CN103493800B - 分离精液的冷冻保藏方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉动物繁殖领域，尤其，涉及一种分离精液的冷冻保藏方法，包括以下步骤：将分离精液在第一预定温度下冷却，得到初冻分离精液；在初冻分离精液中加入Tris B乳化液并在第一预定温度下进行乳化，混匀后得到乳化分离精液；其中，Tris B乳化液由体积百分数为88%的Tris B缓冲液和体积百分数为12%的丙三醇组成；将乳化分离精液在第一预定温度下离心，得到分离精液沉淀；将分离精液沉淀在第一预定温度下通过悬混、计数以及灌装后得到待冷冻的分离精液；将所述待冷冻的分离精液通过程序冷冻仪进行冷冻，得到冷冻分离精液；将所述冷冻分离精液转移至液氮中，冷冻保藏。本发明提供的冷冻保藏方法降低了整个保藏过程的成本。

Description

分离精液的冷冻保藏方法

技术领域

本发明涉动物繁殖领域，具体而言，涉及一种分离精液的冷冻保藏方法。

背景技术

动物的性别控制(sex control)技术是通过对动物的正常生殖过程进行人为干预，使成年雌性动物产出人们期望性别后代的一门生物技术。具体的，该技术是利用动物的含有X染色体和含有Y染色体的精液中DNA含量的差异，借助特异性染色剂染色，然后根据发出的荧光强度，通过计算机预测精子类别，再通过给精液液滴附加电荷，根据静电原理，将含有X染色体的精液和Y染色体的精液分离，得到分离精液，如果得到的分离精液在短期内不用，则需要将得到分离精液冷冻保藏，以保证其活力。

在相关技术中，将分离精液冷冻的过程中，需要在其中加入乳化液以防止分离精液受到冷冻打击；但是常见的乳化液中通常含有大量的Egg yolk（蛋黄）；因此，在配置乳化液的过程中需要将乳化液进行离心、过滤等操作；离心的过程需要用到较多的离心管，过滤的过程需要利用特制的过滤膜，而离心管和特制的过滤膜的价格比较昂贵，进而使得整个配置乳化液过程的成本增加。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离精液的冷冻保藏方法，以解决上述的问题。

本发明的实施例中提供的分离精液的冷冻保藏方法，包括将分离精液在第一预定温度下冷却，得到初冻分离精液；在所述初冻分离精液中加入Tris B乳化液并在第一预定温度下进行乳化，混匀后得到乳化分离精液；其中所述Tris B乳化液由体积百分数为88%的Tris B缓冲液和体积百分数为12%的丙三醇组成；将所述乳化分离精液在第一预定温度下离心，得到分离精液沉淀；将所述分离精液沉淀在第一预定温度下通过悬混、计数以及灌装后得到待冷冻的分离精液；将所述待冷冻的分离精液通过程序冷冻仪进行冷冻，得到冷冻分离精液；将所述冷冻分离精液转移至液氮中，冷冻保藏。

本发明的实施例提供的分离精液的冷冻保藏方法，在将分离精液保藏的过程中，使用了由体积百分数为88%的Tris B缓冲液和体积百分数为12%的丙三醇组成Tris B乳化液作为乳化剂对初冻分离精液进行了乳化，Tris B乳化液可以对初冻分离精液起到保护作用，能够防止初冻精液在后续冷冻的过程中受到冷冻打击，进而影响精子的活力；而Tris B乳化液在乳化初冻分离精液的过程中不需要经过特制的过滤膜进行过滤，并且Tris B乳化液配置成本低，因此，降低了整个保藏过程的成本。

此外，本实施例的这种分离精液的冷冻保藏方法通过初冻、乳化、离心、悬混、计数、灌装以及程序冷冻仪冷冻等流程实现了将分离精液有效保藏的效果，冷冻保藏后的分离精液可应用于动物的繁育中，并按照生产需求人为的控制动物后代的性别，实现了快速繁育高产家畜的效果。

附图说明

图1示出了本发明实施例一提供的分离精液的冷冻保藏方法的流程图；

图2示出了本发明实施例二提供的分离精液的冷冻保藏方法的流程图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例并结合附图对本发明做进一步的详细描述。

本发明的实施例中提供了一种分离精液的冷冻保藏方法，包括以下步骤：

步骤101：将分离精液在第一预定温度下冷却，得到初冻分离精液；

具体的，在步骤101中，第一预定温度为3-5℃，优选4℃，冷却时间为80分钟-100分钟，优选90分钟。

步骤102：在初冻分离精液中加入Tris B乳化液并在第一预定温度下进行乳化，混匀后得到乳化分离精液；

步骤102中，乳化液起到将分离精液保护的作用，防止其在后续低温冷冻过程中受到冷冻打击，进而出现活力降低的缺陷，乳化的过程可以使得精液在处于较低的温度时，防止精子受到冷冻损害。因此，在本实施例中，Tris B乳化液为一种保护剂，其可以保护分离精液，使得其在冷冻过程中不受到冷冻打击。

其中，Tris B乳化液由体积百分数为88%的Tris B缓冲液和体积百分数为12%的丙三醇组成；

在本实施例中，每1000ml Tris B缓冲液可通过以下方法配置而成：将Tris（295mM）35.746g、Citri Acid Monohydrate(95.1mM)19.980g、D-Fructose(81.7Mm)14.712g准确称量后依次加入盛有需配液总量3/4的超纯水中烧杯内充分溶解；待完全溶解后用HCl溶液将pH值调为6.80；pH值调整后的溶液移入体积相对应的容量瓶内进行定容。用灭菌后板式过滤器（上层0.45μm的过滤膜，下层0.22μm的过滤膜）进行过滤灭菌后然后装入储存器皿。

步骤103：将乳化分离精液在第一预定温度下离心，得到分离精液沉淀；

乳化之后，需要将乳化分离精液进行离心，使得乳化液和沉淀分离，进而得到分离精液沉淀，以进行后续的操作。

步骤104：将分离精液沉淀在第一预定温度下通过悬混、计数以及灌装后得到待冷冻的分离精液；

步骤105：将待冷冻的分离精液通过程序冷冻仪进行冷冻，得到冷冻分离精液；

步骤106：将冷冻分离精液转移至液氮中，冷冻保藏。

本发明上述实施例的分离精液的冷冻保藏方法，在将分离精液保藏的过程中，使用了由体积百分数为88%的Tris B缓冲液和体积百分数为12%的丙三醇组成Tris B乳化液作为乳化剂对初冻分离精液进行了乳化，Tris B乳化液可以对初冻分离精液起到保护作用，能够防止初冻精液在后续冷冻的过程中受到冷冻打击，进而影响精子的活力；而Tris B乳化液在乳化初冻分离精液的过程中不需要经过特制的过滤膜进行过滤，并且Tris B乳化液配置成本低，因此，降低了整个保藏过程的成本。

此外，本实施例的这种分离精液的冷冻保藏方法通过初冻、乳化、离心、悬混、计数、灌装以及程序冷冻仪冷冻等流程实现了将分离精液有效保藏的效果，冷冻保藏后的分离精液可以应用于动物的繁育中，可以按照生产需求人为的控制动物后代的性别，快速繁育高产家畜。

为了使得本发明实施例一的浮选方法得到更好的应用，更加有效应用到分离精液的冷冻保藏中，本发明还在上述实施例一的基础之上提供了实施例二，实施例二是对实施例一的基础上做出的进一步的限定和增加，现做详细的阐述和解释，请参考图2：

实施例二

步骤201：将分离精液在第一预定温度下冷却，得到初冻分离精液；

具体的，步骤201的操作过程与步骤101一致，在此不做赘述。

步骤202：在初冻分离精液中加入Tris B乳化液并在第一预定温度下进行乳化，混匀后得到乳化分离精液；

优选的，为了实现更好的乳化效果，使得初冻分离精液实现较大程度的乳化，将Tris B乳化液分两次加入至初冻分离精液中，且每次加入的Tris B乳化液的体积相等，两次加入的间隔时间为10-20分钟。

步骤203：将乳化分离精液在第一预定温度下离心，得到上清液和沉淀；

具体的，乳化完成之后，需要将乳化分离精液进行离心，离心之后得到上清液和沉淀；其中，在步骤203中，离心的转速为：2000-3000转/分钟；离心的时间为：15-20分钟。

步骤204：通过移液枪将上清液去除，得到分离精液沉淀；

得到上清液和沉淀之后需要将上清液去除，在去除上清液的过程中，优选的，通过移液枪将上清液通过去除，并且在吸取的过程中，需要谨慎操作，以防止将上清液和分离精液沉淀之间的精子吸除。

步骤205：将分离精液沉淀在第一预定温度下通过悬混、计数以及灌装后得到待冷冻的分离精液；

在步骤205中，通过悬混、计数以及灌装后得到待冷冻的分离精液；优选的，在本实施例中悬混具体操作为：将分离精液沉淀通过混悬器悬混10-20秒，得到悬浮状的分离精液，悬混的过程中，剧烈的震荡使得精子受到物理损害，进而导致精子失去活力，因此，应避免距离震荡，通过调节悬混器的频率，轻微操作，此外，在悬混的过程中，应避免产生气泡。

本实施例中，优选的，利用血球计数板对悬浮状的分离精液进行计数，得到计数后的分离精液；计数完成之后，优选的，将计数后的分离精液加入Tris A冷冻液以及Tris B冷冻液稀释，得到待灌装的分离精液；

其中，Tris A冷冻液的配置方法包括：Tris(291.7mM)24.23g、Citric Acid Monohydrate(81.9mM)13.70g、D-Fructose(70.2mM)10.07g混匀后用超纯水定容至796ml；再通过加入Egg yolk液定容至1000ml；用封口膜封口后充分混匀，再将溶液倒入烧杯用磁力搅拌器搅拌30分钟。5℃静置过夜（不低于12小时）；静置后的溶液吸去上层5-10毫升液废弃，然后将上清液倒入烧杯；再将上清液分装到离心管后两两平衡。放入离心机内离心（8℃、10000-12000转/分钟、60分钟），离心结束后吸去离心管上层油状物；将上清液倒入试剂瓶内用装有两层膜滤器进行过滤。过滤程序依次为：1.2μm-0.8μm、0.8μm-0.45μm、0.45μm-0.22μm；过滤后的溶液按每1000毫升加入体积为11-13毫升的抗生素溶液（泰勒霉素溶液、庆大霉素溶液等）。

Tris B冷冻液的配置方法包括：每1000毫升的Tris B冷冻液由880毫升的23%Egg yolk Tris-B液和120毫升的丙三醇混合配置而成；其中，每1000毫升的23%Egg yolk Tris-B液由770ml的Tris B缓冲液和230毫升的Egg Yolk配置而成。

通过计数结果，确定稀释过程中需要添加的Tris A冷冻液以及Tris B冷冻液。

具体的，在悬混和计数之后，得到待灌装的分离精液，进一步的，需要将待灌装的分离精液使用单头分装机罐装至冷冻管中，得到待冷冻的分离精液。

在进入程序冷冻仪之前，需要先将待灌装的分离精液使用单头分装机灌装至冷冻管中，以做好冷冻的准备。具体的，冷冻管以0.25ml冷冻细管为优选。

步骤206：将待冷冻的分离精液通过程序冷冻仪进行冷冻，得到冷冻分离精液；

步骤207：将冷冻分离精液转移至盛满液氮的液氮罐中，冷冻保藏。

并且，为了保证冷藏效果，将冷冻分离精液转移至盛满液氮的液氮罐中，并每隔一年更换液氮罐中的液氮。

优选的，在上述实施例中，第一预定温度为3-5℃，优选为4℃。

综上，本实施例的这种分离精液的冷冻保藏方法通过初冻、乳化、离心、悬混、计数、灌装以及程序冷冻仪冷冻等流程实现了将分离精液有效保藏的效果，冷冻保藏后的分离精液可应用于动物的繁育中，并按照生产需求人为的控制动物后代的性别，实现了快速繁育高产家畜的效果。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.分离精液的冷冻保藏方法，其特征在于，包括以下步骤：

将分离精液在第一预定温度下冷却，得到初冻分离精液；

在所述初冻分离精液中加入Tris B乳化液并在第一预定温度下进行乳化，混匀后得到乳化分离精液；

其中，所述Tris B乳化液由体积百分数为88％的Tris B缓冲液和体积百分数为12％的丙三醇组成；所述Tris B乳化液分两次加入至所述初冻分离精液中，且每次加入的Tris B乳化液的体积相等，两次加入的间隔时间为10-20分钟；

将所述乳化分离精液在第一预定温度下离心，得到分离精液沉淀；

将所述分离精液沉淀在第一预定温度下通过悬混、计数以及灌装后得到待冷冻的分离精液；

将所述待冷冻的分离精液通过程序冷冻仪进行冷冻，得到冷冻分离精液；

将所述冷冻分离精液转移至液氮中，冷冻保藏。

2.根据权利要求1所述分离精液的冷冻保藏方法，其特征在于，在所述的将所述乳化分离精液在第一预定温度下离心，得到分离精液沉淀的步骤中，具体包括：

将所述乳化分离精液在第一预定温度下离心，得到上清液和沉淀；

通过移液枪将所述上清液去除，得到所述分离精液沉淀。

3.根据权利要求1所述分离精液的冷冻保藏方法，其特征在于，在所述将所述乳化分离精液在第一预定温度下离心，得到分离精液沉淀的步骤中：

所述离心的转速为：2000-3000转/分钟；

所述离心的时间为：15-20分钟。

4.根据权利要求1所述的分离精液的冷冻保藏方法，其特征在于，在所述将所述分离精液沉淀在第一预定温度下通过悬混、计数以及灌装后得到待冷冻的分离精液的步骤中，所述悬混具体为：

将所述分离精液沉淀通过混悬器悬混10-20秒，得到悬浮状的分离精液。

5.根据权利要求4所述的分离精液的冷冻保藏方法，其特征在于，在所述将所述分离精液沉淀在第一预定温度下通过悬混、计数以及灌装后得到待冷冻的分离精液的步骤中，所述计数具体包括：

利用血球计数板对所述悬浮状的分离精液进行计数，得到计数后的分离精液；

将计数后的分离精液加入Tris A冷冻液以及Tris B冷冻液进行稀释，得到待灌装的分离精液。

6.根据权利要求5所述的分离精液的冷冻保藏方法，其特征在于，在所述将所述分离精液沉淀在第一预定温度下通过悬混、计数以及灌装后得到待冷冻的分离精液的步骤中，所述灌装具体包括：

将所述待灌装的分离精液使用单头分装机灌装至冷冻管中。

7.根据权利要求1-6任一项所述的分离精液的冷冻保藏方法，其特征在于，在所述将所述冷冻分离精液转移至液氮中，冷冻保藏的步骤中，具体包括：

将所述冷冻分离精液转移至盛满液氮的液氮罐中，冷冻保藏。

8.根据权利要求7所述的分离精液的冷冻保藏方法，其特征在于，在所述将所述冷冻分离精液转移至盛满液氮的液氮罐中，冷冻保藏的步骤中，具体包括：

将所述冷冻分离精液转移至盛满液氮的液氮罐中，并每隔一年更换所述液氮罐中的液氮。

9.根据权利要求8所述的分离精液的冷冻保藏方法，其特征在于，所述第一预定温度为3-5℃。