugeben eines anfänglichen Streckmittels und das Auswählen von Sperma durch Fließzytometrie, wobei das Zugeben und das Auswählen in einer beliebigen Reihenfolge vorgenommen werden; (c) das Abkühlen der ausgewählten Spermaprobe; (d) das Isolieren von Sperma aus der ausgewählten kühlen Spermaprobe zur Erzeugung von isoliertem kühlen Sperma; (e) das Zugeben eines abschließenden Streckmittels zum kühlen isolierten Sperma zur Erzeugung einer kühlen Spermasuspension; und (f) das Einfrieren der Spermasuspension.
Verfahren zur in vitro-Fertilisation, umfassend die Verwendung der gefrorenen ausgewählten Spermaprobe gemäß einem der Ansprüche 25 bis 31.
Verwendung der gefrorenen ausgewählten Spermaprobe nach einem der Ansprüche 25 bis 31 zur Herstellung einer Zubereitung zur künstlichen Insemination.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei es sich bei der künstlichen Insemination um eine künstliche Niedrigdosis-Insemination handelt.