JP2003530312A - 選択された精子細胞の低温保存方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、特定の特徴のために選択された精子を低温保存するための方法を提供する。好ましい態様においては、前記方法は、性選択された精子を凍結するために使用される。本発明の低温保存方法はいずれかの数の選択方法により選択された精子を凍結するために使用され得るが、流動細胞計測法を用いての選択が好ましい。本発明はまた、特定の特徴、例えば性タイプについて選択された凍結精子サンプルを提供する。好ましい態様においては、凍結された精子サンプルは、哺乳類精子、例えばヒト、ウシ、ウマ、ブタ、羊、ヘラジカ又はバイソン精子を包含する。選択された凍結精子サンプルが、種々の用途に使用され得る。特に、サンプルは、融解され、そして受精のために使用され得る。従って、本発明はまた、人工受精又は胎外受精のための選択された凍結精子サンプルを用いる方法も包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野： 本発明は、特定の特徴のために選択された精子を凍結するための方法、及び凍
結された選択精子サンプル、並びにそのようなサンプルの使用方法に関する。本
発明は、性選択された精子を保存するために特に有用である。

【０００２】 発明の背景： 半世紀以上前、人口受精は、種々の哺乳類のための商業的交配手段としてアメ
リカ合衆国において紹介された。人工受精は初期においては、精子採取の場所に
比較的隣接した区域に制限されたが、精子の低温保存及び貯蔵の進歩は、人工受
精又は胎外受精のために意図された精子の広範囲の分布及び商品化を促進して来
た。

【０００３】 哺乳類精子の採取、選択、低温保存、貯蔵及び取り扱い技法におけるさらなる
改良は、所望する形質を有する動物を生成する育種者の能力を増強して来た。例
えば、物理的な特種におけるわずかな差異に基づいての哺乳類精子の選択の進歩
は、性タイプに基づいて精子の分離、すなわちX又はY染色体のいずれかを含む細
胞の選択を可能にして来た。この技法は、サンプルにおけるX−又はY−タイプ精
子の相対的百分率の操作及びそれによる、子孫の性の決定を可能にする。性タイ
プ又はいずれか他の所望する特徴に基づいて精子を選択する能力は、遺伝的進行
の促進、生成効率の上昇及び家畜管理における高い柔軟性の達成のための重要な
手段を提供する。しかしながら、この手段の十分な開発は、選択された精子を凍
結し、そして貯蔵する能力に依存する。

【０００４】 種々の方法が細胞を選択するために利用できるが、しかしながら、精子の選択
及び続く処理は、精子がDNA修復できないので、及び精子形態学のために、独得
の要求を提供する。個々の精子は、受精のために重要であり、そして物理的損傷
に対して比較的敏感である、頭部及び尾部を包む先体を有する。さらに、精子受
精能は、採取と使用との間の時間の上昇と共に低下する。利用できる選択方法の
ほとんどは物理的ストレスを包含し、そして時間を要するので、選択された精子
は典型的には、選択されていない細胞に比較して、いくぶん弱かった。受精能は
、選択技法が有意な希釈を包含する場合、さらに低められ得る。この“希釈効果
”は精液血漿における保護成分の損失のためであり得ることが示唆されている。

【０００５】 流動細胞計測法（Flow cytometry）は、性タイプにより精子を分類するために
使用されて来た、特に効果的な選択方法である。しかしながら、分類された精子
は、標準の人口受精又は胎外受精プロトコールにおいて通常、遭遇するそれらの
ストレス以上にストレスを受けやすい。特に、流動細胞計測法は時間がかかり、
そして流動細胞計測法の物理的な強制のために、精子は貯蔵のために最適ではな
いレベルに、分類するために希釈されるべきである（通常、10⁵〜10⁶/mlの程度
）。さらに、人工受精のために意図された、分類された精子は、従来の包装及び
供給装置が使用され得るよう濃縮されるべきである。従って、濃縮段階の必要性
は、すでにいくぶん無防備状態にされた精子を追加の物理的ストレスに暴露する
。

【０００６】 精子の凍結はまた、受精能、運動性及び/又は生存性を常に低め、そして選択
されていない精子を凍結するための技法は良く知られているけれども、選択され
た精子の低温保存のための技法は記載されていない。

【０００７】 発明の要約： 本発明は、特定の特徴のために選択された精子を低温保存するための方法を提
供する。前記方法は、選択された精子サンプルからの精子の単離、所望する精子
濃度を有する懸濁液を生成するために前記単離された精子への最終エキステンダ
ーの続く添加を提供するので、その方法は、精子の希釈をもたらす方法により選
択される精子を低温保存するために特に有用である。好ましい態様においては、
前記方法は、性−選択された精子を凍結するために使用される。本発明の低温保
存方法はいずれかの数の選択方法により選択された精子を凍結するために使用さ
れ得るが、流動細胞計測法を用いての選択が好ましい。

【０００８】 本発明はまた、特定の特徴、例えば性タイプのために選択された凍結精子サン
プルを提供する。好ましい態様においては、凍結された精子サンプルは、哺乳類
精子、例えばヒト、ウシ、ウマ、ブタ、羊、ヘラジカ又はバイソン精子を包含す
る。本発明の凍結された精子サンプルを包含する容器もまた、本発明の範囲内で
ある。 凍結された、選択精子サンプルは種々の用途に使用され得る。特に、サンプル
は融解され、そして受精のために使用され得る。従って、本発明はまた、人工受
精又は胎外受精のために凍結された、選択精子サンプルを用いる方法も包含する
。

【０００９】 本発明の特定の記載： 本発明は、採取された場所から離れた場所に選択された精子サンプルを貯蔵し
、そして/又は輸送することを促進する、特定の特徴のために選択された精子の
低温保存を可能にする。融解は、人工受精（“AI”）及び胎外受精（“TVF”）
のような方法に使用され得る生存精子を生成する。この結果は、精子の十分に記
録されているぜい弱性のために驚くべきことである。従来の研究者は、種々の選
択方法又は低温保存に関するストレスが受精能及び/又は生存率の有意な損失を
もたらすことを示している。本発明者は、妊娠が選択され、そして次に凍結され
た精子により達成され得ることを、最初に示している。

【００１０】 本発明は家畜管理のおいて重要な進歩を提供し、そのような方法に使用するた
めの精子の選択が所望する形質を有する子孫の生産を高めるために使用され得る
。例えば、X又はY染色体のいずれかを担持する精子を得るための選択は、動物、
例えば乳牛又は肉牛家畜のために好都合である、子孫の性別の調節を可能にする
。性選択はまた、価値あるか（例えば、展示用又はレース用馬）又は危険にさら
す動物の交配に使用される。本発明が提供する、選択された精子を凍結する能力
は、例えば家畜生産効率及び品質を高めるためへのそのような選択方法の広範囲
の使用を可能にするであろう。

【００１１】 定義： 用語“先体”又は“先体帽”とは、精子の頭部の前方半分をおおい、そして卵
侵入のために必要な酵素を含む帽を言及する。 用語“性タイプ”とは、精子に存在する性染色体のタイプ（すなわち、X又はY
染色体）を言及する。 用語“受精能獲得”とは、卵を受精する能力を高めるために受ける精子の特定
の変化、例えば卵中への精子の侵入を促進する先体酵素の開放を導く先体の表面
上での酵素変化を言及する。

【００１２】 精子に関して使用される場合、用語“低温保護剤”とは、凍結−融解の間、精
子を保護し、生存性を促進し、そして受精能力を維持する分子を言及する。 用語“希釈効果”とは、高く希釈される場合、精子の運動性及び/又は生存率
の急速な低下を言及する。 本明細書において使用される場合、用語“選択”とは、サンプルが特定の特徴
（特にことわらない限り）の存在又は不在に基づいて細分割される方法を言及す
る。従って“選択された精子サンプル”とは、特定の特徴のための選択にサンプ
ル源をゆだねることによって得られるサンプルである。従って、選択された精子
サンプルは、特定の特徴を有する精子において、サンプル源に関して、富化され
る。

【００１３】 用語“分類”とは、蛍光活性化された細胞ソーター（FACS）を用いて行われる
選択方法を説明するために、本明細書において使用される。 用語“エキステンダー”とは、精子生存率を保存する傾向があるいずれかの媒
体を言及する。用語“エキステンダー”とは、エキステンダーによる精子の希釈
を言及する。 用語“初期エキステンダー”とは、本発明の方法の単離段階の前、精子を拡張
するために使用される媒体を言及する。 用語“最終エキステンダー”とは、本発明の方法の凍結段階の前、精子を拡張
するために使用される媒体を言及する。

【００１４】 本明細書に記載されるエキステンダーにおける“有機物質”とは、精子の冷シ
ョックを低め、そして受精能を保存する傾向があるいずれかの有機物質である。 本明細書に記載されるエキステンダーにおける“エネルギー源”とは、精子が
細胞維持及び/又は運動のために使用できるいずれかの物質である。 用語“重量オスモン濃度”とは、本明細書において使用される場合、水溶液に
おける溶解された溶質粒子（例えば、エキステンダー）の浸透圧の測定である。
溶質粒子は、イオン性及び非イオン性分子を包含する。重量オスモン濃度は、水
1kgに溶解される浸透的に活性な粒子の濃度（すなわち、オスモル）として表さ
れる。

【００１５】 低温保存方法： 本発明は、下記段階： （１）選択された精子サンプルを獲得し； （２）前記選択された精子サンプルを冷却し； （３）単離された精子を生成するために、前記選択された精子サンプルから精
子を単離し； （４）精子の懸濁液を生成するために、前記単離された精子に最終エキステン
ダーを添加し；そして （５）前記精子の懸濁液を凍結することを含んで成る、選択された精子を低温
保存するための方法を提供する。

【００１６】 選択された精子サンプルの獲得： 本発明の低温保存方法における第１段階は、前もって選択された精子サンプル
を獲得し、そしていずれかの適切な選択方法にサンプル源をゆだねることを包含
する。いずれかの種からの精子が、本発明の方法に従って、選択され、そして凍
結され得る。前記方法は、家畜動物、特に家畜からの精子、及び野生動物（例え
ば、絶滅の危機にある種）からの精子により行われ得る。好ましくは、選択され
た精子サンプルは、哺乳類精子を含む。ヒト精子、ウシ、ウマ、ブタ、羊、ヘラ
ジカ及びバイソン精子が特に好ましい。

【００１７】 一般的に、選択された精子サンプルは、正常な生存精子を含む。最終的に、精
子が得られる射精液は典型的には、少なくとも約50％及び好ましくは少なくとも
約75％の形態学的に正常な精子を有する。それらの態様においては、射精液にお
ける少なくとも約40％及び好ましくは少なくとも約60％の精子が、前進運動性を
示す。 混合された集団から細胞を選択するための広範囲の種類の方法、例えば抗体、
抗体フラグメント、又は他の結合パートナーによる細胞成分の結合及び示差染色
に基づく選択が利用できる。

【００１８】 本発明は性タイプに基づく選択により例示され、そして本発明への使用のため
の性選択された精子が、X型精子とY型精子との間での特徴のわずかな差異を利用
するいずれかの選択方策を用いて得られる。典型的な性選択方法は、磁気技法（
例えば、アメリカ特許第4,276,139号を参照のこと）、カラム技法（例えば、ア
メリカ特許第5,514,537号を参照のこと）、重量分析技法（例えば、アメリカ特
許第3,894,529号、再発行の特許第32350号、アメリカ特許第4,092,229号、第4,0
67,965号及び第4,155,831号を参照のこと）を包含する。電気性質の差異に基づ
く性選択がアメリカ特許第4,083,957号に開示され、そして電気及び重量分析性
質の差異に基づいて選択する技法は、アメリカ特許第4,225,405号、第4,698,142
号及び第4,749,458号に論じられる。

【００１９】 アメリカ特許第4,009,260号及び第4,339,434号は運動性の差異に基づいての選
択を記載する。抗体に依存する生化学技法がアメリカ特許第4,511,661号、第4,9
99,283号、第3,687,803号、第4,191,749号、第4,448,767号に開示され、そして
アメリカ特許第5,021,244号、第5,346,990号、第5,439,362号及び第5,660,997号
は膜タンパク質における差異に基づく選択を記載する。

【００２０】 流動細胞計測法は、蛍光色素による示差染色、又は蛍光ラベルされた分子、例
えば抗体又は核酸への結合に基づいて、混合された集団から細胞を分離するため
の好ましい方法である。蛍光活性化された細胞分類（“FACS”）においては、細
胞は、照射に基づいての蛍光強度に基づいて異なった集団に“分類”される。FA
CSは、X染色体がY染色体よりもわずかに多くのDNAを含むので、精子の性選択の
ために使用され得る。

【００２１】 精子が蛍光DNA−結合色素により染色される場合、X染色体担持の精子は、Y染
色体担持の精子よりも、より色素を吸収し、そして従って、２種の集団がFACSに
より分離され得る。この方策はアメリカ特許第4,362,246号に論じられ、そして
アメリカ特許第5,135,759号（Johnsonにより発行される）において有意に拡張さ
れた。分離は、高速度流動細胞計測法、例えばCytomation, Inc. (Ft. Collins,
CO)により生成され、そしてアメリカ特許第5,150131号、第5,602,039号、第5,6
02,349号及び第5,643,796号、並びにPCT公開番号WO96/12171号に記載されるMoFl
o（商標）流動細胞計測法により増強されて来た。

【００２２】 選択された精子サンプルを得るために使用される選択方法は好ましくは、精子
生存性を保存する方法である。精子の比較的ぜい弱性のために、通常の流動細胞
計測技法は、一般的に、精子を分類するためにい改良されるべきである。より特
定には、流動細胞計測法は、光による細胞の染色、希釈及び質問を必要とする。
それらの段階のすべては、精子生存性を低めるストレスを提供する。それらのス
トレスに対する精子の感受性は、種間で及びさらに、種内の個々間で変化するこ
とができる。そのような感受性は、記録されており、又は実験研究、例えば例１
〜５に記載されるそれらの研究により容易に決定され得る。

【００２３】 生存を増強する変法が、上記で論じられた特許公開に記載されている。例えば
精子を分類するための改良された被覆及び採取器システムを提供する方法が、PC
T公開番号WO99/33956号（出願番号PCT/US98/27909号）に開示される。さらに、
下記例１〜７は、精子を染色し、そして分類するための典型的な方法を記載する
。例３は、分類された凍結精子の後−解凍運動性に対するレーザー強度及び色素
濃度の効果の研究を記載する。この研究は、分類の間、弱いレーザー強度の使用
が後−解凍運動性を高めることができることを示す。

【００２４】 選択された精子サンプルは、精子の他に種々の成分を含むことができ、そして
しばしば、選択工程の間、精子を保護するために添加される成分を含むであろう
。FACSの場合、選択された精子サンプルは、染色及び分類のために使用される溶
液（例えば、被覆流体及び捕獲緩衝液）中の成分を含むことができる。 さらに、選択された精子サンプルは典型的には、エキステンダー又はエキステ
ンダー画分を含む。例えば、グリセロールを欠いている“A画分”及びグリセロ
ールを含む“B画分”を包含する“２段階”エキステンダーは良く知られている
。A画分が最初に精子に添加され、続いて等体積のB画分が添加される。この段階
に関しては、B画分はしばしば、少なくとも２つのアリコートに分割され、そし
て連続的に添加され、例えば第２のB画分アリコートが15分後に添加される。

【００２５】 エキステンダー成分が存在しない場合、エキステンダー又はエキステンダー画
分は典型的には、精子がサンプルから単離される前、選択された精子サンプルに
添加される。いくつかのエキステンダー成分が存在する場合、追加の成分が任意
には添加され、その結果、選択された精子サンプルは、単離の前、完全なエキス
テンダー又はエキステンダー画分を含む。典型的な態様においては、ウシ精子は
、エキステンダーのA画分を含む、選択された精子サンプルを生成するために流
動−分類される（例２，３及び４を参照のこと）。

【００２６】 所望には、次にB画分は、単離段階の前、選択された精子サンプルに添加され
得る（例５を参照のこと）。プレ−単離段階エキステンダー（又はエキステンダ
ー画分）は、凍結の前、単離された精子の拡張のために使用される“最終エキス
テンダー”とそれとを区別するために、“初期エキステンダー”と命名される。
選択された精子サンプルがFACSを用いて選択される場合、初期エキステンダーは
、分類のために使用される被覆流体に適合され得る。典型的な適合される被覆流
体及びエキステンダーは、例４において詳細に記載される。

【００２７】 選択された精子サンプルへの使用のための適切なエキステンダーは、生理学的
に許容できるキャリヤーを含む。生理学的に許容できるキャリヤーは典型的には
、水性であり、そして好ましい態様においては、脱イオン水を包含する。適切な
エキステンダーは通常、１又は複数の次の追加の成分を含む：低温保護剤、重量
オスモル濃度を維持し、そしてpHを緩衝する成分、精子の冷ショックを妨げ、そ
して受精能を保持する有機物質、精子の保存性を増強するために一定の有機物質
と共に相乗的に作用する界面活性剤、精子により容易に利用され得るエネルギー
源、冷ショックから精子を保護する酸化防止剤、精子受精能獲得を促進する物質
、及び１又は複数の抗生物質。

【００２８】 本発明において有用な低温保護剤は特定の機構により作用するそれらの制限さ
れないが、ほとんどの従来の低温保護剤は、細胞内脱水を低めることによって、
少なくとも部分的に作用する。特に、凍結は精子を取り囲む媒体における溶質濃
度の上昇により達成される。溶質濃度のこの上昇は、細胞内電解質濃度を高める
、細胞から水を排出する。典型的な低温保護剤は、グリセロール、ジメチルスル
ホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール及び同様のものを包含す
る。

【００２９】 所定のエキステンダーへの使用のために適切な低温保護剤は、精子が由来する
種に依存して変化することができる。例えば、グリセロールはヒト及びウシ精子
の低温保護への使用のために適切であるが、しかし一般的に、ブタ又はウサギ精
子の低温保護のためには使用されない。そのような選択は多くの商業的に価値あ
る精子のために良く知られており、そして他のタイプの精子に関しては、実験的
に容易に決定され得る。

【００３０】 本発明において有用なエキステンダーは任意には、重量オスモル濃度の維持を
助け、そして緩衝能力を提供する１又は複数の成分を包含する。本発明の好まし
い態様においては、エキステンダーの重量オスモル濃度は、生理学的流体のその
重量オスモル濃度に近い。より好ましくは、エキステンダーの重量オスモル濃度
は、約280mOsm〜約320mOsmの範囲である。そのpHはまた、好ましくは、生理学的
に許容できる範囲内であり、より好ましくは約6.5〜約7.5の範囲である。

【００３１】 それらの範囲内での重量オスモル濃度及びpHの維持を助ける物質は、当業界に
おいて良く知られており、そして固体として又は溶液において、エキステンダー
に添加され得る。塩、炭水化物又はそれらの組み合わせを含む緩衝液が、この目
的のために使用され得る。特定の例は、クエン酸ナトリウム、トリス［ヒドロキ
シメチル］アミノメタン、N−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−２−アミノ
エタンスルホン酸、グルタミン酸一ナトリウム、ミルク、HEPES緩衝培地、及び
それらのいずれかの組み合わせを包含する。特定の用途において重量オスモル濃
度の維持及び緩衝能力の提供を助けるために使用される成分は、エキステンダー
の他の成分、及び多くの場合、精子が由来する種に依存して変化することができ
る。しかしながら、本発明への使用のためのそのような成分の選択は、当業者の
レベル内である。

【００３２】 冷ショックに対して精子を保護し、そして受精能力の保存を助ける１又は複数
の有機物質がまた、エキステンダーに含まれ得る。そのような物質は良く知られ
ており、そして時々、“非侵入性低温保存剤”として記載されている。当業者は
、本明細書に記載される低温保存方法の特定の用途のために適切な有機物質を容
易に決定することができる。例えば、例ショック及び希釈効果の攻撃を低めると
思われる保護構成成分（例えば、リポタンパク質、リン脂肪、レシチン）を含む
有機物質がエキステンダーに包含され得る。適切な有機物質は、二糖類、三糖類
及びそれらのいずれかの組み合わせを包含する。典型的な有機物質は、卵黄、卵
黄抽出物、ミルク、ミルク抽出物、カゼイン、アルブミン、コレステロール及び
それらのいずれかの組み合わせを包含する。

【００３３】 エキステンダーはまた、界面活性剤を含むことができる。アルキルイオン界面
活性剤、例えばドデルシル硫酸ナトリウム（SDS）は、冷ショックに対する保護
性を増強するために卵黄と共に相乗的に作用することが報告されている。細胞の
低温保存において有用な他の界面活性剤がまた、エキステンダーに使用され得、
そして特定の用途のためへの特定の界面活性剤の選択は、本明細書に提供される
ガイドを考慮すれば、当業者のレベル以内である。例えば例５を参照のこと。

【００３４】 好ましくは、エキステンダーは、精子により容易に利用されるエネルギー源を
包含する。エネルギー源の不在下で、精子は細胞内リン脂質及び他の細胞成分を
酸化することができる。従って、エキステンダーへのエネルギー源の包含は、細
胞内貯蔵所及び細胞成分を保護する。当業界において良く知られているように、
糖、特に単糖類は、便利なエネルギー源を提供するが、但しいずれかの従来のエ
ネルギー源でも、エキステンダーに使用され得る。エキステンダーにおいて有用
な典型的な単糖類は、グルコース、フルクトース及び/又はマンノースを包含す
る。

【００３５】 １又は複数の酸化防止剤は任意には、冷ショックに対して追加の保護を提供す
るためにエキステンダーに包含され得る。典型的な酸化防止剤は、ブチル化され
たヒドロキシトルエン（BHT）、その誘導体及び同様のものを包含する。しかし
ながら、細胞の低温保存において有用な他の酸化防止剤がまたエキステンダーに
使用され得、そして特定の用途のための特定の酸化防止剤の選択は、本明細書に
提供されるガイドを考慮すれば、当業者のレベル内である。 エキステンダーはまた、精子受精能獲得を促進する物質を含むことができる。
種々の受精能獲得は当業界において知られており、そしてエキステンダーに使用
され得る。例としては、所望により組合して使用され得る、酵素、例えばα−ア
ミラーゼ、β−アミラーゼ、β−グルクロニダーゼを列挙することができる。

【００３６】 最終的に、エキステンダーは好ましくは、実質的な細菌増殖が精子生存性を攻
撃し、そして人工受精又は胎外受精方法において宿主の感染の危険性を高めるの
で、抗生物質を包含する。細胞の低温保存において有用な種々の抗生物質のいず
れかがまた、エキステンダーに使用され得る。適切な抗生物質の選択は、精子が
得られる種、精子サンプルを得、そして取り扱うことに包含される方法、及び標
準化される特定の微生物に依存する。典型的な抗生物質は、チロシン、ゲンタマ
イシン、リンコマイシン、スペクチノマイシン、リンコ−スペクチン（リンコマ
イシン及びスペクチノマイシンの組み合わせ）、ペニシリン、ストレプトマイシ
ン、及びチカルシリン（それらは、単独で又は組合して使用され得る）を包含す
る。しかしながら、当業者は、エキステンダーへの使用のために適切な他の抗生
物質を容易に決定することができる。

【００３７】 典型的なエキステンダーは、下記及び例に詳細に論じられる。 精子濃度は典型的には、サンプル源においてよりも選択された精子サンプルに
おいて低く、そして上記に示されるように、FACSが使用される場合、希釈は有意
である。性タイプに基づいての典型的な分類は、６×10⁵個の細胞/ml捕獲緩衝液
で精子を含むサンプルを生成することができる。そのよう低濃度は貯蔵のために
最適ではないので（少なくとも試験されるほとんどの種に関して）、本発明の低
温保存方法は一般的に、選択された精子サンプルを濃縮する。

【００３８】 選択された精子サンプルの冷却： 低温保存方法における第２段階は、典型的には、調節された速度で温度を低め
ることによって、選択された精子サンプルを冷却することを必要とする。急速過
ぎる冷却は、膜の完全性及び細胞機能の損失をもたらすことができる冷ショック
を引き起こすことができる。冷ショックの効果の厳格さは、種され種で変化し、
そして冷却の速度及び温度範囲のような要因に依存する。適切な調節された冷却
条件下で、精子は熱効果に対して適合できる。中でも、例２は、ウシ精子を冷却
するための条件を記載し、そして他の種の精子を冷却するための適切な条件の決
定は、当業者のレベル内である。

【００３９】 本発明の好ましい態様においては、選択された精子サンプルが典型的には、約
22℃〜約5℃に冷却され、そして冷却は一般的に、約60分〜約24時間、好ましく
は約90分〜約240分間、及び最も好ましくは、約90分〜約120分間にわたって行わ
れる。冷却は、5℃の環境において選択された精子サンプルを単純に配置するこ
とを包含する、いずれかの便利な方法により達成され得る。

【００４０】 選択された精子サンプルからの精子細胞の単離： 選択された精子サンプルの初期拡張の後、精子は、少なくとも約50％の精子回
収率、より好ましくは約75％〜約90％の精子回収率、及び最も好ましくは約80％
〜約90％の精子回収率を提供する、いずれかの十分に適切な単離方法を用いて、
サンプルから単離される。単離段階の間、冷却された精子は一般的に、冷却して
、すなわち約１〜約８℃及び好ましくは、４又は５℃に接近して維持されるべき
である。

【００４１】 懸濁液から細胞を回収するために適切な種々の方法のいずれかが、例えば濾過
、沈殿及び遠心分離方法が、精子を単離するために使用され得る。典型的な好ま
しい態様においては、選択された精子サンプルが、約27mlを越えない体積、及び
好ましくは約20〜約27mlの体積で、50mlの管中にアリコートされる。遠心分離は
、約４℃、約850×gで、約20分間、行われる。好ましくは、遠心分離段階は、少
なくとも約50％〜約90％の精子回収率、より好ましくは約60％〜約90％の精子回
収率、及び最も好ましくは約70％〜約90％の精子回収率を提供する。単離の後、
上清液が除去され、そしてペレットが４℃で軽くかき混ぜることにより又は反復
された吸引により懸濁される。次に、精子濃度が典型的には決定される（例えば
、血球計を用いて）。

【００４２】 単離された精子細胞の最終拡張： 単離の後、所望には、精子をプールし、そして凍結のための適切な濃度に、最
終エキステンダーにより拡張される。最終拡張の後、及び凍結の前、精子の濃度
は好ましくは、約１×10⁶/ml〜約300×10⁶/ml、より好ましくは約10×10⁶/ml〜
約50×10⁶/ml、及び最も好ましくは約10×10⁶/ml〜約20×10⁶/mlの範囲である。 上記の初期エキステンダーの記載はまた、初期エキステンダーと同じか又は異
なることができる最終エキステンダーにも適用される。特定の態様においては、
最終エキステンダーにより拡張された精子サンプルの組成物は、初期エキステン
ダーの添加の後、精子サンプルの組成物に実質的に類似する（同じでなければ）
。

【００４３】 本発明の好ましい態様においては、卵黄−トリスエキステンダーが使用される
。エキステンダーの添加の後、精子懸濁液は、グリセロール（低温保護剤）；ク
エン酸及びトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン（緩衝液）；卵黄（有機物
質）；フルクトース（エネルギー源）；チロシン；ゲンタマイシン及びリコ−ス
ペクチン（抗生物質）を含んで成る。単離された精子への最終エキステンダーの
添加の後、それらの成分の典型的なおおよその濃度は次の通りである：

【００４４】 卵黄−トリスエキステンダーの成分： グリセロール： 4〜8％体積/体積 クエン酸： 55〜75％ トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン：190〜210mM 卵黄： 5〜25％体積/体積 フルクトース： 45〜65mM チロシン： 25〜100μg/ml ゲンタマイシン： 200〜300μg/ml リンコ−スペクチン： 100〜400μg/ml^★ ★：100〜400μg/mlのリンコマイシン及び100〜400μg/mlのスペクチノマイシ
ン。

【００４５】 ウシ精子を凍結するために特に適切なこの態様の変動においては、単離された
精子への最終エキステンダーの添加の後、それらの成分の濃度は、脱イオン水に
おいて、約６％（体積/体積）のグリセロール、約65mMのクエン酸、約200mMのト
リス［ヒドロキシメチル］アミノメタン、約20％（体積/体積）の卵黄、約56mM
のフルクトース、約50μg/mlのチロシン、約250μg/mlのゲンタマイシン、及び
約150/300μg/mlのリンコ−スペクチン（すなわち、150μg/mlのリンコマイシン
及び300μg/mlのスペクチノマイシン）である。

【００４６】 他の態様においては、卵黄−クエン酸塩エキステンダーが使用される。エキス
テンダーの添加の後、精子懸濁液は、グリセロール（低温保存剤）；クエン酸ナ
トリウム（緩衝液）；卵黄（有機物質）；チロシン、ゲンタマイシン及びリンコ
−スペクチン（抗体）を含んで成る。単離された精子への最終エキステンダーの
添加の後、それらの成分の典型的なおおよその濃度は次の通りである：

【００４７】 卵黄−クエン酸塩エキステンダーの成分： グリセロール： 4〜8％体積/体積 クエン酸ナトリウム： 60〜80mM 卵黄： 5〜25％体積/体積 チロシン： 25〜100％μg/ml ゲンタマイシン： 200〜300μg/ml リンコ−スペクチン： 100〜400μg/ml^★ ★：100〜400μg/mlのリンコマイシン及び100〜400μg/mlのスペクチノマイシ
ン。

【００４８】 ウシ精子を凍結するための典型的な好ましい濃度は、約７％（体積/体積）の
グリセロール、約72mMクエン酸ナトリウム、約20％（体積/体積）の卵黄、約50
μg/mlのチロシン、約250μg/mlのゲンタマイシン及び約250/300μg/mlのリンコ
−スペクチンである。 もう１つの他の対応においては、卵黄−TES−トリス（“EY TEST”）エキス
テンダーが使用される。エキステンダーの添加の後、精子懸濁液は、グリセロー
ル（低温保存剤）；卵黄及び加熱されたミルク、例えば1.25％のフルクトース及
び10％のグリセロールを含む均質化されたミルク（有機物質）；チロシン、ゲン
タマイシン及びリンコ−スペクチン（抗生物質）を含んで成る。単離された精子
への最終エキステンダーの添加の後、それらの成分の典型的なおおよその濃度は
、次の通りである：

【００４９】 卵黄TES−トリスエキステンダーの成分： グリセロール： 3〜7％体積/体積 トリス［ヒドロキシメチル−メチル］−２−アミノエタンスルホン酸： 140〜170mM トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン： 60〜80mM 卵黄： 5〜25％体積/体積 フルクトース： 5〜12mM チロシン： 50〜150μg/ml ゲンタマイシン： 400〜600μg/ml リンコ−スペクチン： 200〜700μg/ml^★ ★：200〜700μg/mlのリンコマイシン及び200〜700μg/mlのスペクチノマイシ
ン。

【００５０】 ウシ精子を凍結するための典型的な好ましい濃度は、約５％（体積/体積）の
グリセロール、約158mMのトリス［ヒドロキシメチル−メチル］−２−アミノエ
タンスルホン酸、約72mMのトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン、約20％（
体積/体積）の卵黄、約８mMのフルクトース、約100μg/mlのチロシン、約500μg
/mlのゲンタマイシン及び約300/600μg/mlのリンコ−スペクチンである。

【００５１】 本発明のさらにもう1つの他の態様においては、ミルクエキステンダーが使用
される。エキステンダーの添加の後、精子懸濁液は、グリセロール（低温保護剤
）；加熱された、均質されたミルク（有機物質）；フルクトース（エネルギー源
）；及びチロシン、ゲンタマイシン及びリンコ−スペクチン（抗生物質）を含ん
で成る。単離された精子への最終エキステンダーの添加の後、それらの成分の典
型的なおおよその濃度は、次の通りである：

【００５２】 ミルクエキステンダーの成分： 均質化されたミルク： 90％（体積/体積） グリセロール： 3〜7％（体積/体積） フルクトース： 1.25％（重量/体積） チロシン： 50μg/ml ゲンタマイシン 250μg/ml リンコ−スペクチン： 250/300μμg/ml^★ ★：250〜300μg/mlのリンコマイシン及び250〜300μg/mlのスペクチノマイシ
ン。

【００５３】 ウシ精子を凍結するための典型的な好ましい濃度は、約90％のミルク、約10％
（体積/体積）のグリセロール、約1.25％（体積/体積）のフルクトース、約50μ
g/mlのチロシン、約250μg/mlのゲンタマイシン及び約250/300μg/mlのリンコ−
スペクチンである。

【００５４】 精子を凍結するために標準的に使用される他のエキステンダーはまた、選択さ
れた精子の凍結において最終エキステンダーとして使用され得る。種々の種から
の精子の凍結に使用するために最適化された種々のエキステンダーは記載されて
おり、そして多くの市販されている。ウマ精子のための凍結エキステンダーは典
型的には、ミルク、卵黄、種々の糖、電解質及び低温保護剤から成る。典型的な
凍結エキステンダーは、Squires, E. L., など., Cooled and Frozen Stallion
Semen Animal Reprod. and Biotechnology Laboratory, Bulletin No. 69, Chap
ter8, “Seminal Extender” pp.49-51 (July, 1999) により記載される。

【００５５】 精子の平衡化及び凍結： 精子サンプルの拡張は、次に凍結のために容器に移される、精子の懸濁液を生
成する。精子が受精への使用のために意図される場合、細胞は、受精を達成する
のに十分な個々の用量に便利にアリコートされる。必要とされる用量は1つの種
から次の種に実質的に変化し、そして良く知られており（例えば、ウシ及びウマ
のために）、又は容易に決定され得る。性選択されたウシ精子の場合、便利な用
量は、約1.0×10⁶の精子〜約3.0×10⁶の精子の範囲である。

【００５６】 いずれかの適切な容器、例えばアンプル、バイアル及びストローが凍結のため
に使用され得る。AIのために意図された精子は典型的には、媒精ガンによる使用
のために企画されたストロー（例えば、0.25ml又は0.50mlのストロー）において
凍結される。好ましくは、エキステンダーのボーラスがストロー中に吸入され、
続いて、順序良く、空気、精子、空気及びエキステンダーが吸入され、その結果
、精子は空気空間を両端に有し、ストローのいずれかの端でエキステンダーのボ
ーラスから精子を分離する。 凍結の前、精子は一般的に、約5℃で平衡化される。好ましくは、精子は、約1
〜約18時間、より好ましくは約3〜約6時間、平衡化される（例2を参照のこと）
。

【００５７】 平衡化に続いて、凍結速度が早過ぎない（すなわち、約0.5℃/分以上でない）
いずれかの標準の凍結方法が使用され得る。好ましくは、凍結速度は約0.5℃/分
である。典型的な好ましい態度においては、精子は、静的液体窒素蒸気中に置か
れ、そして凍結が約10日間にわたって３種の異なった段階で行われる。凍結の第
１段階においては、精子は約5℃から約−15℃に、約50℃/分〜約65℃/分の速度
で冷却される。凍結の第２段階においては、精子は約−15℃から−60℃に、約25
℃/分〜約35℃分の速度で冷却される。第３段階においては、精子は約−100℃で
液体窒素中に注入される。

【００５８】 選択された精子サンプル： 凍結方法の他に、本発明は、特定の特許のためにサンプル源から選択された精
子を包含する凍結された精子サンプルを提供する。精子は、凍結方法に関して、
上記で論じられたそれらの種のいずれかを包含するいずれかの種からであり得る
。本発明は、いずれかの適切な方法、例えば上記方法により、いずれかの特徴に
ついて選択された凍結精子を包含する。好ましい態様は、凍結された性選択され
たヒト、ウシ、ウマ、ブタ、羊、ヘラジカ又はバイソン種を包含する。性選択は
好ましくは、上記のようにして、流動細胞計測法を用いて行われる。

【００５９】 本発明の凍結された精子サンプルを含む容器はまた、本発明の範囲内である。
容器は、凍結された精子サンプルと反応しないいずれかの材料から形成され得、
そして意図された用途のためへのサンプルの使用を促進するいずれかの形状又は
他の特徴を有することができる。AIへの使用のために意図されたサンプルに関し
ては、容器は、媒精ガンによる使用のために企画されたストロー（例えば、0.25
ml又は0.5mlのストロー）である。容器は、典型的には−80℃以下である意図さ
れた貯蔵温度でサンプルを保存するのに適切ないずれかの態様で密封される。0.
25mlのストローは、例えばPVC粉末により、超音波的に、又は綿−ポリビニルプ
ラグ及び/又はステンレス鋼ボール（BB）により密封され得る。

【００６０】 本発明の凍結された精子サンプルは典型的には、使用の前、融解されるので、
本発明はまた、融解される、前もって凍結され、選択された精子サンプル、及び
そのような融解されたサンプルを含む容器を提供する。

【００６１】 選択された精子サンプルの使用方法： 本発明の凍結された選択精子サンプルは、精子が使用されるいずれかの方法へ
の使用のために適切である。サンプルは、融解され、そしていずれかの従来の受
精方法、例えば人工受精又は胎外受精に使用され得る。融解は、凍結された非選
択精子に関してと同じ態様で行われる。手短には、凍結された精子を含むストロ
ーが、約35℃〜約37℃の温度で維持される水浴に、約20〜約30秒間、沈められる
。融解の後、精液沈降（例えば、媒精）が、環境変動からの精子の保護を考慮し
て、標準の方法に従って行われる。

【００６２】 実施例 例１： 精子に対する希釈の効果： 目的：凍結されても、分類されてもいないが、しかし高く希釈された精子に関し
ての精子運動に対する精子濃度の効果を決定すること。 A.洗浄されていない精子に対する希釈の効果：

【００６３】 １．サンプル源の採取：精子を、Schenk J., Proc. 17^th NAAB, p.48-58 (199
8), 及びSaacke RG, Proc. NAAB Tech. Conf. AI Reprod. 41: 22-27 (1972) に
記載のようにして人工腟を用いて、通常の採取スケジュールに基づいて雄牛から
採取した。使用されるすべての精液は、50％以上の前進的に運動する精子、及び
75％以上の形態学的に正常な精子を含んだ。抗生物質を、Shin S., Proc. NAAB
Tech. Conf. AI Reprod. 11:33-38 (1986)により記載されるような末処理精液に
、採取の15分以内に添加し、そして精子の濃度を分光計を用いて決定した。

【００６４】 ２．方法：４匹の雄牛からの精子を、72mMのクエン酸ナトリウム中、20％（体
積/体積）の卵黄、50Tg/mlのチロシン、250Tg/mlのゲンタマイシン及び250/300T
g/mlのリンコ−スペクチンにより調製された卵黄−クエン酸塩エキステンダー（
EYC）を用いて、1.25、2.5, 5, 10, 15及び20×10⁶/mlに希釈した。個々のサン
プルは、２重反復して調製され（２本の管/希釈/雄牛）、そして8mlの合計体積/
管を含んだ。

【００６５】 すべてのサンプルを22℃で60分間インキュベートし、この後、スイングバケッ
ト遠心分離機（Eppendorf, Model #5810R）を用いて、600×gで10分間、遠心分
離し、精子を濃縮した。遠心分離の後、１組の２本の管の１つからの上清液を除
去せず；精液を同じ媒体及び元の濃度で、5mlの血清学的ピペットを用いて、反
復された軽い吸引により再懸濁した。（第２組の二本の管は例１Bに使用した。
）次に、精子サンプルを、0.2℃/分で90分間にわたって、5℃に冷却した。それ
らの精子は、“洗浄されていない精子”と称する。すべてのサンプルを、5℃で
、採取の後、24時間又は48時間インキュベートした。

【００６６】 ３．運動性の評価：インキュベーションの後、サンプルを、運動性の決定の前
、ドライブロックインキュベーターを用いて、37℃に10分間、暖めた。この実験
に関しては、前進的に運動する精子の百分率の単一の盲検評価を、個々のサンプ
ルについて決定した。前進性精子運動性は、１人の観察者により個々のサブクラ
スについて主観的に決定され（200倍、位相差顕微鏡）；もう１人は、ランダム
態様で顕微鏡スライドを調製し、その結果、前記観察者は処理を気づいていなか
った。

【００６７】 ４．統計学的分析：データを、因子、例えば雄牛及び初期希釈濃度により、分
散の分析（SAS Institute, Cary, North Carolina）により分析した。別の分析
を、個々のインキュベーション時間、行った。希釈傾向は、（対数）線状対比を
用いて試験された。

【００６８】 ５．結果：洗浄されていない精子についてのデータ（表１）は、両インキュベ
ーション時間、（対数）線状関係（p＜0.01）を表した。運動精子の百分率は、
精子濃度が1.25×10⁶/mlから10×10⁶/mlに上昇するにつれて、上昇するが、しか
しその後、ほとんど差異は存在しなかった。立方用語（cubic term）は、24時間
のインキュベーションの間、有意であり（P＜0.05）、そして48時間のインキュ
ベーションの間、わずかに有意であった（p＜0.1）。両時間で、雄牛効果（p＜0
.01）が存在した。

【００６９】 表１．5℃に冷却した後、洗浄されていない精子運動性（％）に対する冷却の
効果：

【表１】 ａ：（対数）洗浄（ｐ＜0.01）及び立方効果（ｐ＜0.05）。ｂ：（対数）線状
（ｐ＜0.01）及び立方効果（ｐ＜0.01）。c, d, e：共通する上付きを有さない
縦列内の意味は異なる（ｐ0.05）。ｆ：＋ (SAS Institute, Cary, NC, USA)。

【００７０】 B．洗浄された精子に対する希釈の効果： １．サンプル源の採取：例１Aにおいて調製されたサンプルを含む第２組みの
二本の管を、この実験に使用した。 ２．方法：精子を希釈し、インキュベートし、そして例１Aにおけるようにし
て遠心分離により濃縮した。遠心分離に続いて、その上清液7.1mlを個々の管か
ら吸引し、精液血漿のほとんどを除去し、そして精子を900μlのペレットを得た
。精子を、EYC（例１Aを参照のこと）により希釈し、10×10⁶/mlの精子懸濁液を
製造した。次に、サンプルを、例１におけるようにして90分間にわたって、5℃
に冷却した。

【００７１】 ３．運動性の評価：サンプルを暖め、そして例１Aにおけるようにして前進運
動性について評価した。 ４．統計学的分析：データを例１Aにおけるようにして分析した。さらに、例
１Bにおけるデータを、5℃のインキュベーション濃度について分析した。

【００７２】 ５．結果：洗浄された精子についてのデータ（表２）は、精子が24時間後に評
価される場合、有意な処理効果を示さなかった。しかしながら、5℃での48時間
の貯蔵の後、雄牛、初期希釈、インキュベーション濃度及びインキュベーション
効果による雄牛が存在した（p＜0.05）。10×10⁶/mlでよりも20×10⁶/mlで維持
される場合、より多くの精子が運動状態で存続した（31％対20％；p＜0.05）。1
.25、2.5及び５×10⁶個の精子/mlの初期希釈度は、10×10⁶個の精子/mlよりも低
い前進運動性をもたらし、そしてそれぞれの主要効果は、19, 20, 27及び37％の
運動精子を意味する。

【００７３】 表２．前進精精子運動性に対する洗浄、希釈、濃度及び冷却の累積効果（％）
：

【表２】

【００７４】 ａ：20×10⁶個の精子/mlへの濃縮は、48時間の貯蔵の後、10×10⁶個の精子/ml
よりも卓越した（p＜0.05）。また、10×10⁶への初期希釈は、低い希釈度よりも
卓越した（p＜0.05）。プールされた標準誤差（＋）は、24時間のインキュベー
ションの間、4.0、及び48時間のインキュベーションの間、2.8であった。ｂ：有
意（対数）線状傾向（p＜0.06）。

【００７５】 C．結論： 高い精子希釈及び冷却は、精液血漿の存在又は除去にかかわらず、運動精子の
百分率の実質的な低下をもたらした。しかしながら、この希釈効果は、5℃での
貯蔵の前、10×10⁶/ml及び20×10⁶/mlに、希釈された精子を濃縮することによっ
て非常に弱められた。いくつかの雄牛からの精子は他の雄牛からの精子よりも希
釈を耐えることができたが、しかしながら、見出された雄牛差異は典型的である
。非常に希釈された精子は、精液血漿における保護化合物の一部除去により、分
類の間、無防備状態にされ得る。

【００７６】 例２： 分類された精子の凍結の前の平衡化時間の効果： 目的：流動−分類された精子に対する、凍結の前の平衡化時間（3, 6及び8時間
、15℃）の効果を評価すること。 次の実験を、同じ雄牛を用いて完全に反復した： １．サンプル源の採取：４匹の雄牛を採取し、そして例１Aに記載のようにし
て調製した。

【００７７】 ２．方法： ａ）分類のための染色及び調製： ｉ）染色原液の調製：8.89mMのHoechst 33341 (ビス−ベンズイミドH−3334
2；#190305, ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH) の原液を、脱イオン水におい
て調製した。

【００７８】 Ii）精子染色方法：精子を、変性されたTALP緩衝液（表３）において400×1
0⁶個の精子/mlに希釈した。希釈に続いて、Hoechst 33342色素を、224μMの濃度
で精子懸濁液に添加した。染料が精子懸濁液に添加された後、サンプルを34℃で
60分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、精子を、2.67％の透
明にされた卵黄、及び分類工程の間、ゲート制御を可能にする、無防備状態にさ
れた細胞膜により精子におけるHoechst 33342の蛍光を消光する0.002％の食品着
色色素（FD＆C#40）を含むTALPにより、100×10⁶/mlに希釈した。流動分類の直
前、サンプルを、40−μmのナイロンメッシュフィルターを通して、単位重力で
濾過し、いずれかの残骸及び/又は凝集された精子を除去した。

【００７９】 ｂ）分類：351及び364nm及び150mWで作動する2−ラインアルゴンレーザーを用
いて、Hoechst 33342色素を励起した。使用される流動細胞計測法/細胞ソーター
は、50psiで作動するSX MoFlo（商標）（Cytomation, Inc., Fort Collins, Co,
USA）であった。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス；197.0mM;
#T-1503, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）、クエン酸一水和物（55
.4mM；#C-7129, Sigma Chemical Co., ST. Louis, MO, USA）及びフルクトース
（47.5mM；#F-0127, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）から成るトリ
ス基材の被覆流体を使用した。基礎抗体をまた、0.58g/lのペニシリン及び0.05g
/lの硫酸ストレプトマイシンから成るトリス基材の被覆流体に添加した。

【００８０】 精子を、多数の精子の急速な蓄積を可能にする“大量分類”として言及される
方法により分類し、その結果、大規模サンプルが道理に合った時間内で行われ得
る。精子は、標準の操作条件下で流動細胞計測法に通した。但し、生存精子を含
むすべての液滴を、特定の特徴に基づいて（性タイプにする分類）、２本の管中
に分類されるよりもむしろ一本の管中に採取した。精子を、生存性に基づいて分
類し；従って、無防備化された形質膜を有する精子が大量分類の間、排除された
。

【００８１】 染色された精子を、分類の間、22±1℃で維持した。大量分類された精子を、2
00mMのトリス中、20％（体積/体積）の卵黄、65mMのクエン酸、56mMのフルクト
ース、50Tg/mlのチロシン、250Tg/mlのゲンタマイシン、及び脱イオン水中、150
/300 Tg/ml のリンコ−スペクチンにより調製された20％の卵黄−トリスエキス
テンダ−2mlを含む、50mlのプラスチック管に採取した。前記卵黄−トリスエキ
ステンダーは、工程のこの点でグリセロールの欠失を示すために“トリス−A画
分”と称する。精子は、12ml及び約６×10⁶の精子を含むより管に採取された。
続いて、精子を22℃で１〜３時間インキュベートし、性タイプに基づいての分類
の条件をシュミレートした。

【００８２】 ｃ）凍結のための調製：インキュベーションに続いて、分類された精子を、70
分間にわたって5℃に冷却した。冷却の後、２本の管の内容物をプールし、そし
て5℃で設定された、冷蔵されたスイングバケット遠心分離機に移し、そして850
×gで20分間、遠心分離した。上清液を除去した後、精子濃度を約40×10⁶/mlに
するために、約150μlのトリス−A画分エキステンダを、約150μlの精子ペレッ
トに添加することによって、5℃で工程を続けた。個々の雄牛の精子をプールし
、そしてすぐに、12％（v/v）のグリセロールを含む、等体積の卵黄−トリスエ
キステンダー（“トリス−B画分”）により希釈した。前記トリス−B画分を、最
終精子濃度を20×10⁶/mlに調節するために、15分間隔で、精子懸濁液に、２つの
等体積として添加した。精子を含む完全卵黄−トリスエキステンダーの最終グリ
セロール濃度は６％（v/v）であった。

【００８３】 ｄ）平衡化及び凍結：次に、拡張された精子を、0.25mlのポリ塩化ビニル製ス
トロー中に封入し、液体窒素蒸気中においてラック上での通常の方法により凍結
した。４匹の雄牛の個々からの２本のストローを、5℃での3, 6及び18時間の合
計平衡化時間の後、凍結した。

【００８４】 ３．融解後の運動性の評価：ストローを、37℃の水浴において30秒間、融解し
た。前進性運動の盲検評価を、融解の0、1及び２時間後、37℃でサンプルをイン
キュベートした後に行った。２人の観察者のそれぞれは、精液の２本のストロー
の個々から前進性精子運動性を評価した。個々の実験単位のためのそれらの４種
の盲検推定値はサブサンプリングを表す。

【００８５】 ４．統計学的分析：統計学的に、サブサンプルを、主要プロット最小二乗ANOV
Aに対してサブプロットとして分析し、いずれかの観察者及び観察者x処理の相互
作用の効果を分析した。Nは、サブサンプルではない実験単位の数を言及し；標
準誤差を、ANOVAの誤差平均二乗からの４個のサブサンプルの平均及び実験単位
の数に基づいて計算し；最小二乗平均を表した。処理効果を、個々のインキュベ
ーション時間の間、別々のANOVAを通して評価した。モデルは、ランダム効果及
び平均化時間として雄牛及び固定効果として観察者を包含し；サブプロットは観
察者用語及び関連する相互作用から成った。

【００８６】 ５．結果：３−又は６−時間の平衡化時間は、０及び１時間の後−融解インキ
ュベーション（p＜0.01）の間、前進性運動精子の百分率に基づいて、18時間よ
りも卓越したが（表４）、しかし２時間の後−融解インキュベーションではそう
ではなかった。雄牛の効果は、１及び２時間のインキュベーション時間で明白で
あったが（ｐ＜0.05）、しかし０時間でのインキュベーション時間ではそうでは
なかった。平衡化時間相互作用による有意な（p＞0.01）雄牛は存在せず、又は
いずれかの応答に対する有意な観察者の効果も存在しなかった。

【００８７】 表３．変性されたTALP緩衝液：

【表３】 ａ：＃H3375, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA; ｂ：#US70195, 画分V；Amersham/Life Science, Cleveland, OH, USA.

【００８８】 表４．後−融解前進性運動に対するプレー凍結平衡化時間の効果（％）：

【表４】 a. b：共通する上付きを有さない縦列内の意味は異なる（ｐ＜0.05）、Tukey
’s HSD。c:プールされた標準誤差、＋。

【００８９】 ６．結論：結果は、5℃での３時間と６時間との間での合計平衡化時間での後
―融解精子運動性に差異は存在しないが、しかし凍結の前、5℃での18時間の平
衡化に続いて、精子運動性に有意な低下が存在したことを示した。３〜６時間の
範囲は、後−融解運動性の低下を伴なわないで、精子を凍結するための２つの連
続した３時間の分類バッチのプーリングを可能にする。 平衡化−時間相互作用による雄牛は有意でないので、３〜６時間の平衡化が適
切であるが、但し、わずか４匹の雄牛が使用された記載を伴なう。少数の雄牛の
ための最適な平衡化時間は、６時間以上であることが予測される。

【００９０】 例３： 分類された精子に対する染色濃度及びレーザー力の効果： 目的：流動分類された精子に対する、レーザー強度と組合してのHoechst 33342
色素濃度の効果を評価すること： １．サンプル源の採取：６匹の雄牛の精子を、例１Aに記載のようにして、採
取し、そして調製した。

【００９１】 ２．方法： ａ）実験企画：１回の射精液（２匹の雄牛）及び異なった日での２回の射精液
（４匹の雄牛）を、２×２企画及び対照に使用した。 ｂ）染色及び分類：精子の染色、分類方法及び精子の分類は、例２に記載のよ
うにして達成したが、但しHoechst 33342色素を、149TM又は224TMの最終濃度で
精子懸濁液に添加し；そして精子を、100mW又は150mWの入射力で作用するレーザ
により大量分類した。大量分類された精子を、例２に記載のようにして、50mlの
プラスチック管中に採取した。管当たり約15×10⁶の合計精子を含む４本の管を
、個々の雄牛に関して、１時間にわたって採取した。分類された精子を、22℃で
１時間インキュベートし、より長い分類時間をシュミレートした。

【００９２】 ｃ）凍結方法：インキュベーションに続いて、精子を、例２におけるようにし
て冷却した。次に、精子を、850×gで20分間、5℃で遠心分離することによって
濃縮した。上清液の除去の後、150μlのトリス−A画分エキステンダーを、個々
の150μlの精子ペレットに5℃で添加した。精子ペレットのすべてを、軽い反復
された吸引により懸濁し、そして個々の雄牛の精子をプールした。B−画分エキ
ステンダーを、例２に記載のようにして段階的に添加した。個々の雄牛について
の染色されていない、分類されていない対照を、6％のグリセロールを含むトリ
スエキステンダーにおいて、20×10⁶個の精子/mlで調製し、そして大量分類され
た精子を調製しながら、5℃に冷却した。

【００９３】 ｄ）平衡化及び凍結：対照及び分類された精子を、例２に記載のようにして、
0.25mlの5℃で３時間、平衡化されたポリ塩化ビニル製ストロー中に封入し、そ
して次に、従来通りに凍結した。

【００９４】 ３．後−融解運動性の評価：ストローを融解し、そして例２に記載のようにし
て評価した。 ４．統計学的分析：統計学的分析の一般的記載は、例２に提供される。特に、
処理効果は、ANOVAにより評価された。モデルは、主要プロットにおける色素濃
度、レーザー強度及び雄牛、及びサブブロットにおける観察者及び関連する相互
作用を包含した。雄牛は、ランダム効果及び固定される場合、他の因子としてみ
なされた。

【００９５】 ５．結果：雄牛効果は、融解の直後（p＜0.1）、及び37℃での１時間及び２時
間のインキュベーションの後（p0.05）、前進運動性精子の百分率に関して有意
であった。いずれかのインキュベーションの時間での精子運動性に対する、色素
濃度又は色素濃度による雄牛の効果は存在しなかった。雄牛が、ランダム効果と
して見なされる場合、150mWのレーザーは、０時間のインキュベーションでの100
mWのレーザーカよりも低い精子の後−融解運動性をもたらしたが（p＜0.1）、し
かし他のインキュベーション時間ではそうではなかった（表5）。雄牛が固定さ
れた効果として見なされる場合、150mWの力は、すべての３種のインキュベーシ
ョン時間で、100mWよりも低い精子運動性をもたらした（p＜0.05）。

【００９６】 1時間のインキュベーションでの精子運動性に対する、レーザー力による雄牛
の効果は存在しなかったが（p＜0.05）、しかし０又は２時間のインキュベーシ
ョン時間ではそうではなかった。また、より高いレーザー力ほど、０及び１時間
のインキュベーション時間で、対照よりも低い（p＜0.05）精子運動性をもたら
した（表５）。１時間のインキュベーション時間で有意な観察者効果が存在した
が、しかし０又は２時間のインキュベーション時間ではそうではなかった。処理
相互作用による観察者は存在しなかった（p＞0.1）。

【００９７】 表５．後−融解運動性に対するレーザー強度及び色素濃度の効果（％）：

【表５】 ａ：有意な主要効果（ｐ＜0.1）は対照とは異なる（ｐ＜0.05）。ｂ：対照と
は異なる（ｐ＜0.05）。ｃ：プールされた標準誤差＋。

【００９８】 ６．結論：融解後の前進運動性精子の百分率は、染色及び分類工程により低め
られた。より高いレーザー強度は、低いレーザー強度よりも一層の損傷をもたら
した。融解後の精子運動性に対する色素濃度の効果は存在しなかった。従って、
低いレーザー強度での精子結合されたHoechst 33342色素の励起は低い損傷性で
あり、そして高い色素濃度での精子の色素は、融解後の運動性に対して有害な効
果を有さなかった。観察される損傷はたぶん、精子運動性装置に対してであった
。

【００９９】 例４： プレー分類染色方法の評価及び精子の低温保存のためのエキステンダーの選択
： 目的：（１）精子に対する３種のプレー分類処理を評価すること；及び（２）流
動分類された精子の低温保存に関しての被覆流体及びエキステンダー組み合わせ
を評価すること。 次の実験を全体として反復した：

【０１００】 １．サンプル源の採取：４匹の雄牛からの精子を採取し、そして例１Aに記載
のようにして調製した。 ２．方法： ａ）実験企画：３（プレ−分類処理）×３（エキステンダー）×２（被覆流体
）×４（雄牛）×２（観察者）の要因分析方を企画し、分類の前、精子を維持す
る最良の方法を決定し、そして分類された精子を低温保存するための３種のエキ
ステンダを評価した。

【０１０１】 ｂ）サンプル調製及び染色：４匹の雄牛の個々からの新しく採取された精子を
次の通りにして処理した： （１）変性されたTALP（例２、表３を参照のこと）において400×10⁶/mlに
希釈し、そして大量分類の前、34℃で１時間、染色し（“希釈物−０時間”）； （２）希釈、染色及び分類の前、22℃で３時間のストレートでのインキュベ
ートし（“ストレート−３時間”）；又は （３）“希釈物−０時間”として希釈し、そして染色し、そして次に、大量
分類の前、22℃で３時間インキュベートした（“希釈された−３時間”）。

【０１０２】 ｃ）エキステンダー：次の凍結エキステンダーを比較した：７％のグリセロー
ルを含むEYC（例１を参照のこと）、６％のグリセロールを含む卵黄−トリス（
例２を参照のこと）、及び５％のグリセロールを含む卵黄−TES−トリス（TEST
）。EYC“A画分”はグリセロールを含まないEYCエキステンダーを言及し、EYC“
B画分”は最後の所望するグリセロール濃度の２倍（すなわち、14％）を含むEYC
エキステンダーを言及する。従って、EYC B画分が同体積で組合される場合、最
終EYCエキステンダーは７％のグリセロールを含む。トリスA及びB画分は、同様
にして命名され、そして例２に記載される。TESTエキステンダーは、５％のグリ
セロールを含む完全エキステンダーとして調製され；従って、TESTについての“
A”及び“B”画分は存在しなかった。

【０１０３】 ｄ）被覆流体：被覆流体は、例２に記載のような98.6mMのクエン酸ナトリウム
二水和物（＃S279-3、Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ）又はトリスのいずれ
かであった。被覆流体の両タイプは、pH6.8に調節され；重量オスモル濃度は約2
70〜280mOsm/kgであった。トリス被覆流体を用いて、卵黄−トリス及びTEST凍結
エキステンダーにおいて後で拡張される精子を採取した。98.6mMのクエン酸ナト
リウムニ水和物を含む被覆流体を用いて、EYC凍結エキステンダーにおいて後で
拡張される精子を採取した。

【０１０４】 ｅ）分類：プレ−分類処理、被覆流体及びエキステンダーの個々の組み合わせ
のための約58×10⁶個の精子を、150mWの入射レーザー力を用いて、列２に記載の
ようにして大量分類した。分類の後、サンプルを22℃で２時間インキュベートし
、３時間の分類をシュミレートした。 ｆ）凍結方法：インキュベーションに続いて、精子を例２に記載のようにして
冷却した。冷却の後、サンプルを850×gで20分間、5℃で遠心分離した。個々の
サンプルは、約28mlの合計体積を含んで成り、そして50mlのプラスチック管に含
まれた。

【０１０５】 上清液の除去の後、精子を、拡張のために5℃の冷却室に戻した。サンプルを
、69μlのA−画分EYC、A−画分卵黄―トリス又はTESTエキステンダー中に131μl
の精子懸濁液を沈降することによって、40×10⁶/mlに拡張した。すぐに、懸濁液
を、エキステンダー（すなわち、B−画分EYC、B−画分トリス）又はTESTを含む
適合されたグリセロールの添加により20×10⁶個の精子/mlに調節した。B−画分
エキステンダーを、例２に記載のようにして15分間隔で段階的に（２倍）、それ
らのそれぞれのサンプルに添加した。TESTを、B−画分EYC及びトリスエキステン
ダーと同じ態様で段階的に精子に添加した。 ｇ）平衡化及び凍結：精子を、0.25mlのポリ塩化ビニル製ストロー中に充填し
、５℃で３時間、平衡化し、そして次に、液体窒素蒸気中で凍結した。

【０１０６】 ３．後−融解運動性の評価：精子の融解及び後−融解評価を、例２に記載のよ
うにして行った。 ４．統計学的分析：統計学的分析の一般的な記載は例２に提供される。特に、
処理効果は、個々の後―融解インキュベーション時間について分散の別々の分析
を通して評価された。主用プロットは、プレ−分類処理、エキステンダー及び雄
牛を包含し；サブプロットは観察者及び関連する相互作用から成った。雄牛はラ
ンダム効果として見なされ、そして他の因子は固定された。全実験は２度、反復
された。Tukey’s HSD試験を用いて、平均を分離した。

【０１０７】 ５．結果：大量分類された精子の後−融解前進運動性は、個々の後−融解イン
キュベーション時間でのエキステンダー及び雄牛により、及び０時間のインキュ
ベーションでのプレー分類方法により影響された（p＜0.05）（表６）。被覆流
体のために差異は存在しなかった（p＜0.05）。０時間の後−融解インキュベー
ションで、ストレートの3時間の処理の使用は、他の２回のプレー分類染色処理
よりも、凍結及び融解の後、より運動性の精子をもたらした（p＜0.05；表６）
。しかしながら、プレー分類方法は、ランダム効果として見なされる雄牛と共に
、１又は２時間の精子の後−融解インキュベーションの後、統計学的に有意では
なかった。重要なことには、それらの２種のインキュベーション時間で、雄牛相
互作用による有意なプレ−分類処理が存在した（p＜0.05）。さらに、プレ−分
類処理は、すべての後−融解インキュベーション時間で有意な効果を有し、そし
て雄牛は固定された効果として見なされた。

【０１０８】 融解の直後（０時間）、TESTは最良のエキステンダーであったが、しかし37℃
での１又は２時間のインキュベーションの後、トリスが最良のエキステンダーで
あった。重要なことは、いずれの応答に関してもエキステンダー相互作用による
プレ−分類処理は存在しなかった。すべてのインキュベーション時間での観察効
果（p＜0.01）は存在したが、しかし処理相互作用による観察者効果は存在しな
かった。すべての３種のインキュベーション時間でエキステンダー相互作用（p
＜0.05）による雄牛が存在した。

【０１０９】 表６．後−融解前進運動性に対するプレ−分類処理及び凍結エキステンダーの
主要効果（％）：

【表６】 a, b, c：共通する上付きを有さない、主要効果内の縦列内の意味は異なる（p
＜0.05）。 b：プールされた標準誤差＋。

【０１１０】 ６．結論：この研究は、希釈、染色及び分類の前、３時間の精子の維持が、即
座の希釈及び０又は３時間後の染色よりも良好であったことを示した。従って、
分類の３時間までに、３時間そのまま維持され、そして次に染色された元の射精
液の新規アリコートにより続けることが、染色され、そして400××10⁶個の精子
/mlで維持される精子の元のサンプルにより続けることよりも良好である。 TESTエキステンダーが０時間でより高い後−融解運動性を提供したとしても、
トリスは、精子が37℃でのインキュベーションによりストレスを受ける場合、卓
越したエキステンダーであった。いずれの被覆流体も、個々のエキステンダーの
ために同等に十分に作動した。それらの結果に基づけば、本発明者は、標準の作
用方法中に、トリス凍結エキステンダーと組合して、トリス被覆流体の使用を組
み込んだ。

【０１１１】 例５： 流動−分類された精子対する、凍結エキステンダーへのドデシル硫酸ナトリウ
ム（“SDS”）の添加の効果を評価すること： A．凍結エキステンダーにおけるSDSの濃度の効果の評価： １．サンプル源の採取：６匹の雄牛の精子を採取し、そして例１Aに記載のよ
うにして調製した。

【０１１２】 ２．方法：６匹の雄牛の個々からの精子を、0, 0.03, 0.06, 0.09又は0.12％
のSDSを含む20％の完全な卵トリス（“WET”）エキステンダーにおいて、20×10⁶ /mlまで拡張し、ストロー中に充填し、そして凍結した。WETエキステンダーを
、二重蒸留された水100ml当たり、3.028gのトリス［ヒドロキシメチル］アミノ
メタン、1.78gのクエン酸一水和物及び1.25gのフルクトースを用いて調製し、こ
れに20％の完全な卵（体積/体積）を添加した。WETエキステンダーは、約7.0のp
Hで調製され、そして約６％（体積/体積）の最終グリセロール濃度を含んだ。WE
Tエキステンダーはまた、1000IUのペニシリン“G”ナトリウム及び100Tgのスト
レプトマイシン硫酸/mlを含んだ。 ３．結果：それぞれの平均（ｎ＝６匹の雄牛の個々からの１つのサンプル）は
、融解の後、約10分での51, 51, 50, 51及び48％の前進運動性精子であった。そ
れらの結果に基づいて、0.06％のSDSを例5Bにおいて使用した。

【０１１３】 B．流動−分類された精子の後−融解運動性に対する種々の凍結エキステンダー
における0.06％SDSの効果の評価： １．サンプル源の採取：８匹の雄牛の精子を採取し、そして例１Aに記載のよ
うにして調製した。 ２．方法：後−融解運動性を、卵黄−トリス（例２を参照のこと）及びWETエ
キステンダー（例5Aを参照のこと）（0.06％のSDSを含むか又は含まない）にお
いて凍結された精子について研究した。両エキステンダーについての最終グリセ
ロール含有率は６％であった。

【０１１４】 ａ）染色、分類方法、分類：染色された精子サンプルを、例２に記載のように
して、８匹の雄牛の個々のからの射精液から調製した。染色された精子を、例２
に記載のようにして（但し、分類は135mWの入射レーザー力を用いて達成された
）、トリス被覆流体を用いて大量分類した。分類された精子を、個々のエキステ
ンダーに関して、2ｍｌのA−画分凍結緩衝駅を含む50mlのプラスチック製管に採
取し；個々の処理のための合計15×10⁶個の分類された精子（25ml）を採取し、
そして22℃で１時間インキュベートし、より長い分類をシュミレートした。

【０１１５】 ｂ）凍結方法：次に、希釈された精子を、90分間にわたって5℃に冷却した。
等体積の適切なB−画分エキステンダーを、分類された精子を含む個々の50mlの
プラスチック製管に、15分間隔で段階的（２段階）に添加した。25mlのエキステ
ンダー処理のアリコートを、冷蔵された遠心分離機において850×gで20分間、遠
心分離することにより濃縮した。上清液を除去し、600TIの精子ペレットを得、
これを15分間、軽くかきまぜることによって懸濁した。追加のエキステンダーは
、ペレットを含む懸濁液がすでにグリセロールを含むので、精子ペレットに添加
されなかった。精子懸濁液の濃度は約20×10⁶/mlであった。個々の雄牛に関する
。染色されていない、分類されていない対照を、６％のグリセロールを含む卵黄
−トリスエキステンダーにおいて、20×10⁶個の精子/mlで調製した。対照を、5
℃の冷却室に置き、ここで大量分類が生じた。

【０１１６】 ｃ）平衡化及び凍結：すべての対照及び大量分類された精子を充填し、そして
同時に凍結した。精子を0.25mlのポリ塩化ビニル製ストロー中に充填し、5℃で
約３〜約６時間、平衡化し、そして次に、静的液体窒素蒸気において凍結した。

【０１１７】 ３．後−融解運動性の評価：精子の融解及び後−融解評価を、例２に記載のよ
うにして（但し、前進運動性は、インキュベーションの0.5及び2.0時間後に評価
された）行った。 ４．統計学的分析：統計学的分析の一般的な記載は例２に提供される。特に、
処理効果を、個々のインキュベーション時間、分散の別々の分析により評価し；
モデルは、主要ブロットにおける雄牛及びエキステンダー及びサブプロットにお
ける観察者及び関連する相互作用を包含した。平均の差異は、最小有意誤差を試
験により決定された。

【０１１８】 ５．結果：エキステンダーは、0.5又は２時間の後−融解インキュベーション
の後、精子の前進運動性に影響を及ぼした（p＜0.05）（表７）。0.5時間で、WE
T及びSDSは、トリス及びSDSよりも低い運動性をもたらした。２時間で、大量分
類された精子によるすべての処理は、分類されていない対照精子よりも悪かった
。両インキュベーション時間で、有意な雄牛及び観察者効果（p＜0.01）が存在
したが、しかし処理相互作用によっては、観察者効果は存在しなかった。

【０１１９】 表７．後−融解前進性運動に対するエキステンダーの効果（％）：

【表７】 a, b：共通する上付きを有さない縦列内の意味は異なる（p＜0.05）。 ｃ：＋。

【０１２０】 ６．結論：トリス又はWETエキステンダーにおけるSDSの包含は、融解後の運動
性の視覚による評価により決定される場合、精子品質のためにならなかった。ま
た、WET及びトリスエキステンダーを用いての結果は類似し、従って、WETは分類
されたウシ精液を低温保存するためにトリスと同じくらい効果的であるように見
えた。

【０１２１】 例６： 現場試験のための流動分類により性別された精子の品質： 目的：先体完全性に基づいて、分類された精子の後−融解品質を評価すること： １．サンプル源の採取：３匹の雄牛の精子を、例１Aに記載のようにして採取
し、そして調製した。

【０１２２】 ２．方法：同じ射精液からの分類された対照精子及び分類されていない対照精
子を、例２に記載のようにして（但し、精子は90％の純度レベルで性タイプにつ
いて分類された）、染色し、処理し、そして分類した。分類された精子を、約20
mlの体積で採取し、そして90分間にわたって５℃に冷却した（0.2℃/分）。冷却
の後、等体積の卵黄−トリスBエキステンダー（例２を参照のこと）を、分類さ
れた精子に、15分間隔で添加した。上清液の遠心分離及び吸引を、例５に記載の
ようにして達成した。遠心分離及び吸引の後、６％（v/v）のグリセロールを含
む卵黄−トリスエキステンダーを、精子ペレットに添加し、精子濃度を、約20×
10⁶/mlにした。凍結及び融解を、例２に記載のようにして（但し、平衡化時間は
約３時間であった）、行った。

【０１２３】 ３．後-融解運動性の評価：37℃での前進性運動精子の％の視覚的評価を、融
解の後、約10分で行った。精子の先体完全性を、37℃での２時間のインキュベー
ションの後、微分干渉-対比顕微鏡（1000倍）を用いて評価した。精子を40mMの
弗化ナトリウム二より処理し、湿潤物からスミアを製造し、そして処理当たり10
0個の精子を試験した。先体を次のように分類した：（ａ）損なわれていない先
体、（ｂ）膨潤された又は損傷された先体、又は（ｃ）先体の欠失（損なわれて
いる）。

【０１２４】 ４．統計学的分析：分析されるデータは、現場試験において使用される３匹の
雄牛を通して均衡化された19の異なった凍結データからであった。処理効果（分
類−対−対照）を、固定された効果としての雄牛による分散性の分析を通して評
価した。 ５．結果：融解後の前進運動精子の％は、分類の間、死亡精子の除去にもかか
わらず、分類された精子（64％；表８）よりも、分類されていない精子（50％）
に関して、有意に高かった（p＜0.05）。しかしながら、損なわれていない先体
を有する精子の％は異ならなかった。

【０１２５】 分類は先体を欠失する精子の％を高めたが、しかしまた、対照精子（p＜0.05
）に関して、損傷された先体を有する精子の％をも低めた。損なわれていない先
体の％（p＜0.05）、損なわれた先体の％（p＜0.01）、及び後−融解前進運動性
（p＜0.01）に関して、雄牛間に有意な差異が存在した。後−融解運動性に関す
る分類効果による雄牛が存在したが（p＜0.01）、しかし他の応答に関してはそ
うではなかった。雄牛A及びBから、分類された精子と分類されていない精子との
間の後−融解運動性の差異はほぼゼロであり；雄牛Cに関しては、分類された精
子は、対照精子よりも、運動性において低い10％点（19％）であった。

【０１２６】 表８．後−融解運動性（％）及び先体状態（％）に対する分類の効果：

【表８】 a, b：異なった上付きを有する縦列の意味は異なった（p＜0.05）。

【０１２７】 ６．結論：平均的に、分類された、凍結精子についての前進運動性の視覚的評
価は、対象精子に関する運動性よりもわずかに低く（４％点；８％）、但し、こ
の差異は１匹の雄牛に関しては大きかった。それらの評価は、融解の後、約10分
で行われた。小さな平均的差異は、２時間のインキュベーションの後、損なわれ
た先体についての差異と一致する。損傷された又は欠失する先体を有する精子は
たぶん、運動性でない。分類されたサンプルに関して、損なわれた先体を有する
精子の高められた百分率は、実際の分類の前又は後、分類又は低温保存に関連す
る損傷を示す。たぶん、分類は、損傷された先体を欠失する先体に転換した。精
子品質の評価についての標準の方法に基づけば、それらの流動分類された精子の
受精能力がほとんどの雄牛に関して、重度に譲歩されるべきであることを仮定す
るための根拠は存在しない。

【０１２８】 例７： 20％卵黄−トリスエキステンダーを用いての雄牛精子の性選択及び低温保存：
目的：流動分類された雄牛精子の低温保存のためのプロトコールを提供すること
： １．採取及び射精液評価：射精液の採取及び調製は、例１Aに記載される通り
である。75％以上の形態学的に正常な精子を有する、それらの雄牛からの射精液
を選択する。前進性運動精子の百分率を視覚的に推定する（60％以上の前進運動
性を有する射精液画分類のために最良である）。次の通りに原精液に抗生物質を
添加する：100μg/mlの最終濃度でのチロシン、500μg/mlの最終濃度でのゲンタ
マイシン、及び300/600μg/mlの最終濃度でのリンコ―スペクチン。

【０１２９】 ２．染色及び分類方法：原精液サンプルへの抗生物質の添加に続いて、染色の
前15〜20分間を可能にする。サンプルを、例２に記載のようにして染色する。 ３．分類：90％の純度の分類ゲートを設定することによる、X及びYタイプ精子
の両者を分類する。個々の管が最大20mlの合計体積（又は最大２時間/分類）を
含み、そして最終分類された精子濃度が６×10⁵/mlになるまで、2mlの20％卵黄
−トリスA−画分エキステンダー（例２を参照のこと）含む50mlのFalcon管中に
精子を分類する。追加の20％卵黄−トリスA画分捕獲緩衝液が、分類の後、及び
冷却の前、添加され、その結果、卵黄の最終％が少なくとも３％であることを注
意すること。

【０１３０】 ４．凍結方法：分類に続いて、分類されたサンプルを、90分間にわたって5℃
に冷却する。冷却の後、20％卵黄−トリスB−画分エキステンダー（例２を参照
のこと）を、15分間隔で段階的に添加する。精子サンプルに添加されるトリスB
−画分エキステンダーの最終体積は、トリスA−画分エキステンダーの体積に等
しくあるべきである。トリスB−画分エキステンダーが添加された後、精子サン
プルの合計体積は、27mlの合計体積を越えるべきではない。

【０１３１】 トリスB−画分エキステンダーが精子サンプルに添加された後、850×gで20分
間の遠心分離によりサンプルを濃縮する。上清液を吸引し、約150μlの精子ペレ
ットを得る。精子を再懸濁し、そして個々の雄牛についての精子をプールする。 ５．凍結：20×10⁶/mlの最終精子濃度を達成するために完全卵黄−トリスエキ
ステンダー（６％のグリセロール）を添加する。例２に記載のようにして、凍結
するために0.25mlのポリ塩化ビニル製ストロー中に拡張された精子を充填する。

【０１３２】 例８： 現場研究における流動分類された凍結雄牛精子の受精能の評価： 材料及び方法：精液採取及び加工 ： 未知の受精能の若い雄牛からの精液を、人工膣を通して採取した（例１Aを参
照のこと）。分光計により精子濃度、及び前進精子運動の主観的評価の決定の後
、精液を、例２に記載のようにして、加工し、そして分類し、但し、精子は約13
5〜約150mWのレーザー入射力を用いて、90％の純度で性タイプにより分類された
。

【０１３３】 加工及び凍結は、例２に記載のようにして達成されたが、但し平衡化時間は約
３時間であった。Cornell Universal Extender (Seidel GE Jr., Theriogenolog
y 1997; 48: 1255-1264) が、現場試験１、２及び３において液体精液のために
使用された。現場試験２及び３における凍結された精液に関して、使用されるエ
キステンダーは、７％の最終グリセロール濃度を有する、2.9％のクエン酸ナト
リウム及び20％の卵黄であった（例１を参照のこと）。現場試験４〜11に関して
、精子を、200mMのトリス、65mMのクエン酸、56mMのフルクトース、20％の卵黄
及び６％の最終グリセロール濃度から成るトリス基材のエキステンダーにおいて
凍結した（例２を参照のこと）。流動細胞計測法に使用される被覆流体は、試験
１，２及び３に関しては、2.9％のクエン酸ナトリウムであり（例４を参照のこ
と）、そして残る試験に関しては、トリス緩衝液であった（例２を参照のこと）
。

【０１３４】 精子を、ストローの中央における50μlほどのカラムの0.25mlのFranchストロ
ーに充填した。希釈効果を最少にするために、低体積を用い、その結果、少なく
とも10⁷個の精子/mlが存在した。ほとんどの試験においては、精子を有さないエ
キステンダーのカラムをまず、ストロー中に吸引し、綿プラグを湿潤し、続いて
少カラムの空気及び次に、性別された精子を充填した。精子が凍結される場合、
個々のバッチからの1つのストローを、品質調節のために35℃の水において30秒
間、融解し、そして融解の後、25％以下の前進性運動を有するバッチを捨てた。
個々のバッチからの性別された精子のサンプルを音波処理し、そして性別化の精
度を決定するために、流動細胞計測により分析した。

【０１３５】若い雌牛の管理及び人工受精 ： 使用される若い雌牛は、異なった管理実施を有する、６匹の広く分散された製
造ユニットに存在した。季節及び飼育の差異は、実験の異種性に寄与した（表９
を参照のこと）。可能な限り、処理及び調節は、若い雌牛が受精施設に入る場合
、受精者内の雄牛内で組織的に交互にされた。

【０１３６】 発情は次の４種の手段の1つにおいて同調された（表９）：（１）14時間、2.3
kgの穀物に毎日、供給される、500mgの酢酸メレンゲストロール（MGA）、続いて
、MGA（MGA/PG）の供給の最後の日の17, 18又は19日後、25mgのプロスタグラン
ジンF₂α（Lutalyse, Upjohn, Kalamazoo, MI, USA）のi.m. 注入；（２）25mg
のプロスタグランジンF₂α（PG）の１回の注入；（３）20又は25mgのプロスタグ
ランジンF₂αの12日間隔でのi.m. 注入（PG/PG）;又は（４）50又は100TgのGnRH
のi.m.注入、続いて、25mgのプロスタグランジンF₂αの７日後でのi.m.注入（Gn
RH/PG）。

【０１３７】 若い雌牛は、朝及び夕、発情期を調べるために、視覚的に観察されたが、しか
し発情の開始後、約1/2又は１日で、16：00時以後の夕方においてのみ受精され
た。受精は、従来通り、子宮内か、又は胚移行シース（IMV, Minneapolis, MN,
USA） を用いて、個々の子宮角のいずれかであった。後者の場合、精液はできる
だけ前方部が外傷を伴なわないで、非手術的胚移行を同様に達成され得るよう、
子宮角の高い湾曲部を越えて付着された。ほとんどの場合、精液は、角の前方1/
3〜中間の間に付着された。

【０１３８】 ほとんどの実験は、性タイプ（“性別された”）について分類された精子のた
めに使用される同じ雄牛からの20又は40×10⁶個の精子/用量により子宮中に注入
される凍結精子対照を包含した。この対照は、特定の現場試験条件下で若い雌牛
の固有の正常な受精能、及び使用される雄牛の受精能、並びに受精の熟練の複合
評価として作用した。いくつかの試験はまた、低用量の性別されていない対照グ
ループも包含した。時々、多くの対照受精が、性別された精子に対する多くの情
報を得るために、個々の処理のために使用される数の1/2又は2/3であるよう計画
された。凍結され、性別された精子及び対照精子を、35〜37℃の水浴において20
〜30秒間、融解した。種々の他の詳細は、表９に要約される。

【０１３９】 妊娠を、オペレーターの知識の受精処理又は対照を伴わないで、Curran, S.,
Theriogenology 1991; 36: 809-814に記載のようにして、超音波28〜37d後−受
精及び/又は56〜92d後−受精（この時点で、胎児の性がほとんどの試験において
決定される）により診断した。生まれる子牛の性は、胎児−性診断とほぼ同一で
あった。データを、連続性について補正された、single-degree-of-freedomχ二
乗検定により分析し；片側試験が特定されていなければ、両側試験を用いた。5
％以下の受精が、受精処理の誤り、生殖管の明らかな感染、子宮頸の移動の失敗
、等のために選別された。実験から動物を選別する決定は、受精の直後に行われ
、そして妊娠診断に決して基づかれなかった。

【０１４０】 表９．現場試験の方法の詳細：

【表９】

【０１４１】 結果及び議論： 提供されるデータは、研究のロジスティク観点、例えば群れの遺伝的必要性へ
の雄牛の適合性、雄牛に対する受精情報の入手不可能性、試験を通して同じ受精
者の入手不可能性、いくつかの試験におけるきびし気候、初期試験における性別
された精液の制限された量、発情同調の時点で約55日までの妊娠であることがわ
かっている２組の若い雌牛、等により強制される、11の連続的な異種現場試験か
らである。４匹までの雄牛及び３人の受精者が個々の試験により包含され；これ
は、結果が１匹よりも多くの雄牛又は技術者に適用されることの、サンプル集団
における確認を可能にし；しかしながら、不充分なデータが、受精能において雄
牛ごとの差異を正確に評価するために生成された。

【０１４２】 ほとんどの組みの若い雌牛は、本発明者の実験室から140〜250km離れた場所の
繁殖群からであった。いずれかの試験における受精者の間での妊娠割合の有意な
差異は存在しなかったが、しかし受精者当たりの繁殖数は低く、そして差異はた
ぶん、多数の受精にいより検出されるであろう。 発情同調方法は、試験内で比較されず、その結果、それらの方法間での妊娠割
合を比較することには不可能であった。妊娠割合は、使用されるすべての４種の
同調方法のために満足すると思われた。

【０１４３】 受精は１日おきにおこなわれたので、夕方での発情期の若い雌牛を、発情が検
出された後、約24時間で受精した。すべての試験にわたってプールされた、性別
された精子によるそれらの若い雌牛についての妊娠割合は、203/414（49.0％）
であり、これは、朝での発情における若い雌牛の妊娠割合と有意に異ならず（p
＜0.1）、そして従って、発情の検出の後、半日で受精された266/586（45.4％）
。後での受精による高い受精能についてのこの傾向は、低い精子数が使用される
場合、又は他方では、条件が最適状態に及ばない場合、低い受精能雄牛により通
常、推薦されるよりも遅く受精することが好ましい、他の研究からの発見と一致
する。

【０１４４】 処理による妊娠割合、及び入手できる場合、胎児又は牛の性別が表10〜20に提
供される。その目的は、試験８を除いて、雌の子孫を得ることであり；精度はそ
れぞれ、試験1, 3, 8, 9, 10及び11において、95%, 83%, 90%, 83%, 82%及び94%
であった。残る試験においては、胎児又は出産性別は、妊娠診断のタイミング、
胎児性別に熟練した個人の非入手性のために、及び/又は子牛がまだ生まれてい
ないので、入手できなかった。これは、この研究の主要目的が低い用量で受精さ
れる、流動−分類された精子の受精能を決定することであるので、主要な関心で
はなかった。

【０１４５】 性別の精度は、分類パラメーターを調節することによって、50〜95＋％の間で
所望する、実質的にいずれかのレベルに調節され得る。しかしながら、高い精度
は、単位時間当たり分類される低い数をもたらし、特に、Y染色体精子に関して
は、90％の精度が通常の作業のために十分である。

【０１４６】 個々の現場試験からの主用発見が順に要約されるであろう。合計の精子数は、
表の見出しに与えられ；前進運動性精子の数は通常、それらの値の30〜50％であ
ったことを注意すること。現場試験１（表10）は、低数の性別されていない精子
を用いての子宮角受精による妊娠割合が、通常の精子数による対照に類似したこ
とを確かめた。凍結されていない性別された精子による64〜67日目の妊娠割合（
42％）は、分類された精子と同様に、希釈され、染色され、そして遠心分離され
た精子による性別されていない液体対照よりも12％点低かった。

【０１４７】 性別の制度は95％であり；性別された精子から生まれた子牛の性別は、胎児の
性別診断と正確に適合し；対照の胎児の性別に１つの誤りが存在した。２ヶ月の
妊娠期間での流産はなく、そして性別された精子処理からのすべての19匹の子牛
は正常であり、そして生存した。性別された精液処理に関しては、雄牛N1, N2及
びN3に関する２ヶ月の妊娠割合は、それぞれ、41, 44及び40％であり；朝での発
情の若い雌牛の39％（13/33）、及び夕方での発情の50％（6/12）が妊娠した。

【０１４８】 表10．現場試験１の結果―1997年ワイオミングにおけるAngus雌牛：

【表１０】 a, b：共通する上付きを有さない性別比は異なる（p＜0.02）。

【０１４９】 現場試験２（表11）は、性別され、凍結された精子に関する結果は、調節が低
温保存の間、殺害された精子の数に関して行われる場合、性別され、凍結されて
いない精子に類似する最初の証拠を提供した。５℃対18℃で貯蔵された、性別さ
れた精子間での妊娠割合の差異もまた存在しなかった。個々の雄牛からの性別さ
れた精液に関する受精の後、２ヶ月での妊娠割合は、22〜42％の範囲であった（
p＞0.05）。妊娠の１〜２ヶ月での胚の損失は、性別された妊娠及び対照の妊娠
に関して非常に類似した。分娩データは、この試験からの39匹の雌牛から入手で
き；２ヶ月での妊娠のそれらの雌牛（30匹の性別された妊娠、９匹の対照）の個
々は、正常な長さの妊娠の後、分娩した。

【０１５０】 表11．現場試験２の結果−1998年コロラドにおける交雑された雌牛：

【表１１】 a：有意な差異は存在しない、X²。

【０１５１】 現場試験３（表12）は、性別され、凍結された精子が適切な妊娠割合をもたら
したことを確かめた。精子の性別の精度を再び確かめ；しかしながら、生まれる
子牛に関して胎児の性別において４匹の誤りが存在し；生まれる子牛の実際の性
が表される。再び、２ヶ月の妊娠期間で流産は存在しなかった。雄牛N8, N9, AN
5及びAN4に関する、性別され、凍結されていない精子及び性別され、凍結された
精子に対する平均の妊娠割合は、それぞれ24, 31, 50及び60％（p＜0.1）であっ
た。

【０１５２】 表12．現場試験３の結果−1998年ワイオミングにおけるAngns雌牛：

【表１２】 a, b：共通する上付きを有さない意味は異なる（p＜0.05）。 c, d：性別処理からの雌の子牛の百分率（83％）は、対照グループとは異なっ
た；p＜0.05、片側、χ²。

【０１５３】 現場試験4.5及び６（表13, 14, 15）を、３種の異なった雌牛のグループによ
り、同じ場所で行った。不運なことには、現場試験の変転、例えば人員のスケジ
ュール、個々の雄牛からの性別された精液の入手性、等のために、個々の試験を
同様に反復することは不可能であった。試験５と６との間の広く異なった妊娠割
合は、条件が試験間で異なることを示す。試験６における雌牛の何匹がは、それ
らが１ヶ月の自然交配の後、妊娠しなかったので、利用できた。

【０１５４】 それらの試験の条件下で、妊娠割合は、1.5及び3.0×10⁶個の性別された、凍
結された精子/用量間で非常に類似した。さらに、子宮角受精に利点は存在しな
かった。J2の妊娠割合（20/28, 71%）がJ4の妊娠割合（15/39, 39%）よりも高か
った（p＜0.05）、試験５を除いて、雄牛間での妊娠割合の有意な差異（p＜0.05
）は存在しなかった。この差異は、J4が試験４及び６におけるJ2よりも数的であ
るが、しかし有意ではない（p＜0.1）、高い妊娠割合を有したので、試験から試
験で一致しなかった。

【０１５５】 表13．現場試験４の結果−1999年コロラドにおけるホルスタイン雌牛：

【表１３】 a, b：共通する上付きを有さない平均は異なる（p＜0.01）。 ★：d30〜33で妊娠する６匹の雌牛は、第２の妊娠診断の前、売られた；それ
らは妊娠していると推定された。

【０１５６】 表14．現場試験５の結果−1999年コロラドにおけるホルスタイン雌牛：

【表１４】 a：有意な差異は存在しない。

【０１５７】 表15．現場試験６の結果−1999年コロラドにおけるホルスタイン雌牛：

【表１５】 a, b：共通する上付きを有さない平均は異なる（p＜0.05）。

【０１５８】 試験7（表16）に関しては、１人の受精者のみを、再スケジュールのために入
手できた。これは、子宮体受精よりも子宮−角の納得できる利点を示した唯一の
試験である。前記試験の条件下でのこの受精者に関しては、55％以上の雌牛（22
％点）が、子宮体中へよりも子宮角中導入される、性別され、凍結された精液に
より妊娠した。真の差異は、それらの平均に基づいて広い信頼区間が存在するの
で、より小さい。子宮体及び子宮角−受精が比較されるすべての他の試験（5, 6
, 9及び11）においては、妊娠割合は、この技術者及び他の技術者のための両方
法に関しては、非常に類似した。

【０１５９】 試験７に使用される１匹の雄牛からの精液を、分類の前、−20℃で絶縁ボック
スにおいて空路によりモンタナから希釈しないで輸送し；輸送時間は６時間であ
った。２匹の雄牛からの性別された精子についての妊娠割合は、実質的に同一で
あり、すなわち輸送されていない精液に関して49％であり、そして輸送された精
液に関して52％であった。精液は、Hoechst 33342による精子の染色性質がエキ
ステンダーによる希釈により変更されないので、輸送のためにエキステンダーに
より希釈されず、そして冷却もされなかった。さらに、他の研究（例４を参照の
こと）においては、採取と流動分類との間でのほぼ周囲温度での精液の分類は、
それを希釈するよりも卓越していることが見出された。

【０１６０】 表16．現場試験7の結果−1999年コロラドにおける交雑された雌肉牛：

【表１６】 a, b：共通する上付きを有さない平均は異なる（p＜0.01）。

【０１６１】 現場試験８（表17）は、成長促進剤により移植されていないフィードロット雌
牛に関し；この時点で、妊娠は、それらが流産したものとして診断され、従って
、分娩データは入手できなかった。この実験は、効果的な性別がまた、雄指図に
おいて行われ得ることを示す。２匹の雄牛についての妊娠割合は50及び61％であ
った。

【０１６２】 表17．現場試験８の結果−1999年ネブラスカにおけるAngus雌牛：

【表１７】 a：有意な差異は存在しない。

【０１６３】 現場試験９（表18）は、3.0対1.5×10⁶個の性別された、凍結精子/受精用量の
納得する利点を示すための唯一の試験であった。この利点は、両受精者に関して
真であった。２匹の雄牛からの性別された精子に関する妊娠割合は、62及び75％
であった。

【０１６４】 表18．現場試験９の結果−1999年ネブラスカにおけるRed Angus雌牛：

【表１８】 a：3.0×10⁶個の性別された精子は、1.5×10⁶の性別された精子（55％）より
も高い妊娠割合（80％）を有した、p＜0.05、片側、χ²。

【０１６５】 性別された凍結精液による現場試験10（表19）における妊娠割合は、対照に類
似し；この試験上での性別精子の精度はわずか82％であり、しかしながら、これ
は、標的化された90％の精度とは有意には異ならない。性別された精液について
の妊娠割合は、それぞれ、AN4、AN7及びAN8に関して、54, 66及び50％であった
（p＞0.1）。この試験において受精された18匹の雌牛は、現場試験１における性
別された精子に起因する子牛であった。

【０１６６】 表19．現場試験10の結果−1999年ワイオミングにおけるAngus雌牛：

【表１９】 a：有意な差異は存在しない。

【０１６７】 表20．現場11の結果−1999年コロラドにおけるホルスタイン雌牛：

【表２０】 a：有意な差異に存在しない、χ²。 b：性別された精液処理からの17匹の胎児の16匹（94％）は、雌であり；２匹
は超音波により性別するには、体腔において深過ぎた。 試験からのデータを組合し、ここで処理は同一であるが、但し、１××10⁶及
び1.5××10⁶個の精子用量がプールされた（表21）。

【０１６８】 表21．性別され、凍結された精子及び凍結された対照と試験とを組合すことか
らのメタ−要約：

【表２１】

【０１６９】 性別された精子による妊娠割合は一般的に、7〜20倍多くの精子による実験内
での性別されていない対照の70〜90％であった。この差異は、つい最近の試験に
おいては低く、たぶん、改良された性別及び精子処理方法のためである。 いくつかの試験において、雌牛が、受精の１及び２ヶ月後、超音波により妊娠
について試験された。この期間における妊娠の損失は、性別された精子処理（23
/261；8.8％）−対−対照の処理（9/145；6.2％）に関して、類似し（p＜0.1）
、これは、性別による遺伝子損傷が最少である１つの目安である。分娩情報を、
初期試験からのほとんどの家畜は売られ、そして後期試験からの家畜はまだ分娩
したことがないので、小数のみの妊娠雌牛から得た。性別された精液から今日ま
で生成される子牛の人口は、対照の人工と異ならないように見える。

【０１７０】 結論： 家畜における性別比率は、流動細胞計測法/細胞ソーターによるDNA含有率に基
づいての精子の分類、続く低温保存及び比較的通常の人工受精により、いずれか
の性別の約90％にゆがめられ得る。性別された精子に起因する子牛は、正常に見
える。それらの研究におけるほとんどの雄牛に関しては、1.0〜1.5×10⁶個の性
別され、凍結された精子による妊娠割合は、20又は40×10⁶個の精子により従来
通りに受精された、性別されていない対照の70％〜90％であった。それらの結果
は、正しく処理された精液を用いて、良く訓練された受精者により交配された、
良く管理された雌牛に適用される。標準の子宮体受精に比較して、子宮角の両側
中に性別された精子を注入する小さな利点が存在する。

【０１７１】 本発明は、特定の方法及び材料に関して、本明細書において論じる必要があっ
た。それらの特定の方法及び材料の議論は、本発明の目的を達成するために適切
ないずれかの及びすべての他の材料及び方法に拡張する、本発明の範囲に対する
いずれの制限も決して構成しないことが理解されるべきである。 記載されるすべての特許及び出版物は、引用により本明細書に組み込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 精子の低温保存方法であって、 （ａ）選択された精子サンプルを獲得し； （ｂ）前記選択された精子サンプルを冷却し； （ｃ）単離された精子を生成するために、前記選択された精子サンプルから精
   子を単離し； （ｄ）精子の懸濁液を生成するために、前記単離された精子に最終エキステン
   ダーを添加し；そして （ｅ）前記精子の懸濁液を凍結する； ことを含んで成る方法。
2. 【請求項２】 前記選択された精子サンプルが、サンプル源に存在する、特
   徴的に選択された精子の一部を含んで成り、そして前記選択された精子サンプル
   における精子濃度が前記サンプル源におけるよりも低い請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 前記選択された精子サンプルが、性選択された精子を含んで
   成る請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 前記選択されて精子サンプルが、哺乳類精子を含んで成る請
   求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 前記選択された精子サンプルが、ウシ精子を含んで成る請求
   項４記載の方法。
6. 【請求項６】 前記選択された精子サンプルが、ウマ精子を含んで成る請求
   項４記載の方法。
7. 【請求項７】 前記選択された精子サンプルが、ブタ精子を含んで成る請求
   項４記載の方法。
8. 【請求項８】 前記選択された精子サンプルが、流動細胞計測法、磁気技法
   、カラム技法、重量分析技法、生化学技法、精子の運動性に基づく技法、精子の
   電気的性質に基づく技法、及びそれらのいずれかの組み合わせから成る群から選
   択された方法により選択された精子を含んで成る請求項１記載の方法。
9. 【請求項９】 前記精子が、流動細胞計測法により選択されている請求項８
   記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記冷却が、前記選択された精子サンプルの温度を、約5
    ℃に下げることによって行われる請求項１記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記冷却が、約60分〜240分にわたって行われる請求項10
    記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記選択された精子サンプルに添加される前記最終エキス
    テンダーがそれぞれ、低温保護剤の他に、１又は複数の次の成分、すなわち重量
    オスモル濃度を維持し、そしてpHを緩衝する成分、精子の冷却ショックを低め、
    そして受精能を保存する有機物質、エネルギー源、精子受精能獲得を促進する物
    質、及び抗生物質を含んで成る請求項１記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記低温保護剤が、二糖類、三糖類及びそれらのいずれか
    の組み合わせから成る群から選択される請求項12記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記低温保護剤が、グリセロール、ジメチルスルホキシド
    、エチレングリコール、プロピレングリコール及びそれらのいずれかの組み合わ
    せから成る群から選択される請求項12記載の方法。
15. 【請求項１５】 重量オスモル濃度を維持し、そしてpHを緩衝する前記成分
    が、塩を含んで成る緩衝液、炭水化物を含んむ緩衝液、及びそれらのいずれかの
    組み合わせから成る群から選択される請求項12記載の方法。
16. 【請求項１６】 重量オスモル濃度を維持し、そしてpHを緩衝する前記成分
    が、クエン酸ナトリウム、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン、N−トリ
    ス［ヒドロキシメチル］メチル−２−アミノエタンスルホン酸、グルタミン酸一
    ナトリウム、ミルク、HEPES緩衝培地、及びそれらのいずれかの組み合わせから
    成る群から選択される請求項12記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記有機物質が、卵黄、卵黄抽出物、ミルク、ミルク抽出
    物、カゼイン、アルブミン、レシチン及びそれらのいずれかの組み合わせから成
    る群から選択される請求項12記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記エネルギー源が、グリコース、フルクトース、マンノ
    ース及びそれらのいずれかの組み合わせから成る群から選択される単糖類である
    請求項12記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記抗生物質が、チロシン、ゲンタマイシン、リンコマイ
    シン、リンコ−スペクチン、スペクチノンマイシン、ペニシリン、ストレプトマ
    イシン、及びそれらのいずれかの組み合わせから成る群から選択される請求項12
    記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記最終エキスパンダーの添加の後、前記精子サンプル及
    び精子の懸濁液がそれぞれ、グリセロール、クエン酸ナトリウム、トリス［ヒド
    ロキシメチル］アミノメタン、卵黄、フルクトース、及び１又は複数の抗生物質
    を含んで成る請求項１記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記最終エキスパンダーの添加の後、前記精子サンプル及
    び精子の懸濁液がそれぞれ、グリセロール、クエン酸ナトリウム、卵黄、及び１
    又は複数の抗生物質を含んで成る請求項１項記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記最終エキスパンダーの添加の後、前記精子サンプル及
    び精子の懸濁液がそれぞれ、グリセロール、卵黄、ミルク、フルクトース、及び
    １又は複数の抗生物質を含んで成る請求項１記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記エキステンダーが、約6.5〜約7.5の範囲のpHを有する
    請求項１記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記精子が、遠心分離により前記選択された精子サンプル
    から単離される請求項１記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記遠心分離が、少なくとも約50％〜約90％の精子回収を
    可能にする請求項24記載の方法。
26. 【請求項２６】 凍結の前、前記懸濁液における精子の濃度が、約１×10⁶/
    ml〜約300×10⁶/mlである請求項１記載の方法。
27. 【請求項２７】 サンプル源に存在する、特徴的に選択された精子の一部を
    含んで成る凍結された選択精子サンプル。
28. 【請求項２８】 前記凍結された選択精子サンプルが、性選択された精子で
    ある請求項27記載の凍結された選択精子サンプル。
29. 【請求項２９】 前記凍結された選択精子サンプルが、哺乳類精子を含んで
    成る請求項27記載の凍結された選択精子サンプル。
30. 【請求項３０】 前記凍結された選択精子サンプルが、ウシ精子を含んで成
    る請求項29記載の凍結された選択精子サンプル。
31. 【請求項３１】 前記凍結された選択精子サンプルが、ウマ精子を含んで成
    る請求項29記載の凍結された選択精子サンプル。
32. 【請求項３２】 前記凍結された選択精子サンプルが、ブタ精子を含んで成
    る請求項29記載の凍結された選択精子サンプル。
33. 【請求項３３】 前記選択された精子サンプルを選択するために使用される
    方法が、流動細胞計測法、磁気技法、カラム技法、重量分析技法、生化学技法、
    精子の運動性に基づく技法、精子の電気的性質に基づく技法、及びそれらのいず
    れかの組み合わせから成る群からの技法を含んで成る請求項27記載の凍結された
    選択精子サンプル。
34. 【請求項３４】 前記凍結された選択精子サンプルが、流動細胞計測法によ
    り選択された精子を含んで成る請求項33記載の凍結された選択精子サンプル。
35. 【請求項３５】 前記凍結された選択精子サンプルが、 （ａ）選択された精子サンプルを獲得し； （ｂ）前記選択された精子サンプルを冷却し； （ｃ）単離された精子を生成するために、前記選択された精子サンプルから精
    子を単離し； （ｄ）精子の懸濁液を生成するために、前記単離された精子に最終エキステン
    ダーを添加し；そして （ｅ）前記精子の懸濁液を凍結する； ことを含んで成る方法により生成される請求項27記載の凍結された選択精子サ
    ンプル。
36. 【請求項３６】 人工受精又は胎外受精のために請求項27記載の凍結された
    選択精子サンプルを用いることを含んで成る方法。
37. 【請求項３７】 低用量人工受精のために前記凍結された選択精子サンプル
    を用いることを含んで成る請求項36記載の方法。