PL211512B1 - Sposób kriokonserwacji plemników z wyłączeniem plemników ludzkich - Google Patents
Sposób kriokonserwacji plemników z wyłączeniem plemników ludzkichInfo
- Publication number
- PL211512B1 PL211512B1 PL355853A PL35585300A PL211512B1 PL 211512 B1 PL211512 B1 PL 211512B1 PL 355853 A PL355853 A PL 355853A PL 35585300 A PL35585300 A PL 35585300A PL 211512 B1 PL211512 B1 PL 211512B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sperm
- sample
- extender
- frozen
- tris
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 115
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims abstract description 26
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 17
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims abstract description 12
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 7
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims abstract description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 135
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 claims description 96
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 82
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 67
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 59
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 59
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 30
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 30
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 claims description 29
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 20
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 20
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 19
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 19
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 19
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 18
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 18
- 229930194936 Tylosin Natural products 0.000 claims description 18
- 239000004182 Tylosin Substances 0.000 claims description 18
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 18
- 229960004059 tylosin Drugs 0.000 claims description 18
- WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N tylosin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)O[C@H]([C@@H]([C@H]1N(C)C)O)O[C@@H]1[C@@H](C)[C@H](O)CC(=O)O[C@@H]([C@H](/C=C(\C)/C=C/C(=O)[C@H](C)C[C@@H]1CC=O)CO[C@H]1[C@@H]([C@H](OC)[C@H](O)[C@@H](C)O1)OC)CC)[C@H]1C[C@@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)O1 WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N 0.000 claims description 18
- 235000019375 tylosin Nutrition 0.000 claims description 18
- ONXOKWFYBIQOFQ-VSXSCALHSA-N ac1l4s0d Chemical compound OS(O)(=O)=O.O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O.O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]1N(C)C[C@H](C(C)C)C1 ONXOKWFYBIQOFQ-VSXSCALHSA-N 0.000 claims description 17
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 17
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 17
- 230000035558 fertility Effects 0.000 claims description 15
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 14
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 14
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 14
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 14
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 13
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 12
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N Lincomycin Natural products CN1CC(CCC)CC1C(=O)NC(C(C)O)C1C(O)C(O)C(O)C(SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229960005287 lincomycin Drugs 0.000 claims description 9
- OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N lincomycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N 0.000 claims description 9
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 claims description 9
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 claims description 9
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 8
- 230000008010 sperm capacitation Effects 0.000 claims description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 6
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 5
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 claims description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 5
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 claims description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 4
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 claims description 4
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 claims description 4
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 claims description 4
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims description 3
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 3
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 claims description 2
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 claims 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 abstract description 46
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 abstract description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 6
- 238000010187 selection method Methods 0.000 abstract description 6
- 241000157302 Bison bison athabascae Species 0.000 abstract 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 83
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 78
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 64
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 58
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 53
- 244000309465 heifer Species 0.000 description 51
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 45
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 39
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 32
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 28
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 28
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 26
- PXGPLTODNUVGFL-BRIYLRKRSA-N (E,Z)-(1R,2R,3R,5S)-7-(3,5-Dihydroxy-2-((3S)-(3-hydroxy-1-octenyl))cyclopentyl)-5-heptenoic acid Chemical compound CCCCC[C@H](O)C=C[C@H]1[C@H](O)C[C@H](O)[C@@H]1CC=CCCCC(O)=O PXGPLTODNUVGFL-BRIYLRKRSA-N 0.000 description 21
- PXGPLTODNUVGFL-UHFFFAOYSA-N prostaglandin F2alpha Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(O)C1CC=CCCCC(O)=O PXGPLTODNUVGFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 20
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 19
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 19
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 19
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 18
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 17
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 16
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 14
- 241000894007 species Species 0.000 description 14
- 244000309466 calf Species 0.000 description 13
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 230000019100 sperm motility Effects 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 10
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 10
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 10
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 10
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 9
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 9
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 9
- UDKABVSQKJNZBH-DWNQPYOZSA-N Melengestrol acetate Chemical compound C1=C(C)C2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC(=C)[C@](OC(=O)C)(C(C)=O)[C@@]1(C)CC2 UDKABVSQKJNZBH-DWNQPYOZSA-N 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 8
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 8
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 8
- JABNPSKWVNCGMX-UHFFFAOYSA-N 2-(4-ethoxyphenyl)-6-[6-(4-methylpiperazin-1-yl)-1h-benzimidazol-2-yl]-1h-benzimidazole;trihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 JABNPSKWVNCGMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 7
- 230000012173 estrus Effects 0.000 description 6
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 6
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 6
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 229960004106 citric acid Drugs 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 5
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 235000020603 homogenised milk Nutrition 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 4
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 4
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- NMJREATYWWNIKX-UHFFFAOYSA-N GnRH Chemical compound C1CCC(C(=O)NCC(N)=O)N1C(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CC=1NC=NC=1)NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 NMJREATYWWNIKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- -1 monosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AENIGFJRMXRROF-UHFFFAOYSA-N 4-amino-1,6-dihydroxy-3-(2-hydroxyethyl)hexane-3-sulfonic acid Chemical compound OCCC(N)C(CCO)(CCO)S(O)(=O)=O AENIGFJRMXRROF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 2
- 241000282979 Alces alces Species 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283726 Bison Species 0.000 description 2
- 239000004322 Butylated hydroxytoluene Substances 0.000 description 2
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N Citric acid monohydrate Chemical compound O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 229940095259 butylated hydroxytoluene Drugs 0.000 description 2
- 235000010354 butylated hydroxytoluene Nutrition 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 229960002303 citric acid monohydrate Drugs 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 244000144980 herd Species 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 2
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 2
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 229960000999 sodium citrate dihydrate Drugs 0.000 description 2
- PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M sodium fluoride Chemical compound [F-].[Na+] PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000009303 sperm storage Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 2
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 1
- DLIIMZHTXKZGHW-UHFFFAOYSA-N 1-amino-3-hydroxy-2-methylpropane-2-sulfonic acid Chemical compound NCC(C)(CO)S(O)(=O)=O DLIIMZHTXKZGHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 206010055690 Foetal death Diseases 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000003990 capacitor Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001152 differential interference contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002019 doping agent Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000000989 food dye Substances 0.000 description 1
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 1
- 231100000722 genetic damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000010150 least significant difference test Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000003137 locomotive effect Effects 0.000 description 1
- 229940090213 lutalyse Drugs 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- OKHAOBQKCCIRLO-IBVJIVQJSA-N melengestrol Chemical compound C1=C(C)C2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC(=C)[C@@](C(=O)C)(O)[C@@]1(C)CC2 OKHAOBQKCCIRLO-IBVJIVQJSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 208000008634 oligospermia Diseases 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 210000003765 sex chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000020509 sex determination Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011775 sodium fluoride Substances 0.000 description 1
- 235000013024 sodium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 229960004659 ticarcillin Drugs 0.000 description 1
- OHKOGUYZJXTSFX-KZFFXBSXSA-N ticarcillin Chemical compound C=1([C@@H](C(O)=O)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)C=CSC=1 OHKOGUYZJXTSFX-KZFFXBSXSA-N 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
- A01N1/12—Chemical aspects of preservation
- A01N1/122—Preservation or perfusion media
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
- A01N1/12—Chemical aspects of preservation
- A01N1/122—Preservation or perfusion media
- A01N1/125—Freeze protecting agents, e.g. cryoprotectants or osmolarity regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
- A01N1/12—Chemical aspects of preservation
- A01N1/122—Preservation or perfusion media
- A01N1/124—Disinfecting agents, e.g. antimicrobials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
- A01N1/12—Chemical aspects of preservation
- A01N1/122—Preservation or perfusion media
- A01N1/126—Physiologically active agents, e.g. antioxidants or nutrients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
- A61D19/00—Instruments or methods for reproduction or fertilisation
- A61D19/02—Instruments or methods for reproduction or fertilisation for artificial insemination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0608—Germ cells
- C12N5/061—Sperm cells, spermatogonia
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
(21) Numer zgłoszenia: 355853 (51) Int.Cl.
(22) Data zgłoszenia: 22.11.2000 A01N 1/02 (2006.01)
Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
22.11.2000, PCT/US00/030155 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
31.05.2001, WO01/37655
Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Sposób kriokonserwacji plemników z wyłączeniem plemników ludzkich (30) Pierwszeństwo:
24.11.1999, US, 60/167,423 05.01.2000, US, 09/478,299 (43) Zgłoszenie ogłoszono:
31.05.2004 BUP 11/04 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.05.2012 WUP 05/12 (73) Uprawniony z patentu:
XY, LLC, Navasota, US (72) Twórca(y) wynalazku:
JOHN SCHENK, Fort Collins, US (74) Pełnomocnik:
rzecz. pat. Janina Kossowska
PL 211 512 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób kriokonserwacji plemników, z wyłączeniem plemników ludzkich.
Wynalazek jest przydatny do konserwacji plemników selekcjonowanych według płci.
Ponad pół wieku temu w Stanach Zjednoczonych wprowadzono sztuczną inseminację jako narzędzie w hodowli komercyjnej różnych gatunków ssaków. Chociaż sztuczna inseminacja była początkowo ograniczona do regionów stosunkowo bliskich miejscu zbiórki nasienia, postępy w kriokonserwacji i przechowywaniu nasienia ułatwiły szeroką dystrybucję i handel nasieniem przeznaczonym do sztucznej inseminacji lub zapłodnienia in vitro.
Dalsze udoskonalenia w zbiórce nasienia ssaków, selekcji, kriokonserwacji, przechowywaniu i metodach manipulowania zwiększyły możliwości hodowców w produkcji zwierząt mających pożądane cechy. Na przykład, postęp w selekcji nasienia ssaków, opartej na nieznacznych różnicach we właściwościach fizycznych, umożliwiły rozdzielenie plemników według płci, to jest, selekcję komórek zawierających albo chromosom X, albo chromosom Y. Ta technika pozwala hodowcy na manipulowanie odpowiednim procentem plemników X lub Y w próbce, a przez to decydowanie o płci potomstwa. Możliwość selekcji plemników według płci lub jakiekolwiek innej pożądanej cechy dostarcza ważnego narzędzia do przyspieszania postępu genetycznego, wzrostu wydajności produkcji i osiągania większej zdolności przystosowawczej w umiejętnym obchodzeniu się z żywym inwentarzem. Pełne wykorzystanie tego narzędzia zależy jednak od możliwości mrożenia i przechowywania selekcjonowanych plemników.
Do selekcji komórek są dopuszczalne różne sposoby; jednak selekcja i dalsza obróbka plemników stanowi wyjątkowe wyzwanie, ponieważ plemniki nie są zdolne do naprawy DNA oraz ze względu na morfologię plemnika. Każdy plemnik ma pokrywający główkę akrosom i witkę, które są ważne dla płodności i stosunkowo łatwo ulegają uszkodzeniu. Ponadto zdolność plemników do zapłodnienia maleje z czasem upływającym między zbiórką a zastosowaniem. Ponieważ większość dostępnych sposobów selekcji wiąże się z fizycznymi stresami i jest czasochłonnych, wyselekcjonowane plemniki są zwykle do pewnego stopnia upośledzone w porównaniu z komórkami nie selekcjonowanymi. Zdolność do zapłodnienia może ulec dalszemu zmniejszeniu, jeżeli technika selekcji wiąże się ze znacznym rozrzedzeniem. Sugerowano, że ten „efekt rozrzedzenia” może być spowodowany utratą składników ochronnych w plazmie nasienia.
Cytometria przepływowa jest szczególnie efektywnym sposobem selekcji, którym można posłużyć się do sortowania plemników według płci. Jednak sortowane plemniki są poddane dodatkowym stresom poza tymi, które normalnie spotyka się w protokołach standardowej sztucznej inseminacji i zapłodnienia in vitro. W szczególności, cytometria przepływowa jest czasochłonna i ze względu na fizyczne ograniczenia cytometrów przepływowych, plemniki do sortowania muszą być rozrzedzane do 56 poziomów, które nie są optymalne do przechowywania (zwykle rzędu 105-106/ml). Ponadto, sortowane plemniki przeznaczone do sztucznej inseminacji muszą być zagęszczone tak, aby można było zastosować konwencjonalne pakowanie i sprzęt dostarczający. Potrzeba etapu zagęszczania wystawia zatem już do pewnego stopnia upośledzone plemniki na dodatkowe stresy fizyczne.
Mrożenie plemników również niezmiennie zmniejsza ich zdolność do zapłodnienia, ich ruchliwość i/lub żywotność i chociaż sposoby mrożenia nie selekcjonowanych plemników są dobrze znane, nie opisano techniki do kriokonserwowania selekcjonowanych plemników.
W opisie patentowym USA nr 4 474 875 opisano sposób rozdzielania plemników w ciekłym ośrodku rozdzielającym z jednolitym gradientem gęstości, dzięki któremu siły wyporu miały tendencję do oddzielania plemników niosących chromosom X od plemników niosących chromosom Y w kolumnie z gradientem gęstości. Plemniki można pobrać z kolumny z populacji na górze i na dole z różnymi charakterystykami płci. Jak ujawniono w tym opisie patentowym zamrażanie prowadzi się w zhomogenizowanym mleku ze stopniowym zwiększaniem zawartości glicerolu.
Publikacja WO 99/33956 dotyczy sposobu sztucznej inseminacji ssaków niską dawką seksowanych plemników. Plemniki do takiej inseminacji przygotowuje się przez sortowanie ich według płci i wprowadzenie seksowanych plemników do macicy samicy w ilości mniejszej niż w typowym sztucznym zapłodnieniu. Zapłodnienie zwykle przeprowadza się w ciągu około 29 godzin po sortowaniu plemników. Sposób ten nie obejmuje zatem etapu mrożenia sortowanych plemników ani dodawania do nich rozcieńczalników.
PL 211 512 B1
W cytowanej publikacji WO ujawniono ponadto ulepszony układ do cytometrii przepływowej, który pozwala na poprawienie żywotności plemników sortowanych z jego użyciem oraz sposób sortowania plemników.
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu konserwowania plemników przy zastosowaniu niskich temperatur. Sposób ten jest szczególnie przydatny w kriokonserwacji plemników, ponieważ obejmuje izolowanie plemników z próbki selekcjonowanych plemników, następnie dodanie końcowego rozcieńczalnika do wyizolowanych plemników w celu wytworzenia zawiesiny mającej żądane stężenie plemników.
Według wynalazku sposób kriokonserwacji plemników z wyłączeniem plemników ludzkich obejmuje:
(a) otrzymywanie próbki plemników z wyłączeniem plemników ludzkich;
(b) dodawanie do próbki plemników początkowego rozcieńczalnika obejmującego fizjologiczne dopuszczalny nośnik i jeden lub więcej z następujących składników:
i) składnik, który utrzymuje osmolalność i buforuje pH;
ii) substancję organiczną, która zmniejsza udar chłodowy i zabezpiecza płodność plemników;
iii) źródło energii, iv) substancję, która ułatwia kapacytację plemników; i
v) antybiotyk, selekcjonowanie plemników metodą cytometrii przepływowej, z wytworzeniem próbki selekcjonowanych plemników, przy czym plemniki są selekcjonowane według płci, a etapy dodawania i selekcjonowania przeprowadza się w dowolnej kolejności;
(c) ochłodzenie próbki selekcjonowanych plemników do temperatury 22°C do 5°C przez okres 60 do 240 minut;
(d) izolowanie plemników ze schłodzonej próbki selekcjonowanych plemników z uzyskaniem schłodzonych izolowanych plemników;
(e) dodawanie końcowego rozcieńczalnika obejmującego oprócz fizjologicznie dopuszczalnego nośnika i krioprotektanta jeden lub więcej z następujących składników:
i) składnik, który utrzymuje osmolalność i buforuje pH;
ii) substancję organiczną, która zmniejsza udar chłodowy i zabezpiecza płodność plemników;
iii) źródło energii, iv) substancję, która ułatwia kapacytację plemników; i
v) antybiotyk, do schłodzonych, izolowanych plemników z wytwarzaniem schłodzonej zawiesiny plemników o stężeniu komórek plemników od 1 miliona na mililitr rozcieńczalnika do 300 milionów na mililitr rozcieńczalnika; i (f) mrożenie schłodzonej zawiesiny plemników w temperaturze od 5°C do -100°C.
Korzystnie, w tym sposobie jako próbkę selekcjonowanych plemników stosuje się nasienie ssaka, korzystnie wołu, konia lub świni.
Korzystnie, krioprotektant stosowany w etapie e) sposobu jest wybrany z grupy składającej się z dicukrów, tricukrów i dowolnej ich kombinacji lub glicerolu, dimetylosulfotlenku, glikolu etylenowego, glikolu propylenowego i dowolnej ich kombinacji.
Korzystnie, składnik utrzymujący osmolalność i buforujący pH jest wybrany z grupy składającej się z buforu, którym jest sól, buforu zawierającego węglowodan i dowolnej ich kombinacji lub jest wybrany z grupy składającej się z cytrynianu sodu, Tris[hydroksymetylo]aminometanu, kwasu N-Tris[hydroksymetylo]metylo-2-aminoetanosulfonowego, glutaminianu sodu, mleka, podłoża buforowanego HEPES i dowolnej ich kombinacji.
Korzystnie, substancja organiczna jest wybrana z grupy składającej się z żółtka jaja, ekstraktu z żółtka jaja, mleka, ekstraktu z mleka, kazeiny, albuminy, lecytyny i dowolnej ich kombinacji.
Korzystnie, źródłem energii jest monosacharyd wybrany z grupy składającej się z glukozy, fruktozy, mannozy i dowolnej ich kombinacji.
Korzystnie, antybiotyk jest wybrany z grupy składającej się z tylozyny, gentamycyny, linkomycyny, linkospektyny, spektynomycyny, penicyliny, streptomycyny i dowolnej ich kombinacji.
Korzystnie, w sposobie po dodaniu końcowego rozcieńczalnika próbka plemników i zawiesina plemników obejmuje odpowiednio glicerol, cytrynian sodu, Tris[hydroksymetylo]aminometan, żółtko jaja, fruktozę i jeden lub więcej antybiotyków.
PL 211 512 B1
Korzystnie, po dodaniu końcowego rozcieńczalnika próbka plemników i zawiesina plemników, każda, obejmuje glicerol, cytrynian sodu, żółtko jaja i jeden lub więcej antybiotyków.
Korzystnie, rozcieńczalnik ma pH w zakresie 6,5 do 7,5.
Korzystnie, plemniki są izolowane z próbki selekcjonowanych plemników przez wirowanie, które korzystnie umożliwia co najmniej 50% do 90% odzysk plemników.
Wynalazek umożliwia kriokonserwację selekcjonowanych według płci plemników, ułatwiającą przechowywanie i/lub ekspedycję próbek selekcjonowanych plemników do miejsc odległych od miejsca zbiórki. Po rozmrożeniu uzyskuje się żywotne plemniki, które można zastosować w procedurach, takich jak sztuczna inseminacja („Al”) i zapłodnienie in vitro („IVF”). Wynik ten był nieoczekiwany z uwagi na dobrze udokumentowaną delikatność plemników. Wcześniej badacze wykazali, że stresy towarzyszące różnym sposobom selekcji lub kriokonserwacji powodowały znaczną utratę płodności i/lub żywotności. Twórcy niniejszego wynalazku wykazali po raz pierwszy, że można osiągnąć ciąże stosując selekcjonowane, a następnie zamrożone plemniki.
Wynalazek stanowi istotny postęp w hodowaniu żywego inwentarza, gdzie selekcjonowanie nasienia do stosowania w takich procedurach może być zastosowane do zwiększenia produkcji potomstwa mającego pożądane cechy. Na przykład, selekcjonowanie w celu otrzymania plemników zawierających albo chromosom X albo Y, umożliwia kontrolowanie płci potomstwa, co jest korzystne dla hodowców zwierząt, takich jak bydło mleczne lub bydło mięsne. Selekcjonowanie według płci znajduje również zastosowanie w hodowli zwierząt wartościowych (np. koni wystawowych lub wyścigowych) lub zwierząt zagrożonych wymarciem. Mrożenie selekcjonowanych plemników, które umożliwia niniejszy wynalazek, pozwoli na szerokie zastosowanie takich sposobów selekcji w celu np. zwiększania wydajności hodowli żywego inwentarza, jak również jakości.
Stosowane tu określenie „akrosom” lub „akrosomalna czapeczka” odnosi się do czapeczki, która pokrywa przednią połowę główki plemnika i która zawiera enzymy niezbędne do penetracji komórki jajowej.
Określenie „według płci” odnosi się do rodzaju chromosomu płciowego obecnego w plemniku (tj. chromosomu X lub Y).
Określenie „kapacytacja” odnosi się do specyficznych zmian zachodzących w plemniku, mających na celu rozwinięcie zdolności do zapłodnienia komórki jajowej, takich jak zmiany enzymatyczne na powierzchni akrosomu, które prowadzą do uwalniania enzymów akrosomalnych ułatwiających penetrację plemnika do komórki jajowej.
Stosowane w odniesieniu do plemnika określenie „krioprotektant” odnosi się do cząsteczki, która chroni plemnik podczas cyklu mrożenia-rozmrażania, sprzyjając przeżyciu i zachowaniu zdolności do zapłodnienia.
Określenie „efekt rozrzedzenia” odnosi się do szybkiego spadku ruchliwości i/lub żywotności plemników w warunkach wysokiego rozrzedzenia.
Stosowane tu określenie „selekcjonowanie” odnosi się do sposobu, jakim próbka jest podzielona w oparciu o obecność lub brak specyficznej właściwości. Zatem „próbka selekcjonowanych plemników” jest próbką otrzymaną przez poddanie próbki źródłowej selekcjonowaniu ze względu na specyficzną właściwość. Próbka selekcjonowanych plemników jest zatem wzbogacona, w stosunku do próbki źródłowej, w plemniki mające specyficzną właściwość.
Określenie „sortowanie” jest tu stosowane do opisania sposobu selekcji przeprowadzanego z zastosowaniem fluorescencyjnie aktywowanego sortera komórek (FACS).
Określenie „rozcieńczalnik” odnosi się do jakiegokolwiek ośrodka, który przyczynia się do konserwowania żywotności plemników.
Określenie „rozrzedzenie” odnosi się do rozrzedzenia plemników rozcieńczalnikiem.
Określenie „początkowy rozcieńczalnik” odnosi się do ośrodka stosowanego do rozrzedzenia plemników przed etapem izolowania w sposobie według wynalazku.
Określenie „końcowy rozcieńczalnik” odnosi się do ośrodka stosowanego do rozrzedzenia plemników przed etapem mrożenia w sposobie według wynalazku.
„Substancja organiczna” w opisanym tu rozcieńczalniku jest jakąkolwiek substancją organiczną, która przyczynia się do zmniejszenia udaru chłodowego i konserwuje płodność plemników.
„Źródłem energii” w opisanym tu rozcieńczalniku jest jakakolwiek substancja organiczna lub substrat, który może być wykorzystywany przez plemnik do utrzymania procesów komórkowych i/lub ruchliwości.
PL 211 512 B1
Stosowane tu określenie „osmolalność” jest miarą ciśnienia osmotycznego cząstek rozpuszczonej substancji w roztworze wodnym (np. rozcieńczalniku). Cząstki rozpuszczonej substancji obejmują zarówno jony, jak i cząsteczki niezjonizowane. Osmolalność jest wyrażona jako stężenie osmotycznie aktywnych cząstek (tj. osmoli) rozpuszczonych w 1 kg wody.
Otrzymywanie próbki selekcjonowanych plemników
Zgodnie ze sposobem według wynalazku mogą być selekcjonowane i mrożone plemniki jakiegokolwiek gatunku. Sposób można przeprowadzić z plemnikami zwierząt domowych, szczególnie żywego inwentarza, jak również z plemnikami dzikich zwierząt (np. gatunków zagrożonych).
Korzystnie, próbka selekcjonowanych plemników zawiera plemniki ssaków. Szczególnie korzystne są plemniki bydlęce, końskie, świńskie, owcze, łosia i bizona.
Ejakulat, z którego otrzymuje się plemniki ma zwykle co najmniej około 50%, a korzystnie co najmniej około 75% plemników o prawidłowej morfologii. W tych wykonaniach na ogół co najmniej około 40%, a korzystnie co najmniej około 60% plemników w ejakulacie wykazuje ruchliwość postępową.
Cytometria przepływowa, którą stosuje się do selekcjonowania plemników w sposobie według wynalazku, jest korzystnym sposobem oddzielania komórek z mieszanych populacji w oparciu o barwienie różnicowe barwnikami fluorescencyjnymi lub wiązanie ze znakowanymi fluorescencyjnie cząsteczkami, takimi jak przeciwciała lub kwasy nukleinowe. We fluorescencyjnie aktywowanym sortowaniu komórek („FACS”) komórki są „sortowane” do różnych populacji w oparciu o fluorescencyjną intensywność po napromienieniu. FACS można stosować do selekcjonowania plemników według płci, ponieważ chromosom X zawiera nieznacznie więcej DNA niż chromosom Y. Gdy plemniki są barwione fluorescencyjnym barwnikiem wiążącym DNA, plemnik niosący chromosom X absorbuje więcej barwnika niż plemnik niosący chromosom Y, a zatem te dwie populacje mogą być rozdzielane za pomocą FACS. Strategię tę omówiono w opisie patentowym US nr 4 362 246 i znacznie rozwinięto w opisie patentowym US nr 5 135 759 (wydanym Johnsonowi). Rozdzielanie wspomagano przez stosowanie ®, cytometrów przepływowych o wysokiej szybkości przepływu, takich jak cytometr przepływowy MoFlo®, produkowany przez Cytomation, Inc. (Ft Collins, CO) i opisany w opisach patentowych US nr nr 5 150 313, 5 602 039, 5 602 349 i 5 643 796, jak również w publikacji PCT nr WO 96/12171.
Sposób selekcjonowania stosowany do otrzymywania próbki selekcjonowanych plemników jest korzystnie sposobem, w którym zachowana jest żywotność plemników. Z powodu nietrwałości plemników zwykłe metody cytometrii przepływowych powinny być na ogół modyfikowane, gdy są stosowane do sortowania plemników. Bardziej konkretnie, cytometria przepływowa wymaga barwienia, rozcieńczania i poddawania komórek działaniu światła. Wszystkie te etapy stanowią stresy, które mogą zmniejszać żywotność plemników. Wrażliwość plemników na te stresy może różnić się między gatunkami, a nawet między osobnikami jednego gatunku. Takie wrażliwości albo są udokumentowane, albo można je z łatwością określić przez badania empiryczne, takie jak te opisane w przykładach 1-5.
Modyfikacje, które zwiększają żywotność, opisano w publikacjach patentowych omawianych powyżej. Na przykład, procedury dostarczające lepszą osłonę i układy kolektora dla sortowanych plemników ujawniono w publikacji PCT nr WO 99/33956 (zgłoszenie nr PCT/US98/27909). Dalej, w przykładach 1-7 poniżej opisano przykładowe procedury barwienia i sortowania plemników. W przykładzie 3 opisano badanie wpływu natężenia lasera i stężenia barwnika na ruchliwość sortowanych, mrożonych plemników po rozmrożeniu. Badanie to wskazuje, że stosowanie niższych natężeń lasera podczas sortowania może zwiększać ruchliwość po rozmrożeniu.
Próbka selekcjonowanych plemników może zawierać oprócz plemników różne składniki i będzie często zawierać składniki dodane w celu ochrony plemników podczas procesu selekcjonowania. W przypadku FACS próbka selekcjonowanych plemników może zawierać składnik(i) roztworów stosowanych do barwienia i sortowania (np. płyn osłaniający i bufor wychwytujący).
Ponadto, próbka selekcjonowanych plemników zawiera zwykle rozcieńczalnik lub frakcję rozcieńczalnika. Na przykład dobrze znane są „dwuetapowe” rozcieńczalniki, obejmujące „frakcję A” nie zawierającą glicerolu i „frakcję B” zawierającą glicerol. Jako pierwszą dodaje się do plemników frakcję A, następnie dodaje się równą objętość frakcji B. Na tym etapie frakcję B często rozdziela się na co najmniej dwie równe objętości i dodaje kolejno, np. drugą objętość frakcji B dodaje się 15 minut po pierwszej.
Jeżeli składniki rozcieńczalnika są nieobecne, rozcieńczalnik lub frakcję rozcieńczalnika dodaje się zwykle do próbki selekcjonowanych plemników przed wyizolowaniem plemników z próbki. Jeśli tylko pewne składniki rozcieńczalnika są obecne, mogą być dodane ewentualnie dodatkowe składniki tak, że próbka selekcjonowanych plemników obejmuje kompletny rozcieńczalnik lub frakcję rozcień6
PL 211 512 B1 czalnika przed etapem izolowania. W przykładowych wykonaniach, plemniki bydlęce są sortowane przepływowo tak, żeby wytworzyć próbkę selekcjonowanych plemników obejmującej frakcję A rozcieńczalnika (patrz przykłady 2, 3 i 4). W razie potrzeby można następnie do próbki selekcjonowanych plemników dodać frakcję B przed etapem izolowania (patrz przykład 5). Rozcieńczalnik (lub frakcja rozcieńczalnika) sprzed etapu izolowania jest określany jako „rozcieńczalnik początkowy” w celu odróżnienia od „rozcieńczalnika końcowego” stosowanego do rozrzedzania izolowanych plemników przed zamrożeniem. Jeśli próbka selekcjonowanych plemników była selekcjonowana metodą FACS, początkowy rozcieńczalnik można dopasować do płynu osłaniającego stosowanego do sortowania. Przykładowe dopasowane płyny osłaniające i rozcieńczalniki opisano szczegółowo w przykładzie 4.
Rozcieńczalnik odpowiedni do zastosowania w próbce selekcjonowanych plemników zawiera fizjologicznie dopuszczalny nośnik. Fizjologicznie dopuszczalny nośnik jest zwykle wodny, a w korzystnych wykonaniach obejmuje dejonizowaną wodę. Odpowiednie rozcieńczalniki zwykle obejmują jeden lub więcej z następujących składników dodatkowych: krioprotektant, składnik utrzymujący osmolalność i buforujący pH, substancję organiczną zapobiegającą udarowi chłodowemu i zabezpieczającą zdolność nasienia do zapłodnienia, źródło energii, które może być łatwo wykorzystane przez plemniki, substancja ułatwiająca kapacytację plemników i jeden lub więcej antybiotyków.
Chociaż krioprotektanty przydatne w sposobie według wynalazku nie są ograniczone do tych działających przez konkretny mechanizm, to większość konwencjonalnych czynników krioprotekcyjnych działa, co najmniej częściowo, przez zmniejszanie wewnątrzkomórkowej utraty wody. Konkretnie, z zamrażaniem wiąże się wzrost stężenia rozpuszczonej substancji w ośrodku otaczającym plemniki. Ten wzrost stężenia rozpuszczonej substancji wyciąga wodę z komórek na zewnątrz, co zwiększa wewnątrzkomórkowe stężenie elektrolitów. Przykładowe krioprotektanty obejmują glicerol, dimetylosulfotlenek, glikol etylenowy, glikol propylenowy i tym podobne. Krioprotektant odpowiedni do zastosowania w danym rozcieńczalniku może różnić się zależnie od gatunków, od których pochodzą plemniki. Na przykład, glicerol jest odpowiedni do zastosowania w kriokonserwacji plemników bydlęcych, ale generalnie nie stosuje się go do kriokonserwacji plemników świńskich lub króliczych. Takie preferencje są dobrze znane dla plemników wartościowych komercyjnie i mogą być łatwo określone empirycznie dla innych rodzajów plemników.
Rozcieńczalnik użyteczny w sposobie według wynalazku obejmuje ewentualnie jeden lub więcej składników, które pomagają w utrzymaniu osmolalności i zapewniają zdolność buforową. W korzystnych wykonaniach wynalazku osmolalność rozcieńczalnika jest zbliżona do osmolalności płynów fizjologicznych. Korzystniej, osmolalność rozcieńczalnika jest w zakresie około 280 mOsm do około 320 mOsm. Korzystnie, pH jest również w fizjologicznie dopuszczalnym zakresie, bardziej korzystnie w zakresie około 6,5 do około 7,5.
Substancje pomocne w utrzymaniu osmolalności i pH w tych zakresach są dobrze znane w dziedzinie i mogą być dodane do rozcieńczalnika jako ciało stałe lub już w roztworze. W tym celu można zastosować bufor zawierający sól, węglowodan lub ich kombinację. Konkretne przykłady buforów obejmują cytrynian sodu, Tris[hydroksymetylo]aminometan i TES (kwas N-Tris[hydroksymetylo]metylo-2-aminoetanosulfonowy) i glutaminian sodu; mleko; ośrodek buforowany HEPES; i jakąkolwiek ich kombinację. Składnik pomocny w utrzymywaniu osmolalności i zapewniający pojemność buforową w konkretnym zastosowaniu może różnić się w zależności od innych składników rozcieńczalnika, a w pewnych przypadkach od gatunku, od którego pochodzą plemniki. Jednak wybór takiego składnika do zastosowania w sposobie według wynalazku leży w zakresie umiejętności specjalisty w dziedzinie.
W rozcieńczalniku może być również zawarta jedna lub więcej substancji organicznych, chroniących przed udarem chłodowym i pozwalających zachować zdolność nasienia do zapłodnienia. Takie substancje są dobrze znane i czasami opisywane jako „nie penetrujące krioprotektanty”. Specjalista w dziedzinie może bez trudu określić substancję organiczną odpowiednią dla konkretnego zastosowania opisanego tu sposobu kriokonserwacji. Na przykład, w rozcieńczalniku mogą być zawarte substancje organiczne, obejmujące składniki ochronne, (np. lipoproteiny, fosfolipidy, lecytynę), które, jak uważa się, zmniejszają wpływ udaru chłodowego i efekt rozrzedzenia. Odpowiednie substancje organiczne obejmują dicukry, tricukry i jakąkolwiek ich kombinację. Substancje organiczne, przykładowo, obejmują żółtko jaja, wyciąg z żółtka jaja, mleko, wyciąg z mleka, kazeinę, albuminę, lecytynę, cholesterol i jakąkolwiek ich kombinację.
Rozcieńczalnik może również zawierać detergent. Doniesiono o synergistycznym działaniu alkilowych detergentów jonowych, takich jak dodecylosiarczan sodu (SDS) z żółtkiem jaja w zwiększaniu
PL 211 512 B1 ochrony przed udarem chłodowym. W rozcieńczalniku mogą być zastosowane również inne detergenty przydatne w kriokonserwacji komórek, a wybór konkretnego detergentu dla konkretnego zastosowania w świetle dostarczonych tu informacji jest w zakresie umiejętności specjalisty w dziedzinie, patrz np. przykład 5.
Korzystnie, rozcieńczalnik zawiera źródło energii, które jest łatwe do wykorzystania przez plemniki. Przy braku źródła energii plemniki mogą utleniać wewnątrzkomórkowe fosfolipidy i inne składniki komórkowe. Zatem obecność źródła energii w rozcieńczalniku chroni wewnątrzkomórkowe rezerwy i komórkowe składniki. Jak dobrze wiadomo w dziedzinie, cukry, szczególnie monosacharydy, dostarczają dogodnego źródła energii, chociaż w rozcieńczalniku może być zastosowane jakiekolwiek konwencjonalne źródło energii. Przykładowe monosacharydy użyteczne w rozcieńczalniku obejmują glukozę, fruktozę i/lub mannozę.
W rozcieńczalniku może być ewentualnie zawarty jeden lub więcej przeciwutleniaczy w celu dostarczenia dodatkowej ochrony przed udarem chłodowym. Przykładowe przeciwutleniacze obejmują butylowany hydroksytoluen (BHT), jego pochodne i tym podobne. Jednak w rozcieńczalniku mogą być zastosowane inne przeciwutleniacze przydatne w kriokonserwacji komórek, a wybór konkretnego przeciwutleniacza dla konkretnego zastosowania jest w zakresie umiejętności specjalisty w dziedzinie w świetle dostarczonych tu informacji.
Rozcieńczalnik może zawierać również substancję ułatwiającą kapacytację plemników. Różne czynniki ułatwiające kapacytację są znane w dziedzinie i mogą być wykorzystywane w rozcieńczalniku. Przykłady obejmują enzymy, takie jak alfa-amylaza, beta-amylaza, beta-glukuronidaza, które w razie potrzeby mogą być zastosowane w kombinacji.
Wreszcie, rozcieńczalnik korzystnie zawiera antybiotyk, ponieważ znaczny wzrost bakteryjny może zagrażać żywotności plemników i zwiększać ryzyko infekcji gospodarza podczas sztucznej inseminacji lub procedur zapłodnienia in vitro. W rozcieńczalniku również mogą być wykorzystywane różne antybiotyki przydatne w kriokonserwacji komórek. Wybór odpowiedniego antybiotyku zależy od gatunków, z których otrzymano plemniki, od procedur związanych z otrzymywaniem i manipulacją próbką plemników i od konkretnego mikroorganizmu (mikroorganizmów). Przykładowe antybiotyki obejmują tylozynę, gentamycynę, linkomycynę, spektynomycynę, linkospektynę (kombinacja linkomycyny i spektynomycyny), penicylinę, streptomycynę i tikarcylinę, które można stosować same lub w kombinacji. Jednak specjalista w dziedzinie może łatwo określić inne antybiotyki odpowiednie do zastosowania w rozcieńczalniku.
Przykładowe rozcieńczalniki omówiono bardziej szczegółowo poniżej i w przykładach.
Stężenie plemników jest zwykle niższe w selekcjonowanej próbce plemników niż w próbce źródłowej i jak wskazywano powyżej, gdy stosuje się FACS, rozrzedzenie jest znaczące. Przez zwykłe 5 sortowanie według płci można wytworzyć próbkę zawierającą plemniki w ilości 6 x 105 komórek/ml buforu wychwytującego. Ponieważ tak niskie stężenie nie jest optymalne dla przechowywania (przynajmniej dla większości badanych gatunków), w sposobie kriokonserwacji według wynalazku na ogół zagęszcza się próbkę selekcjonowanych plemników.
Chłodzenie próbki selekcjonowanych plemników
Trzeci etap sposobu kriokonserwacji wymaga chłodzenia próbki selekcjonowanych plemników, zwykle przez zmniejszanie temperatury z kontrolowaną szybkością. Zbyt szybkie chłodzenie może wywołać udar chłodowy, który może być przyczyną utraty integralności błony komórkowej i funkcji komórki. Intensywność działań wywołanych udarem chłodowym różni się u różnych gatunków i zależy od czynników, takich jak szybkość chłodzenia i zakres temperatury. W warunkach odpowiedniego kontrolowanego chłodzenia, plemniki są zdolne do adaptacji do czynników termicznych. W przykładzie 2 między innymi opisano warunki chłodzenia plemników bydlęcych, a określenie odpowiednich warunków chłodzenia plemników innych gatunków jest w zakresie umiejętności specjalistów w dziedzinie.
W korzystnym wykonaniu wynalazku próbka selekcjonowanych plemników jest schładzana do temperatury od 22°C do 5°C i ochładzanie jest prowadzone przez okres 60 minut do 24 godzin, korzystnie przez okres około 90 minut do 240 minut i korzystniej przez okres około 90 minut do około 120 minut. Chłodzenie można przeprowadzić jakimkolwiek dogodnym sposobem, obejmującym zwykłe umieszczenie próbki selekcjonowanych plemników w otoczeniu o temperaturze 5°C.
Izolacja komórek plemników z próbki selekcjonowanych plemników
Po początkowym rozcieńczeniu próbki selekcjonowanych plemników, plemniki izolowano z próbki stosując dowolny wystarczająco delikatny sposób izolacji, dostarczający przynajmniej około 50% odzysku plemników, korzystniej około 75% do około 90% odzysku plemników i najkorzystniej
PL 211 512 B1 około 80% do około 90% odzysku plemników. Podczas etapu izolacji schłodzone plemniki powinno być generalnie przetrzymywane w chłodzie, tj. między około 1 a około 8°C i korzystnie blisko 4 lub 5°C.
Do izolowania plemników może być stosowany dowolny z różnorodnych sposobów, odpowiedni do odzyskiwania komórek z zawiesiny, w tym, na przykład, filtracja, sedymentacja i wirowanie. W przykładowym korzystnym wykonaniu próbkę selekcjonowanych plemników rozdziela się do 50 ml probówek w równych objętościach nie przekraczających około 27 ml, a korzystnie około 20-27 ml. Wirowanie prowadzi się w około 4°C przy około 850 x g przez 20 minut. Korzystnie, etap wirowania daje przynajmniej około 50% do około 90% odzysku plemników, korzystniej około 60% do około 90% odzysku plemników i najkorzystniej około 70% do około 90% odzysku plemników. Po izolacji supernatant usuwa się, a osad zawiesza się delikatnie worteksując lub powtarzając aspirację przy 4°C. Wtedy zwykle określa się stężenie plemników (np. z zastosowaniem hemacytometru).
Końcowe rozcieńczanie izolowanych komórek plemników
Po izolacji plemniki zbiera się i, o ile to konieczne, rozrzedza się końcowym rozcieńczalnikiem do odpowiedniego dla zamrażania stężenia. Korzystnie, stężenie plemników po końcowym rozrzedzeniu a przed zamrożeniem jest w zakresie od około 1 x 106/ml do około 300 x 106/ml, korzystniej od około 10 x 106/ml do około 50 x 106/ml i najkorzystniej od około 10 x 106/ml do około 20 x 106/ml.
Zamieszczony powyżej opis początkowego rozcieńczalnika stosuje się również do końcowego rozcieńczalnika, który może być taki sam lub różny od początkowego rozcieńczalnika. W konkretnych wykonaniach skład próbki plemników rozrzedzonych końcowym rozcieńczalnikiem jest zasadniczo podobny (jeśli nie taki sam) do składu próbki plemników po dodaniu początkowego rozcieńczalnika.
W korzystnym wykonaniu wynalazku stosuje się jako rozcieńczalnik żółtko jaja-Tris. Po dodaniu rozcieńczalnika zawiesina plemników obejmuje glicerol (krioprotektant); kwas cytrynowy i Tris[hydroksylmetylo]aminometan (bufor); żółtko jaja (substancja organiczna); fruktozę (źródło energii); tylozynę, gentamycynę i linkospektynę (antybiotyki). Typowe przybliżone stężenia tych składników po dodaniu końcowego rozcieńczalnika do izolowanych plemników wynoszą;
Składniki rozcieńczalnika żółtko jaja-Tris
Glicerol: 4-8% obj./obj.
Kwas cytrynowy: 55-75 mM
Tris[hydroksymetylo]aminometan: 190-210 mM
Żółtko jaja: 5-25% obj./obj.
Fruktoza: 45-65 mM
Tylozyna: 25-100 μg/ml
Gentamycyna: 200-300 μg/ml
Linkospektyna: 100-400 μg/ml* *100-400 μg/ml linkomycyny i 100-400 μg/ml spektynomycyny
W odmianie tego wykonania szczególnie odpowiedniego dla zamrażania plemników bydlęcych, stężenia tych składników po dodaniu końcowego rozcieńczalnika do izolowanych plemników wynoszą około 6% (obj./obj.) glicerolu, około 65 mM kwasu cytrynowego, około 200 mM Tris[hydroksymetylo]aminometanu, około 20% (obj./obj.) żółtka jaja, około 56 mM fruktozy, około 50 μg/ml tylozyny, około 250 μg/ml gentamycyny i około 150/300 μg/ml linkospektyny (tj. 150 μg/ml linkomycyny i 300 μg/ml spektynomycyny) w dejonizowanej wodzie.
W alternatywnym wykonaniu zastosowano rozcieńczalnik żółtko jaja-cytrynian. Po dodaniu rozcieńczalnika zawiesina plemników obejmowała glicerol (krioprotektant), cytrynian sodu (bufor), żółtko jaja (substancja organiczna), tylozynę, gentamycynę i linkospektynę (antybiotyki). Typowe przybliżone stężenia tych składników po dodaniu końcowego rozcieńczalnika do izolowanych plemników wynoszą:
Składniki rozcieńczalnika żółtko jaja-cytrynian
Glicerol: 4-8% obj./obj.
Cytrynian sodu: 60-80 mM
Żółtko jaja: 5-25% obj./obj.
Tylozyna: 25-100 μg/ml
Gentamycyna: 200-3 00 μg/ml
Linkospektyna: 100-400 μg/ml* *100-400 μg/ml linkomycyny i 100-400 μg/ml spektynomycyny
PL 211 512 B1
3-7% obj./obj. 140-170 mM 60-80 mM 5-25% obj./obj. 5-12 mM 50-150 μg/ml 400-600 μg/ml 200-700 μg/μl*
Przykładowo, korzystne stężenia dla zamrażania plemników bydlęcych wynoszą około 7% (obj./obj.)glicerolu, około 72 mM cytrynianu sodu, około 20% (obj./obj.) żółtka jaja, około 50 μg/ml tylozyny, około 250 μg/ml gentamycyny i około 250/300 μg/ml linkospektyny.
W innym, alternatywnym wykonaniu zastosowano rozcieńczalnik żółtko jaja-TES-Tris („EY TEST”). Po dodaniu rozcieńczalnika zawiesina plemników obejmowała glicerol (krioprotektant), żółtko jaja i grzane mleko, np. mleko homogenizowane zawierające 1,25% fruktozy z 10% glicerolu (substancje organiczne); tylozynę, gentamycynę i linkospektynę (antybiotyki). Typowe przybliżone stężenia tych składników po dodaniu końcowego rozcieńczalnika do izolowanych plemników wynoszą:
Składniki rozcieńczalnika żółtko jaja-TES-Tris
Glicerol:
Kwas Tris[hydroksymetylometylo]-2-aminoetanosulfonowy:
Tris [hydroksymetylo]aminometan:
Żółtko jaja:
Fruktoza:
Tylozyna:
Gentamycyna:
Linkospektyna:
*200-700 μg/ml linkomycyny i 200-700 μg/ml spektynomycyny
Przykładowo, korzystne stężenia dla zamrażania plemników bydlęcych wynoszą około 5% (obj./obj.)glicerolu, około 158 mM kwasu Tris[hydroksymetylometylo]-2-aminoetanosulfonowego, około 72 mM Tris[hydroksymetylo]aminometanu, około 20% (obj./obj.) żółtka jaja, około 8 mM fruktozy, około 100 μg/ml tylozyny, około 500 μg/ml gentamycyny i około 300/600 μg/ml linkospektyny.
W jeszcze innym alternatywnym wykonaniu wynalazku zastosowano jako rozcieńczalnik mleko. Po dodaniu rozcieńczalnika zawiesina plemników obejmowała glicerol (krioprotektant), ogrzane homogenizowane mleko (substancja organiczna), fruktozę (źródło energii), tylozynę, gentamycynę i linkospektynę (antybiotyki). Typowe przybliżone stężenia tych składników po dodaniu końcowego rozcieńczalnika do izolowanych plemników wynoszą:
Składniki rozcieńczalnika mlecznego
Mleko homogenizowane 90% (obj./obj.)
Glicerol: 3-7% (obj./obj.)
Fruktoza: 1,25% (wag./obj.)
Tylozyna: 50 μg/ml
Gentamycyna: 250 μg/ml
Linkospektyna: 250-300 μg/ml* *250-300 g/ml linkomycyny i 250-300 μg/ml spektynomycyny
Przykładowo, korzystne stężenia dla zamrażania plemników bydlęcych wynoszą około 90% mleka, około 10% (obj./obj.) glicerolu, około 1,25% (wag./obj.) fruktozy, około 50 μg/ml tylozyny, około 250 μg/ml gentamycyny i około 250/300 μg/ml linkospektyny.
Inne standardowo stosowane do zamrażania nasienia rozcieńczalniki mogą być również stosowane jako rozcieńczalnik końcowy w zamrożonych selekcjonowanych plemnikach. Opisano różne rozcieńczalniki optymalizowane do zastosowania w zamrażaniu plemników od różnych gatunków i wiele z nich jest dostępnych na rynku. Rozcieńczalniki do zamrażania końskich plemników zawierają typowo mleko, żółtko jaja, różne cukry, elektrolity i krioprotektant. Przykładowe rozcieńczalniki do zamrażania opisali E. L. Squires i współ., Cooled and Frozen Stallion Semen Animal Reprod. and Biotechnology Laboratory, Bulletin nr 69, Rozdział 8, „Seminal Extenders” str. 49-51 (lipiec 1999).
Równoważenie i zamrażanie plemników
Przez rozrzedzenie próbki plemników uzyskuje się zawiesinę plemników, którą następnie przenosi się do pojemników do zamrażania. Jeżeli plemniki są przeznaczone do stosowania w zapłodnieniu, komórki są dogodnie rozdzielane na indywidualne dawki wystarczające do osiągnięcia zapłodnienia. Wymagane dawki mogą różnić się zasadniczo zależnie od gatunku i są albo dobrze znane (np. dla bydła i koni), albo mogą być łatwo określone. W przypadku selekcjonowanych według płci plemników bydlęcych dogodne dawki są w zakresie od około 1,0 x 106 plemników do około 3,0 x 106 plemników.
Do zamrażania można wykorzystać jakikolwiek odpowiedni pojemnik, na przykład ampułkę, fiolkę i słomkę. Plemniki przeznaczone do Al (sztucznej inseminacji) są zwykle mrożone w słomkach (np. słomkach 0,25 ml lub 0,50 ml) przeznaczonych do stosowania w pistolecie do inseminacji. Korzystnie, bolus rozcieńczalnika jest wciągany do słomki, a po nim kolejno powietrze, plemniki, powietrze i roz10
PL 211 512 B1 cieńczalnik, tak więc plemniki są z obu stron otoczone przez przestrzeń powietrzną, która oddziela je od bolusa rozcieńczalnika przy każdym końcu słomki.
Przed zamrożeniem plemniki zwykle są równoważone w 5°C. Korzystnie plemniki są równoważone przez okres od około 1 godziny do około 18 godzin, korzystniej między około 3 godzin a około 18 godzin, a najkorzystniej między około 3 godzin a około 6 godzin (patrz przykład 2).
Po zrównoważeniu może być zastosowany jakikolwiek standardowy sposób zamrażania o niezbyt dużej szybkości mrożenia (tj. nie przekraczającej około 0,5°C/minutę). Korzystnie prędkość mrożenia wynosi około 0,5°C/minutę. W przykładowym korzystnym wykonaniu plemniki umieszcza się w statycznych oparach ciekłego azotu, a zamrażanie przeprowadza się w trzech różnych stadiach przez okres około 10 minut.
W pierwszym stadium zamrażania plemniki chłodzi się do temperatury od około 5°C do około -15°C z prędkością od około 40°C/minutę do około 65°C/minutę.
W drugim stadium zamrażania plemniki chłodzi się do temperatury od około -15°C do około -60°C z prędkością od około 25°C/minutę do około 35°C/minutę.
W trzecim stadium plemniki zanurza się w ciekłym azocie w około -100°C.
Próbki selekcjonowanych plemników
Próbka zamrożonych plemników obejmuje plemniki selekcjonowane z próbki źródłowej według płci. Plemniki mogą pochodzić od dowolnego gatunku, w tym jakiegokolwiek z tych omówionych powyżej w odniesieniu do sposobu zamrażania. Korzystne wykonania obejmują zamrożone selekcjonowane według płci plemniki bydlęce, końskie, świńskie, owcze, łosia lub bizona. Selekcję według płci przeprowadzono z zastosowaniem cytometrii przepływowej, jak opisano ogólnie powyżej.
Pojemnik zawierający próbkę zamrożonych plemników może być wytworzony z jakiegokolwiek materiału, który nie wchodzi w reakcję z próbką zamrożonych plemników i może mieć dowolny kształt lub inną cechę, która ułatwi wykorzystanie próbki w planowanym zastosowaniu. Dla próbek przeznaczonych do zastosowania w Al, na przykład dogodnie pojemnikiem jest słomka (np. słomka 0,25 ml lub 0,5 ml) przeznaczona do stosowania w pistolecie inseminacyjnym. Pojemnik uszczelnia się w dowolny sposób odpowiedni dla konserwacji próbki w planowanej temperaturze przechowywania, która zwykle wynosi poniżej -80°C Celsjusza. Słomki 0,25 ml mogą być uszczelnione, na przykład, proszkiem PCV, ultradźwiękowo lub bawełniano-poliwinylowym korkiem i/lub kulką stali nierdzewnej (BB).
Sposoby stosowania próbki selekcjonowanych plemników
Zamrożona próbka selekcjonowanych plemników jest odpowiednia do zastosowania w dowolnym sposobie wykorzystującym plemniki. Próbkę można rozmrozić i zastosować w dowolnym konwencjonalnym sposobie zapłodnienia, takim jak sztuczna inseminacja lub zapłodnienie in vitro. Rozmrażanie przeprowadza się w ten sam sposób jak dla zamrożonych nie selekcjonowanych plemników. Krótko mówiąc, słomkę zawierającą zamrożone plemniki zanurza się w kąpieli wodnej utrzymując temperaturę około 35°C do około 37°C przez okres około 20 do około 30 sekund. Po rozmrożeniu złożenie plemników (np. inseminację) przeprowadza się zgodnie ze standardowymi procedurami, biorąc pod uwagę ochronę plemników przed fluktuacjami otoczenia.
Przykłady
P r z y k ł a d 1. Wpływy rozrzedzenia na plemniki
Cel: określenie wpływu stężenia plemników na ruchliwość plemników dla nie zamrożonych, nie sortowanych, ale bardzo rozrzedzonych plemników.
A. Wpływy rozrzedzenia na nie przemywane plemniki
1. Pobieranie próbki źródłowej. Nasienie pobrano od byków zgodnie z rutynowym schematem pobierania stosując sztuczną pochwę jak opisano w J. Schenk, Proc. 17 NAAB, str. 48-58 (1998) i Saacke RG, Proc. NAAB Tech. Conf. Al Reprod. 41: 22-27 (1972). Wszystkie stosowane ejakulaty zawierały ponad 50% plemników wykazujących ruch postępowy i ponad 75% plemników o prawidłowej morfologii. Do oczyszczonego surowego ejakulatu dodano antybiotyki jak opisał S. Shin, Proc. NAAB Tech. Conf. Al Reprod. 11: 33-38 (1986) w 15 minut od pobrania, a stężenie plemników określono stosując spektrofotometr.
2. Metody. Nasienie od 4 byków rozrzedzono do 1,25, 2,5, 5, 10, 15 i 20 x 106/ml stosując rozcieńczalnik żółtko jaja-cytrynian (EYC) wytworzony z 20% (obj./obj.) żółtka jaja w 72 mM cytrynianu sodu, 50 Tg/ml tylozyny, 250 Tg/ml gentamycyny i 250/300 Tg/ml linkospektyny. Każdą próbkę wytworzono podwójnie (2 probówki/rozrzedzenie/byk) i całkowita objętość na probówkę wynosiła 8 ml. Wszystkie próbki inkubowano przez 60 minut w 22°C, następnie wirowano stosując wirówkę typu
PL 211 512 B1 „swinging bucket” (Eppendorf, Model # 5810R) przy 600 x g przez 10 minut zatężenia celu zagęszczenia nasienia. Po wirowaniu z jednego zestawu podwójnych probówek nie usunięto supernatantu; nasienie ponownie zawieszono w tym samym ośrodku i w wyjściowym stężeniu, przez powtarzaną delikatną aspirację z zastosowaniem 5-ml pipety serologicznej (drugi zestaw podwójnych probówek zastosowano w przykładzie 1B). Próbki nasienia ochładzano następnie do 5°C przy 0,2°C/min przez 90 minut. To nasienie określono jako „przemywane niepłukane nasienie”. Wszystkie próbki inkubowano przy 5°C przez 24 lub 48 godzin po pobraniu.
3. Ocena ruchliwości. Po inkubacji próbki ogrzano do 37°C stosując inkubator typu „dry block” przez 10 minut przed określeniem ruchliwości. Do tego eksperymentu dla każdej próbki określono pojedyncze, ślepe szacowanie procentu plemników o ruchliwość postępowej. Postępowa ruchliwość plemników była określona subiektywnie dla każdej podklasy przez pojedynczego obserwatora (x 200, mikroskop fazowo-kontrastowy); inna osoba przygotowywała szkiełka przedmiotowe mikroskopu w sposób zrandomizowany, tak więc obserwator był nieświadomy sposobów traktowania.
4. Analiza statystyczna. Dane analizowano analizą wariancji (SAS Institute, Cary, North Carolina) z czynnikami takimi jak dawca byk i stężenie po początkowym rozrzedzeniu. Wykonano oddzielne analizy dla każdego czasu inkubacji. Trendy rozrzedzenia badano stosując (log) kontrastów linearnych.
5. Wyniki. Dane dla nie przemywanych plemników (tabela 1) ujawniły (log) liniową zależność (P < 0,01) dla obu czasów inkubacji. Procent ruchliwych plemników wzrastał wraz ze wzrostem stężenia plemników od 1,25 x 106/ml do 10 x 106/ml, ale później występowała mała różnica. Składowa sześcienna była znacząca (P < 0,05) dla 24-godzinnych i marginalnie znacząca (P < 0,1) dla 48-godzinnych inkubacji. W obu przypadkach występował efekt byka (P < 0,01).
T a b e l a 1
Wpływ chłodzenia na ruchliwość nie przemywanych plemników (%) po ochłodzeniu do 5°C
| Rozrzedzenie (106/ml) | Inkubacja w 5°C | |
| 24 ha | 48 hb | |
| 1,25 | 18c | 0c |
| 2,5 | 38c,d | 6 ąd |
| 5,0 | 56d | 31d,e |
| 10,0 | 61d | 42e |
| 15,0 | 55d | 44e |
| 20,0 | 58d | 41e |
| S.E.f | 5,6 | 6,4 |
a (log) efekty liniowe (P < 0,01) i sześcienne (P < 0,05).
b (log) efekty liniowe (P < 0,01) i sześcienne (P < 0,1).
c' ,e Średnie w kolumnach bez wspólnych wykładników różnią się (P < 0,05). f błąd średniokwadratowy ΛΝΟΥΛ + Ά (SAS Institute, Cary, NC, USA).
Wpływy rozrzedzenia na przemywane plemniki
1. Pobranie próbki źródłowej. W doświadczeniu tym zastosowano drugi zestaw podwójnych probówek zawierających próbki, przygotowany w przykładzie 1A.
2. Metody. Nasienie rozrzedzano, inkubowano i zagęszczano przez wirowanie jak w przykładzie 1A. Po odwirowaniu z każdej probówki zaaspirowano 7,1 ml supernatantu, usuwając większość plazmy nasienia i pozostawiając plemniki w 900 μl osadu. Plemniki rozrzedzono w EYC (patrz przykład 1A) wytwarzając zawiesiny plemników 10 x 106/ml lub 20 x 106/ml. Następnie, próbki ochładzano do 5°C przez 90 minut jak w przykładzie 1A.
3. Ocena ruchliwości. Próbki ogrzewano i oceniano ruchliwość postępową jak w przykładzie 1A.
4. Analiza statystyczna. Dane analizowano jak w przykładzie 1A. Ponadto dane w przykładzie 1B analizowano dla stężenia podczas inkubacji w 5°C.
5. Wyniki. Dane dla przemywanych plemników (tabela 2) nie ujawniły znacznych wpływów traktowania, gdy plemniki oceniano po 24 godzinach. Jednak po 48 godzinnym przechowywaniu w 5°C
PL 211 512 B1 wystąpiły efekty byka, rozrzedzenia początkowego, stężenia podczas inkubacji i byka przez inkubację (P < 0,05). Więcej plemników zachowało ruchliwość, gdy utrzymywano je w 20 x 106/ml niż przy 10 x 106/ml (31% vs. 20%; P < 0,05). Początkowe rozrzedzenia 1,25, 2,5 i 5 x 106 plemników/ml dały ruchliwość postępową niższą niż 10 x 106 plemników/ml (P < 0,05), ze średnimi odpowiedniego efektu głównego 19, 20, 27 i 37% ruchliwych plemników.
T a b e l a 2
Skumulowane wpływy przemywania, rozrzedzania, zagęszczania i ochładzania na ruchliwość postępową plemników
| Stężenie plemników podczas 1 h wstępnej inkubacji w 37°C (%) | Przechowywanie w 5°C - stężenie plemników i czas trwania | |||
| 24 h | 48 ha | |||
| 20 x 106/ml | 10 x 106/ml | 20 x 106/ml | 10 x 106/mlb | |
| 1,25 | 45 | 49 | 24 | 15 |
| 2,5 | 51 | 40 | 29 | 11 |
| 5,0 | 54 | 54 | 32 | 21 |
| 10,0 | 51 | 50 | 40 | 34 |
| 15,0 | 60 | 41 | ||
| 20,0 | 55 | 40 |
a Stężenie 20 x 106 plemników/ml przewyższało (P < 0,05) 10 x 106 plemników/ml po 48 h przechowywania. Również wstępne rozrzedzenie 10 x 106 przewyższało niższe rozrzedzenia (P < 0,05).
Połączone błędy standardowe, V błąd średniokwadratowy ΛΝΟνΛ + 4N wynosił 4,0 dla 24 h i 2,8 dla 48 h inkubacji. b Istotny trend (log) liniowy (P < 0,06).
Wniosek
Wysokie rozrzedzenie i ochładzanie nasienia powodowało istotne zmniejszenie procentu ruchliwych plemników, bez względu na obecność czy usunięcie plazmy nasienia. Jednak ten efekt rozrzedzenia był bardzo osłabiony przy zagęszczeniu rozrzedzonego nasienia do 10 x 106/ml, a jeszcze bardziej do 20 x 106/ml przed przechowywaniem w 5°C.
Nasienie od pewnych dawców lepiej tolerowało rozrzedzenie niż nasienie od innych byków; jednak stwierdzone różnice są typowe. Silnie rozrzedzone nasienie może być przyczyną uszkodzenia plemników podczas sortowania, częściowo przez usunięcie ochronnych związków z plazmy nasienia.
P r z y k ł a d 2. Wpływy czasu równoważenia przed zamrożeniem sortowanych plemników
Cel: ocena wpływu czasów równoważenia (3, 6 i 18 h, 5°C) przed zamrożeniem przepływowo sortowanych plemników.
Powtórzono w całości następujące doświadczenie z użyciem tych samych dawców - byków:
1. Pobranie próbki źródłowej. Nasienie od 4 byków pobrano i przygotowano jak opisano w przykładzie 1A.
2. Metody.
a) Barwienie i przygotowanie do sortowania
i) Przygotowanie roztworu podstawowego barwnika: roztwór podstawowy 8,89 mM Hoechst 33342 (bis-Benzimid H-33342; #190305, ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH) przygotowano w dejonizowanej wodzie.
ii) Procedura barwienia plemników: plemniki rozrzedzono w modyfikowanym buforze TALP (tabela 3) do 400 x 106 plemników/ml. Po rozrzedzeniu do zawiesin plemników dodano barwnik Hoechst
33342 w stężeniu 224 μM. Po dodaniu barwnika do zawiesin plemników próbki inkubowano przez minut w 34°C. Po inkubacji plemniki rozrzedzono do 100 x 106/ml dodając TALP zawierający
2,67% oczyszczonego żółtka jaja i 0,002% barwnika do żywności (FD & C #40), który wygasza fluorescencję Hoechst 33342 w plemnikach z uszkodzonymi błonami komórkowymi, pozwalając na odrzucenie ich w procesie sortowania. Tuż przed sortowaniem przepływowym próbki filtrowano przy ciężarze jednostkowym przez filtr nylonowy o wielkości oczka 40 μm, w celu usunięcia resztek i/lub zlepionych plemników.
PL 211 512 B1
b) Sortowanie. Do wzbudzania barwnika Hoechst zastosowano dwuliniowy laser argonowy działający przy 351 i 364 nm i 150 mW. Zastosowano cytometr przepływowy/sorter komórkowy SX ®
MoFlo® (Cytomation, Inc., Fort Collins, CO, USA) działający przy 344,74 Pa (50 psi). Zastosowano płyn osłonowy oparty na Tris, zawierający Tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris; 197,0 mM; #T-1503, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), monohydrat kwasu cytrynowego (55,4 mM; #C-7129, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) i fruktozę (47,5 mM; #F-0127, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Do płynu osłonowego opartego na Tris dodano również antybiotyki pierwszego rzutu obejmujące 0,58 g/l penicyliny i 0,05 g/l siarczanu streptomycyny.
Plemniki sortowano w procesie określanym jako „sortowanie masowe”, który pozwala na szybkie gromadzenie dużej liczby plemników, tak więc w rozsądnym czasie można wykonać przykłady na dużą skalę.
Plemniki przechodziły przez cytometr przepływowy w standardowych warunkach roboczych z wyjątkiem tego, że wszystkie krople zawierające żywe plemniki zbierano do pojedynczej probówki, a nie sortowano do dwóch probówek w oparciu o płeć.
Plemniki sortowano na podstawie ich żywotności; stąd plemniki o uszkodzonych błonach komórkowych były wykluczane podczas masowego sortowania.
Podczas sortowania barwione plemniki utrzymywano w 22 ± 1°C. Masowo sortowane plemniki zbierano do 50 ml plastikowych probówek zawierających 2 ml 20% rozcieńczalnika żółtko jaja-Tris, przygotowanego z 20% żółtka jaja (obj./obj.) w 200 ml Tris, 65 mM kwasu cytrynowego, 56 mM fruktozy, 50 Tg/ml tylozyny, 250 Tg/ml gentamycyny i 150/300 Tg/ml linkospektyny w dejonizowanej wodzie.
Rozcieńczalnik żółtko jaja-Tris określono jako „Tris-frakcja A” w celu podkreślenia braku glicerolu w tym punkcie procedury.
Plemniki zebrano do probówek tak, by zawierały 12 ml i w przybliżeniu około 6 x 106 plemników.
Plemniki były później inkubowane w 22°C przez 1 do 3 godzin w celu symulacji warunków sortowania według płci.
c) Przygotowanie do zamrożenia. Po inkubacji sortowane plemniki ochładzano do 5°C przez okres 70 minut. Po ochłodzeniu zawartości dwóch probówek spulowano i chłodzono, wirówkę typu „swinging bucket” nastawiono na 5°C i przez 20 minut wirowano przy 850 x g. Po usunięciu supernatantu proces kontynuowano w 5°C dodając około 150 μΐ rozcieńczalnika Tris-frakcja A do około 150 μΐ osadu plemników w celu otrzymania stężenia plemników w przybliżeniu 40 x 106/ml. Plemniki od indywidualnych byków spulowano i bezzwłocznie rozrzedzono w równej objętości rozcieńczalnika żółtko jaja-Tris zawierającego 12% (obj./obj.) glicerolu („Tris-frakcja B”). Tris-frakcję B dodano do zawiesiny plemników w 2 równych objętościach w 15 minutowych odstępach w celu dostosowania końcowego stężenia plemników do 20 x 106/ml. Końcowe stężenie glicerolu w kompletnym rozcieńczalniku żółtko jaja-Tris, wynosiło 6% (obj./obj.).
d) Równoważenie i mrożenie. Następnie, rozrzedzone plemniki umieszczono w 0,25 ml słomkach z polichlorku winylu do mrożenia rutynowymi procedurami na stojakach w statycznych oparach ciekłego azotu. Dwie słomki od każdego z 4 byków zamrożono po 3, 6 i 18 godzinach całkowitego czasu równoważenia w 5°C.
3. Ocena ruchliwości po rozmrożeniu. Słomki rozmrażano w 37°C łaźni wodnej przez 30 sekund. Ślepe szacowanie ruchliwości postępowej wykonano po inkubacji próbek w 37°C dla 0, 1 i 2 godzin po rozmrożeniu. Każdy z dwóch obserwatorów szacował postępową ruchliwość plemników z każdej z dwóch słomek. Te cztery ślepe oznaczenia ilościowe dla każdej jednostki doświadczalnej reprezentują podpróby.
4. Analiza statystyczna. Podpróby analizowano statystycznie jako subplot głównego płotu metodą najmniejszych kwadratów ANOVA w celu zbadania wpływów dowolnej obserwacji i interakcji obserwacja x traktowanie. N odnosi się do liczby jednostek doświadczalnych, a nie podprób; błędy standardowe obliczono na podstawie średnich z 4 podprób z błędów średniokwadratowych ANOVA i liczb jednostek doświadczalnych; przedstawiono średnie najmniejszych kwadratów.
Wpływy traktowania oceniono przez oddzielne ANOVA dla każdego czasu inkubacji. Model obejmował dawców-byki jako efekt losowy, a czas równoważenia i obserwację jako efekty ustalone; subplot składał się z określonych obserwacji i związanych z nimi interakcji.
5. Wyniki. Czasy równoważenia 3 i 6 godzin przeważały nad 18 godzinami (tabela 4) w oparciu o procent postępowo poruszających się plemników dla 0 i 1 godziny (P < 0,01), ale nie dla 2 godzin inkubacji po rozmrożeniu. Efekty dawców były oczywiste przy czasach inkubacji 1 i 2 godziny (P < 0,05),
PL 211 512 B1 ale nie przy 0 godzin. Nie było znaczącego wpływu (P > 0,1) przez interakcję w czasie równoważenia, jak również nie było znacznego wpływu obserwacji na jakąkolwiek odpowiedź.
T a b e l a 3
Zmodyfikowany bufor TALP
| Składnik | Stężenie |
| NaCI | 95,0 mM |
| KCI | 3,0 mM |
| NaHPO4 | 0,3 mM |
| NaHCO3 | 10,0 mM |
| MgCl2 · 6 H2O | 0,4 mM |
| Pirogronian sodu | 2,0 mM |
| Glukoza | 5,0 mM |
| Mleczan sodu | 25,0 mM |
| HEPESa | 40,0 mM |
| Bydlęca albumina osoczowab | 3,0 mg/ml |
| Siarczan gentamycyny | 30,0 μg/ml |
a #H3375, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA b #US70195, frakcja V; Amersham/Life Science, Cleveland, OH, USA
T a b e l a 4
Wpływ czasu równoważenia przed zamrożeniem na postępową ruchliwość po rozmrożeniu (%)
| Równoważenie przy 5°C | Inkubacja w 37°C po rozmrożeniu | ||
| 0 h | 1 h | 2 h | |
| 3 h | 41a | 36a,b | 16 |
| 6 h | 41a | 37a | 18 |
| 18 h | 35b | 31b | 12 |
| S. E.c | 1,5 | 0,8 | 2,0 |
a,b w kolumnach średnie bez wspólnego wykładnika różnią się (P < 0,05), Tukey's HSD.
c połączone błędy standardowe, V błąd średniokwadratawy ΛΝΟνΛ
6. Wniosek
Wyniki wskazały na brak różnic w ruchliwości plemników po rozmrożeniu w całkowitym czasie równoważenia 3-6 godzin w 5°C, ale występował znaczny spadek ruchliwości plemników po 18 godzinach równoważenia w 5°C przed zamrożeniem. Zakres 3-6 godzin pozwala na połączenie 2 kolejnych 3-godzinnych serii sortowania dla zamrożonych plemników bez zmniejszenia ruchliwości po rozmrożeniu.
Ponieważ interakcja byk i czas równoważenia nie była znacząca, czas równoważenia 3 do 6 godzin był właściwy, z zastrzeżeniem, że wykorzystano tylko 4 byki. Optymalny czas równoważenia dla mniejszej ilości byków przypuszczalnie wynosi > 6 godzin.
P r z y k ł a d 3. Wpływy stężenia barwnika i mocy lasera na sortowane plemniki
Cel: ocena wpływu stężenia barwnika Hoechst 33342 w kombinacji z intensywnością lasera na sortowane przepływowo plemniki.
1. Pobranie próbki źródłowej. Nasienie pobrano od 6 byków i przygotowano jak w przykładzie 1A.
2. Metody
a) Projekt doświadczalny. Zastosowano jeden ejakulat (2 byki) i 2 ejakulaty z różnych dni (4 byki) w projekcie 2 przez 2 plus kontrola.
PL 211 512 B1
b) Barwienie i sortowanie. Barwienie, przygotowanie do sortowania i sortowanie plemników wykonano jak opisano w przykładzie 2 z wyjątkiem tego, że barwnik Hoechst 33342 dodano do zawiesin plemników w stężeniu końcowym 149 TM lub 224 TM; a plemniki sortowano masowo laserem działającym przy 100 mW lub 150 mW doprowadzonej mocy. Sortowane masowo plemniki zebrano do 50 ml plastikowych probówek, jak opisane w przykładzie 2. Dla każdego byka przez 1 godzinę zebrano cztery probówki zawierające w przybliżeniu 15 x 106 całkowitego nasienia/probówkę. Sortowane plemniki inkubowano przez 1 godzinę w 22°C symulując dłuższy czas sortowania.
c) Przygotowanie do zamrożenia. Po inkubacji plemniki ochłodzono jak w przykładzie 2. Następnie, plemniki zagęszczono przez wirowanie w 5°C przy 850 x g przez 20 minut. Po usunięciu supernatantu do każdych 150 μl osadu plemników dodano 150 μl rozcieńczalnika Tris-frakcja A. Wszystkie osady plemników zawieszono przez delikatną powtarzaną aspirację i spulowano plemniki od indywidualnych byków. Rozcieńczalnik Tris-frakcja B dodawano stopniowo jak w przykładzie 2. Dla każdego byka przygotowano nie barwioną i nie sortowaną kontrolę przy 20 x 106 plemników/ml w rozcieńczalniku Tris zawierającym 6% glicerol i ochłodzono do 5°C, podczas gdy sortowane masowo było plemniki były przygotowywane.
d) Równoważenie i zamrażanie. Kontrolę i sortowane plemniki umieszczono w 0,25 ml słomkach z polichlorku winylu, jak opisano w przykładzie 2, równoważono w 5°C przez 3 godziny, a następnie zamrożono konwencjonalnie.
4. Analiza statystyczna. Ogólny opis analizy statystycznej dostarczono w przykładzie 2. Szczególnie wpływy traktowania oszacowano przez ANOVA. Model obejmował stężenie barwnika, intensywność lasera i byki w głównym plocie, oraz obserwatora i związane interakcje w subplocie. Byki uznano za efekt losowy, a inne czynniki jako ustalone.
5. Wyniki. Wpływy byków na procent plemników o postępowej ruchliwości bezpośrednio po rozmrożeniu (P < 0,1) oraz po 1 i 2 godzinach inkubacji w 37°C (P < 0,05) były znaczne. Nie stwierdzono wpływu stężenia barwnika lub byka x stężenie barwnika na ruchliwość plemników przy dowolnym czasie inkubacji. Przy uznaniu wpływu dawców - byków za efekt losowy 150 mM moc lasera powodowała niższą ruchliwość plemników po rozmrożeniu niż 100 mW przy 0 godzinach inkubacji (P < 0,1), ale nie przy innych czasach inkubacji (tabela 5). Jeżeli byki uznano za efekty ustalone, 150 mW moc powodowała niższą ruchliwość plemników niż 100 mW (P < 0,05) przy wszystkich 3 czasach inkubacji. Stwierdzono wpływ byka i mocy lasera (P < 0,05) na ruchliwość plemników przy 1 godzinie, ale nie przy 0 lub 2 godzinach inkubacji. Również najwyższa moc lasera powodowała niższą ruchliwość plemników niż kontrola (P < 0,05) przy 0 i 1 godzinie inkubacji (tabela 5). Stwierdzono znaczny efekt obserwacji przy 1 godzinie, ale nie przy 0 lub 2 godzinach inkubacji. Nie stwierdzono interakcji obserwacja i traktowanie (P > 0,1).
T a b e l a 5
Wpływy intensywności lasera i stężenia barwnika na ruchliwość (%) po rozmrożeniu
| Średnie efektu głównego | Inkubacja w 37°C | ||
| 0 h | 1 h | 2 h | |
| Kontrola | 49 | 44 | 33 |
| Stężenie barwnika | |||
| 149 μM | 41 | 39 | 30 |
| 224 μM | 42 | 39 | 30 |
| Intensywność lasera | |||
| 100 mW | 46 | 42 | 33 |
| 150 mW | 38a | 35b | 27 |
| S. E.c | 2,2 | 1,2 | 1,3 |
a Istotny efekt główny (P < 0,1) różni się od kontroli (P < 0,05).
b Różni się od kontroli (P < 0,05).
c Połączone błędy standardowe, V błąd średniokwadratowy ΛΝΟΥΛ +
PL 211 512 B1
6. Wnioski. Procent plemników o postępowej ruchliwości zmniejszał się wskutek procesu barwienia i sortowania. Wyższa intensywność lasera była bardziej szkodliwa niż niższa intensywność lasera. Nie stwierdzono wpływu stężenia barwnika na ruchliwość plemników po rozmrożeniu. Zatem pobudzenie barwnika Hoechst 33342 związanego z plemnikiem przy niższych intensywnościach lasera jest mniej szkodliwe i barwienie plemników przy najwyższym stężeniu barwnika nie miało szkodl iwego wpływu na ruchliwość po rozmrożeniu. Obserwowane uszkodzenie przypuszczalnie dotyczyło aparatu ruchowego plemników.
P r z y k ł a d 4. Ocena poprzedzających sortowanie procedur barwienia i wybór rozcieńczalników do kriokonserwacji plemników
Cel: (1) ocena trzech poprzedzających sortowanie zabiegów na plemnikach; i (2) ocena kombinacji płynu osłonowego i rozcieńczalnika dla kriokonserwacji sortowanych przepływowo plemników.
Powtórzono w całości następujące doświadczenie:
1. Pobranie próbki źródłowej. Pobrano nasienie od 4 byków i przygotowano jak w przykładzie 1A.
2. Metody
a) Projekt doświadczalny. Zaprojektowano 3 (traktowania poprzedzające sortowanie) przez 3 (rozcieńczalniki) przez 2 (płyny osłonowe) przez 4 (dawcy-byki) przez 2 (obserwacje) silniowy eksperyment w celu określenia najlepszej procedury przetrzymywania plemników przed sortowaniem i oceny trzech rozcieńczalników do kriokonserwacji sortowanych plemników.
b) Przygotowanie i barwienie próbki. Świeżo zebrane nasienie od każdego z 4 byków potraktowano następująco:
(1) rozrzedzono do 400 x 106/ml w zmodyfikowanym TALP (patrz przykład 2, tabela 3) i barwiono przez 1 godzinę w 34°C przed masowym sortowaniem („rozrzedzenie - 0 h);
(2) inkubowano bez domieszki w 22°C przez 3 godziny przed rozrzedzeniem, barwieniem i sortowaniem („czysty - 3 h”); lub (3) rozrzedzono i barwiono jako „rozrzedzenie 0 h”, a następnie inkubowano w 22°C przez 3 godziny przed masowym sortowaniem („rozrzedzone - 3 h”).
c) Rozcieńczalniki. Porównano następujące rozcieńczalniki do zamrażania: EYC (patrz przykład 1) zawierający 7% glicerolu, żółtko jaja-Tris (patrz przykład 2) zawierający 6% glicerolu i żółtko jaja-TES-Tris (TEST) zawierający 5% glicerolu. EYC „Frakcja A” dotyczy rozcieńczalnika EYC nie zawierającego glicerolu, a EYC „Frakcja B” dotyczy rozcieńczalnika EYC zawierającego dwa razy końcowe żądane stężenie glicerolu (tj. 14%). Zatem, gdy frakcje EYC A i B połączono w równych objętościach, końcowy rozcieńczalnik EYC zawierał 7% glicerolu. Frakcje Tris A i B nazwano podobnie i opisano w przykładzie 2. Rozcieńczalnik TEST przygotowano jako kompletny rozcieńczalnik zawierający 5% glicerolu; stąd nie było frakcji „A” i „B” dla TEST.
d) Płyn osłonowy. Jak opisano w przykładzie 2 płynem osłonowym był albo 98,6 mM dihydrat cytrynianu sodu (#279-3, Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), albo Tris. Oba rodzaje płynu osłonowego doprowadzono do pH 6,8; osmolalność wynosiła około 270 do 280 mOsm/kg. Płyn osłonowy Tris stosowano przy zbieraniu nasienia, które później rozrzedzano w rozcieńczalnikach do zamrażania żółtko jaja-Tris i TEST. Płyn osłonowy, zawierający 98,6 mM dihydratu cytrynianu sodu, zastosowano do zbierania nasienia rozrzedzanego później rozcieńczalnikiem do mrożenia EYC.
e) Sortowanie. W przybliżeniu 58 x 106 plemników dla każdej kombinacji zabiegu poprzedzającego sortowanie, płyn osłonowy i rozcieńczalnik były masowo sortowane jak opisano w przykładzie 2, przy 150 mW mocy padającej lasera. Dla każdego sortowania plemniki zbierano przez około 1 godzinę. Po sortowaniu próbki inkubowano w 22°C przez 2 godziny symulując 3 godziny sortowania.
f) Przygotowanie do zamrażania. Po inkubacji plemniki ochładzano jak w przykładzie 2. Po schłodzeniu próbki wirowano w 5°C przy 850 x g przez 20 minut. Każda próbka obejmowała około 28 ml całkowitej objętości i była zawarta w 50 ml probówce z tworzywa sztucznego. Po usunięciu supernatantu plemniki z powrotem umieszczono w zimnym pomieszczeniu o temperaturze 5°C w celu rozrzedzenia. Próbki rozrzedzono do 40 x 106/ml przez złożenie 131 μl zawiesiny plemników w 69 μl frakcji A EYC, frakcji A żółtko jaja-Tris lub rozcieńczalniku TEST. Zawiesiny natychmiast doprowadzono do 20 x 106 plemników/ml przez dodanie dobranego rozcieńczalnika zawierającego glicerol (tj. frakcję B EYC, frakcję B Tris) lub TEST. Rozcieńczalniki frakcji B dodawano do odpowiednich próbek stopniowo (2X) w 15 minutowych odstępach jak opisano w przykładzie 2. TEST dodano do plemników stopniowo w ten sam sposób jak rozcieńczalniki frakcje B EYC i Tris.
PL 211 512 B1
g) Równoważenie i zamrażanie. Plemniki umieszczono w 0,25 ml rurkach probówkach z polichlorkiem winylu, równoważono przez 3 godziny w 5°C i natychmiast zamrażano w statycznych parach ciekłego azotu.
3. Ocena ruchliwości po rozmrożeniu. Rozmrażanie i ocenianie plemników po rozmrożeniu wykonano jak w przykładzie 2.
4. Analiza statystyczna. Ogólny opis analizy statystycznej dostarczono w przykładzie 2. Konkretnie, wpływy traktowań oceniono przez oddzielną analizę wariancji dla każdego czasu inkubacji po rozmrożeniu. Główny plot obejmował traktowanie przed sortowaniem, rozcieńczalniki i byki; subplot składał o się z obserwacji i towarzyszących interakcji. Byki przyjęto za efekt losowy, a inne czynniki za ustalone. Całe doświadczenie powtórzono dwa razy. Do separacji średnich zastosowano test Tukey'a HDS.
5. Wyniki. Na postępową ruchliwość po rozmrożeniu masowo sortowanych plemników wpływano (P < 0,05) przez rozcieńczalnik i dawców-byki przy każdym czasie inkubacji po rozmrożeniu i przez procedurę poprzedzającą sortowanie przy 0 h inkubacji (tabela 6). Nie stwierdzono różnic spowodowanych płynami osłonowymi (P > 0,05). Przy 0 h inkubacji po rozmrożeniu stosowanie 3-godzinnego zabiegu bez domieszki powodowało większy ruch plemników po zamrożeniu i rozmrożeniu niż inne 2 zabiegi barwienia poprzedzające sortowanie (P < 0,05; tabela 6). Jednak procedury poprzedzające sortowanie nie były statystycznie istotne po inkubacji plemników po rozmrożeniu dla 1 lub 2 godziny z bykami przyjętymi za efekt losowy. Ważne jest, że przy tych 2 czasach inkubacji nie było znaczących interakcji zabieg poprzedzający sortowanie x byk (P < 0,05). Ponadto, zabieg poprzedzający sortowanie mógł być istotnym efektem przy wszystkich czasach inkubacji po rozmrożeniu, jeżeli byki byłyby uważane za efekt ustalony. Natychmiast po rozmrożeniu (0 h), TEST był najlepszym rozcieńczalnikiem, ale po 1 lub 2 godzinach inkubacji w 37°C, najlepszym rozcieńczalnikiem był Tris. Ważne jest, że nie było interakcji zabieg poprzedzający sortowanie x rozcieńczalnik dla jakiejkolwiek odpowiedzi. Stwierdzono efekty obserwacji (P < 0,01) przy wszystkich czasach inkubacji, ale nie stwierdzono interakcji obserwacje x traktowanie. Stwierdzono interakcję byk x rozcieńczalnik (P < 0,05) przy wszystkich 3 czasach inkubacji.
T a b e l a 6
Główne wpływy zabiegu poprzedzającego sortowanie i rozcieńczalników do mrożenia na postępową ruchliwość plemników po rozmrożeniu (%)
| Procedura poprzedzająca sortowanie | Inkubacja przy 37°C | |||
| Rozcieńczalnik | 0 h | 1 h | 2 h | |
| Rozrzedzenie - 0 h | Średnia | 39a | 32 | 22 |
| Bez domieszki - 3 h | Średnia | 43b | 36 | 25 |
| Rozrzedzenie - 3 h | Średnia | 38a | 31 | 19 |
| Średnia | EYC | 36a | 29a | 17a |
| Średnia | Tris | 40b | 39b | 29b |
| Średnia | TEST | 44c | 33c | 20a |
| S.E. | 0,8 | 0,8 | 0,7 |
a,b,c średnie w kolumnach, z efektami głównymi, bez wspólnych wykładników różnią się (P < 0,05).
d Połączone błędy standardowe, V błąd średniokwadratowy ANOVA +7A?
6. Wniosek. Badanie wykazało, że przetrzymywanie nasienia bez domieszki przez 3 godziny przed rozrzedzeniem, barwieniem i sortowaniem było lepsze, niż bezpośrednie rozrzedzenie i barwienie 0 h lub 3 godziny później. Zatem, sortowanie najlepiej jest prowadzić z nową próbką oryginalnego ejakulatu, który przetrzymywano bez domieszki przez 3 godziny i następnie barwiono, a nie z oryginalną próbką nasienia barwioną i przetrzymywaną przy 400 x 106 plemników/ml. Gdyby nawet rozcieńczalnik TEST dostarczał wyższej ruchliwości po rozmrożeniu w 0 h, Tris był lepszym rozcieńczalnikiem, gdy plemniki były poddawane stresowi przez inkubację w 37°C. Każdy płyn osłonowy działał równie dobrze dla każdego rozcieńczalnika. W oparciu o te wyniki do standardowej procedury operacyjnej włączono stosowanie płynu osłonowego Tris w połączeniu z rozcieńczalnikiem do zamrażania Tris.
PL 211 512 B1
P r z y k ł a d 5. Wpływy dodatków rozcieńczalnika na sortowane plemniki
Cel: Ocena wpływu dodania dodecylosiarczanu sodu („SDS”) do rozcieńczalnika do zamrażania na sortowane przepływowo plemniki.
A. Ocena wpływu stężenia SDS w rozcieńczalniku do mrożenia
1. Pobranie próbki źródłowej. Pobrano nasienie od 6 byków i przygotowano jak opisano w przykładzie 1A.
2. Metody. Nasienie od każdego z 6 byków rozrzedzono do 20 x 106/ml w rozcieńczalniku 20% całe jajko-Tris („WET”), zawierającym 0, 0,03, 0,06, 0,09 lub 0,12 procent SDS, umieszczono w słomkach i zamrożono. Rozcieńczalnik WET przygotowano stosując 3,028 g Tris[hydroksymetylo]aminometanu, 1,78 g monohydratu kwasu cytrynowego i 1,25 g fruktozy na 100 ml podwójnie destylowanej wody, do której dodano 20% całe jajko (obj./obj.). Wytworzono rozcieńczalnik WET o pH około 7,0 i końcowym stężeniu glicerolu około 6% (obj./obj.). Rozcieńczalnik WET zawierał również 1000 lU penicyliny „G” sodowej i 100 Tg siarczanu streptomycyny/ml.
3. Wyniki. Odpowiednie średnie (n = 1 próbka od każdego z 6 byków) wynosiły 51, 51, 50, 51 i 48% plemników o postępowej ruchliwości w przybliżeniu 10 minut po rozmrożeniu. Opierając się na tych wynikach w przykładzie 5B zastosowano 0,06 % SDS. B. Ocena wpływów 0,06 % SDS w różnych rozcieńczalnikach do zamrażania na ruchliwość po rozmrożeniu przepływowo sortowanych plemników
1. Pobranie próbki źródłowej. Pobrano nasienie od 6 byków i przygotowano jak w przykładzie 1A.
2. Metody. Badano ruchliwość po rozmrożeniu plemników zamrożonych w rozcieńczalnikach żółtko jaja-Tris i WET (patrz przykład 5A) z i bez 0,06% SDS. Końcowa zawartość glicerolu w obu rozcieńczalnikach wynosiła 6%.
a) Barwienie, przygotowanie do sortowania, sortowanie. Barwione próbki plemników przygotowano z ejakulatu od każdego z 8 byków, jak opisano w przykładzie 2. Barwione plemniki sortowano masowo z zastosowaniem płynu osłonowego jak w przykładzie 2, z wyjątkiem tego, że sortowanie wykonano stosując 135 mW moc padającą lasera. Sortowane plemniki zebrano do 50 ml probówek ze sztucznego tworzywa, zawierających 2 ml frakcji A buforu do zamrażania dla każdego rozcieńczalnika; 15 x 106 całkowitych sortowanych plemników (25 ml) dla każdego traktowania zebrano i inkubowano przez 1 godzinę w 22°C w celu symulowania dłuższego sortowania.
b) Przygotowanie do mrożenia. Rozrzedzone plemniki ochłodzono do 5°C przez 90 minut. Równą objętość odpowiedniego rozcieńczalnika frakcji B dodano stopniowo (2 x) w 15 minutowych odstępach do każdej 50 ml probówki z tworzywa sztucznego zawierającej sortowane plemniki. Próbki 25 ml traktowane rozcieńczalnikiem zagęszczano przez wirowanie przez 20 minut przy 850 x g w wirówce chłodniczej. Supernatant usunięto pozostawiając 600 Tl osadu plemników, który zawieszono przez delikatne wirowanie przez 15 sekund. Nie dodano dodatkowego rozcieńczalnika do osadu plemników, ponieważ zawiesina zawierająca osad zawierała już glicerol. Stężenie zawiesiny plemników wynosiło w przybliżeniu 20 x 106/ml. Dla każdego byka przygotowano niebarwioną i niesortowaną kontrolę o 20 x 106 plemników/ml w rozcieńczalniku żółtko jaja-Tris, zawierającym 6% glicerol. Kontrolę umieszczono w pomieszczeniu chłodniczym w 5°C, podczas gdy przeprowadzano masowe sortowanie.
c) Równoważenie i zamrażanie. Wszystkie kontrole i sortowane masowo plemniki zapakowano i zamrożono w tym samym czasie. Plemniki umieszczono w 0,25 ml rurkach probówkach z polichlorku winylu, równoważono przez około 3-6 godzin w 5°C i następnie zamrożono w statycznych oparach ciekłego azotu.
3. Ocena ruchliwości po rozmrożeniu. Rozmrażanie i oceny plemników po rozmrożeniu wykonano jak w Przykładzie 2 z tym wyjątkiem, że ruchliwość postępową oceniono po 0,5 i 2,0 godzinach inkubacji.
4. Analiza statystyczna. Ogólny opis analiz statystycznych dostarczono w przykładzie 2. Konkretnie, wpływy traktowania oceniono przez osobne analizy wariancji dla każdego czasu inkubacji; model obejmował byka i rozcieńczalnik w plocie głównym i obserwację i związane interakcje w subplocie. Różnice w średnich określono przez test najmniej istotnych różnic.
5. Wyniki. Rozcieńczalnik oddziaływał (P < 0,05) na postępową ruchliwość plemników po 0,5 lub 2 godzinach inkubacji (tabela 7). Przy 0,5 godziny WET plus SDS powodowały niższą ruchliwość niż Tris z SDS. Przy 2 godzinach wszystkie zabiegi z masowo sortowanymi plemnikami były gorsze niż z niesortowanymi plemnikami kontrolnymi. Występowały istotne efekty byka i obserwacji (P < 0,01) przy obu czasach inkubacji, ale nie było interakcji obserwacja x traktowanie.
PL 211 512 B1
T a b e l a 7
Wpływ rozcieńczalnika na postępową ruchliwość po rozmrożeniu (%)
| Rozcieńczalnik | Inkubacja w 37°C | |
| 0,5 h | 2 h | |
| Tris (nie sortowany) | 42a | 41a |
| Tris bez SDS | 40a,b | 35b |
| Tris z SDS | 42a | 37b |
| WET bez SDS | 40a,b | 35b |
| WETz SDS | 38b | 35b |
| S. E.c | 1,0 | 1,2 |
a,b średnie w kolumnach bez wspólnego wykładnika różnią się (P < 0,05).
c
Zbłąd średniokwadratowy ΛΝΟΥΛ + 75'
6. Wniosek. Włączenie SDS w rozcieńczalnikach Tris lub WET nie poprawiło jakości plemników, jak określono przez wizualną ocenę ruchliwości po rozmrożeniu. Podobne były również wyniki z zastosowaniem rozcieńczalników WET i Tris; stąd WET okazał się tak samo skuteczny jak Tris do kriokonserwacji sortowanych plemników.
P r z y k ł a d 6. Jakość plemników sortowanych przepływowo według płci dla prób terenowych
Cel: ocena jakości sortowanych plemników po rozmrożeniu oparta na integralności akrosomalnej.
1. Pobranie próbki źródłowej. Nasienie od 3 byków zebrano i przygotowano jak opisano w przykładzie 1A.
2. Sposoby. Sortowane i niesortowane plemniki kontrolne z tego samego ejakulatu barwiono, przetwarzano i sortowano jak w Przykładzie 2 z tym wyjątkiem, że plemniki sortowano według płci przy 90% poziomie czystości. Sortowane plemniki zebrano do objętości w przybliżeniu 20 ml i ochłodzono do 5°C przez 90 minut (0,2°C/min.). Po ochłodzeniu do sortowanych plemników w 15 minutowych odstępach dodano równą objętość rozcieńczalnika żółtko jaja-Tris B (patrz przykład 2) w dwóch równych objętościach. Wirowania i aspirowania supernatantu dokonano jak w przykładzie 5. Po wirowaniu i aspirowaniu do osadu plemników dodano rozcieńczalnik żółtko jaja-Tris zawierający 6% glicerolu (obj./obj.), doprowadzając stężenie plemników do około 20 x 106/ml. Zamrażanie i rozmrażanie przeprowadzono jak opisano w przykładzie 2, z tym wyjątkiem, że czas równoważenia wynosił 3 godziny.
3. Ocena ruchliwości po rozmrożeniu. Wizualną ocenę odsetka plemników z postępową ruchliwością w 37°C wykonano w przybliżeniu 10 minut po rozmrożeniu. Integralność akrosomalna plemników oceniono stosując różnicową mikroskopię interferencyjno-kontrastową (x 1000) po 2 godzinach inkubacji w 37°C. Plemniki poddano działaniu 40 mM fluorku sodu, sporządzono mokry wymaz i zbadano 100 plemników na traktowanie. Akrosomy sklasyfikowano jako: (a) akrosomy nienaruszone, (b) akrosomy obrzmiałe lub uszkodzone lub (c) akrosomy nieprawidłowe (nienienaruszone).
4. Analiza statystyczna. Analizowane dane pochodziły z 19 różnych dat mrożenia od 3 byków stosowanych w próbach terenowych. Wpływy traktowań (sortowane vs. kontrola) oceniono przez analizę wariancji z bykami jako efektem ustalonym.
5. Wyniki. Odsetek plemników o postępowej ruchliwości po rozmrożeniu był znacznie wyższy (P < 0,05) dla niesortowanych plemników (50%) niż dla sortowanych (46%; tabela 8), pomimo usunięcia martwych plemników podczas sortowania. Jednak odsetek plemników z nienaruszonym akrosomem nie różnił się. Sortowanie zwiększało odsetek plemników o brakującym akrosomie, ale również zmniejszało odsetek plemników z uszkodzonym akrosomem, w stosunku do kontrolnych plemników (P < 0,05). Wśród byków występowały istotne różnice w odsetku nienaruszonych akrosomów (P < 0,05), odsetku nie nienaruszonych akrosomów (P < 0,01) i postępowej ruchliwości po rozmrożeniu (P < 0,01). Występował efekt byk x sortowanie dla ruchliwości po rozmrożeniu (p < 0,01), ale nie dla innych odpowiedzi. Od byków A i B różnice w ruchliwości po rozmrożeniu między sortowanymi i niesortowanymi plemnikami były bliskie zeru; dla byka C plemniki sortowane miały ruchliwość o 10 punktów procentowych (19%) niższą niż plemniki kontrolne.
PL 211 512 B1
T a b e l a 8
Wpływ sortowania na ruchliwość po rozmrożeniu (%) i stan akrosomu (%)
| Stan akrosomu | ||||
| Nienaruszony | Uszkodzony | Nienaruszony | Ruchliwość po rozmrożeniu | |
| Kontrola | 64a | 20a | 15a | 50a |
| Sortowane | 65a | 14b | 21b | 46b |
Kolumnowe średnie z różnymi wykładnikami różnią się (P < 0,05).
6. Wniosek. Wizualne oceny postępowej ruchliwości dla sortowanych, mrożonych plemników średnio były nieznacznie niższe (4 punkty procentowe; 8%) niż dla plemników kontrolnych, chociaż dla jednego byka różnica ta była większa. Ocen tych dokonano w przybliżeniu 10 minut po rozmrożeniu. Mała średnia różnica jest zgodna z różnicą dla nie-nienaruszonych akrosomów po 2 godzinach inkubacji. Plemniki z uszkodzonym lub nieprawidłowym akrosomem są prawdopodobnie nieruchliwe. Wzrost odsetka plemników z nienaruszonym akrosomem dla sortowanych próbek, wskazuje na uszkodzenie związane z sortowaniem lub z kriokonserwacją przed lub po aktualnym sortowaniu. Przypuszczalnie sortowanie przekształca uszkodzone akrosomy w akrosomy nieprawidłowe. W oparciu o standardowe procedury oceny jakości nasienia nie istnieją podstawy do przypuszczenia, że dla większości byków potencjał zapładniający tych przepływowo sortowanych plemników mógłby być poważnie zagrożony.
P r z y k ł a d 7. Selekcja według płci i kriokonserwacja plemników byka z użyciem rozcieńczalnika 20% żółtko jaja-Tris
Cel: Dostarczenie protokołu kriokonserwacji przepływowo sortowanych plemników.
1. Pobranie i oszacowanie ejakulatu. Ejakulaty pobrano i przygotowano jak opisano w przykładzie 1A. Wybrano ejakulaty od byków z plemnikami o prawidłowej morfologii > 75%. Oszacowano wizualnie odsetek plemników o postępowej ruchliwości (najlepsze do sortowania są ejakulaty z ruchliwością postępową > 60%). Do surowego nasienia dodano następujące antybiotyki: tylozynę w końcowym stężeniu 100 μg/ml, gentamycynę w końcowym stężeniu 500 μg/ml i linkospektynę w końcowym stężeniu 300/600 μg/ml.
2. Barwienie i przygotowanie do sortowania. Po dodaniu antybiotyków do próbki surowego nasienia odczekano 15-20 minut przed barwieniem. Barwienie próbek opisano w przykładzie 2.
3. Sortowanie. Sortowano plemniki zarówno z chromosomem X jak i Y, przy ustawieniu bramek sortowania na 90% czystości. Plemniki sortowano do 50 ml probówek Falcona zawierających 2 ml frakcji A rozcieńczalnika 20% żółtko jaja-Tris (patrz przykład 2), aż każda probówka zawierała maksimum 20 ml objętości (lub maksimum 2 godziny na sortowanie), a końcowe stężenie sortowanych 5 plemników wynosiło 6 x 105/ml. Odnotowano, że dodatkowy bufor wychwytujący-frakcja A-20% żółtko jaja-Tris trzeba dodać po sortowaniu i przed chłodzeniem, tak, że końcowy procent żółtka jaja wynosi przynajmniej 3%.
4. Przygotowanie do zamrażania. Po sortowaniu, chłodzono sortowane próbki do 5°C przez okres 90 minut. Po schłodzeniu dodano frakcję B rozcieńczalnika 20% żółtko jaja-Tris (patrz przykład 2) stopniowo (2 x) w 15 minutowych odstępach. Końcowa objętość frakcji B rozcieńczalnika Tris dodanego do próbki plemników powinna być równa objętości frakcji A rozcieńczalnika Tris. Całkowita objętość próbki plemników po dodaniu frakcji B rozcieńczalnika Tris nie powinna przekraczać 27 ml całkowitej objętości. Po dodaniu do próbki plemników frakcji B rozcieńczalnika Tris, próbkę zagęszczono przez 20 minutowe wirowanie przy 850 x g. Zaaspirowano supernatant pozostawiając w przybliżeniu 150 μl osadu plemników. Plemniki ponownie zawieszono i spulowano plemniki od każdego indywidualnego byka.
5. Zamrażanie. Dodano kompletny rozcieńczalnik żółtko jaja-Tris (6% glicerol) do osiągnięcia końcowego stężenia plemników 20 x 106/ml. Rozrzedzone plemniki do zamrożenia umieszczano w 0,25 ml słomkach z polichlorku winylu, jak opisano w przykładzie 2.
P r z y k ł a d 8. Ocena płodności zamrożonych plemników byków przepływowo sortowanych w badaniach terenowych
Materiały i metody
Zbiórka i obróbka nasienia
PL 211 512 B1
Nasienie od młodych byków o nieznanej płodności zebrano za pomocą sztucznej pochwy (patrz przykład 1A). Po określeniu stężenia nasienia spektrofotometrem i subiektywnej ocenie postępowej ruchliwości plemników, nasienie poddano obróbce i sortowano plemniki jak opisano w przykładzie 2, z tym wyjątkiem, że plemniki sortowano według płci przy 90% czystości stosując moc padającą lasera około 135 do około 150 mW. Obróbkę i zamrożenie przeprowadzono jak w przykładzie 2, z tym wyjątkiem, że czas równoważenia wynosił około 3 godzin. Do ciekłego nasienia w trzech próbach terenowych zastosowano uniwersalny rozcieńczalnik Cornella (Seidel G. E. Jr., Theriogenology 1997; 48: 1255-1264). Do zamrożonych plemników w próbach terenowych 2 i 3 zastosowano rozcieńczalnik: 2,9% cytrynian sodu + 20% żółtko jaja o końcowym stężeniu glicerolu 7% (patrz przykład 1). Do prób terenowych 4 do 11 plemniki zamrożono w rozcieńczalniku opartym na Tris złożonym z 200 mM Tris, 65 mM kwasu cytrynowego, 56 mM fruktozy, 20% żółtka jaja i końcowego stężenia glicerolu 6% (patrz przykład 2). Płynem osłonowym zastosowanym w cytometrii przepływowej był 2,9% cytrynian sodu (patrz przykład 4) dla próby 1, 2 i 3 i bufor Tris dla pozostałych prób (patrz przykład 2).
Plemniki umieszczono w 0,25 ml słomkach French w słupkach tak małych jak 50 μI w środku słomki. W celu zminimalizowania efektu rozrzedzenia stosowano małe objętości, które zawierały przynajmniej 107 plemników/ml, W większości prób najpierw aspirowano do słomki słupek rozcieńczalnika bez plemników w celu zmoczenia bawełnianej zatyczki, następnie mały słupek powietrza i następnie seksowane plemniki. Gdy plemniki zamrożono, jedną słomkę z każdej serii rozmrażano w wodzie o 35°C przez 30 sekund dla kontroli jakości, a serie z ruchliwością postępową po rozmrożeniu mniejszą niż 25% odrzucano. Próbki seksowanych plemników z każdej serii sonikowano i analizowano cytometrią przepływową w celu określenia dokładności seksowania.
Hodowla jałówek i sztuczna inseminacja
Wykorzystane jałówki pochodziły z 6 bardzo rozproszonych jednostek produkcyjnych o różnych praktykach hodowlanych. Sezonowe i hodowlane różnice przyczyniały się dodatkowo do różnorodności doświadczeń (tabela 9). W miarę możliwości traktowania kontrole były systematycznie modyfikowane w obrębie byków, w obrębie inseminatorów, gdy jałówki wchodziły do zabudowań, w których prowadzono inseminację. Ruję synchronizowano jednym z 4 sposobów (tabela 9): (1) podawanie 500 mg octanu melengesterolu (MGA) dziennie w 2,3 kg zboża przez 14 dni, po czym iniekcja domięśniowa 25 mg prostaglandyny F2α, (Lutalyse, Upjohn, Kalamazoo, MI, USA) 17, 18 lub 19 dni po ostatnim dniu podawania MGA (MGA/PG); (2) pojedyncza iniekcja 25 mg prostaglandyny F2α (PG); (3) 20 lub 25 mg prostaglandyny F2α wstrzykniętej domięśniowo w odstępach 12-dniowych (PG/PG) lub (4) 50 lub 100 Tg GnRH wstrzykniętych domięśniowo, a następnie 25 mg prostaglandyny F2α 7 dni później (GnRH/PG). Jałówki poddawano wizualnej inspekcji w celu oceny stanu rui rano i wieczorem, ale inseminacji dokonywano tylko wieczorami po 16:00, w przybliżeniu 1/2 lub 1 dzień po rozpoczęciu rui. Inseminacji dokonywano zarówno konwencjonalnie do trzonu macicy lub po połowie do każdego rogu macicy stosując osłonki do nietraumatycznego transferu embrionu (IMV, Minneapolis, MN, USA). W drugim przypadku nasienie złożono za krzywizną większą rogu macicy tak daleko do przodu, jak można to było przeprowadzić bez urazu, identycznie jak niechirurgicznym transferem embrionu. W większości przypadków nasienie złożono między trzecim przednim a środkowym rogiem. Większość doświadczeń obejmowała inseminacje do trzonu macicy kontrolnego zamrożonego nasienia 20 lub 40 x 106 plemników/dawkę od tych samych byków, które wykorzystano do sortowania plemników według płci („seksowanie”). Kontrola ta posłużyła za złożone oszacowanie wewnętrznej, prawidłowej płodności jałówek w konkretnych warunkach próby terenowej, jak również płodności byków i wprawy inseminatorów. Niektóre próby obejmowały również niską dawkę kontrolnej nieseksowanej grupy kontrolnej. Czasami liczbę kontrolnych inseminacji planowano na 1/2 lub 2/3 liczby stosowanej dla każdego traktowania w celu otrzymania więcej informacji o seksowanych plemnikach. Mrożone seksowane plemniki i plemniki kontrolne rozmrażano przez 20 do 30 sekund w kąpieli wodnej o 35 do 37°C. Różne inne szczegóły podsumowano w tabeli 9. Ciążę diagnozowano ultrasonograficznie 28 do 37 dnia po inseminacji i/lub 56 do 92 dnia po inseminacji, w którym to czasie w większości prób określono płeć płodu, jak opisali Curran, S., Theriogenology 1991; 36: 809-814, bez wiedzy operatora o tym czy inseminacji dokonano nasieniem poddanym traktowaniu czy kontrolnym. Płci urodzonych cieląt były prawie identyczne z diagnozą płci płodu. Dane analizowano w teście chi-kwadrat z jednym stopniem swobody, Z poprawką na ciągłość; jeżeli nie wyszczególniono testów 1-stronnych, to zastosowano testy 2-stronne. Mniej niż 5% inseminacji wycofano z powodu błędów w zabiegu inseminacyjnym, wstępującej infekcji dróg rodnych, niemożności przejścia szyjki, itp. Decyzje o wycofaniu zwierząt z doświadczeń podejmowano krótko po inseminacji i nigdy w oparciu o diagnozę ciąży.
PL 211 512 B1
T a b e l a 9
Proceduralne szczegóły prób terenowych
| Próba | Daty insemi- nacji | Rasy jałówek | Wykorzystane byki | Insemina- torzy | Synchronizacja rui | Uwagi |
| 1 | 5/20-23 1997 | Angus | N1, N2, AN4 | A, B | MGA/PG | Obejmowała kontrole o niskiej dawce |
| 2 | 2/18-5/22 1998 | Angus mieszaniec | N3, N4, N5, N6 | C, D | PG/PG | Niska dawka, ale kontrole o normalnej dawce; niektóre jałówki ciężarne i po poronieniu przy synchronizacji |
| 3 | 6/2-6/5 1998 | Angus | AN4, AN5, N7, N8 | B, D | MGA/PG | |
| 4 | 2/10-13 1999 | Holstein | J2, J4 | C, D | PG | Błoto, śnieg, wiatr i zimno, ulewny deszcz |
| 5 | 2/24-26 1999 | Holstein | J2, J4, J5 | C, B, D | PG/PG | |
| 6 | 4/14-16 1999 | Holstein | J2, J3, J4, J5 | C, D | PG | Niektóre jałówki wycofano z reprodukcji |
| 7 | 4/27-5/1 1999 | Hereford & Angus mieszaniec | AN1, AN4 | C | MGA/PG | Nasienie 1 byka ekspediowano 6 godzin przed sortowaniem; ciężka pogoda |
| 8 | 4/21-23 1999 | Angus mieszaniec | H1, H2 | E | MGA/PG | Jałówki pastwiskowe |
| 9 | 5/5-8 1999 | Czerwony Angus | AR1, AR2 | C, F | MGA/PG | |
| 10 | 5/31-6/2 1999 | Angus | AN4, AN7, AN8 | B, D | GnRH/PG | |
| 11 | 7/28-30 1999 | Holstein | H2, H3 | C, D | PG/PG | Pierwsza replikacja możliwa w znacznie większej próbie |
Wyniki i omówienie
Przedstawione dane pochodzą z 11 kolejnych, heterogennych prób terenowych, ograniczonych przez aspekty logistyczne badań, takie jak posiadanie byków dopasowanych do potrzeb genetycznych stada, niedostępność informacji o płodności byków, ograniczona liczba jałówek, niedostępność tych samych inseminatorów w próbach, ciężka pogoda w niektórych próbach, ograniczona ilość seksowanego nasienia we wcześniejszych próbach, 2 grupy jałówek, u których stwierdzono ciążę do około 55 dni od czasu synchronizacji rui, itp. W każdej próbie brało udział do 4 byków i 3 inseminatorów; umożliwiło to próbkowanie populacji w celu zagwarantowania, że wyniki mają zastosowanie nie tylko dla jednego byka czy technika; jednak uzyskano niedostateczne dane do precyzyjnej oceny różnic w płodności pomiędzy bykami.
Większość grup jałówek pochodziło ze stad rozpłodowych zlokalizowanych 140 do 250 km od naszego laboratorium. Nie występowały istotne różnice we wskaźniku ciąż między inseminatorami w dowolnej próbie, ale liczby rozpłodów na inseminatora były niskie i różnice mogłyby być wykryte przy większej liczbie inseminacji.
W próbach nie porównywano sposobów synchronizacji rui, zatem niemożliwe było porównanie wskaźnika ciąż między tymi sposobami. Wskaźniki ciąż okazały się zadawalające dla wszystkich czterech zastosowanych procedur synchronizacyjnych.
Ponieważ inseminacje wykonywano raz dziennie, jałówki z wieczorną rują poddawano inseminacji w przybliżeniu 24 godziny po wykryciu rui.
PL 211 512 B1
Wskaźnik ciąż dla tych jałówek zapłodnionych seksowanym nasieniem we wszystkich próbach wynosił 203/414 (49,0%), co nie różni się znacznie (P > 0,1) od tych jałówek z poranną rują, a zatem poddawanych inseminacji pół dnia po wykryciu rui 266/586 (45,4%).
Ta tendencja do wyższej płodności przy późniejszej inseminacji jest zgodna z wynikami innych badań, że korzystne jest dokonywanie późnej inseminacji niż normalnie zalecana przy niższej płodności byków, gdy stosowano małą ilość nasienia lub gdy warunki są poza tym suboptymalne.
Wskaźniki ciąż do traktowań, i gdy jest to osiągalne, płeć płodów lub cieląt przedstawiono w tabelach 10 do 20. Celem było otrzymanie potomstwa płci żeńskiej, z wyjątkiem próby 8; dokładność wynosiła 95%, 83%, 90%, 83%, 82% i 94% odpowiednio w próbach 1, 3, 8, 9, 10 i 11. W pozostałych próbach płeć płodu lub urodzeniowa były niedostępne z powodu braku koordynacji diagnostyki ciąży, niedostępności specjalistów mogących określić płeć płodów i/lub ponieważ cielęta jeszcze się nie urodziły. Nie miało to większego znaczenia, ponieważ głównym celem badania było określenie potencjału zapładniającego sortowanego przepływowo nasienia, z zastosowaniem niskich jego dawek do inseminacji.
Dokładność seksowania może być dostosowana do potencjalnie dowolnego żądanego poziomu między 50 i 95+% przez dostosowanie parametrów sortowania. Jednak większą dokładność uzyskuje się przy mniejszej liczbie plemników sortowanych w jednostce czasu, szczególnie dla plemników z chromosomem Y. W rutynowej pracy wystarczająca jest 90% dokładność.
Główne wyniki z każdej próby terenowej będą kolejno podsumowane. Należy zwrócić uwagę, że całkowite liczby plemników są podane w nagłówkach tabeli; liczby plemników z postępową ruchliwością stanowią zwykle 30 do 50% tych wartości. Próba terenowa 1 (tabela 10) potwierdza, że wskaźnik ciąż przy inseminacji do rogu macicy z zastosowaniem małej liczby nieseksowanych plemników był podobny do kontroli z normalną liczbą plemników.
Wskaźnik ciąż 64 do 67 dnia przy zastosowaniu niemrożonego seksowanego nasienia (42%) wynosił 12 punktów procentowych poniżej ciekłej nieseksowanej kontroli z nasieniem rozrzedzonym, barwionym i wirowanym identycznie jak nasienie sortowane.
Dokładność seksowania wynosiła 95%; płeć cieląt urodzonych po zapłodnieniu nasieniem seksowanym dokładnie odpowiadała diagnozowanej płci płodu; wystąpiła jedna pomyłka w określeniu płci płodu kontroli.
Nie było poronień między 2 miesiącem a końcem ciąży i wszystkie 19 cieląt poczętych w wyniku traktowania seksowanym nasieniem było normalnych i przeżyło.
Przy traktowaniu seksowanym nasieniem determinującym wskaźniki 2-miesięcznych ciąż dla byków N1, N2 i N3 wynosiły odpowiednio 41, 44 i 40%; 39% (13/33) jałówek z rują poranną i 50% (6/12) z rują wieczorną stało się cielnymi.
T a b e l a 10
Wyniki próby terenowej 1 - jałówki Angus z Wyoming, 1997
| Traktowanie/miejsce | Liczba plemników | Liczba jałówek | Liczba ciąż dzień 31 do 33 | Liczba ciąż dzień 64 do 67 | Liczba cieląt płci żeńskiej |
| Seksowane plemniki, 5°C/rogi | 3 x 105 | 45 | 20 (44%) | 19 (42%) | 18 (95%)a |
| Plemniki kontrolne, 5°C/rogi | 3 x 105 | 28 | 15 (54%) | 15 (54%) | 5 (53%)b |
| Plemniki kontrolne mrożone/trzon | 40 x 106 | 29 | 16 (55%) | 15 (52%) | 11 (73%)a,b |
a,b Wskaźniki płci bez wspólnych wykładników różnią się (P < 0,02).
W próbie terenowej 2 (tabela 11) dostarczono pierwszy dowód, że wyniki z seksowanym zamrożonym nasieniem, są podobne jak z niemrożonym seksowanym nasieniem, jeżeli zrobi się poprawkę na liczbę plemników, które nie przeżyły kriokonserwacji. Nie stwierdzono również różnicy we wskaźnikach ciąż między seksowanym nasieniem przechowywanym w 5 versus 18°C.
Wskaźniki ciąż przy 2 + miesiącach po inseminacji dla nasienia seksowanego od indywidualnych byków mieściły się w zakresie od 22 do 42% ciąż (P > 0,05).
Strata embrionów między 1 a 2 miesiącem ciąży była podobna dla ciąży będących wynikiem inseminacji seksowanym nasieniem i kontrolnym.
Z tej próby były dostępne dane cielenia od 39 jałówek; każda z tych jałówek (30 ciąż będących efektem inseminacji z użyciem seksowanego nasienia, 9 kontroli) cielna w 2 miesiącu ocieliła się po ciąży prawidłowej długości.
PL 211 512 B1
T a b e l a 11
Wyniki próby terenowej 2 - jałówki Crossbred w Kolorado, 1998
| Traktowanie/miejsce | Liczba plemników | Liczba jałówek | Liczba ciąż dzień 30 do 35a | Liczba ciąż dzień 59 do 92a |
| Plemniki kontrolne, 5°C/rogi | 5 x 105 | 58 | 27 (47%) | 24 (41%) |
| Seksowane plemniki, 5°C/rogi | 5 x 105 | 51 | 17(33%) | 16 (31%) |
| Seksowane plemniki, 18°C/rogi | 5 x 105 | 46 | 16 (35%) | 12 (26%) |
| Plemniki kontrolne mrożone/rogi | 1 x 106 | 87 | 29 (33%) | 28 (32%) |
a bez znacznych różnic, χ2.
Próba terenowa 3 potwierdziła, że seksowane zamrożone nasienie daje racjonalne wskaźniki ciąż. Ponownie potwierdzono dokładność seksowania nasienia; jednak wystąpiły 4 błędy w określeniu płci płodów w stosunku do narodzonych cieląt. Przedstawiono aktualną płeć urodzonych cieląt. I znów nie było poronień między 2 miesiącem a końcem ciąży. Obliczone średnie wskaźniki ciąż dla seksowanego i niezamrożonego nasienia i dla seksowanego i zamrożonego nasienia dla byków N8, N9, AN5 i AN4 wynosiły odpowiednio 24, 31, 50 i 60% (P < 0,1).
T a b e l a 12
Wyniki próby terenowej 3 - jałówki Angus w Wyoming, 1998
| Traktowanie/miejsce | Liczba plemników | Liczba jałówek | Liczba ciąż dzień 62 do 65 | Liczba cieląt płci żeńskiej |
| Seksowane plemniki seksowane 18°C/rogi | 5 x 105 | 37 | 11 (30%)a | 18 (91%)a |
| Seksowane plemniki seksowane, mrożone/rogi | 1 x 106 | 35 | 18 (51%)a,b | 14(78%)c |
| Plemniki kontrolne mrożone/trzon | 40 x 106 | 37 | 27 (73%)b | 16 (59%)d |
a,b średnie bez wspólnych wykładników różnią się (P < 0,05).
c,d odsetek cieląt płci żeńskiej z zabiegów z nasieniem seksowanym (83%) różnił się od grupy kontrolnej, P < 0,05, 1-stronny, χ2.
4, 5 i 6 próbę terenową (tabele 13, 14, 15) wykonano w tym samym miejscu z trzema różnymi grupami jałówek. Niestety, nie było możliwe powtórzenie każdej próby podobnie z powodu ograniczeń prób terenowych, takich jak harmonogram personelu, dostępność seksowanego nasienia od każdego byka, itp. Znaczne różnice wskaźników ciąż między próbami 5 a 6 wskazują na różne warunki prób. Niektóre jałówki w próbie 6 były na zbyciu, ponieważ nie udało się u nich uzyskać ciąży po miesiącu naturalnego krycia. W warunkach tych prób wskaźniki ciąż były bardzo podobne - w zakresie 1,5 a 3,0 x 106 seksowanych, zamrożonych plemników/dawkę. Ponadto, nie występowały korzyści z inseminacji do rogu macicy. Nie było znacznych różnic (P > 0,05) we wskaźnikach ciąż wśród byków z wyjątkiem próby 5, w której wskaźnik ciąż dla J2, 20/28 (71%) był wyższy niż J4, 15/39 (38%) (P < 0,05). Różnica ta nie była stała w kolejnych próbach, ponieważ J4 miał liczbowo ale nieznacznie (P > 0,1) wyższe wskaźniki ciąż niż J2 w próbach 4 i 6.
T a b e l a 13
Wyniki próby terenowej 4 - jałówki Holstein w Kolorado, 1999
| Traktowanie g/miejsce | Liczba plemników | Liczba jałówek | Liczba ciąż dzień 30 do 33 | Liczba ciąż dzień 64 do 67* |
| Seksowane plemniki - seksowane, zamrożone/trzon | 1,5 x 106 | 55 | 36 (65%)a,b | 36 (65%)a,b |
| Seksowane plemniki, mrożone/trzon | 3 x 106 | 52 | 27 (52%)a | 26 (50%)a |
| Plemniki kontrolne mrożone/trzon | 20 x 106 | 55 | 45 (82%)b | 43 (78%)b |
a,b średnie bez wspólnych wykładników różnią się (P < 0,01).
* Sześć ciężarnych jałówek w 30 do 33 dniu sprzedano przed drugą diagnostyką ciąży; przyjęto, że ciąże u tych jałówek przetrwały.
PL 211 512 B1
T a b e l a 14
Wyniki próby terenowej 5 - jałówki Holstein w Kolorado, 1999
| Traktowanie/miejsce | Liczba plemników | Liczba jałówek | Liczba ciąż dzień 33 do 35 | Liczba ciąż dzień 60 do 62a |
| Seksowane plemniki, mrożone/trzon | 1,5 x 106 | 23 | 12 (52%) | 12(52%) |
| Seksowane plemniki, mrożone/trzon | 3 x 106 | 25 | 15(60%) | 14(56%)a |
| Seksowane plemniki, mrożone/rogi | 1,5 x 106 | 25 | 15(60%) | 12 (48%) |
| Seksowane plemniki, mrożone/rogi | 3 x 106 | 25 | 17(68%) | 15 (60%) |
| Plemniki kontrolne, mrożone/trzon | 20 x 106 | 30 | 20 (67%) | 19 (63%) |
a Bez znacznych różnic
T a b e l a 15
Wyniki 6 próby terenowej - jałówki Holstein w Kolorado, 1999
| Traktowanie/miejsce | Liczba plemników | Liczba jałówek | Liczba ciąż dzień 31 do 34 | Liczba ciąż dzień 60 do 63 |
| Seksowane plemniki, mrożone/trzon | 1,5 x 106 | 27 | 11 (41%)a | 9 (33%)a |
| Seksowane plemniki, mrożone/trzon | 3 x 106 | 25 | 10 (40%)a | 9 (36%)a |
| Seksowane plemniki, mrożone/rogi | 1,5 x 106 | 24 | 8 (33%)a | 7 (29%)a |
| Seksowane plemniki, mrożone/rogi | 3 x 106 | 24 | 10 (42%)a | 8 (33%)a |
| Plemniki kontrolne, mrożone/trzon | 20 x 106 | 24 | 18 (75%)b | 17 (71%)b |
a,b średnie bez wspólnych wykładników różnią się (P < 0,05).
W 7 próbie (tabela 16) dostępny był tylko jeden inseminator z powodu zmian w planowaniu. Jest to jedyna próba pokazująca przekonujące korzyści inseminacji do rogu macicy nad inseminacją do trzonu macicy.
Dla tego inseminatora w warunkach próby 55% więcej jałówek (22 punkty procentowe) było ciężarnych po zastosowaniu seksowanego nasienia, zamrożonego, umieszczonego w rogach macicy, a nie w trzonie macicy.
Prawdziwa różnica może być mniejsza, ponieważ występował szeroki przedział ufności dla tych średnich. We wszystkich pozostałych próbach (5, 6, 9 i 11), w których porównywano inseminację do trzonu i do rogów macicy, wskaźniki ciąż były bardzo podobne dla obu sposobów dla tego technika, jak również dla innych techników.
Nasienie od jednego z byków zastosowane w próbie 7 przewieziono bez rozrzedzenia drogą powietrzną z Montany w izolowanym pojemniku w ~ 20°C przed sortowaniem; czas przewozu wynosił 6 godzin.
Wskaźniki ciąż dla seksowanego nasienia od dwóch byków były rzeczywiście identyczne, 49% dla nieprzewożonego nasienia i 52% dla przewożonego nasienia. Nasienia nie rozrzedzano rozcieńczalnikiem i nie chłodzono do przewozu, ponieważ właściwości barwienia nasienia Hoechst 33342 zmieniały się pod wpływem rozrzedzenia rozcieńczalnikami.
Ponadto, w innych badaniach (patrz przykład 4) stwierdzono, że przechowywanie czystego nasienia w temperaturze otoczenia między pobraniem a sortowaniem przepływowym jest lepsze niż jego rozrzedzenie.
T a b e l a 16
Wyniki próby terenowej 7 - jałówki Crossbred beef w Kolorado, 1999
| T raktowanie/miejsce | Liczba plemników | Liczba jałówek | Liczba ciąż dzień 33 do 35 |
| Seksowane plemniki, zamrożone/trzon | 1,5 x 106 | 86 | 34 (40%)a |
| Seksowane plemniki, zamrożone/trzon | 1,5 x 106 | 86 | 53 (62%)b |
| Seksowane plemniki, zamrożone/rogi | 20 x 106 | 35 | 18 (51%)a,b |
a,b średnie bez wspólnych wykładników różnią się (P < 0,01).
PL 211 512 B1
Próba terenowa 8 (tabela 17) dotyczyła jałówek „feedlot”, u których nie doszło do implantacji z dużymi czynnikami promocyjnymi; w okresie zdiagnozowanej ciąży poroniły, tak więc dane dotyczące cielenia nie były dostępne. Ten eksperyment pokazał, że skuteczne potomstwa seksowane także może być ukierunkowane na płeć męską. Wskaźniki ciąż dla dwóch byków wynosiły 50 i 61%.
T a b e l a 17
Wyniki próby terenowej 8 - jałówki Angus w Nebrasce, 1999
| Traktowanie/miejsce | Liczba plemników | Liczba jałówek | Liczba ciąża dzień 74 do 76 | Liczba płodów płci męskiej |
| Seksowane plemniki, zamrożone, laser 72 mW/trzon | 1 x 106 | 18 | 7 (39%) | 6 (86%) |
| Seksowane plemniki, zamrożone, laser 135 mW/trzon | 1 x 106 | 18 | 13 (78%) | 12 (92%) |
a Bez znacznych różnic.
Próba terenowa 9 (tabela 18) była jedyną próbą wykazującą przekonywującą przewagę dawki 3,0 versus dawka 1,5 x 106) seksowanych, zamrożonych plemników/dawka inseminacyjna.
Przewaga ta była prawdziwa dla obu inseminatorów.
Wskaźniki ciąż dla seksowanych plemników od 2 byków wynosiły 62 i 75%.
T a b e l a 18
Wyniki próby terenowej 9 - jałówki Red Angus w Nebrasce, 1999
| Traktowanie/miejsce | Liczba plemników | Liczba jałówek | Liczba ciąż dzień 60 do 63a | Liczba płodów płci żeńskiej |
| Seksowane plemniki, mrożone/trzon | 1,5 x 106 | 15 | 8 (53%) | 7 (88%) |
| Seksowane plemniki płci, mrożone/trzon | 3 x 106 | 14 | 12 (86%) | 9 (75%) |
| Seksowane plemniki, mrożone/rogi | 1,5 x 106 | 16 | 9 (56%) | 7 (78%) |
| Seksowane plemniki, mrożone/rogi | 3 x 106 | 16 | 12 (75%) | 11 (92%) |
| Plemniki kontrolne mrożone/trzon | 20 x 106 | 30 | 21 (70%) | 13 (62%) |
a 3,0 x 106 seksowanych plemników miało wyższy wskaźnik ciąż (80%) niż 1,5 x 106 (55%), P < 0,05, 1-stronny χ2.
Wskaźniki ciąż w 10 próbie terenowej (tabela 19) z zamrożonym seksowanym nasieniem były podobne do kontroli; dokładność seksowania nasienia w tej próbie wynosiła tylko 82%, co jednak nie stanowi znacznej różnicy wobec docelowej 90% dokładności.
Wskaźniki ciąż dla seksowanego nasienia wynosiły odpowiednio 54, 66 i 50% dla byków AN4,
AN7 i AN8 (P > 0,1).
Osiemnaście jałówek poddanych inseminacji w tej próbie było cielętami pochodzącymi z ciąż po zastosowaniu seksowanego nasienia w próbie terenowej 1.
T a b e l a 19
Wyniki próby terenowej 10 - jałówki Angus w Wyoming, 1999
| Traktowanie/miejsce | Liczba plemników | Liczba jałówek | Liczba ciąż dzień 61 do 63a | Liczba płodów płci żeńskiej |
| Seksowane plemniki, mrożone/trzon | 1 x 106 | 44 | 26 (59%) | 23 (85%) |
| Seksowane plemniki, mrożone/trzon | 3 x 106 | 43 | 23 (53%) | 17 (74%) |
| Plemniki kontrolne mrożone/trzon | 20 x 106 | 35 | 20 (57%) | 12 (57%) |
a Bez znacznych różnic.
PL 211 512 B1
T a b e l a 20
Wyniki próby terenowej 11 - jałówki Holstein w Kolorado, 1999
| Zabieg/miejsce | Liczba plemników | Liczba jałówek | Liczba ciąż dzień 28 do 30a | Liczba ciąż dzień 56 do 58a,b |
| Seksowane plemniki, mrożone/trzon | 1 x 106 | 12 | 8 (67%) | 7 (58%) |
| Seksowane plemniki, mrożone/trzon | 3 x 106 | 12 | 6 (50%) | 4 (33%) |
| Seksowane plemniki, mrożone/rogi | 1 x 106 | 7 | 4 (57%) | 4 (57%) |
| Seksowane plemniki, mrożone/rogi | 3 x 106 | 7 | 4 (57%) | 4 (57%) |
| Plemniki kontrolne mrożone/trzon | 20 x 106 | 9 | 4 (44%) | 3 (33%) |
a Bez znacznych różnic, χ2.
b 16 z 17 płodów (94%) z zabiegów z zastosowaniem seksowanego nasienia było płci żeńskiej; 2 były zbyt głęboko w jamie trzonu do ultrasonograficznego określenia płci.
Dane z prób, w których zabiegi były identyczne, połączono, z tym wyjątkiem, że spulowano dawki 1 x 10 i 1,5 x 106 plemników (tabela 21).
T a b e l a 21
Podsumowanie połączonych prób z zamrożonym seksowanym nasieniem i zamrożonymi kontrolami
| Połączone próby | Liczba plemników/miejsce | Liczba jałówek | Liczba ciąż |
| 5, 6, 9, 11 | 1,0-1,5 x 106/trzon | 77 | 36 (47%) |
| 3,0 x 106/trzon | 76 | 38 (50%) | |
| 1,0-1,5 x 106/rogi | 72 | 32 (44%) | |
| 3,0 x 106/rogi | 72 | 39 (54%) | |
| 20 x 106/trzon, kontrola | 93 | 61 (66%) | |
| 4, 5, 6, 9, 10, 11 | 1,0-1,5 x 106/trzon | 176 | 98 (56%) |
| 3,0 x 106/trzon | 171 | 88 (51%) | |
| 20 x 106/trzon, kontrola | 183 | 124(68%) | |
| 5, 6, 7, 9, 11 | 1,5 x 106/trzon | 163 | 70 (43%) |
| 1,5 x 106/róg | 158 | 85 (54%) | |
| 20 x 106/trzon, kontrola | 128 | 79 (62%) |
Wskaźniki ciąż z seksowanego nasienia determinującego określoną płeć wynosiły generalnie 70-90% kontroli o nieokreślonej płci w doświadczeniach z 7 do 20 razy większą ilością plemników. Różnica ta była mniejsza we wcześniejszych próbach, co mogło być odbiciem wpływu procedur seksowania i przygotowywania nasienia. W niektórych próbach badano ultrasonograficznie ciążę u jałówek zarówno 1, jak i 2 miesiące po inseminacji. Straty ciąż w tym przedziale były podobne (P > 0,1) dla traktowań z seksowanym nasieniem (23/261; 8,8%) w porównaniu z kontrolnym (9/145; 6,2%), co jest miarą tego, że uszkodzenie genetyczne spowodowane seksowaniem jest minimalne. Informacje o cieleniu się otrzymano tylko o kilku ciężarnych jałówkach, ponieważ większość bydła z wcześniejszych prób sprzedano, a te z późniejszych prób jeszcze się nie ocieliły. Populacja cieląt wyprodukowana po dzień dzisiejszy z seksowanego nasienia nie różni się od populacji kontrolnej.
Wnioski
Proporcje płci u bydła mogą być zniekształcone do około 90% dla obu płci przez sortowanie nasienia na podstawie zawartości DNA w cytometrze przepływowym/sorterze komórkowym, następnie kriokonserwacji i odpowiednio rutynowej sztucznej inseminacji. Cielęta poczęte z seksowanego nasienia wydają się być normalne. W badaniach tych dla większości byków wskaźniki ciąż z 1,0 do 1,5 x 106 seksowanych, zamrożonych plemników wynosiły 70 do 90% nieseksowanych kontroli z 20 lub 40 x 106 zamrożonych plemników w konwencjonalnej inseminacji. Wyniki te mają zastosowanie w dobrze zarządzanej hodowli jałówek przy dobrze wyszkolonych inseminatorach stosujących właściwie obrobione nasienie. Może istnieć mała przewaga inseminacji seksowanego nasienia dwustronnie do rogów macicy w porównaniu ze standardową inseminacją do trzonu macicy.
Claims (18)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób kriokonserwacji plemników z wyłączeniem plemników ludzkich, znamienny tym, że obejmuje:(a) otrzymywanie próbki plemników z wyłączeniem plemników ludzkich;(b) dodawanie do próbki plemników początkowego rozcieńczalnika obejmującego fizjologiczne dopuszczalny nośnik i jeden lub więcej z następujących składników:i) składnik, który utrzymuje osmolalność i buforuje pH;ii) substancję organiczną, która zmniejsza udar chłodowy i zabezpiecza płodność plemników;iii) źródło energii, iv) substancję, która ułatwia kapacytację plemników; iv) antybiotyk, selekcjonowanie plemników metodą cytometrii przepływowej, z wytworzeniem próbki selekcjonowanych plemników, przy czym plemniki są selekcjonowane według płci, a etapy dodawania i selekcjonowania przeprowadza się w dowolnej kolejności;(c) ochłodzenie próbki selekcjonowanych plemników do temperatury 22°C do 5°C przez okres 60 do 240 minut;(d) izolowanie plemników ze schłodzonej próbki selekcjonowanych plemników z uzyskaniem schłodzonych izolowanych plemników;(e) dodawanie końcowego rozcieńczalnika obejmującego oprócz fizjologicznie dopuszczalnego nośnika i krioprotektanta jeden lub więcej z następujących składników:i) składnik, który utrzymuje osmolalność i buforuje pH;ii) substancję organiczną, która zmniejsza udar chłodowy i zabezpiecza płodność plemników;iii) źródło energii, iv) substancję, która ułatwia kapacytację plemników; iv) antybiotyk, do schłodzonych, izolowanych plemników z wytwarzaniem schłodzonej zawiesiny plemników o stężeniu komórek plemników od 1 miliona na mililitr rozcieńczalnika do 300 milionów na mililitr rozcieńczalnika; i (f) mrożenie schłodzonej zawiesiny plemników w temperaturze od 5°C do -100°C.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako próbkę selekcjonowanych plemników stosuje się plemniki ssaka.
- 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako próbkę selekcjonowanych plemników stosuje się plemniki bydlęce.
- 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako próbkę selekcjonowanych plemników stosuje się plemniki końskie.
- 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako próbkę selekcjonowanych plemników stosuje się plemniki świńskie.
- 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że krioprotektant jest wybrany z grupy składającej się z dicukrów, tricukrów i dowolnej ich kombinacji.
- 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że krioprotektant jest wybrany z grupy składającej się z glicerolu, dimetylosulfotlenku, glikolu etylenowego, glikolu propylenowego i dowolnej ich kombinacji.
- 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że składnik utrzymujący osmolalność i buforujący pH jest wybrany z grupy składającej się z buforu, którym jest sól, buforu zawierającego węglowodan i dowolnej ich kombinacji.
- 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że składnik utrzymujący osmolalność i buforujący pH jest wybrany z grupy składającej się z cytrynianu sodu, Tris[hydroksymetylo]aminometanu, kwasu N-Tris[hydroksymetylo]metylo-2-aminoetanosulfonowego, glutaminianu sodowego, mleka, podłoża buforowanego HEPES i dowolnej ich kombinacji.
- 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że substancja organiczna jest wybrana z grupy składającej się z żółtka jaja, ekstraktu z żółtka jaja, mleka, ekstraktu z mleka, kazeiny, albuminy, lecytyny i dowolnej ich kombinacji.
- 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że źródłem energii jest monosacharyd wybrany z grupy składającej się z glukozy, fruktozy, mannozy i dowolnej ich kombinacji.PL 211 512 B1
- 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że antybiotyk jest wybrany składającej się z tylozyny, gentamycyny, linkomycyny, linkospektyny, spektynomycyny, penicyliny, streptomycyny i dowolnej ich kombinacji.
- 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po dodaniu końcowego rozcieńczalnika próbka nasienia i zawiesina plemników obejmuje odpowiednio glicerol, cytrynian sodu, Tris[hydroksymetylo]aminometan, żółtko jaja, fruktozę i jeden lub więcej antybiotyków.
- 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po dodaniu końcowego rozcieńczalnika próbka plemników i zawiesina plemników, każda, obejmuje glicerol, cytrynian sodu, żółtko jaja i jeden lub więcej antybiotyków.
- 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po dodaniu końcowego rozcieńczalnika ta próbka plemników i zawiesina plemników, każda, zawiera glicerol, żółtko jaja, mleko, fruktozę i jeden lub więcej antybiotyków.
- 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozcieńczalnik ma pH w zakresie 6,5 do 7,5.
- 17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że plemniki są izolowane z próbki selekcjonowanych plemników przez wirowanie.
- 18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że wirowanie umożliwia co najmniej 50% do 90% odzysk plemników.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16742399P | 1999-11-24 | 1999-11-24 | |
| US09/478,299 US7208265B1 (en) | 1999-11-24 | 2000-01-05 | Method of cryopreserving selected sperm cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL355853A1 PL355853A1 (pl) | 2004-05-31 |
| PL211512B1 true PL211512B1 (pl) | 2012-05-31 |
Family
ID=26863156
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL355853A PL211512B1 (pl) | 1999-11-24 | 2000-11-22 | Sposób kriokonserwacji plemników z wyłączeniem plemników ludzkich |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US7208265B1 (pl) |
| EP (2) | EP1557087B1 (pl) |
| JP (1) | JP2003530312A (pl) |
| KR (1) | KR100757753B1 (pl) |
| CN (1) | CN100367849C (pl) |
| AR (1) | AR026572A1 (pl) |
| AT (1) | ATE288197T1 (pl) |
| AU (1) | AU782919B2 (pl) |
| BG (1) | BG106731A (pl) |
| BR (1) | BR0016049A (pl) |
| CA (1) | CA2391370C (pl) |
| CZ (1) | CZ20021770A3 (pl) |
| DE (1) | DE60017945T2 (pl) |
| DK (1) | DK1557087T3 (pl) |
| EA (1) | EA200200593A1 (pl) |
| EE (1) | EE200200264A (pl) |
| ES (2) | ES2442382T3 (pl) |
| HU (1) | HUP0203920A2 (pl) |
| IL (1) | IL149802A0 (pl) |
| MX (2) | MX338434B (pl) |
| NZ (2) | NZ519078A (pl) |
| PL (1) | PL211512B1 (pl) |
| SK (1) | SK7222002A3 (pl) |
| UY (1) | UY26449A1 (pl) |
| WO (1) | WO2001037655A1 (pl) |
Families Citing this family (112)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU752985B2 (en) | 1997-01-31 | 2002-10-03 | Xy, Llc. | Optical apparatus |
| US6071689A (en) | 1997-12-31 | 2000-06-06 | Xy, Inc. | System for improving yield of sexed embryos in mammals |
| US6149867A (en) | 1997-12-31 | 2000-11-21 | Xy, Inc. | Sheath fluids and collection systems for sex-specific cytometer sorting of sperm |
| JP2002521043A (ja) | 1998-07-30 | 2002-07-16 | エックスワイ，インコーポレイテッド | 非外科的人工授精のためのウマシステム |
| US7208265B1 (en) * | 1999-11-24 | 2007-04-24 | Xy, Inc. | Method of cryopreserving selected sperm cells |
| EP2258174A3 (en) | 2000-05-09 | 2012-06-13 | Xy, Llc | High purity x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations of spermatozoa |
| JP2004503231A (ja) * | 2000-06-12 | 2004-02-05 | エックスワイ，インコーポレイテッド | Ｘ染色体保有精子およびｙ染色体保有精子の単離された集団を利用する統合群れ管理システム |
| CN1450857A (zh) * | 2000-08-10 | 2003-10-22 | Gtc生物治疗学公司 | 精子的低温保存 |
| WO2002043486A1 (en) | 2000-11-29 | 2002-06-06 | Xy, Inc. | System for in-vitro fertilization with spermatozoa separated into x-chromosome and y-chromosome bearing populations |
| US7713687B2 (en) | 2000-11-29 | 2010-05-11 | Xy, Inc. | System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations |
| KR20030014891A (ko) * | 2001-08-13 | 2003-02-20 | (주)베티즌 | 개 정액 냉각용 및 동결용 조성물, 이를 이용한 개 정액냉각 및 동결 방법 그리고 냉각 및 동결된 정액을 이용한개 인공수정 방법 |
| AU2003259205B2 (en) * | 2002-07-22 | 2009-10-08 | Xy, Llc. | Sperm cell process system |
| US11243494B2 (en) | 2002-07-31 | 2022-02-08 | Abs Global, Inc. | Multiple laminar flow-based particle and cellular separation with laser steering |
| US8486618B2 (en) | 2002-08-01 | 2013-07-16 | Xy, Llc | Heterogeneous inseminate system |
| EP2284256A3 (en) * | 2002-08-01 | 2012-08-29 | Xy, Llc | Low pressure sperm separation system |
| CN1675868B (zh) * | 2002-08-02 | 2010-09-29 | 西门子公司 | 通过错误隐蔽检测分析接收到的有用信息的方法和设备 |
| JP2005535346A (ja) | 2002-08-15 | 2005-11-24 | エックスワイ，インコーポレイテッド | 高分解能フローサイトメーター |
| US7169548B2 (en) | 2002-09-13 | 2007-01-30 | Xy, Inc. | Sperm cell processing and preservation systems |
| CA2518882C (en) | 2003-03-28 | 2017-05-09 | Monsanto Technology Llc | Apparatus, methods and processes for sorting particles and for providing sex-sorted animal sperm |
| JP2006525019A (ja) | 2003-03-28 | 2006-11-09 | モンサント テクノロジー エルエルシー | 精子の染色方法 |
| ES2541121T3 (es) * | 2003-05-15 | 2015-07-16 | Xy, Llc | Clasificación eficiente de células haploides por sistemas de citometría de flujo |
| WO2005042137A2 (en) | 2003-10-30 | 2005-05-12 | Cytonome, Inc. | Multilayer hydrodynamic sheath flow structure |
| US20050114915A1 (en) * | 2003-11-26 | 2005-05-26 | Vicam L.P. | Method for sex biasing spermatozoa |
| DK1730523T3 (da) | 2004-03-29 | 2010-03-29 | Inguran Llc | Anvendelse af en sammensætning, som regulerer oxiderings-/reduktionsprocesser intracellulært og/eller ekstracellulært ved en farvnings- eller sorteringsproces for spermatozoer |
| CN101014700B (zh) * | 2004-03-29 | 2012-03-28 | 英格朗公司 | 用于分选带有x或y染色体富集群的精子悬浮液 |
| EP2801363B1 (en) * | 2004-03-29 | 2018-02-21 | Inguran, LLC | Process for storing sorted spermatozoa |
| AU2005266930B2 (en) * | 2004-07-22 | 2010-09-16 | Inguran, Llc | Process for enriching a population of sperm cells |
| DK2884258T3 (da) | 2004-07-27 | 2017-01-02 | Beckman Coulter Inc | Forbedring af flowcytometrisk diskrimination med computerimplementeret geometrisk transformation |
| CN1295956C (zh) * | 2004-07-27 | 2007-01-24 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 鱼类精子冷冻保存的实用化方法 |
| US7618770B2 (en) * | 2005-07-29 | 2009-11-17 | Xy, Inc. | Methods and apparatus for reducing protein content in sperm cell extenders |
| AU2006304620A1 (en) * | 2005-10-19 | 2007-04-26 | Scott Josephson | Improved reproductive management |
| US8096940B2 (en) * | 2005-10-19 | 2012-01-17 | Iversync Ii Llc | Reproductive management |
| CA2683858A1 (en) * | 2007-04-12 | 2008-10-23 | Oxis International, Inc. | Ergothioneine and/or its derivatives as a cell preservative |
| US20080269549A1 (en) * | 2007-04-27 | 2008-10-30 | The Jackson Laboratory | Method, article, and apparatus for cryopreservation of biological samples |
| AU2008338530A1 (en) | 2007-12-14 | 2009-06-25 | Minitube Of America, Inc. | Gender-specific separation of sperm cells and embryos |
| US9383369B2 (en) * | 2008-03-31 | 2016-07-05 | Barb Ariel Cohen | Methods for improving fertility and selectivity for desired offspring sex in artificial insemination |
| US8512224B2 (en) * | 2009-01-24 | 2013-08-20 | Xy, Llc | Method of producing an inseminate |
| US8251887B2 (en) * | 2009-01-24 | 2012-08-28 | Xihe Li | Reproductive technology of low dose semen production and in vitro/in vitro fertilization in domestic animals |
| EP2361967A1 (en) * | 2010-02-26 | 2011-08-31 | Assistance Publique - Hôpitaux de Paris | Gametes separation methods, compositions and uses thereof |
| US20110223586A1 (en) * | 2010-03-11 | 2011-09-15 | David Karabinus | Optical particle characterization system |
| US20110223587A1 (en) * | 2010-03-11 | 2011-09-15 | Schulman Joseph D | Optical particle characterization system |
| CA2794934A1 (en) * | 2010-04-01 | 2011-10-06 | Inguran, Llc | Methods and systems for reducing dna fragmentation in a processed sperm sample |
| US10908066B2 (en) | 2010-11-16 | 2021-02-02 | 1087 Systems, Inc. | Use of vibrational spectroscopy for microfluidic liquid measurement |
| JP5738314B2 (ja) * | 2010-12-01 | 2015-06-24 | 一般社団法人家畜改良事業団 | 人工授精用ストロー |
| JP2011098972A (ja) * | 2011-01-04 | 2011-05-19 | Zenkoku Nogyo Kyodo Kumiai Rengokai | 精液希釈液及び希釈精液の保存方法 |
| WO2012106294A1 (en) | 2011-02-04 | 2012-08-09 | Cytonome/St, Llc | Particle sorting apparatus and method |
| WO2012145306A2 (en) | 2011-04-18 | 2012-10-26 | Inguran Llc | Polymeric members and methods for marking polymeric members |
| US9358091B2 (en) | 2011-04-18 | 2016-06-07 | Inguran, Llc | Two-dimensional bar codes in assisted reproductive technologies |
| CN102246744A (zh) * | 2011-05-03 | 2011-11-23 | 陕西省动物研究所 | 大熊猫精液冷冻保存液及其制备方法 |
| CA2837340C (en) | 2011-06-01 | 2019-08-06 | Inguran, Llc | Compositions and methods for improving the quality of processed sperm |
| US9781919B2 (en) | 2011-06-01 | 2017-10-10 | Inguran, Llc | Compositions and methods for improving the quality of processed sperm |
| US9581587B2 (en) * | 2011-09-30 | 2017-02-28 | Inguran, Llc | Sperm staining and sorting methods |
| KR101396925B1 (ko) * | 2011-11-14 | 2014-05-20 | 가천의과학대학교 산학협력단 | 루코스포리디움 속 미생물 유래 결빙 방지 단백질을 이용한 생식 세포 또는 생체 조직의 동결 보존 방법 |
| JP5980499B2 (ja) * | 2011-11-22 | 2016-08-31 | 株式会社ピィアイシィ・バイオ | 豚人工授精用精液希釈保存物 |
| AU2013232381B2 (en) | 2012-03-14 | 2018-08-30 | Membrane Protective Technologies, Inc. | System and substances for cryopreservation of viable cells |
| KR101399432B1 (ko) | 2012-04-30 | 2014-05-30 | 한경대학교 산학협력단 | 미니돼지 정자의 동결보존방법 |
| US9433195B2 (en) | 2012-06-06 | 2016-09-06 | Inguran, Llc | Methods for increasing genetic progress in a line or breed of swine using sex-selected sperm cells |
| US9888990B2 (en) | 2012-06-06 | 2018-02-13 | Inguran, Llc | Methods for use of sex sorted semen to improve genetic management in swine |
| US10379026B2 (en) | 2012-08-29 | 2019-08-13 | Inguran, Llc | Cell processing using magnetic particles |
| DK3326721T3 (da) | 2012-08-29 | 2019-11-25 | Inguran Llc | Magnetisk fjernelse eller identificering af beskadigede eller kompromitterede spermatozoer |
| EP3492603B1 (en) | 2012-10-05 | 2022-07-20 | Inguran, LLC | Methods of processing sperm for sex sorting |
| US10620213B2 (en) | 2012-10-05 | 2020-04-14 | Inguran, Llc | High pressure sperm sorting and flow cytometer methods |
| DK2908631T3 (en) * | 2012-10-18 | 2018-03-05 | Inguran Llc | Two-dimensional barcodes in assisted reproduction technologies |
| CN103039433B (zh) * | 2012-12-10 | 2014-08-13 | 山东天龙牧业科技有限公司 | 一种用于驴精液冷冻保存的酪蛋白抗冻剂及其制备方法 |
| CN103039434B (zh) * | 2012-12-10 | 2014-08-27 | 山东天龙牧业科技有限公司 | 一种用于驴精液冷冻保存的鸭蛋卵黄抗冻剂及其制备方法 |
| CN103858858A (zh) * | 2012-12-11 | 2014-06-18 | 中国农业大学 | 马精液稀释液及其制备方法 |
| CN102986651A (zh) * | 2012-12-24 | 2013-03-27 | 邓凯伟 | 一种猪精液颗粒冷冻保存稀释和冷冻方法 |
| EP2972212B1 (en) | 2013-03-14 | 2022-12-21 | Cytonome/ST, LLC | Hydrodynamic focusing apparatus and methods |
| KR101457526B1 (ko) * | 2013-06-15 | 2014-11-03 | (주)나비바이오텍 | 돼지 정액의 보존성 개선을 위한 희석액 조성물 |
| US8961904B2 (en) | 2013-07-16 | 2015-02-24 | Premium Genetics (Uk) Ltd. | Microfluidic chip |
| CL2013002501A1 (es) | 2013-08-29 | 2014-04-11 | Univ Austral De Chile | Metodo para el enfriamiento y criopreservacion de espermatozoides de un mamífero; diluyentes utilizados en dicho metodo; kit para la inseminación artificial. |
| CN103493800B (zh) * | 2013-09-29 | 2015-09-16 | 大连金弘基种畜有限公司 | 分离精液的冷冻保藏方法 |
| CN103518703B (zh) * | 2013-10-14 | 2015-08-19 | 武鸣县水产畜牧兽医技术推广站 | 一种猪精液稀释剂 |
| CN103518704B (zh) * | 2013-10-14 | 2015-12-23 | 武鸣县水产畜牧兽医技术推广站 | 一种猪精液的保温方法 |
| US11796449B2 (en) | 2013-10-30 | 2023-10-24 | Abs Global, Inc. | Microfluidic system and method with focused energy apparatus |
| HRP20201663T1 (hr) * | 2014-07-09 | 2020-12-25 | F. Hoffmann - La Roche Ag | PRILAGOĐAVANJE pH VRIJEDNOSTI RADI POBOLJŠANJA OPORAVKA BANAKA STANICA USLIJED ODMRZAVANJA |
| CA2905670C (en) | 2014-09-26 | 2025-08-05 | Inguran, Llc | SEX-SORTED SPERM EXPRESSING A DOSE-RESPONSE AND PRODUCTION METHODS FOR SEX-SORTED SPERM EXPRESSING A DOSE-RESPONSE |
| US11708556B2 (en) * | 2014-10-20 | 2023-07-25 | University Of Utah Research Foundation | Tissue sample processing system and associated methods |
| WO2016090310A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-06-09 | Inguran, Llc | Cell processing using magnetic particles |
| EP4137798A1 (en) | 2015-02-19 | 2023-02-22 | 1087 Systems, Inc. | Scanning infrared measurement system |
| WO2017159737A1 (ja) * | 2016-03-16 | 2017-09-21 | 一般社団法人家畜改良事業団 | 精子用希釈液及びそれを用いた精子の保存方法 |
| CN105660609A (zh) * | 2016-04-22 | 2016-06-15 | 李志新 | 一种牛精液保存方法 |
| MD4513C1 (ro) * | 2016-11-21 | 2018-04-30 | Общественное Учреждение "Научно-Практический Институт Биотехнологий В Зоотехники И Ветеринарной Медицине" | Mediu de protecţie pentru crioconservarea materialului seminal de berbeci |
| CA3210334A1 (en) | 2017-01-20 | 2018-07-26 | Inguran, Llc | Sperm processing method, apparatus and related media compositions |
| US11819019B2 (en) | 2017-12-01 | 2023-11-21 | University Of Saskatchewan | Protein-free semen cryopreservation |
| US11413358B2 (en) | 2018-04-09 | 2022-08-16 | Inguran, Llc | Sperm nuclei and methods of their manufacture and use |
| CN108293982A (zh) * | 2018-04-10 | 2018-07-20 | 公安部南昌警犬基地 | 一种犬精液冷冻保存稀释液的制备方法及其应用 |
| CN108378022A (zh) * | 2018-05-09 | 2018-08-10 | 中南大学 | 一种人类精子冷冻保护剂 |
| WO2019226790A1 (en) | 2018-05-23 | 2019-11-28 | Abs Global, Inc. | Systems and methods for particle focusing in microchannels |
| CN108684656A (zh) * | 2018-06-20 | 2018-10-23 | 河南省鼎元种牛育种有限公司 | 一种牛冻精稀释液及其制备方法 |
| CN109223245B (zh) * | 2018-09-26 | 2021-02-05 | 江苏农牧科技职业学院 | 一种适于冷藏的种鹅精子的人工授精方法 |
| US11767511B2 (en) | 2018-11-30 | 2023-09-26 | Cellphire, Inc. | Platelets as delivery agents |
| AU2019387368A1 (en) | 2018-11-30 | 2021-06-17 | Cellphire, Inc. | Platelets as delivery agents |
| KR102226182B1 (ko) * | 2018-12-14 | 2021-03-10 | 대한민국 | 난황추출물과 유단백추출물을 포함하는 정자의 동결보존용 조성물 |
| CA3133622C (en) | 2019-03-19 | 2024-04-23 | Inguran, Llc | Method for improved sperm cell populations |
| JP7212886B2 (ja) * | 2019-03-22 | 2023-01-26 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 受精用精子液の製造方法及び凍結精子ストローの製造方法 |
| US10982187B2 (en) | 2019-03-26 | 2021-04-20 | Genus Plc | Bos taurus variety ‘HO840003150607238’ and methods of use thereof |
| WO2020215011A1 (en) | 2019-04-18 | 2020-10-22 | Abs Global, Inc. | System and process for continuous addition of cryoprotectant |
| KR20220016092A (ko) | 2019-05-03 | 2022-02-08 | 셀파이어, 인크. | 혈액 생성물을 생산하기 위한 물질 및 방법 |
| US11513114B2 (en) * | 2019-05-29 | 2022-11-29 | Abs Global, Inc. | Kill event optimization |
| US10975351B2 (en) | 2019-06-17 | 2021-04-13 | Abs Global, Inc. | Bos taurus variety ‘JE840003146074527’ and methods of use therof |
| WO2021034719A1 (en) | 2019-08-16 | 2021-02-25 | Cellphire, Inc. | Thrombosomes as an antiplatelet agent reversal agent |
| US11628439B2 (en) | 2020-01-13 | 2023-04-18 | Abs Global, Inc. | Single-sheath microfluidic chip |
| CA3170134A1 (en) | 2020-02-04 | 2021-08-12 | Cellphire, Inc. | Treatment of von willebrand disease |
| US20230236173A1 (en) | 2020-06-22 | 2023-07-27 | Westfaelische Wilhelms-Universitaet Muenster | Sperm stratification |
| KR20230087494A (ko) * | 2020-10-15 | 2023-06-16 | 에이비에스 글로벌, 인코포레이티드 | 돼지의 성별화된 정액 및 그 사용 방법 |
| EP4232601A4 (en) | 2020-10-21 | 2024-10-09 | ABS Global, Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR PROCESSING GENETIC SAMPLES TO DETERMINE IDENTITY OR DETECT CONTAMINATION |
| EP4248190A4 (en) | 2020-11-23 | 2024-12-25 | ABS Global, Inc. | MODULAR FLOW CYTOMETRY SYSTEMS AND METHODS FOR PROCESSING SAMPLES |
| TW202245814A (zh) | 2021-02-17 | 2022-12-01 | 美商賽菲爾公司 | 用於治療抗血小板誘導的凝血病之凍乾血小板衍生物組成物 |
| CN112931490B (zh) * | 2021-04-02 | 2022-03-22 | 吉林省养蜂科学研究所（吉林省蜂产品质量管理监督站、吉林省蜜蜂遗传资源基因保护中心） | 一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法 |
| CN114214198A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-03-22 | 中溶科技股份有限公司 | 一种菌种保藏保护剂及其制备方法和应用 |
| EP4558516B1 (en) | 2022-07-18 | 2025-08-13 | Yeda Research and Development Co. Ltd | Albumin protein variants, production thereof and uses of same |
Family Cites Families (628)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US34782A (en) * | 1862-03-25 | Improvement in lamps | ||
| US1174875A (en) * | 1913-04-24 | 1916-03-07 | Carl Lehr | Machine for making wire tacks. |
| US3005756A (en) | 1958-11-14 | 1961-10-24 | Noland L Van Demark | Diluter containing carbon dioxide for preserving semen |
| US3299354A (en) | 1962-07-05 | 1967-01-17 | Coulter Electronics | Aperture tube structure for particle study apparatus |
| US3499435A (en) | 1967-06-02 | 1970-03-10 | Paul E Rockwell | Esophageal probe for use in monitoring |
| US3547526A (en) | 1967-10-26 | 1970-12-15 | Kollsman Instr Corp | Optical beam cross-section converter |
| US3810010A (en) | 1968-11-02 | 1974-05-07 | Telefunken Patent | Particle analysis method and apparatus wherein liquid containing particles is sucked into a constricted flow path |
| US3829216A (en) | 1968-11-26 | 1974-08-13 | M Persidsky | Optical system and method for counting sperm cells |
| DE1815352C3 (de) | 1968-12-18 | 1975-03-20 | Wolfgang Prof. Dr. Dittrich | Automatisches MeB- und Zählgerät für die Teilchen einer Dispersion |
| US4327177A (en) | 1969-04-10 | 1982-04-27 | Wallace Shrimpton | Method and means for controlling the sex of mammalian offspring and product therefor |
| US4474875A (en) | 1969-04-10 | 1984-10-02 | Wallace Shrimpton | Method and means for controlling the sex of mammalian offspring and product therefor |
| US3894529A (en) | 1969-04-10 | 1975-07-15 | Bio Controls Inc | Method and means for controlling the sex of mammalian offspring and product therefor |
| DE1919628C3 (de) | 1969-04-18 | 1975-04-10 | Wolfgang Prof. Dr. Dittrich | Anordnung zum automatischen Zählen und/oder Klassifizieren von in einem strömungsfähigen Medium dispergierten Teilchen |
| US3687806A (en) | 1969-11-04 | 1972-08-29 | Bio Controls Inc | Method for controlling sex of mammalian offspring |
| US3788744A (en) * | 1970-01-14 | 1974-01-29 | Bio Physics Systems Inc | Method and apparatus for photoanalysis |
| US3661460A (en) | 1970-08-28 | 1972-05-09 | Technicon Instr | Method and apparatus for optical analysis of the contents of a sheathed stream |
| US3816249A (en) | 1970-11-23 | 1974-06-11 | B Bhattacharya | Universal medium and method for extending the useful life of semen in vitro |
| US3644128A (en) | 1970-12-28 | 1972-02-22 | Stuart Lipner | Method of preparing comminuted meat products |
| US3756459A (en) | 1971-01-12 | 1973-09-04 | Damon Corp | Method and apparatus for metering fluid utilizing pressure differentials |
| US3916143A (en) | 1971-04-22 | 1975-10-28 | Research Corp | Branding living animals |
| US3791384A (en) * | 1971-07-15 | 1974-02-12 | Schaumann H | Artificial insemination of sows |
| US3833796A (en) | 1971-10-13 | 1974-09-03 | Georgia Tech Res Inst | Method and apparatus for chromosome digitizing |
| BE793185A (fr) | 1971-12-23 | 1973-04-16 | Atomic Energy Commission | Appareil pour analyser et trier rapidement des particules telles que des cellules biologiques |
| US3826364A (en) | 1972-05-22 | 1974-07-30 | Univ Leland Stanford Junior | Particle sorting method and apparatus |
| US3761941A (en) | 1972-10-13 | 1973-09-25 | Mead Corp | Phase control for a drop generating and charging system |
| CA1029833A (en) | 1973-02-23 | 1978-04-18 | Hildegarde Goehde | Apparatus for the automatic counting and measuring of suspended particles |
| US3791517A (en) * | 1973-03-05 | 1974-02-12 | Bio Physics Systems Inc | Digital fluidic amplifier particle sorter |
| US4009260A (en) | 1973-04-19 | 1977-02-22 | Schering Aktiengesellschaft | Fractionation of sperm |
| USRE29141E (en) * | 1973-06-14 | 1977-02-22 | Coulter Electronics, Inc. | Apparatus for orienting generally flat particles for sensing |
| US3893766A (en) | 1973-06-14 | 1975-07-08 | Coulter Electronics | Apparatus for orienting generally flat particles for slit-scan photometry |
| US3947093A (en) | 1973-06-28 | 1976-03-30 | Canon Kabushiki Kaisha | Optical device for producing a minute light beam |
| US3944917A (en) * | 1973-08-13 | 1976-03-16 | Coulter Electronics, Inc. | Electrical sensing circuitry for particle analyzing device |
| US3909744A (en) | 1973-09-24 | 1975-09-30 | United Technologies Corp | Unstable resonator system producing a high irradiance beam in the far field |
| US3906929A (en) | 1973-11-23 | 1975-09-23 | Lynn Lawrence Augspurger | Processes for reproduction of cellular bodies |
| US3854470A (en) * | 1973-11-23 | 1974-12-17 | L Augspurger | Reproduction processes for cellular bodies |
| FR2254639B1 (pl) | 1973-12-18 | 1978-06-02 | Agronomique Inst Nat Rech | |
| US4070617A (en) | 1974-05-08 | 1978-01-24 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Device for controlling the particle flow in an apparatus for measuring the properties of particles suspended in liquid |
| US3973196A (en) | 1974-05-24 | 1976-08-03 | Coulter Electronics, Inc. | Method and apparatus for ejecting a metered amount of particulate sample |
| US3963606A (en) | 1974-06-03 | 1976-06-15 | Coulter Electronics, Inc. | Semi-automatic adjusting delay for an electronic particle separator |
| US3877430A (en) | 1974-07-17 | 1975-04-15 | Horst K Wieder | Artificial insemination apparatus |
| US4083957A (en) | 1974-07-26 | 1978-04-11 | Lang John L | Process for the alteration of the sex-ratio of mammals |
| US4006360A (en) * | 1974-08-21 | 1977-02-01 | Block Engineering, Inc. | Method of discriminating between dyed particles and background fluorescence of the dye |
| USRE32350E (en) | 1974-11-22 | 1987-02-10 | Bhairab C. Bhattacharya | Thermal convection counter streaming sedimentation and forced convection galvanization method for controlling the sex of mammalian offspring |
| US4092229A (en) | 1975-12-17 | 1978-05-30 | Bhattacharya Bhairab C | Thermal convection counter streaming sedimentation and forced convection galvanization method for controlling the sex of mammalian offspring |
| US3976197A (en) | 1974-11-22 | 1976-08-24 | Bhattacharya Bhairab C | Thermal convection counter streaming sedimentation method and apparatus for controlling the sex of mammalian offspring |
| US3940943A (en) * | 1975-01-22 | 1976-03-02 | The Curators Of The University Of Missouri | Multistage freezing system for preservation of biological materials |
| US4014611A (en) | 1975-04-30 | 1977-03-29 | Coulter Electronics, Inc. | Aperture module for use in particle testing apparatus |
| DE2521236C3 (de) | 1975-05-10 | 1978-12-14 | Hildegard Dr. 4400 Muenster Goehde Geb. Kuhl | Einrichtung zum Zählen und Messen von in einer Flüssigkeit suspendierten Teilchen |
| US3960449A (en) | 1975-06-05 | 1976-06-01 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Measurement of angular dependence of scattered light in a flowing stream |
| US4058732A (en) | 1975-06-30 | 1977-11-15 | Analytical Radiation Corporation | Method and apparatus for improved analytical fluorescent spectroscopy |
| US4007087A (en) | 1975-10-17 | 1977-02-08 | Gametrics Limited | Sperm fractionation and storage |
| AU2154077A (en) | 1976-01-27 | 1978-07-27 | Univ Edinburgh | Control of sex ratio in mammalian offspring |
| US4162282A (en) | 1976-04-22 | 1979-07-24 | Coulter Electronics, Inc. | Method for producing uniform particles |
| US4302166A (en) | 1976-04-22 | 1981-11-24 | Coulter Electronics, Inc. | Droplet forming apparatus for use in producing uniform particles |
| JPS5319891A (en) | 1976-06-10 | 1978-02-23 | Coulter Electronics | Method and apparatus for folling drop formation and separation |
| GB1583150A (en) | 1976-08-02 | 1981-01-21 | Milk Marketing Board | Apparatus for collecting eggs |
| US4110604A (en) | 1976-11-04 | 1978-08-29 | Becton, Dickinson And Company | Particle density measuring system |
| DE2709399C3 (de) | 1977-03-04 | 1980-07-24 | Goehde, Wolfgang, Dr., 4400 Muenster | Einrichtung zum Messen von Zelleigenschaften |
| DE2716095C2 (de) | 1977-04-12 | 1987-02-19 | Becton, Dickinson and Co., Paramus, N.J. | Verfahren zur Steuerung der Bewegungsbahn von in einem Elektrolyten suspendierten Teilchen und Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens |
| US4448767A (en) | 1977-10-11 | 1984-05-15 | Sumar Corporation | Preparation of monospecific male-specific antibody and the use thereof for increasing the percentage of mammalian offspring of either sex |
| US4191749A (en) | 1977-10-11 | 1980-03-04 | Bryant Bernard J | Method and material for increasing the percentage of mammalian offspring of either sex |
| US4189236A (en) * | 1978-03-20 | 1980-02-19 | Coulter Electronics, Inc. | Ellipsoid-conic radiation collector and method |
| US4179218A (en) | 1978-05-15 | 1979-12-18 | The Boeing Company | Particle size analyzer |
| DE2832091A1 (de) | 1978-07-21 | 1980-01-31 | Eidenschink Henning | Optisches verfahren zur bestimmung der teilchengroesse kolloidaler loesungen und messgeraet zur durchfuehrung des verfahrens |
| US4276139A (en) | 1978-08-16 | 1981-06-30 | Lawson Rommon L | Process for magnetic separation and collection of viable female and male spermatozoa |
| US4225405A (en) | 1978-08-16 | 1980-09-30 | Lawson Rommom L | Process for separation and collection of viable female and male spermatozoa |
| US4230558A (en) | 1978-10-02 | 1980-10-28 | Coulter Electronics, Inc. | Single drop separator |
| US4341471A (en) | 1979-01-02 | 1982-07-27 | Coulter Electronics, Inc. | Apparatus and method for measuring the distribution of radiant energy produced in particle investigating systems |
| US4267268A (en) | 1979-03-12 | 1981-05-12 | Nelson Jr Robert A | Spermatozoa extenders |
| US4274408A (en) | 1979-03-26 | 1981-06-23 | Beatrice Nimrod | Method for guide-wire placement and novel syringe therefor |
| US4200802A (en) | 1979-03-28 | 1980-04-29 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Parabolic cell analyzer |
| NO144002C (no) | 1979-04-10 | 1981-05-27 | Norsk Hydro S Inst For Kreftfo | Anordning for anvendelse ved vaeskestroemsfotometri |
| US4408877A (en) | 1979-04-10 | 1983-10-11 | Ernst Leitz Wetzlar Gmbh | Device for hydrodynamic focussing of a particle-suspension in a liquid flow cytophotometer |
| US4263508A (en) | 1979-04-20 | 1981-04-21 | Research Corporation | Pulse edge measurement for determining particle dimensional characteristics |
| US4255021A (en) | 1979-04-20 | 1981-03-10 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Optical device with conical input and output prism faces |
| US4318482A (en) | 1979-08-20 | 1982-03-09 | Ortho Diagnostics, Inc. | Method for measuring the velocity of a perturbed jetting fluid in an electrostatic particle sorting system |
| US4318480A (en) | 1979-08-20 | 1982-03-09 | Ortho Diagnostics, Inc. | Method and apparatus for positioning the point of droplet formation in the jetting fluid of an electrostatic sorting device |
| US4318481A (en) | 1979-08-20 | 1982-03-09 | Ortho Diagnostics, Inc. | Method for automatically setting the correct phase of the charge pulses in an electrostatic flow sorter |
| US4317520A (en) | 1979-08-20 | 1982-03-02 | Ortho Diagnostics, Inc. | Servo system to control the spatial position of droplet formation of a fluid jet in a cell sorting apparatus |
| US4325483A (en) | 1979-08-20 | 1982-04-20 | Ortho Diagnostics, Inc. | Method for detecting and controlling flow rates of the droplet forming stream of an electrostatic particle sorting apparatus |
| DE2943116C2 (de) | 1979-10-25 | 1986-06-19 | Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung mbH, 8000 München | Einrichtung zur durchflußcytometrischen Reaktions- und/oder Diffusionsmessung |
| US4284355A (en) | 1979-10-29 | 1981-08-18 | Ortho Diagnostics, Inc. | Automated method for cell volume determination |
| US4400764A (en) | 1980-02-05 | 1983-08-23 | The Boeing Company | Low backscatter illumination system |
| US4367043A (en) * | 1980-05-05 | 1983-01-04 | Leland Stanford Junior University | Method and means for delivering liquid samples to a sample scanning device |
| US4362246A (en) | 1980-07-14 | 1982-12-07 | Adair Edwin Lloyd | Method of treating collected mammal semen and separating sperm into X Y components |
| US4348107A (en) | 1980-07-18 | 1982-09-07 | Coulter Electronics, Inc. | Orifice inside optical element |
| EP0046345A3 (en) | 1980-08-15 | 1982-03-03 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Controlled hydrodynamic flow in flow cytometry systems |
| US4350410A (en) | 1980-10-08 | 1982-09-21 | The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration | Multiprism collimator |
| US4487320A (en) | 1980-11-03 | 1984-12-11 | Coulter Corporation | Method of and apparatus for detecting change in the breakoff point in a droplet generation system |
| US4691829A (en) | 1980-11-03 | 1987-09-08 | Coulter Corporation | Method of and apparatus for detecting change in the breakoff point in a droplet generation system |
| US4395676A (en) | 1980-11-24 | 1983-07-26 | Coulter Electronics, Inc. | Focused aperture module |
| US4361400A (en) | 1980-11-26 | 1982-11-30 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Fluidic assembly for an ultra-high-speed chromosome flow sorter |
| US4680258A (en) | 1981-03-24 | 1987-07-14 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Process for sex determination in man by use of monoclonal antibodies to the H-Y antigen |
| US4673288A (en) | 1981-05-15 | 1987-06-16 | Ratcom, Inc. | Flow cytometry |
| US4818103A (en) | 1981-05-15 | 1989-04-04 | Ratcom | Flow cytometry |
| DE3266669D1 (en) | 1981-06-24 | 1985-11-07 | Becton Dickinson Co | Analyzer for simultaneously determining volume and light emission characteristics of particles |
| FR2510393A1 (fr) | 1981-07-31 | 1983-02-04 | Bertrand Cassou | Appareil de transfert d'elements de reproduction animale, tels que des embryons |
| US4339434A (en) | 1981-08-17 | 1982-07-13 | Gametrics Limited | Method of increasing the incidence of female offspring |
| US4395397A (en) | 1981-09-17 | 1983-07-26 | Sidney Farber Cancer Institute, Inc. | Apparatus and method for killing unwanted cells |
| US4422761A (en) | 1981-09-28 | 1983-12-27 | Frommer Joseph C | Photo-electric particle sensing system |
| US4515274A (en) | 1981-12-02 | 1985-05-07 | Coulter Corporation | Particle analyzing and sorting apparatus |
| SU1056008A1 (ru) | 1982-01-25 | 1983-11-23 | Предприятие П/Я Р-6681 | Проточный цитофлуориметр |
| JPS59500340A (ja) | 1982-03-08 | 1984-03-01 | モトロ−ラ・インコ−ポレ−テツド | 集積回路のリ−ドフレ−ム |
| US4511661A (en) | 1982-03-19 | 1985-04-16 | University Patents, Inc. | ATCC HB8116 And its monoclonal anti-H-Y antibody, Hyclonalan |
| US4498766A (en) | 1982-03-25 | 1985-02-12 | Becton, Dickinson And Company | Light beam focal spot elongation in flow cytometry devices |
| DE3315195A1 (de) | 1982-04-29 | 1983-11-03 | International Remote Imaging Systems Inc., 91311 Chatsworth, Calif. | Verfahren zum ausrichten von teilchen in einer fluidprobe |
| DE3315194A1 (de) | 1982-04-29 | 1983-11-03 | International Remote Imaging Systems Inc., 91311 Chatsworth, Calif. | Verfahren zum trennen von in einer fluidprobe stroemenden teilchen |
| US4629687A (en) | 1982-07-29 | 1986-12-16 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Positive selection sorting of cells |
| GB2125181B (en) | 1982-08-11 | 1986-01-29 | Coulter Electronics | Flow cells for particle study |
| US4559309A (en) | 1982-09-01 | 1985-12-17 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Flow cytometry-fluorescence measurements for characterizing sperm |
| EP0120854A4 (en) | 1982-10-05 | 1985-06-10 | Genetic Engineering Inc | PROCESS FOR TREATING SPERM RECOVERED FROM A MAMMAL AND SEPARATING THE SPERM INTO COMPONENTS X AND Y. |
| US4501366A (en) | 1982-12-14 | 1985-02-26 | Adolph Coors Company | Photomultiplier tube assembly |
| EP0112188B1 (en) | 1982-12-21 | 1987-06-16 | Crosfield Electronics Limited | Light beam-splitter |
| US4492436A (en) * | 1983-01-03 | 1985-01-08 | At&T Bell Laboratories | Polarization independent beam splitter |
| JPS59143146A (ja) | 1983-02-07 | 1984-08-16 | Nippon Kogaku Kk <Nikon> | ミラ−集光型照明光学系 |
| CA1206559A (en) | 1983-03-04 | 1986-06-24 | Robert E. Auer | Method of and apparatus for detecting change in the breakoff point of a droplet generation system |
| IT1197570B (it) | 1983-02-11 | 1988-12-06 | Serono Ist Farm | Miscele di fsh e lh da ipofisi porcine in rapporto definito |
| CH651930A5 (en) | 1983-03-24 | 1985-10-15 | Coulter Corp | Apparatus for analysis and sorting of particles |
| JPS59174742A (ja) | 1983-03-25 | 1984-10-03 | Agency Of Ind Science & Technol | 微小粒子を区分又は選別する方法及びその装置 |
| GB2145112B (en) | 1983-04-27 | 1987-02-18 | Milk Marketing Board | Sorting living spermatozoa |
| US4523809A (en) | 1983-08-04 | 1985-06-18 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force | Method and apparatus for generating a structured light beam array |
| NZ207393A (en) | 1983-08-05 | 1987-03-31 | Neal Lloyd First | Staining dna in living cells |
| US4538733A (en) | 1983-10-14 | 1985-09-03 | Becton, Dickinson And Company | Particle sorter with neutralized collection wells and method of using same |
| US4780406A (en) | 1983-10-18 | 1988-10-25 | The Regents Of The University Of California | Flow cytometric measurement of total DNA and incorporated halodeoxyuridine |
| US4585736A (en) | 1983-10-18 | 1986-04-29 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Flow cytometric measurement of total DNA and incorporated halodeoxyuridine |
| US4735504A (en) | 1983-10-31 | 1988-04-05 | Technicon Instruments Corporation | Method and apparatus for determining the volume & index of refraction of particles |
| EP0148497B1 (de) | 1983-12-24 | 1990-10-31 | Inotech Ag | Vorrichtung zum Führen und Sammeln von Licht in der Fotometrie od. dgl. |
| US4573796A (en) * | 1984-01-06 | 1986-03-04 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Apparatus for eliminating background interference in fluorescence measurements |
| US4631483A (en) | 1984-02-01 | 1986-12-23 | Coulter Electronics, Inc. | Particle analyzing apparatus and method of moving particles in suspension through such apparatus |
| US4714680B1 (en) | 1984-02-06 | 1995-06-27 | Univ Johns Hopkins | Human stem cells |
| US4965204A (en) | 1984-02-06 | 1990-10-23 | The Johns Hopkins University | Human stem cells and monoclonal antibodies |
| WO1985004014A1 (en) | 1984-02-29 | 1985-09-12 | Research Corporation | Flow cytometers |
| US4545677A (en) | 1984-03-05 | 1985-10-08 | Becton, Dickinson And Company | Prismatic beam expander for light beam shaping in a flow cytometry apparatus |
| US4600302A (en) | 1984-03-26 | 1986-07-15 | Becton, Dickinson And Company | Flow cytometry apparatus with uniform incoherent light excitation |
| DE3412620A1 (de) | 1984-04-04 | 1985-10-17 | Basf Ag, 6700 Ludwigshafen | Laseroptische anordnung zur messung des dispergiergrades in stroemenden systemen |
| US4609286A (en) | 1984-04-16 | 1986-09-02 | Becton, Dickinson And Company | Dispersion prism for separation of wavelengths of spectrally rich light in a flow cytometry apparatus |
| US4605558A (en) | 1984-04-20 | 1986-08-12 | Wallace Shrimpton | Process for cell separation |
| US4660971A (en) | 1984-05-03 | 1987-04-28 | Becton, Dickinson And Company | Optical features of flow cytometry apparatus |
| FR2563726B1 (fr) | 1984-05-04 | 1986-10-10 | Robert Cassou | Appareil d'insemination artificielle, notamment des carnivores |
| FR2566543B1 (fr) | 1984-06-20 | 1988-02-26 | Commissariat Energie Atomique | Dispositif optique a rendement de collection eleve et cytofluorimetre en faisant application |
| EP0171676B1 (en) | 1984-07-31 | 1990-11-07 | Hitachi, Ltd. | Free-flow electrophoretic separation method and apparatus therefor |
| EP0177718B1 (de) | 1984-09-11 | 1989-12-06 | Partec AG | Verfahren und Vorrichtung zur Sortierung von mikroskopischen Partikeln |
| US4661913A (en) | 1984-09-11 | 1987-04-28 | Becton, Dickinson And Company | Apparatus and method for the detection and classification of articles using flow cytometry techniques |
| US4598408A (en) | 1984-10-22 | 1986-07-01 | Trw Inc. | High extraction efficiency cylindrical ring resonator |
| FR2574656B1 (fr) | 1984-12-13 | 1988-08-05 | Cassou Robert | Sonde gynecologique notamment pour l'injection de semence ou d'embryons dans la cavite des animaux, tels que les juments |
| FR2575063B1 (fr) | 1984-12-21 | 1988-07-01 | Cassou Robert | Sonde gynecologique pour insemination artificielle, notamment pour porcins |
| SU1260778A1 (ru) | 1985-01-31 | 1986-09-30 | Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт | Устройство дл флуоресцентного анализа отдельных микрочастиц в потоке |
| US4702598A (en) | 1985-02-25 | 1987-10-27 | Research Corporation | Flow cytometer |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| CA1250808A (en) | 1985-04-29 | 1989-03-07 | David W. Dresser | Semen sexing |
| US4662742A (en) | 1985-05-10 | 1987-05-05 | Becton, Dickinson And Company | Scatter/fluorescene beam splitter in a flow cytometry apparatus |
| US4877965A (en) | 1985-07-01 | 1989-10-31 | Diatron Corporation | Fluorometer |
| USRE34782E (en) | 1985-07-01 | 1994-11-08 | Diatron Corporation | Fluorometer |
| US4744090A (en) | 1985-07-08 | 1988-05-10 | Trw Inc. | High-extraction efficiency annular resonator |
| NO156916C (no) | 1985-07-10 | 1987-12-16 | Harald B Steen | Stroemningskammer for vaeskestroemsfotometer. |
| NO156917C (no) | 1985-07-16 | 1987-12-16 | Harald B Steen | Anordning for maaling av biologiske cellers lysspredning i vaeskestroemsfotometere. |
| US4989977A (en) * | 1985-07-29 | 1991-02-05 | Becton, Dickinson And Company | Flow cytometry apparatus with improved light beam adjustment |
| US4794086A (en) | 1985-11-25 | 1988-12-27 | Liquid Air Corporation | Method for measurement of impurities in liquids |
| US4770992A (en) | 1985-11-27 | 1988-09-13 | Den Engh Gerrit J Van | Detection of specific DNA sequences by flow cytometry |
| US4999283A (en) | 1986-01-10 | 1991-03-12 | University Of Kentucky Research Foundation | Method for x and y spermatozoa separation |
| US5447841A (en) | 1986-01-16 | 1995-09-05 | The Regents Of The Univ. Of California | Methods for chromosome-specific staining |
| US5756696A (en) | 1986-01-16 | 1998-05-26 | Regents Of The University Of California | Compositions for chromosome-specific staining |
| US4710635A (en) | 1986-04-14 | 1987-12-01 | Becton, Dickinson And Company | Dual laser excitation from single laser source |
| NL8601000A (nl) | 1986-04-21 | 1987-11-16 | Jan Greve T H Twente Afdeling | Het gebruik van gepolariseerd licht in stromingscytometrie. |
| US5336217A (en) | 1986-04-24 | 1994-08-09 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Insepm) | Process for treatment by irradiating an area of a body, and treatment apparatus usable in dermatology for the treatment of cutaneous angio dysplasias |
| JPS62274238A (ja) | 1986-05-22 | 1987-11-28 | ベクトン・デイツキンソン・アンド・カンパニ− | フロ−サイトメトリ−装置に用いる光学的結合用ゲル |
| US4790653A (en) | 1986-05-22 | 1988-12-13 | Becton Dickinson And Company | Housing for a flow cytometry apparatus with particle unclogging feature |
| US4786165A (en) | 1986-07-10 | 1988-11-22 | Toa Medical Electronics Co., Ltd. | Flow cytometry and apparatus therefor |
| US4704891A (en) | 1986-08-29 | 1987-11-10 | Becton, Dickinson And Company | Method and materials for calibrating flow cytometers and other analysis instruments |
| US4867908A (en) | 1986-08-29 | 1989-09-19 | Becton, Dickinson And Company | Method and materials for calibrating flow cytometers and other analysis instruments |
| FR2609885B1 (fr) | 1987-01-22 | 1989-04-14 | Cassou Robert | Instrument pour l'insemination artificielle, le transfert d'embryons ou le prelevement de liquides folliculaires chez les mammiferes |
| US4780451B1 (en) | 1987-01-23 | 1995-04-04 | Asua International Inc | Composition and method for producing superovulation in cattle |
| US5162306A (en) | 1987-01-23 | 1992-11-10 | Donaldson Lloyd E | Composition and method for producing superovulation in mammals |
| EP0279000B1 (en) | 1987-02-17 | 1993-07-21 | Ratcom, Inc. | Flow cytometry |
| KR970007077B1 (ko) | 1987-03-13 | 1997-05-02 | 코울터 일렉트로닉스 인커퍼레이티드 | 광산란 기술을 이용한 다중-부분식별 분석 방법 |
| US4764013A (en) | 1987-03-23 | 1988-08-16 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Interferometric apparatus and method for detection and characterization of particles using light scattered therefrom |
| US4765737A (en) | 1987-03-30 | 1988-08-23 | Cornell Research Foundation | Cell size measurements using light in flow cytometry and cell sorting |
| US5346990A (en) | 1987-04-08 | 1994-09-13 | Cytogam, Inc. | Sex-associated membrane proteins and methods for increasing the probability that offspring will be of a desired sex |
| DE3851458T2 (de) | 1987-04-08 | 1995-02-09 | Hitachi Ltd | Vorrichtung mit einer scheideförmigen Durchflusszelle. |
| US5021244A (en) * | 1988-12-06 | 1991-06-04 | Cytogam, Inc. | Sex-associated membrane antibodies and their use for increasing the probability that offspring will be of a desired sex |
| JPS63262565A (ja) | 1987-04-20 | 1988-10-28 | Hitachi Ltd | フロ−セル |
| ATE110467T1 (de) | 1987-04-27 | 1994-09-15 | Preikschat F K | Vorrichtung und verfahren zur untersuchung von teilchen. |
| EP0289677A3 (en) | 1987-04-27 | 1989-05-10 | Fritz K. Preikschat | Apparatus and method for particle analysis |
| FR2614626B1 (fr) | 1987-04-30 | 1989-07-21 | Ranoux Claude | Conteneur pour fecondation des ovocytes et replacement des embryons chez l'homme et l'animal |
| JP2642632B2 (ja) | 1987-07-03 | 1997-08-20 | 株式会社日立製作所 | 微粒子計測装置および微粒子計測方法 |
| GB8716285D0 (en) | 1987-07-10 | 1987-08-19 | Medical Res Council | Light collecting device |
| US4979093A (en) | 1987-07-16 | 1990-12-18 | Cavro Scientific Instruments | XYZ positioner |
| US4987539A (en) | 1987-08-05 | 1991-01-22 | Stanford University | Apparatus and method for multidimensional characterization of objects in real time |
| US4796788A (en) * | 1987-08-26 | 1989-01-10 | Liqui-Box Corporation | Bag-in-box packaging and dispensing of substances which will not readily flow by gravity |
| US4758729A (en) | 1987-08-28 | 1988-07-19 | Spectra-Physics, Inc. | Apparatus and method for measuring the included angle of a reflective cone |
| DE3832901A1 (de) | 1987-10-02 | 1989-04-20 | Hitachi Ltd | Teilchenmessvorrichtung |
| US4793705A (en) | 1987-10-07 | 1988-12-27 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Single molecule tracking |
| US4831385A (en) | 1987-10-14 | 1989-05-16 | Burlington Industries, Inc. | Vacuum tray fluid-jet start-up system |
| US4980277A (en) | 1987-10-16 | 1990-12-25 | Cultor Ltd. | Cryoprotectant solution and method |
| US5712807A (en) * | 1987-10-21 | 1998-01-27 | Bangham; James Andrew | Pulse analyzing method and apparatus |
| US5789155A (en) | 1987-10-30 | 1998-08-04 | California Institute Of Technology | Process for identifying nucleic acids and triple helices formed thereby |
| EP0386061A1 (en) | 1987-11-10 | 1990-09-12 | Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Gov. Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland | Particle monitoring system |
| GB8726304D0 (en) | 1987-11-10 | 1987-12-16 | Secr Defence | Particle asymmetry analyser |
| US4845025A (en) | 1987-11-10 | 1989-07-04 | Coulter Corporation | Biological sample mixing apparatus and method |
| GB8726305D0 (en) | 1987-11-10 | 1987-12-16 | Secr Defence | Portable particle analysers |
| US5040890A (en) | 1987-11-25 | 1991-08-20 | Becton, Dickinson And Company | Sheathed particle flow controlled by differential pressure |
| US4988619A (en) | 1987-11-30 | 1991-01-29 | United States Department Of Energy | Flow cytometry apparatus |
| US4887721A (en) | 1987-11-30 | 1989-12-19 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Laser particle sorter |
| US4936465A (en) | 1987-12-07 | 1990-06-26 | Zoeld Tibor | Method and apparatus for fast, reliable, and environmentally safe dispensing of fluids, gases and individual particles of a suspension through pressure control at well defined parts of a closed flow-through system |
| US5219729A (en) | 1988-02-25 | 1993-06-15 | Serono Laboratories, Inc. | Fertility assay |
| US5622820A (en) | 1988-03-10 | 1997-04-22 | City Of Hope | Method for amplification and detection of RNA and DNA sequences |
| US4836038A (en) | 1988-03-18 | 1989-06-06 | Aim Instruments Ltd. | Automated sampler-injector apparatus and method for sampling a quantity of sample and testing portions of said quantity |
| US5057413A (en) | 1988-06-13 | 1991-10-15 | Becton, Dickinson And Company | Method for discriminating between intact and damaged cells in a sample |
| US5070080A (en) | 1988-08-10 | 1991-12-03 | Fahim Mostafa S | Method of inhibiting generation, maturation, motility and viability of sperm with minerals in bioavailable form |
| JPH0718785B2 (ja) | 1988-09-19 | 1995-03-06 | 株式会社日立製作所 | フローセル装置 |
| JP2635125B2 (ja) | 1988-09-30 | 1997-07-30 | 東亜医用電子株式会社 | 核の分葉指数を求めるための粒子分析装置及び方法 |
| JP2635126B2 (ja) | 1988-09-30 | 1997-07-30 | 東亜医用電子株式会社 | 核の分葉指数を求めるための粒子分析装置及び方法 |
| JPH02168160A (ja) | 1988-12-22 | 1990-06-28 | Omron Tateisi Electron Co | 細胞選別装置 |
| US5726009A (en) * | 1989-03-20 | 1998-03-10 | Anticancer, Inc. | Native-state method and system for determining viability and proliferative capacity of tissues in vitro |
| JPH02289808A (ja) | 1989-04-28 | 1990-11-29 | Olympus Optical Co Ltd | 照明光学系 |
| US4981580A (en) | 1989-05-01 | 1991-01-01 | Coulter Corporation | Coincidence arbitration in a flow cytomery sorting system |
| ATE142788T1 (de) | 1989-05-10 | 1996-09-15 | Us Agriculture | Verfahren zur vorwahl des geschlechts der nachkommenschaft |
| US4942305A (en) | 1989-05-12 | 1990-07-17 | Pacific Scientific Company | Integrating sphere aerosol particle detector |
| JP2992298B2 (ja) | 1989-05-12 | 1999-12-20 | サイトガム，インコーポレイテッド | 性関連膜タンパク質および子が所望の性を有する確率を増大させるための方法 |
| US5055393A (en) | 1989-06-13 | 1991-10-08 | Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Prenatal sex determination of bovine cells using male-specific oligonucleotides |
| US4954715A (en) | 1989-06-26 | 1990-09-04 | Zoeld Tibor | Method and apparatus for an optimized multiparameter flow-through particle and cell analyzer |
| JPH0353164A (ja) | 1989-07-20 | 1991-03-07 | Canon Inc | サンプル供給装置及びこれを用いたサンプル測定装置 |
| US5098657A (en) | 1989-08-07 | 1992-03-24 | Tsi Incorporated | Apparatus for measuring impurity concentrations in a liquid |
| US5030002A (en) | 1989-08-11 | 1991-07-09 | Becton, Dickinson And Company | Method and apparatus for sorting particles with a moving catcher tube |
| US5005981A (en) | 1989-09-08 | 1991-04-09 | Becton, Dickinson And Company | Apparatus for method for causing vortices in a test tube |
| US5215376A (en) | 1989-09-08 | 1993-06-01 | Becton, Dickinson And Company | Method for causing vortices in a test tube |
| US5167926A (en) | 1989-09-13 | 1992-12-01 | Kabushiki Kaisha Tiyoda Seisakusho | Apparatus for pretreating cells for flow cytometry |
| JP2808321B2 (ja) | 1989-09-19 | 1998-10-08 | 東亜医用電子株式会社 | 細胞分析方法及び装置 |
| US5072382A (en) | 1989-10-02 | 1991-12-10 | Kamentsky Louis A | Methods and apparatus for measuring multiple optical properties of biological specimens |
| US5275787A (en) * | 1989-10-04 | 1994-01-04 | Canon Kabushiki Kaisha | Apparatus for separating or measuring particles to be examined in a sample fluid |
| EP0422616B1 (en) | 1989-10-11 | 1996-02-07 | Canon Kabushiki Kaisha | Apparatus for and method of fractionating particle in particle-suspended liquid in conformity with the properties thereof |
| JPH03140840A (ja) | 1989-10-26 | 1991-06-14 | Hitachi Ltd | 流動細胞分析装置 |
| FR2653885B1 (fr) | 1989-10-27 | 1994-01-14 | Abx | Appareil pour le comptage et la determination d'au moins une sous-population leucocytaire. |
| US5034613A (en) | 1989-11-14 | 1991-07-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Two-photon laser microscopy |
| US5101978A (en) | 1989-11-27 | 1992-04-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Fluidic sorting device for two or more materials suspended in a fluid |
| AU647741B2 (en) | 1989-12-01 | 1994-03-31 | Regents Of The University Of California, The | Methods and compositions for chromosome-specific staining |
| US5274240A (en) | 1990-01-12 | 1993-12-28 | The Regents Of The University Of California | Capillary array confocal fluorescence scanner and method |
| EP0448931B1 (en) * | 1990-01-26 | 1996-04-03 | Canon Kabushiki Kaisha | Method for measuring a specimen by the use of fluorescence light |
| JP3049254B2 (ja) | 1990-02-08 | 2000-06-05 | シスメックス株式会社 | ２種類の光源を備えた光学式粒子分析装置 |
| IL93634A0 (en) | 1990-03-05 | 1990-12-23 | Galai Lab Ltd | Particle size analyzer |
| US5153117A (en) | 1990-03-27 | 1992-10-06 | Genetype A.G. | Fetal cell recovery method |
| US5492534A (en) * | 1990-04-02 | 1996-02-20 | Pharmetrix Corporation | Controlled release portable pump |
| US5150313A (en) | 1990-04-12 | 1992-09-22 | Regents Of The University Of California | Parallel pulse processing and data acquisition for high speed, low error flow cytometry |
| US5076472A (en) | 1990-06-13 | 1991-12-31 | Becton, Dickinson And Company | Cleaning cycle for flow cytometers |
| US5087295A (en) | 1990-06-13 | 1992-02-11 | Becton Dickinson And Company | Cleaning cycle for flow cytometers |
| US5160974A (en) | 1990-06-25 | 1992-11-03 | Flow Science, Inc. | Closed sample cell for use in flow cytometry |
| US5559032A (en) | 1990-06-29 | 1996-09-24 | Pomeroy; Patrick C. | Method and apparatus for post-transfer assaying of material on solid support |
| US5366888A (en) | 1990-07-09 | 1994-11-22 | Amrad Corporation Limited | Enhanced maintenance of pregnancy using leukaemia inhibitory factor in embryo culturing |
| JP2939647B2 (ja) | 1990-07-24 | 1999-08-25 | シスメックス株式会社 | フローイメージングサイトメータにおける自動焦点調整方法 |
| IE76732B1 (en) | 1990-08-07 | 1997-11-05 | Becton Dickinson Co | One step test for absolute counts |
| US5259593A (en) | 1990-08-30 | 1993-11-09 | University Of Southern California | Apparatus for droplet stream manufacturing |
| JPH04115136A (ja) | 1990-09-05 | 1992-04-16 | Hitachi Ltd | 粒子計測装置 |
| US5132548A (en) | 1990-09-14 | 1992-07-21 | High Yield Technology | High sensitivity, large detection area particle sensor for vacuum applications |
| US5204884A (en) | 1991-03-18 | 1993-04-20 | University Of Rochester | System for high-speed measurement and sorting of particles |
| US5273527A (en) | 1992-05-12 | 1993-12-28 | Ovamed Corporation | Delivery catheter |
| US5663048A (en) | 1990-10-04 | 1997-09-02 | University Of Calgary | Y-chromosome specific polynucleotide probes for prenatal sexing |
| US5840482A (en) | 1990-10-10 | 1998-11-24 | The Regents Of The University Of California | Y chromosome specific nucleic acid probe and method for determining the Y chromosome in situ |
| WO1992008120A1 (en) | 1990-10-29 | 1992-05-14 | Macquarie University | Pulsed laser flow cytometry |
| US5116125A (en) | 1990-10-31 | 1992-05-26 | Biophos Medical Ab | Fertility analyzer |
| EP0555212B1 (en) | 1990-10-31 | 1994-10-12 | Biophos Medical Ab | Fertility analyzer |
| JP2874746B2 (ja) | 1990-11-22 | 1999-03-24 | シスメックス株式会社 | フローイメージングサイトメータにおけるフローセル機構 |
| US5991028A (en) | 1991-02-22 | 1999-11-23 | Applied Spectral Imaging Ltd. | Spectral bio-imaging methods for cell classification |
| JP3121849B2 (ja) | 1991-02-27 | 2001-01-09 | シスメックス株式会社 | フローイメージサイトメータ |
| JPH0734012B2 (ja) | 1991-02-27 | 1995-04-12 | 東亜医用電子株式会社 | フローイメージサイトメータ |
| US5144224A (en) | 1991-04-01 | 1992-09-01 | Larsen Lawrence E | Millimeter wave flow cytometer |
| US5199576A (en) | 1991-04-05 | 1993-04-06 | University Of Rochester | System for flexibly sorting particles |
| EP0515211A3 (en) | 1991-05-23 | 1993-04-07 | Becton Dickinson And Company | Apparatus and method for phase resolved fluorescence lifetimes of independent and varying amplitude pulses |
| DE9107792U1 (de) | 1991-06-25 | 1991-09-12 | Labotect-Labor-Technik, Göttingen, GmbH, 3406 Bovenden | Instrumentensatz zum uterinen Embryonentransfer |
| FR2678506B1 (fr) | 1991-07-01 | 2000-03-10 | Claude Ranoux | Procede de fecondation en cycle spontane. |
| US5548661A (en) | 1991-07-12 | 1996-08-20 | Price; Jeffrey H. | Operator independent image cytometer |
| US5412466A (en) | 1991-07-26 | 1995-05-02 | Toa Medical Electronics Co., Ltd. | Apparatus for forming flattened sample flow for analyzing particles |
| DE69230902D1 (de) | 1991-08-30 | 2000-05-18 | Omron Tateisi Electronics Co | Vorrichtung zur Zellenanalyse |
| US5488469A (en) * | 1991-08-30 | 1996-01-30 | Omron Corporation | Cell analyzing apparatus |
| US5548395A (en) | 1991-09-20 | 1996-08-20 | Toa Medical Electronics Co., Ltd. | Particle analyzer |
| US5578449A (en) | 1991-10-03 | 1996-11-26 | Hilding Ohlsson, S.A. | Procedure for the sex determination of embryos in mammals especially applied to bovine embryos |
| US5919621A (en) | 1991-10-24 | 1999-07-06 | Brown; David B. | Methods for diagnosing human male infertility |
| JP3212647B2 (ja) | 1991-10-24 | 2001-09-25 | シスメックス株式会社 | イメージングフローサイトメータ |
| US5866344A (en) * | 1991-11-15 | 1999-02-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Antibody selection methods using cell surface expressed libraries |
| US5370842A (en) | 1991-11-29 | 1994-12-06 | Canon Kabushiki Kaisha | Sample measuring device and sample measuring system |
| JP2593021B2 (ja) | 1991-12-13 | 1997-03-19 | 伊藤ハム株式会社 | ウシ胚の性の識別方法 |
| JP3130628B2 (ja) | 1992-01-30 | 2001-01-31 | シスメックス株式会社 | 粒子判定装置 |
| US5400179A (en) | 1992-02-18 | 1995-03-21 | Asahi Kogaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Optical multilayer thin film and beam splitter |
| EP0556748B1 (en) | 1992-02-20 | 1998-10-28 | Canon Kabushiki Kaisha | Method and apparatus for particle manipulation, and measuring apparatus utilizing the same |
| US5471299A (en) | 1992-02-21 | 1995-11-28 | The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland | Apparatus and method for the analysis of particle characteristics using monotonically scattered light |
| US5558998A (en) | 1992-02-25 | 1996-09-24 | The Regents Of The Univ. Of California | DNA fragment sizing and sorting by laser-induced fluorescence |
| US6120735A (en) | 1992-02-26 | 2000-09-19 | The Ohio States University | Fractional cell sorter |
| US5298967A (en) | 1992-06-02 | 1994-03-29 | Pacific Scientific Company | Measurement of concentrations of dissolved solvent |
| JP3145486B2 (ja) | 1992-06-12 | 2001-03-12 | シスメックス株式会社 | イメージングフローサイトメータ |
| DE4393316T1 (de) | 1992-07-13 | 1995-05-11 | Pall Corp | Automatisiertes System und Verfahren zur Behandlung eines biologischen Fluids |
| JP3215175B2 (ja) | 1992-08-10 | 2001-10-02 | シスメックス株式会社 | 粒子分析装置 |
| US5315122A (en) | 1992-08-25 | 1994-05-24 | Becton, Dickinson And Company | Apparatus and method for fluorescent lifetime measurement |
| US5466572A (en) | 1992-09-03 | 1995-11-14 | Systemix, Inc. | High speed flow cytometric separation of viable cells |
| PT662124E (pt) | 1992-09-03 | 2002-10-31 | Univ California | Separacao citometrica de fluxo de alta velocidade de celulas viaveis de mamifero |
| US5736410A (en) | 1992-09-14 | 1998-04-07 | Sri International | Up-converting reporters for biological and other assays using laser excitation techniques |
| US5275933A (en) | 1992-09-25 | 1994-01-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Triple gradient process for recovering nucleated fetal cells from maternal blood |
| US5371585A (en) | 1992-11-10 | 1994-12-06 | Pacific Scientific Company | Particle detecting instrument with sapphire detecting cell defining a rectangular flow path |
| US5359907A (en) | 1992-11-12 | 1994-11-01 | Horiba Instruments, Inc. | Method and apparatus for dry particle analysis |
| US5395588A (en) * | 1992-12-14 | 1995-03-07 | Becton Dickinson And Company | Control of flow cytometer having vacuum fluidics |
| FR2699678A1 (fr) | 1992-12-23 | 1994-06-24 | Unceia | Procédé cytométrique de séparation de spermatozoïdes X et Y en fonction de leur contenu en ADN. |
| JPH06197665A (ja) | 1993-01-07 | 1994-07-19 | Norin Suisansyo Chikusan Shikenjo | 体外受精用培地および体外受精方法 |
| DE69417542T2 (de) | 1993-01-16 | 1999-07-15 | James Andrew Norwich Bangham | Signalverarbeitungssystem |
| JP2525713B2 (ja) | 1993-01-19 | 1996-08-21 | 農林水産省畜産試験場長 | 低分子チオ―ル化合物を用いた牛胚の培養法および輸送法 |
| US5467189A (en) | 1993-01-22 | 1995-11-14 | Venturedyne, Ltd. | Improved particle sensor and method for assaying a particle |
| JP3052665B2 (ja) | 1993-01-26 | 2000-06-19 | 株式会社日立製作所 | フローセル装置 |
| CA2113957A1 (en) | 1993-01-29 | 1994-07-30 | University Of Guelph | Nucleotide sequences for bovine sex determination |
| US5453575A (en) | 1993-02-01 | 1995-09-26 | Endosonics Corporation | Apparatus and method for detecting blood flow in intravascular ultrasonic imaging |
| AU673245B2 (en) | 1993-02-01 | 1996-10-31 | Seq, Ltd. | Methods and apparatus for DNA sequencing |
| US5367474A (en) | 1993-02-08 | 1994-11-22 | Coulter Corporation | Flow cytometer |
| US5547849A (en) | 1993-02-17 | 1996-08-20 | Biometric Imaging, Inc. | Apparatus and method for volumetric capillary cytometry |
| US5556764A (en) | 1993-02-17 | 1996-09-17 | Biometric Imaging, Inc. | Method and apparatus for cell counting and cell classification |
| US5563059A (en) | 1993-02-23 | 1996-10-08 | Genentech, Inc. | Use of human inhibin and human activin to increase the number of mature primate oocytes |
| DE69418131D1 (de) | 1993-03-01 | 1999-06-02 | Gen Signal Corp | Vorrichtung zur erzeugung einer einstellbaren ringförmigen beleuchtung für einen photolithograpischen projektionsapparat |
| NO930980L (no) | 1993-03-18 | 1994-09-19 | Flowtech As | Optisk konfigurasjon for væskeströmcytofotometer |
| US5658751A (en) | 1993-04-13 | 1997-08-19 | Molecular Probes, Inc. | Substituted unsymmetrical cyanine dyes with selected permeability |
| US5494795A (en) | 1993-05-05 | 1996-02-27 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Specific oligonucleotide primers for detection of pathogenic campylobacter bacteria by polymerase chain reaction |
| US5439578A (en) | 1993-06-03 | 1995-08-08 | The Governors Of The University Of Alberta | Multiple capillary biochemical analyzer |
| DE69418248T2 (de) | 1993-06-03 | 1999-10-14 | Hamamatsu Photonics Kk | Optisches Laser-Abtastsystem mit Axikon |
| AU6857094A (en) | 1993-06-04 | 1995-01-03 | Kwahak International Co., Ltd. | Artificial insemination and embryo transfer device |
| NO932088L (no) | 1993-06-08 | 1995-01-05 | Oddbjoern Gjelsnes | Anordning for anvendelse ved væskeströmscytometri |
| US5464581A (en) | 1993-08-02 | 1995-11-07 | The Regents Of The University Of California | Flow cytometer |
| US5483469A (en) | 1993-08-02 | 1996-01-09 | The Regents Of The University Of California | Multiple sort flow cytometer |
| US6328071B1 (en) | 1993-08-06 | 2001-12-11 | Cary Austin | Well pressure tank |
| EP0649014B1 (en) | 1993-09-16 | 2005-11-23 | Sysmex Corporation | Particle analyzing apparatus |
| US5503994A (en) | 1993-10-08 | 1996-04-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System for sample detection with compensation for difference in sensitivity to detection of components moving at different velocities |
| US5480774A (en) | 1993-10-14 | 1996-01-02 | A/F Protein, Inc. | Determination of genomic sex in salmonids |
| JP3290786B2 (ja) | 1993-11-26 | 2002-06-10 | シスメックス株式会社 | 粒子分析装置 |
| GB9324938D0 (en) | 1993-12-04 | 1994-01-26 | Atomic Energy Authority Uk | Aerosol generator |
| FI96452C (fi) | 1994-01-26 | 1996-06-25 | Pekka Haenninen | Menetelmä väriaineiden virittämiseksi |
| BR9408370A (pt) | 1994-02-28 | 1997-08-26 | Sunkyong Ind Ltd | Derivados aciclonucleosídeo de pirimidina |
| US5475487A (en) | 1994-04-20 | 1995-12-12 | The Regents Of The University Of California | Aqueous carrier waveguide in a flow cytometer |
| DE4414940C2 (de) | 1994-04-28 | 1998-07-02 | Pekka Haenninen | Lumineszenz-Rastermikroskop mit zwei Photonen Anregung |
| US5595866A (en) | 1994-05-27 | 1997-01-21 | Methodist Hospital Of Indiana, Inc. | Step-wise method to remove cryoprotectant from sperm |
| DE4419894A1 (de) | 1994-06-07 | 1995-12-14 | Gip Medizin Technik Gmbh | Endoskopische Punktionsnadelvorrichtung |
| EP0687956B2 (de) | 1994-06-17 | 2005-11-23 | Carl Zeiss SMT AG | Beleuchtungseinrichtung |
| US5891734A (en) | 1994-08-01 | 1999-04-06 | Abbott Laboratories | Method for performing automated analysis |
| US5601234A (en) | 1994-08-01 | 1997-02-11 | Abbott Laboratories | Fluid nozzle and method of introducing a fluid |
| JP3375203B2 (ja) | 1994-08-08 | 2003-02-10 | シスメックス株式会社 | 細胞分析装置 |
| FR2723735B1 (fr) | 1994-08-18 | 1996-10-31 | Abx Sa | Boitier a branchement automatique pour distribution de reactifs dans un appareil notamment un analyseur hematologique. |
| US20020186874A1 (en) | 1994-09-07 | 2002-12-12 | Jeffrey H. Price | Method and means for image segmentation in fluorescence scanning cytometry |
| US5790692A (en) | 1994-09-07 | 1998-08-04 | Jeffrey H. Price | Method and means of least squares designed filters for image segmentation in scanning cytometry |
| US5700692A (en) | 1994-09-27 | 1997-12-23 | Becton Dickinson And Company | Flow sorter with video-regulated droplet spacing |
| US5934885A (en) | 1994-10-07 | 1999-08-10 | Bayer Corporation | Reagent pump assembly |
| IL115327A (en) | 1994-10-07 | 2000-08-13 | Bayer Ag | Diaphragm pump |
| US6861265B1 (en) | 1994-10-14 | 2005-03-01 | University Of Washington | Flow cytometer droplet formation system |
| US5602039A (en) | 1994-10-14 | 1997-02-11 | The University Of Washington | Flow cytometer jet monitor system |
| US5602349A (en) | 1994-10-14 | 1997-02-11 | The University Of Washington | Sample introduction system for a flow cytometer |
| JPH10507524A (ja) | 1994-10-14 | 1998-07-21 | ユニバーシティ オブ ワシントン | 高速フローサイトメータ液滴形成システム |
| US5643796A (en) | 1994-10-14 | 1997-07-01 | University Of Washington | System for sensing droplet formation time delay in a flow cytometer |
| US5495719A (en) * | 1994-11-14 | 1996-03-05 | Gray, Jr.; Carl O. | Method of preserving spermatozoa |
| JP3347495B2 (ja) * | 1994-11-14 | 2002-11-20 | シスメックス株式会社 | 粒子分析装置 |
| US5514537A (en) | 1994-11-28 | 1996-05-07 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Process and apparatus for sorting spermatozoa |
| WO1996018205A1 (en) | 1994-12-08 | 1996-06-13 | Molecular Dynamics, Inc. | Fluorescence imaging system employing a macro scanning objective |
| US5632754A (en) | 1994-12-23 | 1997-05-27 | Devices For Vascular Intervention | Universal catheter with interchangeable work element |
| EP0720012B1 (en) | 1994-12-26 | 2004-09-08 | Sysmex Corporation | Flow cytometer |
| US5835262A (en) | 1994-12-28 | 1998-11-10 | Research Development Corporation Of Japan | Multi-wavelength optical microscope |
| FI98765C (fi) | 1995-01-16 | 1997-08-11 | Erkki Soini | Virtaussytometrinen menetelmä ja laite |
| US5793485A (en) | 1995-03-20 | 1998-08-11 | Sandia Corporation | Resonant-cavity apparatus for cytometry or particle analysis |
| US5608519A (en) * | 1995-03-20 | 1997-03-04 | Gourley; Paul L. | Laser apparatus and method for microscopic and spectroscopic analysis and processing of biological cells |
| US5620842A (en) | 1995-03-29 | 1997-04-15 | Becton Dickinson And Company | Determination of the number of fluorescent molecules on calibration beads for flow cytometry |
| US5786560A (en) | 1995-03-31 | 1998-07-28 | Panasonic Technologies, Inc. | 3-dimensional micromachining with femtosecond laser pulses |
| US5528045A (en) | 1995-04-06 | 1996-06-18 | Becton Dickinson And Company | Particle analyzer with spatially split wavelength filter |
| US5682038A (en) | 1995-04-06 | 1997-10-28 | Becton Dickinson And Company | Fluorescent-particle analyzer with timing alignment for analog pulse subtraction of fluorescent pulses arising from different excitation locations |
| ATE339680T1 (de) | 1995-04-06 | 2006-10-15 | Delaval Holding Ab | Verfahren und vorrichtung zur quantitativen bestimmung von teilchen in flüssigkeiten |
| US5641457A (en) | 1995-04-25 | 1997-06-24 | Systemix | Sterile flow cytometer and sorter with mechanical isolation between flow chamber and sterile enclosure |
| US5687727A (en) | 1995-05-01 | 1997-11-18 | Danforth Biomedical Incorporated | Catheter adaptor with slitting blade and improved manual control and method of use |
| AU713345B2 (en) | 1995-05-09 | 1999-12-02 | Curators Of The University Of Missouri, The | A system for introducing a fluid into the uterus of an animal |
| FR2734637B1 (fr) | 1995-05-24 | 1997-08-14 | Abx Sa | Dispositif d'inspection optique d'un fluide, notamment pour analyses hematologiques |
| US5798276A (en) | 1995-06-07 | 1998-08-25 | Molecular Probes, Inc. | Reactive derivatives of sulforhodamine 101 with enhanced hydrolytic stability |
| US5650847A (en) | 1995-06-14 | 1997-07-22 | Erkki Soini | Method and device for determination of parameters of individual microparticles |
| US6454945B1 (en) | 1995-06-16 | 2002-09-24 | University Of Washington | Microfabricated devices and methods |
| US5716852A (en) | 1996-03-29 | 1998-02-10 | University Of Washington | Microfabricated diffusion-based chemical sensor |
| US5589457A (en) | 1995-07-03 | 1996-12-31 | Ausa International, Inc. | Process for the synchronization of ovulation |
| US6411835B1 (en) | 1997-01-13 | 2002-06-25 | Medispectra, Inc. | Spectral volume microprobe arrays |
| NZ313947A (en) | 1995-08-11 | 1999-05-28 | Univ Guelph | Identification of non-sex and sex specific molecules; immunisation with antibodies |
| EP0862432A4 (en) | 1995-09-06 | 2003-03-19 | Univ New York State Res Found | DYES OF FREQUENCY RISE TO TWO PHOTONS AND THEIR APPLICATIONS |
| DE19533092A1 (de) | 1995-09-07 | 1997-03-13 | Basf Ag | Vorrichtung zur parallelisierten Zweiphotonen-Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (TPA-FCS) und deren Verwendung zum Wirkstoff-Screening |
| US6329158B1 (en) | 1995-09-15 | 2001-12-11 | Becton Dickinson And Company | Use of dimly fluorescing nucleic acid dyes in the identification of nucleated cells |
| US6040139A (en) | 1995-09-19 | 2000-03-21 | Bova; G. Steven | Laser cell purification system |
| US5726751A (en) * | 1995-09-27 | 1998-03-10 | University Of Washington | Silicon microchannel optical flow cytometer |
| US5780230A (en) | 1995-10-06 | 1998-07-14 | Coriell Institute For Medical Research | Compositions and methods for human sperm activation and quantitative assessment of human sperm genome replication |
| US5736330A (en) | 1995-10-11 | 1998-04-07 | Luminex Corporation | Method and compositions for flow cytometric determination of DNA sequences |
| AU723170B2 (en) | 1995-10-19 | 2000-08-17 | Bio-Origyn Llc | Methods and compositions to improve germ cell and embryo survival and function |
| US6117068A (en) | 1995-10-19 | 2000-09-12 | Elite Genetics, Inc | Artificial insemination system |
| ES2186732T3 (es) | 1995-11-09 | 2003-05-16 | Medical Res Council | Uso de medio cyb para el transporte y almacenamiento de esperma. |
| DE19549015C1 (de) | 1995-12-28 | 1997-04-03 | Siemens Ag | Verfahren und Anordnung zur Überwachung eines abreißenden Flüssigkeitstrahls |
| JP3584108B2 (ja) | 1996-01-08 | 2004-11-04 | キヤノン株式会社 | レンズ鏡筒 |
| US6641708B1 (en) | 1996-01-31 | 2003-11-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method and apparatus for fractionation using conventional dielectrophoresis and field flow fractionation |
| WO1997029354A1 (de) | 1996-02-05 | 1997-08-14 | Bayer Aktiengesellschaft | Verfahren und vorrichtung zum sortieren und zur gewinnung von planar ausgebrachten biologischen objekten wie biologische zellen bzw. zellorganellen, histologischen schnitten, chromosomenteilchen etc. mit laserstrahlen |
| BR9600722A (pt) | 1996-02-14 | 1997-12-30 | Jorge Antonio Rodrigues Claro | Bomba de infusão para contidos em bolsas plásticas flexíveis |
| AU1852297A (en) | 1996-02-16 | 1997-09-02 | Inphocyte, Inc. | System and method for rapid analysis of cells using spectral cytometry |
| JP3127111B2 (ja) | 1996-02-22 | 2001-01-22 | 株式会社日立製作所 | フロー式粒子画像解析方法および装置 |
| US6090947A (en) | 1996-02-26 | 2000-07-18 | California Institute Of Technology | Method for the synthesis of pyrrole and imidazole carboxamides on a solid support |
| US6143901A (en) | 1996-07-31 | 2000-11-07 | Genesoft, Inc. | Complex formation between dsDNA and pyrrole imidazole polyamides |
| US5895922A (en) | 1996-03-19 | 1999-04-20 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of National Defence | Fluorescent biological particle detection system |
| US5701012A (en) | 1996-03-19 | 1997-12-23 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of National Defence | Fluorescent biological particle detection system |
| US5747349A (en) | 1996-03-20 | 1998-05-05 | University Of Washington | Fluorescent reporter beads for fluid analysis |
| JP3640461B2 (ja) | 1996-04-03 | 2005-04-20 | シスメックス株式会社 | 粒子分析装置 |
| US5707808A (en) | 1996-04-15 | 1998-01-13 | The Regents Of The University Of California | Optical selection and collection of DNA fragments |
| DE69737513T2 (de) | 1996-04-25 | 2007-12-13 | Genicon Sciences Corp., San Diego | Teilchenförmiges markierungsmittel verwendendes analytassay |
| WO1997043620A1 (en) | 1996-05-15 | 1997-11-20 | International Remote Imaging Systems, Inc. | Selectively emphasizing particles of interest from a fluid sample for analysis |
| JP2963393B2 (ja) | 1996-06-14 | 1999-10-18 | 浜松ホトニクス株式会社 | 光電子増倍管用電圧分割回路 |
| US5846737A (en) | 1996-07-26 | 1998-12-08 | Molecular Probes, Inc. | Conjugates of sulforhodamine fluorophores with enhanced fluorescence |
| US5909278A (en) | 1996-07-29 | 1999-06-01 | The Regents Of The University Of California | Time-resolved fluorescence decay measurements for flowing particles |
| ES2328423T3 (es) | 1996-07-30 | 2009-11-12 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Sistema optico para un instrumento de hematologia analitica. |
| US5844685A (en) | 1996-07-30 | 1998-12-01 | Bayer Corporation | Reference laser beam sampling apparatus |
| US6042249A (en) | 1996-07-30 | 2000-03-28 | Bayer Corporation | Illuminator optical assembly for an analytical instrument and methods of alignment and manufacture |
| EP0822401A3 (en) | 1996-07-30 | 1999-05-06 | Bayer Corporation | Hydraulic system for a hematology analytical instrument |
| US5883378A (en) | 1996-07-30 | 1999-03-16 | Bayer Corporation | Apparatus and methods for transmitting electrical signals indicative of optical interactions between a light beam and a flowing suspension of particles |
| US5719667A (en) * | 1996-07-30 | 1998-02-17 | Bayer Corporation | Apparatus for filtering a laser beam in an analytical instrument |
| US5872627A (en) * | 1996-07-30 | 1999-02-16 | Bayer Corporation | Method and apparatus for detecting scattered light in an analytical instrument |
| US6074827A (en) | 1996-07-30 | 2000-06-13 | Aclara Biosciences, Inc. | Microfluidic method for nucleic acid purification and processing |
| US5745308A (en) | 1996-07-30 | 1998-04-28 | Bayer Corporation | Methods and apparatus for an optical illuminator assembly and its alignment |
| US5998140A (en) | 1996-07-31 | 1999-12-07 | The Scripps Research Institute | Complex formation between dsDNA and oligomer of cyclic heterocycles |
| US5804436A (en) | 1996-08-02 | 1998-09-08 | Axiom Biotechnologies, Inc. | Apparatus and method for real-time measurement of cellular response |
| BR9710726A (pt) | 1996-08-07 | 2000-01-11 | Cuno Inc | Dispositivo dosador de aditivos e seu sistema de fluìdos. |
| JP2002503334A (ja) | 1996-09-04 | 2002-01-29 | テクニカル ユニバーシティ オブ デンマーク | 粒子の分離と分析用のマイクロフローシステム |
| ATE267596T1 (de) | 1996-09-06 | 2004-06-15 | Medarex Inc | Cyanidinzusammensetzungen und deren therapeutische und diagnostische verwendungen |
| US5873254A (en) | 1996-09-06 | 1999-02-23 | Interface Multigrad Technology | Device and methods for multigradient directional cooling and warming of biological samples |
| US6221654B1 (en) | 1996-09-25 | 2001-04-24 | California Institute Of Technology | Method and apparatus for analysis and sorting of polynucleotides based on size |
| US5759767A (en) | 1996-10-11 | 1998-06-02 | Joseph R. Lakowicz | Two-photon and multi-photon measurement of analytes in animal and human tissues and fluids |
| US6002471A (en) | 1996-11-04 | 1999-12-14 | California Institute Of Technology | High resolution scanning raman microscope |
| US5799830A (en) | 1996-11-08 | 1998-09-01 | Carroll; David C. | Pressure vessel access port |
| US5696157A (en) | 1996-11-15 | 1997-12-09 | Molecular Probes, Inc. | Sulfonated derivatives of 7-aminocoumarin |
| AU752985B2 (en) | 1997-01-31 | 2002-10-03 | Xy, Llc. | Optical apparatus |
| US6534308B1 (en) | 1997-03-27 | 2003-03-18 | Oncosis, Llc | Method and apparatus for selectively targeting specific cells within a mixed cell population |
| US5874266A (en) * | 1997-03-27 | 1999-02-23 | Palsson; Bernhard O. | Targeted system for removing tumor cells from cell populations |
| US6753161B2 (en) | 1997-03-27 | 2004-06-22 | Oncosis Llc | Optoinjection methods |
| GB9707096D0 (en) | 1997-04-08 | 1997-05-28 | Smithkline Beecham Plc | Novel device |
| JP2968231B2 (ja) | 1997-04-11 | 1999-10-25 | 株式会社荏原製作所 | 空調システム |
| DE19717749A1 (de) | 1997-04-21 | 1998-10-22 | Fraunhofer Ges Forschung | Verfahren und Vorrichtung zur quantitativen und qualitativen on-line-Differenzierung von biotischen und abiotischen Partikeln |
| US6050935A (en) | 1997-05-09 | 2000-04-18 | Biofertec | Container assembly for intravaginal fertilization and culture and embryo transfer and method of intravaginal fertilization and culture employing such a container |
| US6133995A (en) | 1997-05-09 | 2000-10-17 | Sysmex Corporation | Particle measuring apparatus |
| AU7831798A (en) | 1997-06-09 | 1998-12-30 | Guava Technologies, Inc. | Method and apparatus for detecting microparticles in fluid samples |
| AU8148898A (en) | 1997-06-23 | 1999-01-04 | Luminex Corporation | Interlaced lasers for multiple fluorescence measurement |
| ES2260809T3 (es) | 1997-07-01 | 2006-11-01 | Vlp Watertown Limited Partnership | Metodo para la determinacion del sexo de una progenie mamifera. |
| US6111398A (en) | 1997-07-03 | 2000-08-29 | Coulter International Corp. | Method and apparatus for sensing and characterizing particles |
| BR9704313A (pt) | 1997-07-08 | 1999-04-06 | Alves Elias Walter | Utilização de ig-y de ovo de galinha associado a anticorpos monoclonais contra antigenos sexo especifico na imunosexagem de espermatozóides de bovinos |
| US5899848A (en) | 1997-07-14 | 1999-05-04 | Haubrich; Mark A. | Device and process for artificial insemination of animals |
| US5985216A (en) | 1997-07-24 | 1999-11-16 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Flow cytometry nozzle for high efficiency cell sorting |
| US5876942A (en) | 1997-07-24 | 1999-03-02 | National Science Council Of Republic Of China | Process for sexing cow embryos |
| US5985538A (en) | 1997-08-01 | 1999-11-16 | Saint Barnabas Medical Center | Cryopreservation and cell culture medium comprising less than 50 mM sodium ions and greater than 100 mM choline salt |
| US5819948A (en) | 1997-08-21 | 1998-10-13 | Van Den Engh; Gerrit J. | Particle separating apparatus and method |
| US6003678A (en) | 1997-08-21 | 1999-12-21 | University Of Washington | Particle separating apparatus and method |
| US5880474A (en) | 1997-08-29 | 1999-03-09 | Becton Dickinson And Company | Multi-illumination-source flow particle analyzer with inter-location emissions crosstalk cancelation |
| CA2304197C (en) | 1997-09-22 | 2009-02-03 | University Of Guelph | Reduction of sperm sensitivity to chilling |
| US6540895B1 (en) | 1997-09-23 | 2003-04-01 | California Institute Of Technology | Microfabricated cell sorter for chemical and biological materials |
| US6322901B1 (en) | 1997-11-13 | 2001-11-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Highly luminescent color-selective nano-crystalline materials |
| US6201628B1 (en) | 1997-11-19 | 2001-03-13 | University Of Washington | High throughput optical scanner |
| US6086574A (en) | 1997-11-21 | 2000-07-11 | Hyclone Laboratories, Inc. | Fluid delivery systems with diptube connector |
| US5895764A (en) | 1997-11-24 | 1999-04-20 | University Of New Mexico | Controlled sheath flow injection cytometry |
| US6207392B1 (en) | 1997-11-25 | 2001-03-27 | The Regents Of The University Of California | Semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes |
| US5990479A (en) | 1997-11-25 | 1999-11-23 | Regents Of The University Of California | Organo Luminescent semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes |
| WO1999031488A1 (en) | 1997-12-12 | 1999-06-24 | Chemunex S.A. | Digital flow cytometer |
| US6149867A (en) | 1997-12-31 | 2000-11-21 | Xy, Inc. | Sheath fluids and collection systems for sex-specific cytometer sorting of sperm |
| US6071689A (en) | 1997-12-31 | 2000-06-06 | Xy, Inc. | System for improving yield of sexed embryos in mammals |
| EP1058688A4 (en) | 1998-02-03 | 2004-10-06 | Xy Inc | USE OF SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS TO DETECT THE PRESENCE OF MALE BOVINE CHROMOSOME BY CHAIN AMPLIFICATION BY POLYMERASE |
| US6746873B1 (en) | 1998-02-20 | 2004-06-08 | Xy, Inc. | Vibratory system for a sorting flow cytometer |
| RU2224992C2 (ru) | 1998-02-20 | 2004-02-27 | Кси, Инк. | Вибрационная система для проточного цитометра, предназначенного для сортинга |
| US6154276A (en) | 1998-02-23 | 2000-11-28 | The Regents Of The University Of California | Waveguide detection of right-angle-scattered light in flow cytometry |
| US6211477B1 (en) | 1998-02-26 | 2001-04-03 | Becton Dickinson And Company | Electrostatic deceleration system for flow cytometer |
| US6248590B1 (en) | 1998-02-27 | 2001-06-19 | Cytomation, Inc. | Method and apparatus for flow cytometry |
| US6042025A (en) | 1998-03-13 | 2000-03-28 | Smith Et Al. | Two hole dispenser with baffles |
| DE69912935T2 (de) | 1998-03-16 | 2004-09-02 | Partec Partikelzählgeräte GmbH | Elektronisches gerät zur präzisen abgabe kleiner flüssigkeitsmengen |
| JP3594794B2 (ja) | 1998-03-24 | 2004-12-02 | 独立行政法人 科学技術振興機構 | ナノ秒時間ゲート分光診断装置 |
| US6642018B1 (en) | 1998-03-27 | 2003-11-04 | Oncosis Llc | Method for inducing a response in one or more targeted cells |
| CA2325860A1 (en) | 1998-03-30 | 1999-10-07 | Bioshaf Ltd. | Flow cytometer for analysis of general diagnostic factors in cells and body fluids |
| US6175409B1 (en) | 1999-04-02 | 2001-01-16 | Symyx Technologies, Inc. | Flow-injection analysis and variable-flow light-scattering methods and apparatus for characterizing polymers |
| JP3350442B2 (ja) | 1998-04-09 | 2002-11-25 | 科学技術振興事業団 | 顕微鏡システム |
| AU4184099A (en) | 1998-05-14 | 1999-11-29 | Luminex Corporation | Zero dead time architecture and method for flow cytometer |
| CA2320296A1 (en) | 1998-05-18 | 1999-11-25 | University Of Washington | Liquid analysis cartridge |
| JP2002528699A (ja) | 1998-05-22 | 2002-09-03 | カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー | 微細製作細胞分類器 |
| US6079836A (en) | 1998-07-20 | 2000-06-27 | Coulter International Corp. | Flow cytometer droplet break-off location adjustment mechanism |
| JP2002521043A (ja) | 1998-07-30 | 2002-07-16 | エックスワイ，インコーポレイテッド | 非外科的人工授精のためのウマシステム |
| US6729369B2 (en) | 1998-07-31 | 2004-05-04 | Chata Biosystems, Inc. | Vessel for containing/transporting a fluent substance |
| US20040107150A1 (en) | 1998-07-31 | 2004-06-03 | Chata Biosystems, Inc. Of Colorado | Apparatus and method with vessel for containing/transporting a fluent substance |
| DE29813921U1 (de) | 1998-08-04 | 1998-10-08 | Kisfeld, Alfons, 48691 Vreden | Vorrichtung zur Besamung von Tieren, insbesondere Sauen |
| US6309815B1 (en) | 1998-08-07 | 2001-10-30 | University Of Kansas Medical Center | Composition and method for preparation, storage and activation of large populations of immotile sperm |
| AU5675099A (en) | 1998-08-17 | 2000-03-06 | William E. Trout | Use of zeranol to modulate reproductive cycles |
| DE69937353T2 (de) | 1998-08-21 | 2008-07-17 | Union Biometrica, Inc., Somerville | Instrument zur analyse und selektiven verteilung von objektproben |
| US6326144B1 (en) | 1998-09-18 | 2001-12-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Biological applications of quantum dots |
| US6495333B1 (en) | 1998-09-22 | 2002-12-17 | Becton Dickinson And Company | Flow cytometric, whole blood dendritic cell immune function assay |
| US6208411B1 (en) | 1998-09-28 | 2001-03-27 | Kla-Tencor Corporation | Massively parallel inspection and imaging system |
| US6707555B1 (en) | 1998-10-15 | 2004-03-16 | Sysmex Corporation | Optical information measuring apparatus |
| US6423505B1 (en) | 1998-12-03 | 2002-07-23 | Becton Dickinson And Company | Methods and reagents for quantitation of HLA-DR and CD11b expression on peripheral blood cells |
| US7116407B2 (en) | 1998-12-15 | 2006-10-03 | Union Biometrica, Inc. | System for axial pattern analysis of multicellular organisms |
| US6128133A (en) | 1998-12-22 | 2000-10-03 | Lucent Technologies Inc. | Optical beamsplitter |
| JP2000206032A (ja) | 1999-01-06 | 2000-07-28 | Bayer Corp | 可変割合体積粒子計数装置及び試料の特性を定める方法 |
| US20010006416A1 (en) | 1999-01-11 | 2001-07-05 | Johnson Paul E. | Ribbon flow cytometry apparatus and methods |
| US6256096B1 (en) | 1999-01-11 | 2001-07-03 | Softray | Flow cytometry apparatus and method |
| US6150119A (en) * | 1999-01-19 | 2000-11-21 | Caliper Technologies Corp. | Optimized high-throughput analytical system |
| US6473176B2 (en) | 1999-01-25 | 2002-10-29 | Amnis Corporation | Imaging and analyzing parameters of small moving objects such as cells |
| US6671044B2 (en) | 1999-01-25 | 2003-12-30 | Amnis Corporation | Imaging and analyzing parameters of small moving objects such as cells in broad flat flow |
| US6580504B1 (en) | 1999-01-25 | 2003-06-17 | Amnis Corporation | Multipass cavity for illumination and excitation of moving objects |
| US6119465A (en) | 1999-02-10 | 2000-09-19 | Mullens; Patrick L. | Shipping container for storing materials at cryogenic temperatures |
| FR2789778B1 (fr) | 1999-02-12 | 2001-09-14 | France Telecom | Procede pour associer des references d'acheminement a des paquets de donnees au moyen d'une memoire trie, et routeur de paquets appliquant ce procede |
| US6323632B1 (en) | 1999-08-13 | 2001-11-27 | Coulter International Corp. | Solid state RF oscillator-detector for flow cytometer |
| US6097485A (en) | 1999-03-08 | 2000-08-01 | Integrated Waveguides, Inc. | Microchip optical transport technology for use in a personal flow cytometer |
| FR2791645B1 (fr) | 1999-04-02 | 2001-06-15 | Valois Sa | Echantillon de produit fluide destine a la presse |
| US6193647B1 (en) * | 1999-04-08 | 2001-02-27 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Microfluidic embryo and/or oocyte handling device and method |
| US6793387B1 (en) | 1999-05-08 | 2004-09-21 | Chata Biosystems, Inc. | Apparatus for automatic preparation of a mixture and method |
| FR2793495B1 (fr) | 1999-05-14 | 2001-08-10 | Imv Technologies | Dilueur pour la cryoconservation de spermatozoides de bovins |
| FR2793708B1 (fr) | 1999-05-21 | 2001-08-03 | Valois Sa | Dispositif de distribution de produit fluide |
| US6372506B1 (en) | 1999-07-02 | 2002-04-16 | Becton, Dickinson And Company | Apparatus and method for verifying drop delay in a flow cytometer |
| IT1307787B1 (it) | 1999-07-26 | 2001-11-19 | Univ Firenze | Processo per incrementare la motilita' degli spermatozoi e spermatozoia motilita' superiore cosi' ottenuti. |
| DE19935766A1 (de) | 1999-07-29 | 2001-02-01 | Friedrich Schiller Uni Jena Bu | Verfahren zur optischen Anregung von Fluorophor-markierter DNA und RNA |
| US6664550B2 (en) | 1999-08-30 | 2003-12-16 | Sandia National Laboratories | Apparatus to collect, classify, concentrate, and characterize gas-borne particles |
| US6495366B1 (en) | 1999-09-03 | 2002-12-17 | Therakos, Inc. | Uninterrupted flow pump apparatus and method |
| US6813017B1 (en) | 1999-10-20 | 2004-11-02 | Becton, Dickinson And Company | Apparatus and method employing incoherent light emitting semiconductor devices as particle detection light sources in a flow cytometer |
| WO2001028700A1 (en) | 1999-10-21 | 2001-04-26 | Cytomation, Inc. | Transiently dynamic flow cytometer analysis system |
| US6472153B1 (en) | 1999-10-26 | 2002-10-29 | Epoch Biosciences, Inc. | Hybridization-triggered fluorescent detection of nucleic acids |
| US7208265B1 (en) | 1999-11-24 | 2007-04-24 | Xy, Inc. | Method of cryopreserving selected sperm cells |
| EP2281879B1 (en) * | 1999-11-30 | 2016-01-27 | Intrexon Corporation | Apparatus for determining a morphological or physiological characteristic of individual cells in a biological specimen |
| US6263745B1 (en) | 1999-12-03 | 2001-07-24 | Xy, Inc. | Flow cytometer nozzle and flow cytometer sample handling methods |
| US6558911B1 (en) | 1999-12-10 | 2003-05-06 | Oregon Health Sciences University | Sperm quality assay |
| WO2001049205A1 (es) | 2000-01-03 | 2001-07-12 | Iberica De Reproduccion Asistida, S.L. | Dispositivo de inseminacion artificial en ganado porcino |
| ES2174778T3 (es) | 2000-01-14 | 2002-11-16 | Exelixis Deutschland Gmbh | Procedimiento de crioconservacion de esperma de pez cebra. |
| US6465169B2 (en) | 2000-01-14 | 2002-10-15 | Artemis Pharmaceuticals Gmbh | Method for cryoconservation of Zebrafish sperm |
| IT1317724B1 (it) | 2000-01-14 | 2003-07-15 | Istituto Sperimentale Italiano | Procedimento per la produzione di embrioni non umani di sessopredeterminato ad alto valore genetico. |
| WO2001055454A1 (en) | 2000-01-28 | 2001-08-02 | Althea Technologies, Inc. | Methods for analysis of gene expression |
| US6587203B2 (en) | 2000-02-17 | 2003-07-01 | Cornell Research Foundation, Inc. | Sort stream stabilizer for flow cytometer |
| US6618143B2 (en) | 2000-02-18 | 2003-09-09 | Idexx Laboratories, Inc. | High numerical aperture flow cytometer and method of using same |
| US6646742B1 (en) | 2000-02-19 | 2003-11-11 | Mwi, Inc. | Optical device and method for multi-angle laser light scatter |
| JP3587755B2 (ja) | 2000-03-14 | 2004-11-10 | シスメックス株式会社 | 粒子測定装置およびその方法 |
| GB2360360B (en) | 2000-03-14 | 2002-03-20 | Univ Bristol | A method of sorting cells |
| US6482652B2 (en) | 2000-03-23 | 2002-11-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Biological particle sorter |
| AU2001249589B2 (en) | 2000-03-30 | 2006-07-13 | Iowa State University Research Foundation | Genetic markers for improved meat characteristics in animals |
| CA2405802A1 (en) | 2000-04-11 | 2001-10-18 | Chemometec A/S | Method and apparatus for detecting fluorescence of a sample |
| EP1147774A1 (en) | 2000-04-20 | 2001-10-24 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Method for improving the quality of sperm for artificial insemination of animals |
| EP2258174A3 (en) | 2000-05-09 | 2012-06-13 | Xy, Llc | High purity x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations of spermatozoa |
| WO2001090295A1 (en) | 2000-05-19 | 2001-11-29 | Cytomation, Inc. | A rapid multi-material sample input system |
| US6590911B1 (en) | 2000-06-02 | 2003-07-08 | Coherent, Inc. | Passively modelocked harmonic-generating laser |
| US6700130B2 (en) | 2001-06-29 | 2004-03-02 | Honeywell International Inc. | Optical detection system for flow cytometry |
| US7351376B1 (en) | 2000-06-05 | 2008-04-01 | California Institute Of Technology | Integrated active flux microfluidic devices and methods |
| US6503698B1 (en) * | 2000-06-16 | 2003-01-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Cryopreservation of swine embryos |
| JP2004503231A (ja) | 2000-06-12 | 2004-02-05 | エックスワイ，インコーポレイテッド | Ｘ染色体保有精子およびｙ染色体保有精子の単離された集団を利用する統合群れ管理システム |
| DE10031028B4 (de) | 2000-06-26 | 2008-09-04 | Gnothis Holding Sa | Verfahren zur Selektion von Partikeln |
| GB0016920D0 (en) | 2000-07-10 | 2000-08-30 | Univ Cambridge Tech | Decondensation of DNA |
| CN1450857A (zh) | 2000-08-10 | 2003-10-22 | Gtc生物治疗学公司 | 精子的低温保存 |
| US20040005582A1 (en) | 2000-08-10 | 2004-01-08 | Nanobiodynamics, Incorporated | Biospecific desorption microflow systems and methods for studying biospecific interactions and their modulators |
| FR2813283B1 (fr) | 2000-08-25 | 2003-02-14 | Valois Sa | Distributeur a pompe integree |
| EP1190684A1 (en) | 2000-09-05 | 2002-03-27 | Universiteit Gent | Device and method for artificial insemination of bovines and other animals |
| US20020028434A1 (en) | 2000-09-06 | 2002-03-07 | Guava Technologies, Inc. | Particle or cell analyzer and method |
| JP2004522418A (ja) | 2000-09-08 | 2004-07-29 | アイオワ ステート ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション，インコーポレーティッド | 新規なｐｒｋａｇ３対立遺伝子並びに生殖性及び肉質の形質の遺伝標識としてのその使用 |
| WO2002023163A1 (en) | 2000-09-15 | 2002-03-21 | California Institute Of Technology | Microfabricated crossflow devices and methods |
| GB0023041D0 (en) | 2000-09-20 | 2000-11-01 | Univ Manchester | Identification apparatus |
| CN1325909C (zh) | 2000-09-27 | 2007-07-11 | 清华大学 | 用于微粒操纵与微粒导向的装置及其使用方法 |
| US7208120B2 (en) | 2000-09-27 | 2007-04-24 | The Trustees Of Boston University | Cellular diagnostic arrays, methods of using and processing for producing same |
| BR0005045A (pt) | 2000-09-28 | 2002-05-14 | Marcos Fernando De Resende Mat | Método para sexagem de espermatozóides usando a via clássica do sistema complemento, com eliminação da via alternativa pela inativação da proteina "b" |
| EP1322936A2 (en) | 2000-10-03 | 2003-07-02 | California Institute Of Technology | Microfluidic devices and methods of use |
| GB2383543B (en) | 2000-10-05 | 2005-03-09 | Xy Inc | System of hysteroscopic insemination of mares |
| US20040031071A1 (en) | 2000-10-05 | 2004-02-12 | Xy, Inc. | System of hysteroscopic insemination of mares |
| WO2002031467A1 (en) | 2000-10-12 | 2002-04-18 | Amnis Corporation | Multipass cavity for illumination and excitation of moving objects |
| JP2004537712A (ja) | 2000-10-18 | 2004-12-16 | バーチャル・アレイズ・インコーポレーテッド | 多重細胞分析システム |
| AU3948002A (en) | 2000-10-23 | 2002-05-27 | Py Patent Inc | Fluid dispenser having a rigid vial and flexible inner bladder |
| US20040034879A1 (en) * | 2000-11-09 | 2004-02-19 | Steve Rothstein | Mammalian sex selection using genetic modification |
| US20050064383A1 (en) | 2000-11-22 | 2005-03-24 | Bashkin James K. | Methods and apparatus for producing gender enriched sperm |
| SE0004777D0 (sv) | 2000-12-22 | 2000-12-22 | Amersham Pharm Biotech Ab | Separation of X-and Y-sperm cells |
| US7713687B2 (en) * | 2000-11-29 | 2010-05-11 | Xy, Inc. | System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations |
| US6849423B2 (en) * | 2000-11-29 | 2005-02-01 | Picoliter Inc | Focused acoustics for detection and sorting of fluid volumes |
| WO2002043486A1 (en) | 2000-11-29 | 2002-06-06 | Xy, Inc. | System for in-vitro fertilization with spermatozoa separated into x-chromosome and y-chromosome bearing populations |
| US20020064809A1 (en) | 2000-11-29 | 2002-05-30 | Mutz Mitchell W. | Focused acoustic ejection cell sorting system and method |
| US20020064808A1 (en) | 2000-11-29 | 2002-05-30 | Mutz Mitchell W. | Focused acoustic energy for ejecting cells from a fluid |
| EP1340080A2 (en) | 2000-11-30 | 2003-09-03 | The Netherlands Cancer Institute | Membrane molecule indicator compositions and methods |
| US6576291B2 (en) | 2000-12-08 | 2003-06-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Preparation of nanocrystallites |
| CA2440181A1 (en) | 2000-12-15 | 2002-07-25 | Dakocytomation Denmark A/S | Electrical conductive containment system |
| US6577387B2 (en) | 2000-12-29 | 2003-06-10 | Johnson & Johnson Vision Care, Inc. | Inspection of ophthalmic lenses using absorption |
| US6911450B1 (en) | 2001-01-29 | 2005-06-28 | Universite De Geneve | Pyrimidine acyclonucleoside derivatives, preparation method and use thereof |
| US6673095B2 (en) | 2001-02-12 | 2004-01-06 | Wound Healing Of Oklahoma, Inc. | Apparatus and method for delivery of laser light |
| US7029916B2 (en) | 2001-02-21 | 2006-04-18 | Maxcyte, Inc. | Apparatus and method for flow electroporation of biological samples |
| WO2002077011A2 (en) | 2001-03-12 | 2002-10-03 | The State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of The University Of Oregon | Oxidation-reduction sensitive green fluorescent protein variants |
| US6706163B2 (en) | 2001-03-21 | 2004-03-16 | Michael Seul | On-chip analysis of particles and fractionation of particle mixtures using light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces |
| CA2442019A1 (en) | 2001-03-22 | 2002-10-03 | Infigen, Inc. | Sex-specific selection of sperm from transgenic animals |
| EP1245944B1 (en) | 2001-03-29 | 2007-02-14 | Sysmex Corporation | Flow cytometer |
| WO2002078906A2 (en) | 2001-03-29 | 2002-10-10 | Cellect Technologies Corp. | Methods devices and systems for sorting and separating particles |
| JP2005509113A (ja) * | 2001-04-03 | 2005-04-07 | マイクロニクス， インコーポレイテッド | ミクロ流体構造において使用するための空気バルブ界面 |
| JP2002311027A (ja) | 2001-04-09 | 2002-10-23 | Hitachi Software Eng Co Ltd | ビーズ、ビーズ製造方法、フローサイトメータ及びプログラム |
| US6416190B1 (en) | 2001-04-27 | 2002-07-09 | University Of Chicago | Apparatus for using optical tweezers to manipulate materials |
| US20020186375A1 (en) | 2001-05-01 | 2002-12-12 | Asbury Charles L. | Device and methods for detecting samples in a flow cytometer independent of variations in fluorescence polarization |
| WO2002092161A1 (en) | 2001-05-10 | 2002-11-21 | Biophan, Llc | Miniaturized particle analyzer |
| US7345758B2 (en) | 2001-05-17 | 2008-03-18 | Cytopeia | Apparatus for analyzing and sorting biological particles |
| EP1395374B1 (en) | 2001-05-17 | 2013-04-17 | Beckman Coulter, Inc. | Flow cytometer with active automated optical alignment system |
| US20020182590A1 (en) | 2001-05-25 | 2002-12-05 | Vanderbilt University | Determining protein function in cell culture using RNA interference |
| US20030048433A1 (en) | 2001-06-01 | 2003-03-13 | Jean-Marie Desjonqueres | Cytometer signal processing system and method |
| FR2825987B1 (fr) | 2001-06-19 | 2003-12-12 | Valois Sa | Distributeur de produit fluide |
| WO2003008937A2 (en) | 2001-07-18 | 2003-01-30 | The Regents Of The University Of Michigan | Gas-focusing flow cytometer cell and flow cytometer detection system with waveguide optics |
| US7704728B2 (en) | 2001-07-18 | 2010-04-27 | The University Of Michigan | Microfluidic gravity pump with constant flow rate |
| FR2828281B1 (fr) | 2001-08-02 | 2004-12-31 | Biocytex | Dispositif pour l'analyse d'un echantillon notamment par cytometrie de flux |
| WO2003020877A2 (en) | 2001-09-01 | 2003-03-13 | Pharmacia Corporation | Staining and sorting genomes and chromosomes using sequence-specific polyamides |
| DE10151216A1 (de) | 2001-10-16 | 2003-04-24 | Zeiss Carl Jena Gmbh | Verfahren zur optischen Erfassung von charakteristischen Größen einer beleuchteten Probe |
| US20030078703A1 (en) | 2001-10-19 | 2003-04-24 | Surromed, Inc. | Cytometry analysis system and method using database-driven network of cytometers |
| US6838289B2 (en) | 2001-11-14 | 2005-01-04 | Beckman Coulter, Inc. | Analyte detection system |
| US6831279B2 (en) | 2001-11-27 | 2004-12-14 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of National Defence | Laser diode-excited biological particle detection system |
| WO2003056335A2 (de) | 2001-12-31 | 2003-07-10 | Institut für Physikalische Hochtechnologie e.V. | Mikrovertiefungsarray zur grössenabhängigen sortierung oder separation von in einer strömenden flüssigkeit suspendierten zellen und verfahren zur untersuchung der funktionellen aktivität von einzelzellen |
| AU2002363895A1 (en) | 2001-12-31 | 2003-07-15 | Institut Fur Physikalische Hochtechnologie E.V. | Cell sorting system for the size-based sorting or separation of cells suspended in a flowing fluid |
| US6780377B2 (en) | 2002-01-22 | 2004-08-24 | Dakocytomation Denmark A/S | Environmental containment system for a flow cytometer |
| CA2474846C (en) * | 2002-01-31 | 2008-04-15 | Fiskars Brands, Inc. | Multi-function tool with spring biased implement |
| US6698627B2 (en) * | 2002-02-19 | 2004-03-02 | Valois S.A.S. | Fluid dispenser |
| US6849394B2 (en) * | 2002-02-21 | 2005-02-01 | Minitube Of America | Compositions comprising reproductive cell media and methods for using such compositions |
| AU2003219836A1 (en) | 2002-02-27 | 2003-09-09 | The Regents Of The University Of Michigan | Process for sorting motile particles from lesser-motile particles and apparatus suitable therefor |
| US7223371B2 (en) | 2002-03-14 | 2007-05-29 | Micronics, Inc. | Microfluidic channel network device |
| US20030175980A1 (en) | 2002-03-14 | 2003-09-18 | Hayenga Jon W. | Ribbon flow cytometry and cell sorting |
| JP2004000144A (ja) | 2002-03-29 | 2004-01-08 | Aisin Seiki Co Ltd | 細胞分離選別装置、細胞整列用基板 |
| WO2004003697A2 (en) | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Monsanto Technology Llc | Swine genetics business system |
| EP1531813A1 (en) | 2002-07-10 | 2005-05-25 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Use of compounds for increasing spermatozoa motility |
| AU2003259205B2 (en) | 2002-07-22 | 2009-10-08 | Xy, Llc. | Sperm cell process system |
| EP2284256A3 (en) | 2002-08-01 | 2012-08-29 | Xy, Llc | Low pressure sperm separation system |
| JP2005535346A (ja) | 2002-08-15 | 2005-11-24 | エックスワイ，インコーポレイテッド | 高分解能フローサイトメーター |
| US7169548B2 (en) | 2002-09-13 | 2007-01-30 | Xy, Inc. | Sperm cell processing and preservation systems |
| JP3983151B2 (ja) | 2002-09-25 | 2007-09-26 | ダイワ精工株式会社 | 魚釣用スピニングリール |
| US7201875B2 (en) | 2002-09-27 | 2007-04-10 | Becton Dickinson And Company | Fixed mounted sorting cuvette with user replaceable nozzle |
| US20040061853A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-04-01 | Blasenheim Barry J. | Prism-based flow cytometry excitation optics |
| US6941005B2 (en) | 2002-11-01 | 2005-09-06 | Coulter International Corp. | Monitoring and control of droplet sorting |
| EP1565737A4 (en) | 2002-11-20 | 2007-02-14 | Univ Virginia | SEPARATION OF SPERM CELLS FROM OTHER BIOLOGICAL SUBSTANCES USING MICRO-PRODUCED EQUIPMENT, AND RELATED METHODS |
| AU2003297304A1 (en) | 2002-12-19 | 2004-07-22 | Monsanto Technology Llc | Method and means for early detection of pregnancy in animals by combination testing |
| JP2006525019A (ja) | 2003-03-28 | 2006-11-09 | モンサント テクノロジー エルエルシー | 精子の染色方法 |
| CA2518882C (en) | 2003-03-28 | 2017-05-09 | Monsanto Technology Llc | Apparatus, methods and processes for sorting particles and for providing sex-sorted animal sperm |
| ES2541121T3 (es) | 2003-05-15 | 2015-07-16 | Xy, Llc | Clasificación eficiente de células haploides por sistemas de citometría de flujo |
| US20050011582A1 (en) * | 2003-06-06 | 2005-01-20 | Haug Jeffrey S. | Fluid delivery system for a flow cytometer |
| DK1730523T3 (da) | 2004-03-29 | 2010-03-29 | Inguran Llc | Anvendelse af en sammensætning, som regulerer oxiderings-/reduktionsprocesser intracellulært og/eller ekstracellulært ved en farvnings- eller sorteringsproces for spermatozoer |
| EP2801363B1 (en) | 2004-03-29 | 2018-02-21 | Inguran, LLC | Process for storing sorted spermatozoa |
| AU2005266930B2 (en) | 2004-07-22 | 2010-09-16 | Inguran, Llc | Process for enriching a population of sperm cells |
| DK2884258T3 (da) | 2004-07-27 | 2017-01-02 | Beckman Coulter Inc | Forbedring af flowcytometrisk diskrimination med computerimplementeret geometrisk transformation |
| US20060118167A1 (en) | 2004-12-03 | 2006-06-08 | Xy, Inc. | Pressure regulated continuously variable volume container for fluid delivery |
| US20060147894A1 (en) | 2004-12-30 | 2006-07-06 | Vicam, L.P. | Jacketed vessel for holding semen for sex biasing mammals through artificial insemination and systems and methods for enhancing the probability of sex biasing using the same |
| US7591064B2 (en) * | 2005-07-20 | 2009-09-22 | Hitachi Global Storage Technologies Netherlands B.V. | Method of fabrication for tape medium read head with unitary formation of multiple elements |
| US7618770B2 (en) * | 2005-07-29 | 2009-11-17 | Xy, Inc. | Methods and apparatus for reducing protein content in sperm cell extenders |
| CN100998524A (zh) | 2007-01-19 | 2007-07-18 | 北京锦绣大地农业股份有限公司 | 牛性控胚胎生产方法 |
-
2000
- 2000-01-05 US US09/478,299 patent/US7208265B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-22 HU HU0203920A patent/HUP0203920A2/hu unknown
- 2000-11-22 KR KR1020027006696A patent/KR100757753B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-22 DK DK05001937.1T patent/DK1557087T3/da active
- 2000-11-22 ES ES05001937.1T patent/ES2442382T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-22 PL PL355853A patent/PL211512B1/pl unknown
- 2000-11-22 NZ NZ519078A patent/NZ519078A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-11-22 IL IL14980200A patent/IL149802A0/xx active IP Right Grant
- 2000-11-22 AR ARP000106162A patent/AR026572A1/es active IP Right Grant
- 2000-11-22 EP EP05001937.1A patent/EP1557087B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-22 CA CA002391370A patent/CA2391370C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-22 AU AU17552/01A patent/AU782919B2/en not_active Expired
- 2000-11-22 CN CNB008186170A patent/CN100367849C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-22 SK SK722-2002A patent/SK7222002A3/sk unknown
- 2000-11-22 WO PCT/US2000/030155 patent/WO2001037655A1/en not_active Ceased
- 2000-11-22 MX MX2012003682A patent/MX338434B/es unknown
- 2000-11-22 AT AT00980267T patent/ATE288197T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-11-22 EE EEP200200264A patent/EE200200264A/xx unknown
- 2000-11-22 JP JP2001539284A patent/JP2003530312A/ja active Pending
- 2000-11-22 BR BR0016049-0A patent/BR0016049A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-11-22 EP EP00980267A patent/EP1257168B1/en not_active Revoked
- 2000-11-22 ES ES00980267T patent/ES2237473T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-22 CZ CZ20021770A patent/CZ20021770A3/cs unknown
- 2000-11-22 MX MXPA02005134A patent/MXPA02005134A/es active IP Right Grant
- 2000-11-22 NZ NZ530441A patent/NZ530441A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-11-22 DE DE60017945T patent/DE60017945T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-22 EA EA200200593A patent/EA200200593A1/ru unknown
- 2000-11-24 UY UY26449A patent/UY26449A1/es not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-05-21 BG BG106731A patent/BG106731A/bg unknown
- 2002-10-07 US US10/266,562 patent/US20030157475A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-12-07 US US11/608,079 patent/US7820425B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-12-07 US US11/608,039 patent/US20070099171A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-09-07 US US12/807,555 patent/US20110004052A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-01-28 US US13/752,082 patent/US20130137081A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1257168B1 (en) | Method of cryopreserving selected sperm cells | |
| RU2303354C2 (ru) | Искусственное осеменение млекопитающих малым количеством разделенных по полу сперматозоидов | |
| Graham | Cryopreservation of stallion spermatozoa | |
| Schenk et al. | Cryopreservation of flow-sorted bovine spermatozoa | |
| US7838210B2 (en) | Sperm suspensions for sorting into X or Y chromosome-bearing enriched populations | |
| US6641526B1 (en) | Development of normal offspring from oocytes injected with freeze-dried spermatozoa | |
| Beltran et al. | Optimized extenders for cryopreservation of buck semen for artificial insemination | |
| AU2005203165B2 (en) | Method of cryopreserving selected sperm cells | |
| Peña Jr et al. | Boar spermatozoa maintains DNA integrity after cryopreservation using different concentrations of glycerol | |
| HK1077708B (en) | Method of cryopreserving selected sperm cells | |
| HK1077708A (en) | Method of cryopreserving selected sperm cells | |
| Niasari-Naslaji et al. | Effect of lactose extender with different levels of osmolality and pH on the viability of Bactrian camel (Camelus bactrianus) spermatozoa | |
| Arshadi et al. | Journal of Basic and Clinical Veterinary Medicine | |
| RU2442324C2 (ru) | Способ получения нескольких эмбрионов и млекопитающего заданного пола | |
| Phetudomsinsuk et al. | Effects of extenders and glutamine on the cooled storage of semen of Thai native crossbred and full-size purebred horses | |
| Abd-Allah et al. | Successful production of buffalo embryos from vitrified immature and mature oocytes in vitro | |
| Monteiro et al. | Equine Semen Biotechnology | |
| Kim et al. | Analysis of Sperm Ability in Specific Pathogen Free Miniature pig for Production of Bio-Organ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification |